DE4408034C1 - Verfahren zur massenspektrometrischen Analyse von Proben aus 2D-Gel-Elektrophoreseplatten mit matrixunterstützter ionisierender Laser-Desorption - Google Patents
Verfahren zur massenspektrometrischen Analyse von Proben aus 2D-Gel-Elektrophoreseplatten mit matrixunterstützter ionisierender Laser-DesorptionInfo
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Description
Das Verfahren betrifft die massenspektrometrische Analyse von separierten Sub
stanzproben auf sogenannten 2-D-Gel-Elektrophoreseplatten, wie sie insbesondere
für die Proteinbestimmung verwendet werden, mit einer Ionisierung der Substanz
proben durch matrix-unterstützte Ionisierung Laser-Desorption (englisch: MALD
oder MALDI = matrix assisted laser desorption/ionization). Die Moleküle der
Substanzproben werden dazu auf eine dünne, lackartige glatte Matrixschicht
übertragen, die auf einem vorzugsweise metallischen Probenträger aufgebracht ist.
Die Übertragung geschieht direkt oder indirekt, beispielsweise über eine PVDF-
Membran als Zwischenträger, durch elektrophoretischen Transport der Moleküle.
Vor der Übertragung können die Proteine einer enzymatischen Zerschneidung ihrer
Aminosäureketten unterworfen werden.
Die zweidimensionale Elektrophorese stellt eine der schnellsten und elegantesten
Methoden zur gleichzeitigen Trennung von Hunderten von Proteinen aus biolo
gischen Proteingemischen dar und bietet zudem eine grobe Klassifizierung. In der
Monatszeitschrift "Electrophoresis" (Verlag Chemie, Weinheim) werden in jährlichen
November-Sonderausgaben (editiert durch J. E. Celis) allein Tausende von mensch
lichen und tierischen Proteinen, die mit dieser Methode getrennt und grob klassifi
ziert wurden, in Datenbanken zusammengefaßt. Dabei wird eine grobe Bestimmung
des Molekulargewichts der Proteine aufgrund der elektrophoretischen Eigenschaften
vorgenommen, die jedoch wegen unbekannter Formfaktoren um einen Faktor 2
falsch sein können. Die Molekulargewichte reichen dabei von 8 bis etwa 160
Kilodalton.
Von den im November 1993 veröffentlichten 3038 Haut-Proteinen waren 763 näher
identifiziert, und nur von 176 Proteinen waren Teile der Aminosäure-Sequenz
bekannt. Für die früher veröffentlichten Datenbanken gilt ähnliches. Insgesamt
schätzt man allein die Anzahl menschlicher Proteine auf 50 000 bis 100 000, etwa
ebensoviel, wie es, geschätzt, menschliche Gene gibt.
Es ist seit langem wünschenswert, die Proteine genauer zu bestimmen. Insbesondere
würde das "Human Genome Project" leer laufen, wenn es nicht gelänge, die durch
die DNA-Ketten erzeugten Eiweiße genau zu bestimmen. Die Bestimmung sollte
sich nicht nur auf das genaue Molekulargewicht beziehen, sondern nach Möglichkeit
auf die von DNA-Sequenzanalysen unabhängige Bestimmung der vollständigen
Aminosäure-Sequenz.
Ein Zwischenschritt in der Bestimmung ist die Feststellung, ob es sich bei einem
Protein um ein bereits bekanntes Protein handelt. Dieser Schritt kann heute relativ
leicht vollzogen werden. In Datenbanken sind heute etwa 30 000 bis 40 000 Proteine
erfaßt, mit ihren Aminosäure-Sequenzen, soweit in Teilen oder ganz bekannt.
Außerdem sind dort mehr als 100 000 Proteine gespeichert, deren Aminosäure-
Sequenzen rechnerisch aus DNA-Sequenzdaten gewonnen wurden. Existenz oder
richtige Struktur dieser Proteine sind aber noch unbekannt.
Ein Beispiel ist die Datenbank des Europäischen Molekular-Biologischen Laborato
riums in Heidelberg (EMBL), die auf Computer-CDs erhältlich ist.
