DE60114245T2

DE60114245T2 - Verfahren und vorrichtung zur identifizierung und quantifizierung chemischer komponenten einer mischung

Info

Publication number: DE60114245T2
Application number: DE60114245T
Authority: DE
Inventors: Thomas Jacibus VOGELS; Florian Wulfert; Jan Van Der Greef; Albert Tas
Original assignee: Nederlandse Organisatie voor Toegepast Natuurwetenschappelijk Onderzoek TNO
Current assignee: Nederlandse Organisatie voor Toegepast Natuurwetenschappelijk Onderzoek TNO
Priority date: 2000-08-03
Filing date: 2001-08-03
Publication date: 2006-07-13
Anticipated expiration: 2021-08-04
Also published as: US6743364B2; DE60114245D1; US20020053545A1; EP1384248A2; EP1384248B1; US20040267459A1; CA2417621A1; WO2002013228A3; JP2004506216A; WO2002013228A2; ATE307387T1; US7056434B2; AU2001294343A1; NL1016034C2; IL154188A0

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft das Gebiet der Datenverarbeitung und -auswertung. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verarbeitung und Auswertung von Massenchromatographieund Massenspektrometriedaten.
HINTERGRUND
Entwicklungen, sowohl in der Technologie der Massenspektrometrie als auch in der Kombination von Massenspektrometern (nachfolgend mit "MS" bezeichnet) mit einer breiten Vielfalt von Trenn- und Mikrotrennverfahren, erhöhen schnell die Kapazität von MS in Bezug auf die Datenerzeugung. Bei Verwendung moderner Instrumente ist die Zeit, die zur Gewinnung der oben erwähnten Daten, wie zum Beispiel Chromatogramme und Massenspektren, erforderlich ist, kein kritischer Faktor mehr; vielmehr ist es die Zeit, die zum Analysieren der Daten benötigt wird. Insbesondere weist ein Datensatz oft Tausende von Massenspektren auf, die über einen Bereich eines Masse-Ladungs-Verhältnisses (m/z) von zwei bis drei Größenordnungen gemessen werden. Eine ausgedehnte Studie, die diese Daten benutzt kann Tage beanspruchen, wenn eine komplette Analyse benötigt wird. Insbesondere in einer Forschungsumgebung muss diese Analyse von hochqualifiziertem und folglich kostspieligem Personal ausgeführt werden.
In diesem Zusammenhang ist der Einsatz von effizienter Datenverarbeitung und -auswertung zur Erhöhung der Geschwindigkeit, mit der Daten gehandhabt werden, sehr wünschenswert. Je nach der Anwendung kann man die Informationsgewinnung aus verschiedenen Gesichtspunkten aus angehen. Bei Verunreinigungs-Untersuchungen durch Kapillarelektrophorese/Massenspektrometrie (CE/MS) oder Flüssigchromatographie/Massenspektrometrie (LC/MS) müssen zum Beispiel Datenverarbeitungs- und -auswertungswerkzeuge in der Lage sein, eine wirkungsvolle Wertspitzenermittlung von Verbindungen, die in sehr geringen Konzentrationen vorliegen, durchzuführen. Wenn andererseits eine Untersuchung und ein Vergleich sehr ähnlicher komplexer Verbindungen vorgenommen werden soll, wie zum Beispiel im sich schnell erweiternden Gebiet der Proteomik, müssen Datenverarbeitungs- und -auswertungswerkzeuge in der Lage sein, Daten von mehreren komplexen Mischungen zu korrelieren.
Ein Ansatz nach dem Stand der Technik für die Verarbeitung von Daten, die durch eine Kombination von Massenspektrometrie und Chromatographie erzeugt werden, ist das US-Patent Nr. 5,672,869 für Windig et al. (nachfolgend "das 869er Patent " genannt). Das 869er Patent beschreibt einen Datenverarbeitungsansatz, der Scheinwertspitzen und Rauschen durch Glätten der Rohdaten trennt. Dieser Ansatz vergleicht dann die verarbeiteten und die Rohdaten. Wenn eine Massenspur nur Hintergrundrauschen enthält, wird die Differenz zwischen rohen und verarbeiteten Daten hervorgehoben, und der Algorithmus weist dieser speziellen Massenspur einen niedrigen massenchromatographischen Qualitätswert (nachfolgend MCQ-Wert genannt) zu. Andererseits werden den Massenspuren, die eine Wertspitze enthalten, hohe MCQ-Werte zugewiesen. Das 869er Patent lehrt dann das Auswählen nur der Massenspuren, die einen MCQ oberhalb eines geeigneten Schwellenwertes besitzen.
Es ist jedoch nicht unbedingt klar, was ein geeigneter Schwellenwert, besonders für komplexe und/oder verrauschte Daten, ist. Zum Beispiel können durch Wahl eines zu hohen Schwellenwertes einige relevante Informationen auf Signalen niedriger Intensität verloren gehen, während durch Einstellen eines zu niedrigen Schwellenwertes viele "Signale" gewählt werden können, die tatsächlich nur Hintergrundrauschen sind. Als Folge dessen kann eine umfangreiche Kontrolle von rohen und verarbeiteten Daten durch ausgebildetes Personal erforderlich sein, um dieses Problem anzugehen, was daher die Datenverarbeitungseffizienz und -geschwindigkeit senkt.
Es besteht daher Bedarf an einem Datenverarbeitungsverfahren, das für eine effizientere und klarere Datenverarbeitung sorgt.
KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung wendet eine Theorie des Informationsgehalts an und kombiniert sie mit einer Datenglättung, um so ein Maß an Datenqualität bereitzustellen, das die effiziente und klare Auswertung von Daten besser unterstützt. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein Maß für die Datenqualität bereit, welches auf dem beruht, was hierin