Diese Datenbanken sind teilweise bereits rechnerisch so aufbereitet, daß sie auch die
bei enzymatischer Verdauung erwartbaren Bruchstücke enthalten, etwa die Bruch
stücke, die sich bei Anwendung von Trypsin bilden. Trypsin zerschneidet die
Aminosäuren-Ketten immer an charakteristischen Stellen zwischen zwei bestimmten
Aminosäuren.
Die Mischung dieser Trypsin-Bruchstücke ist nun für ein Protein außerordentlich
charakteristisch. Schon aus der Kenntnis des Molekulargewichts einiger weniger
Bruchstücke läßt sich ein Protein sehr sicher identifizieren. Erst unter 10¹³ Proteinen
finden sich zwei voneinander verschiedene Proteine, die fünf verschiedene Trypsin-
Bruchstücke mit exakt gleichen Molekulargewichten gemeinsam haben. Bei mehr als
fünf bekannten Bruchstücken steigt die Sicherheit der Bestimmung exponentiell an.
Die Verdauung eines unbekannten Proteins mit dem Enzym Trypsin, und eine
anschließende Messung der Molekulargewichte der Bruchstücke erlaubt es daher
schnell und mit hoher Sicherheit, in der Datenbank zu prüfen, ob das Protein schon
in der Datenbank erfaßt ist.
Die Messung der Molekulargewichte kann sehr schnell und einfach mit der Massen
spektrometrie erfolgen. Die Methode der matrixunterstützten ionisierenden Laser-
Desorption erlaubt heute die gleichzeitige, sehr effektive Ionisierung von Peptiden
und Proteinen in Mischungen. Die Ionen können mit Flugzeit-Spektrometern, mit
Ionenfallen- oder ICR-Massenspektrometern gemessen werden.
Die Unterstützung der ionisierenden Laser-Desorption großer, organischer Moleküle
durch lichtabsorbierende Substanzmatrices, meist organische Säuren oder andere
nicht zu große, polare organische Moleküle, ist heute bereits eine weit verbreitete
Standardtechnik. Sie wird vorzugsweise für die Flugzeit-Massenspektrometrie
verwendet, ist aber auch für ionenspeichernde Massenspektrometer, wie ICR oder
Ionenfallen, geeignet.
Beim Beschuß mit einem gepulsten Laser wird durch Aufheizen eines kleinen
Volumens der Matrixsubstanz eine Dampfwolke gebildet, die wegen der leichten
Ionisierbarkeit der Moleküle und der relativ hohen Verdampfungstemperatur nach
der Saha-Eggert-Gleichung einen geringen Anteil an ionisierten Molekülen enthalten
muß, also ein schwaches Plasma darstellt. Die in dem Matrixmaterial eingeschlosse
nen großen Moleküle, also in unserem Falle die Proteine, werden dabei in schonen
der Weise mit verdampft. Durch Ionen-Molekül-Reaktionen in diesem Plasma
werden dann bevorzugt die schweren Moleküle ionisiert, da deren Ionisierung
energetisch günstiger ist.
Die ionisierende Laser-Desorption ist eine besonders günstige Ionisierungsmethode
für Flugzeit-Massenspektrometer, da die Ionen der großen Moleküle durch den
gepulsten Laser in einem sehr kurzem Zeitintervall gebildet werden, und da sich die
Flugzeit-Spektrometer wegen ihres nach oben offenen Massenbereichs besonders
gut für die Untersuchung von großen Molekülen eignen. Es werden dabei allgemein
Laser mit einer Pulslänge von etwa 5 Nanosekunden benutzt.
Die Methode erforderte bislang eine oberflächlich sehr unregelmäßige Schicht mit
einigen größeren Matrixkristallen, in die die Untersuchungssubstanz eingebettet
werden mußte. Durch eine neue, in der Patentanmeldung BFA 1/94 beschriebene
Methode ist es aber möglich, eine gleichmäßig dicke, glatte, lackähnliche Matrix
schicht zu benutzen, deren Dicke bei zwei bis drei Wellenlängen des verwendeten
Laserlichtes liegt, und die es erlaubt, die Analysensubstanzen erst nach Erzeugung
dieser Schicht auf die Oberfläche der Matrixschicht aufzutragen.
Das Beladen dieser Matrixschicht mit Substanzmolekülen ist sehr einfach. Eine sehr
verdünnte Lösung kann beispielsweise einfach als Lösungstropfen aufpipettiert
werden. Eine kurze Einwirkungszeit genügt, um die Substanzmoleküle an die
Matrixoberfläche fest zu binden. Die Art dieser Bindung ist noch nicht bekannt, es
mag sich um oberflächliche Adsorption, um Absorption in den obersten Schichten
der Matrix, oder auch um ein oberflächliches Eindringen in zwischenkristalline
Bereiche handeln. Die Bindung ist jedenfalls so fest, daß sich die Substanzmoleküle
in nachfolgenden Waschungen der Oberfläche nicht beseitigen lassen.
Diese neue Präparationsmethode zeigt eine ganz exzellent verbesserte Substanz
ausbeute. Mit nur 50 Attomol eines Proteins, aufgetragen auf einen Fleck von etwa
2 Millimeter Durchmesser, können bereits gut auswertbare Spektren erhalten
werden. Damit ist der Substanzverbrauch gegenüber der bisher üblichen Methode
um einen Faktor Tausend verringert.
Die neue Präparationsmethode erzeugt quer über die Auftragungsfläche der
Analysensubstanz hinweg eine stets sehr gleichmäßige Ionisierungsstärke.
Diese Eigenschaften - Schicht mit glatter Oberfläche, feste Adsorption der Substanz
moleküle aus der Lösung, und eine gleichmäßige, extrem hohe Empfindlichkeit un
abhängig vom Ort des Laserbeschusses - läßt einen so präparierten Probenträger zur
idealen Unterlage für die Analyse der elektrophoretisch getrennten Proteine werden.
Doch nicht nur das, gleichzeitig ist auch die Qualität der Spektren mit dieser
Methode erheblich verbessert.
Das Massenauflösungsvermögen von Flugzeit-Spektrometern ist mit dieser Proben
vorbereitung deutlich erhöht und entspricht dem Auflösungsvermögen, das von
dem Spektrometer zu erwarten ist. Mit Flugzeit-Massenspektrometern, die mit
energiefokussierenden Reflektoren ausgestattet sind, lassen sich Massenauflösungs
vermögen von m/Am = 5000 erreichen.
Die Genauigkeit der Massenbestimmung wird dadurch erhöht, daß die Massen
skalen (Funktion der Abhängigkeit der Masse von der Flugzeit) nicht mehr - wie bei
bisheriger Probenbereitungstechnik - für verschieden Substanzen eines Gemisches
im selben Spektrum verschieden sind.
Die Genauigkeit der Massenbestimmung wird ferner dadurch erhöht, daß sich die
Massen sehr genau gemäß der theoretischen Abhängigkeit der Masse von der
Flugzeit inter- oder extrapolieren lassen. Es ist - im Rahmen der überhaupt erziel
baren Massengenauigkeit - keine Verzerrung der Massenskala mehr festzustellen.
Die Probenträger mit der Matrixschicht können dabei sogar mit Referenzmaterialien
zur Bestimmung der Masse vorbeladen sein. Diese "internen Referenzmaterialien"
haben sehr genau bekannte Massen, aus denen sich leicht unbekannte Massen der
später aufgebrachten Untersuchungssubstanzen ermitteln lassen. Bei der massen
spektrometrischen Analyse erscheinen beide Materialien im selben Spektrum.
Die Trypsin-verdauten Proteinbruchstücke haben Molekulargewichte im Bereich
von rund 500 bis 3000 atomaren Masseneinheiten. Ihr Molekulargewicht muß auf die
Masseneinheit genau bestimmt werden. Durch die oben angegebenen Verbes
serungen der Methode sind alle Voraussetzungen für eine gute Proteinanalyse
erfüllt. Es bleibt nur die Frage offen, wie die Proteine aus der Elektrophoreseplatte
auf die Probenträgerplatte überführt werden können.
Es läßt sich diese Methode zur Ionisierung aber nicht nur für Flugzeit-Spektrometer
benutzen, sie kann auch für speichernde Massenspektrometer, wie ICR-Spektro
meter oder Ionenfallen, mit Erfolg verwendet werden.
Mit Ionenfallen-Massenspektrometern können beispielsweise die Aminosäuren-
Sequenzen auch direkt bestimmt werden. Die Ionenfallen lassen sich so betreiben,
daß nur eine einzige Ionensorte (Ionen einer Masse) eingespeichert wird, etwa ein
bestimmtes Trypsin-Bruchstück des originalen Proteins. Eine künstlich in der
Ionenfalle herbeigeführte Fragmentierung dieses Bruchstücks liefert dann Amino
säurenketten-Fragmente verschiedener Länge, aus denen sich nach bekannten
Methoden die Sequenz bestimmen läßt. Durch Wiederholung des Verfahrens für die
verschiedenen Trypsin-Bruchstücke kann man die gesamte Sequenz bestimmen,
wenn man die Sequenz der Trypsin-Bruchstücke kennt. Diese läßt sich aber mit
anderen Methoden feststellen, unter anderem auch wieder massenspektrometrisch.
Die Idee der MALDI-Analyse von elektrophoretisch separierten Proteinen ist nicht
neu. So sind in jüngster Zeit zwei Arbeiten erschienen, die sich mit der MALD-
Ionisierung von Elektro-Blot-Membranen mit nachträglichem Auftrag der Matrix
materialien beschäftigen.
K. Strupat, M. Karas, F. Hillenkamp, C. Eckerskorn und F. Lottspeich (Anal. Chem.
66, 464, (1994)) berichten über die Anwendung der MALD-Ionisierung von
Peptiden, die mit Elektrophorese von Gel-Platten auf PVDF-Membranen übertragen
worden und nachträglich mit Matrixsubstanzen versehen worden waren. Die Laser-
Desorption erfolgte direkt von der PVDF-Membran. Es wurden, mit verschiedenen
Matrices, sowohl UV-Laserlicht (337 nm) wie auch infrarotes Licht (2,94 µm) benutzt,
wobei letzteres die besseren Ergebnisse brachte. Die Ionisierung von der PVDF-
Membran hat jedoch erhebliche Nachteile. Es werden im unteren Massenbereich
große Mengen an nicht als Linien aufgelöste Untergrundionen erzeugt, die das
Spektrum kleiner Peptide überdecken.
M. Vestling und C. Fenselau (Anal. Chem. 66, 471 (1994)) berichten über ein prak
tisch gleiches Verfahren mit UV-Licht (337 nm), mit erstmalig durchgeführtem,
zusätzlichem enzymatischen Abbau der Proteine durch Proteolyse in der PVDF-
Membran. Durch bessere Probenpräparation, wahrscheinlich durch besseres
Waschen, wurden hier bessere Spektren gewonnen. Diese Arbeit bietet auch eine
gute Übersicht über den gegenwärtigen Stand der Technik.
Die erhaltenen Massenauflösungen sind in beiden Fällen bei weitem nicht so gut,
wie sie mit Dünnschicht-Matrixfilmen erhalten werden, wenn von den Autoren auch
"zufriedenstellende Genauigkeiten von 0,1%" für die Massenbestimmung angegeben
wurden. Eine Genauigkeit von 0,1% reicht nicht aus, um im Massenbereich von 1000
bis 3000 atomaren Masseneinheiten die Molekularmasse zweifelsfrei zu bestimmen.
Es ist ein Verfahren zu finden, mit dem separierte Proteine aus einer 2-D-Gel-
Elektrophoreseplatte, unter Erhalt ihrer örtlichen Verteilung, auf höchstempfindliche
MALDI-Probenträgerplatten überführt werden können. Dabei soll es möglich sein,
eine enzymatische Spaltung der Proteine zwischenzuschalten.
Basis der Erfindung ist die Erkenntnis, daß sich Proteine und andere Analysensub
stanzen nachträglich auf Matrixschichten bestimmter Präparation aufbringen lassen.
Sie können dann, entgegen der herrschenden Lehre, durch matrixunterstützte
ionisierende Laser-Desorption ganz ausgezeichnet und mit hoher Empfindlichkeit
ionisiert werden, mit Spektrenqualitäten, wie sie bisher nicht erreicht werden
konnten. Bislang herrschte die Lehre, daß die Analysensubstanzen in Kristalle der
Matrixsubstanz während der Auskristallisation eingebaut werden müßten, um
durch Laser-Desorption ionisierbar zu werden.
Eine weitere Basis der Erfindung ist, daß sich auch mikroskopisch glatte Schichten
aus der Matrixsubstanz so herstellen lassen, daß sie oberflächlich mit der Analysen
substanz beladen werden können, und zu einer höchstempfindlichen MALDI-
Ionisierung fähig sind.
Eine weitere Basis der Erfindung ist es, daß sich die Analysensubstanzen aus
Lösungen, deren Lösemittel die Matrixsubstanz praktisch nicht löst, von selbst fest
an die Matrix binden. Die Oberfläche der in bestimmter Weise präparierten Schicht
saugt somit durch Diffusion frei bewegliche Analysenmoleküle vollständig aus der
Lösung. Die Moleküle der Analysensubstanz haften fest an der Matrixschicht, und
lösen sich nicht wieder in der aufgebrachten Lösung.
Eine weitere Basis der Erfindung ist die Erkenntnis, daß dieser Prozeß der Bindung
an die Matrixoberfläche nicht durch anwesende Puffersalze, nicht einmal durch
schwache Säuren, behindert wird.
Eine weitere Basis ist die Erkenntnis, daß sich die Matrixschichten mit den aufge
brachten Proteinen nachträglich waschen lassen, ohne die Proteine zu verlieren.
Damit können Salze, Elektrolyte und andere Beigaben der Proteinlösung von der
Matrixschicht entfernt werden. Diese Waschungen sind außerordentlich wichtig, da
mit ihnen die Qualität der erhaltenen Spektren steigt. Einige der Peptide erscheinen
überhaupt nur nach dem Waschen, einige erscheinen ungewaschen nur als
Kationen-Addukte, einige erscheinen als normal protonierte Ionen. Insgesamt ist das
Auflösungsvermögen ohne Waschungen herabgesetzt. (Matrixschichten, die nach
bisheriger Methode der Auskristallisation aus aufgebrachten Tröpfchen hergestellt
wurden, halten Waschungen nicht stand; die kleinen Kriställchen werden dabei
fortgespült.)
Die so auf die Matrixschicht aufgebrachten und gewaschenen Proteine ergeben
Massenspektren von überragender Qualität. Sie sind bis zu einem Molekular
gewichtsbereich von 3000 Dalton isotopenaufgelöst, das heißt, es lassen sich die
Massensignale der einzelnen Massen des Isotopenmusters eines Moleküls vonein
ander trennen, und es können für die einzelnen Massen genaue Massenzahlen
bestimmt werden. Die Genauigkeit der Massenbestimmung liegt bei 20 ppm.
Die Empfindlichkeit der Methode ist ebenfalls überragend. Von 50 Attomol eines
Peptids oder Proteins lassen sich gut vermeßbare Spektren erzeugen.
Wird das feuchte Gel der Elektrophoreseplatte in direkten Kontakt mit der glatten
Matrixschicht gebracht, so werden Substanzmoleküle, die durch Diffusion die
Matrixschicht erreichen, sofort an diese gebunden.
Leider sind die Moleküle aber in der Gelschicht nicht so frei beweglich, daß sie in
beträchtlichem Maße diffundieren könnten. Es lassen sich daher ohne unterstützen
de Maßnahmen nur sehr geringe Mengen der Analysensubstanzen an die Matrix
schicht bringen.
Etwas besser wirkt der direkte Kontakt mit einer Übertrager-Membran, auf die die
Proteine mit dem bekannten Verfahren des sogenannten "Elektro-Blotting", d. h.
durch elektrophoretischen Transport, übertragen werden können. Aber auch hier
sind die Protein-Moleküle auf der Überträger-Membran nicht frei beweglich, liegen
allerdings an der Oberfläche in höherer Konzentration vor.
Der Zusatz bestimmter Chemikalien löst die Proteine vom Gel oder von der Über
träger-Membran, macht sie besser frei beweglich und verbessert so die Anlagerung
an die Matrixschicht. Für diesen Zweck kann beispielsweise Trifluor-Essigsäure in
sehr verdünnter Form benutzt werden. Nachteilig ist aber hierbei, daß die Ortsauf
lösung der Separation hierdurch beträchtlich verschlechtert wird.
Es wird daher hier insbesondere vorgeschlagen, die Protein-Moleküle durch elektro
phoretischen Transport zur Matrixschicht zu bringen, an der sie sich dann in
vorbeschriebener Weise binden. Der Transport wird durch bestimmte Elektrolyte,
wie schwache Lösungen von Tris-base und Borsäure, unterstützt. Die Technik ist in
der Biochemie bereits weit verbreitet, und braucht dem Fachmann nicht näher
erläutert werden.
Der elektrophoretische Transport verlangt einen minimalen Stromfluß, der in der
Regel von den dünnen mikrokristallinen Matrixschichten ohne Schwierigkeiten
durchgelassen wird. Einige Schichten bedürfen aber der künstlichen Erhöhung der
Leitfähigkeit. Diese kann durch die Einlagerung von leitenden Substanzen bewirkt
werden, wobei sowohl ionische Leiter (Salze) wie auch metallische Leiter (feinste
Metallpulver) verwendet werden können.
Durch die Einschaltung eines Zwischenträgers, etwa einer PVDF-Membran, lassen
sich die Proteinketten auch in bekannter Weise durch Enzyme ortsfest in der
Membran spalten (Proteolyse). Auch diese Technik ist dem biochemischen Fach
mann bekannt.
Für alle diese Techniken ist das anschließende Waschen des matrixbeladenen
Probenträgers von großer Bedeutung. Es können die für die elektrophoretische
Trennung im Gel benötigten Salze, und die für den elektrophoretischen Transport
zur Blot-Membran oder zur Matrixschicht benötigten Elektrolyte (beispielsweise
Borsäure) nach dem Übertragen auf die Matrixschicht wieder abgewaschen werden,
um Spektren mit der oben geschilderten überragenden Qualität zu erhalten.
Das Verfahren wird insbesondere in der Medizin größere gesundheitliche und wirt
schaftliche Bedeutung erlangen. Es ist mit der Kombination Gel-Elektrophorese und
MALDI-MS sehr schnell möglich, fehlgebildete Eiweiße aus den Zellen bestimmter
Organe oder bestimmter Körperflüssigkeiten zu finden, und die Art der Fehlbildung
zu bestimmen. Diese fehlgebildeten Eiweiße erscheinen auf der Gel-Elektrophorese
platte (nach Anfärben oder anderen Methoden der Sichtbarmachung) an anderen als
ihren angestammten Plätzen, und können so sehr leicht, beispielsweise mit bereits
existierenden Computerprogrammen, herausgefunden werden. Mit der hier vorge
stellten Methode ist es dann sehr schnell möglich, die Art der Fehlbildung des
Eiweißes zu bestimmen.
Eine Lösung von α-Cyano-4-Hydroxy-Zimtsäure in Aceton verteilt sich beim Auf
pipettieren auf einen sauberen, metallischen Träger praktisch augenblicklich, da ihre
Oberflächenspannung verschwindend klein ist. Ein Mikroliter einer fast gesättigten
Lösung genügt für etwa 4 Quadratzentimeter Oberfläche, woraus sich eine Dicke des
Lösungsfilms von etwa 2,5 Mikrometer, und eine Dicke der Matrixschicht nach dem
Eintrocknen von etwa 300 bis 600 Nanometer ergibt. Diese Dicke hat sich als sehr
günstig erwiesen.
Verdunstet man das Lösungsmittel unter einem sauberen Luftstrom in weniger als
10 Sekunden, so erhält man eine dünne, optisch glatte, lackartige Schicht der Matrix.
Das Matrixmaterial α-Cyano-4-Hydroxy-Zimtsäure, das in Aceton besonders gut
löslich ist, jedoch kaum in reinem Wasser oder in angesäuerten Methanol-Wasser-
Gemischen, hat sich für Proteinanalysen besonders bewährt. Es können jedoch auch
andere, dem Fachmann bekannte Matrixmaterialien oder Lösemittel mit ähnlichem
Erfolg verwendet werden.
Die so hergestellten Probenträger mit dünner Matrixschicht binden Protein- und
andere schwere Moleküle aus Lösungen so fest, daß sie in anschließenden Waschun
gen mit leicht angesäuertem Wasser, aber auch anderen Waschflüssigkeiten, nicht
mehr beseitigt werden können. Die Waschungen beseitigen störende Begleitsubstan
zen, wie Puffersalze, Elektrolyte und andere Residuen der Lösung.
Es ist günstig, die vorzugsweise metallischen Probenträger vor oder nach dem
Belegen mit der Matrixschicht mit einem elektrisch nicht leitfähigen Lackrand zu
versehen. Dieser Rand erleichtert die spätere elektrophoretische Übertragung von
Proteinen, da ein Kurzschluß mit dem metallischen Träger am Rande vermieden
wird.
Die Probenträger können nun mit der glatten Matrixschicht fest auf die feuchte
Gelplatte oder feuchte Übertragungsmembran gedrückt, und dort einige Minuten
gehalten werden. Dieser Prozeß alleine genügt bereits, um Spektren zu erhalten. Es
werden dabei pro separiertem Protein, und abhängig von der Ausgangskonzentra
tion, etwa 5 bis 200 Attomol Substanz übertragen, wobei etwa 50 Attomol für ein
relativ gutes Spektrum ausreichen.
Das Versetzen der Membranen mit einer sehr verdünnten Lösung von Trifluor-
Essigsäure, die anschließend von der Matrixschicht wieder gut abgewaschen wird,
erhöht die Ausbeute leicht.
Am günstigsten ist jedoch ein elektrophoretischer Transport der Proteine zu der
Matrixschicht. Mit elektrophoretischem Transport können leicht Femtomol-Mengen
übertragen werden. Da eine Überladung der Matrixschicht mit Proteinen dem
Ionisierungsprozeß schadet, kann man das Beladen der Matrixschicht mehrmals
wiederholen, ohne eine zu starke Abnahme der Konzentration in der Ausgangs
membran zu bemerken. Es können verschiedene Probenträgerplatten mit Proteinen
aus einer einzigen Gel-Separation belegt werden, entweder von verschiedenen
Stellen der Gel-Platte, oder auch von derselben Stelle, da die Proteinmenge größer ist
als für die Probenträgerplatte benötigt.
Bei Verwendung der Übertragungsmembran können die Proteine in an sich bekann
ter Weise in situ durch Enzyme zerschnitten ("verdaut") werden. Dieser Vorgang
wird Proteolyse genannt. Anschließend wird dann das Gemisch der Bruchstücke
elektrophoretisch auf die Matrixschicht übertragen. Auch hier genügen etwa 50 bis
100 Attomol pro Bruchstück, also auch nur 50 bis 100 Attomol des Ausgangs
proteins, für ausreichend gute Spektren, die das Molekulargewicht der Bruchstücke
auf besser als eine atomare Masseneinheit ergeben.
Insbesondere kann man wegen der hohen massenspektrometrischen Empfindlichkeit
mehrere Probenträgerplatten von einer Gel-Separation aus beladen. Es ist dabei
möglich, einige Probenträger mit den unzerschnittenen, originalen Proteinen zu
beladen, und weitere Probenträger anschließend mit enzymatisch verdauten
Proteinen. Es lassen sich damit sowohl die Molekulargewichte der originalen Pro
teine wie auch die Identität der Proteine durch die Enzym-Bruchstücke bestimmen.
Für die Spektrenaufnahme kann besonders günstig ein defokussierter Laserstrahl
benutzt werden. Es lassen sich von einer Auftragung mit 50 Attomol Analysen
substanz in aufeinanderfolgenden Laserschüssen etwa 30 bis 300 Spektren erzeugen,
die gewöhnlich aufaddiert werden, um das Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu
verbessern. Bei einer Wiederholfrequenz des Lasers von 10 Hz dauert die gesamte
Spektrenaufnahme für eine Substanz nur drei bis dreißig Sekunden. Bei höheren
Konzentrationen lassen sich wesentlich kürzere Aufnahmezeiten erzielen.
Insbesondere kann man durch Verschieben des Laser-Punktes (oder durch Bewegen
der Probenträgerplatte) die Oberfläche des Probenträgers mit dem Massenspektro
meter abtasten. Die einzelnen, räumlich verteilten Proteine lassen sich dann durch
ihre Spektren erkennen. Bei überlappenden Proteinflecken können mathematische
Trennmethoden für die "Dekonvolution" der Spektren angewandt werden, wie sie
schon für GC/MS-Techniken entwickelt worden sind.
Zweckmäßigerweise ist die Matrixschicht bereits vorher mit Referenzsubstanzen
bekannter Molekularmasse belegt, um durch diese interne Referenz zu sehr genauen
Molekulargewichtsbestimmungen zu kommen. Es konnte bereits mit so belegten
Matrixschichten Massengenauigkeiten von etwa 20 ppm erreicht werden.
Eine oder auch mehrere Referenzsubstanzen mit bekannten Molekulargewichten
können sehr einfach vor dem Aufbringen der Proben großflächig in sehr geringer
Menge aufgebracht werden. Es ist auch möglich, die Referenzsubstanzen bereits der
Matrixlösung beizugeben.
Die Probenträger lassen sich mit Matrixschichten und Referenzsubstanzen über viele
Wochen aufheben. Guter Luftabschluß ist ratsam, da sich die sehr adsorptions
aktiven Schichten relativ rasch mit Substanzen aus der Umgebungsluft anreichern.
Eine Kühlung der Träger ist ebenfalls empfehlenswert, weil noch nicht bekannt ist,
ob sich die mikrokristalline Schicht im Laufe der Zeit zu größeren Kristallen
umkristallisiert.
Claims (16)
1. Verfahren zur massenspektrometrischen Analyse von Substanzproben, die
mit ein- oder zweidimensionaler Gel-Elektrophorese auf Gel-Elektrophoreseplatten
separiert wurden, mit einer Ionisierung der Substanzproben nach ihrer Überführung
auf Probenträgerplatten durch matrix-unterstützte ionisierende Laser-Desorption
(MALDI), dadurch gekennzeichnet, daß die Probenträgerplatten mit einer optisch
glatten, adsorptiven Schicht einer festen Matrixsubstanz überzogen sind, und daß
die Substanzproben durch direkten Kontakt mit der feuchten Elektrophoreseplatte,
oder, bei Benutzung einer Übertrager-Membran durch Kontakt mit der feuchten
Übertrager-Membran, auf die Oberfläche der Matrixschicht der Probenträgerplatte
übertragen werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Übertragung
auf die Probenträgerplatte von ausgeschnittenen Stücken der Gel-Elektrophorese
platte oder der Überträger-Membran, die ausgewählte Substanzproben enthalten,
aus erfolgt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Übertragung
der Substanzproben ohne Zerschneiden der Membranen großflächig unter Erhaltung
ihrer 2-dimensionalen Verteilung geschieht.
4. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Über
tragung der Probensubstanzen durch die Zugabe von Chemikalien, beispielsweise
verdünnter Trifluor-Essigsäure, erleichtert wird.
5. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Sub
stanzproben von der Elektrophoreseplatte oder der Übertrager-Membran elektro
phoretisch zur Probenträgerplatte übertragen werden.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2, 3 oder 5, dadurch gekennzeichnet,
daß die Substanzproben von der Elektrophoreseplatte zunächst in an sich bekannter
Weise elektrophoretisch auf eine Übertragungsmembran übertragen werden
("Elektro-Blotting"), und daß in einem zweiten Schritt die Substanzproben von der
Übertragungsmembran zur Matrixschicht auf der Probenträgerplatte elektrophore
tisch übertragen werden.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Übertragungs
membran aus PVDF (Polyvinylidendifluorid) besteht.
8. Verfahren nach einem der bisherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet,
daß es sich bei den Substanzproben um Proteine im weitesten Sinne handelt.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäure
ketten der Proteine in einem Zwischenschritt enzymatisch zerschnitten werden.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Zerschneiden
in der Gel-Elektrophoreseplatte erfolgt.
11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Zerschneiden
der Proteine in der Übertragungsmembran stattfindet.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9, 10, oder 11, dadurch gekennzeichnet,
daß das enzymatische Zerschneiden durch Trypsin geschieht.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeich
net, daß die Übertragung von Proteinen aus einer Gel-Separation portionenweise
nacheinander auf mehrere Probenträgerplatten erfolgt.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß nach einer oder
mehreren Übertragungen von unzerschnittenen Proteinen auf Probenträgerplatten
eine enzymatische Zerschneidung der zurückgeblieben Portionen der Proteine
stattfindet, und anschließend die proteolytischen Bruchstücke der Proteine einmal
oder mehrmals auf Trägerplatten übertragen werden.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeich
net, daß die Oberfläche der Probenträgerplatten durch fortlaufende Spektrennahmen
an verschiedenen Stellen ein- oder zweidimensional abgetastet wird.
16. Verfahren nach einem der bisherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet,
daß die Matrixschicht der Probenträgerplatte durch Einlagerung von ionen- oder
elektronenleitenden Substanzen leitend gemacht wird.
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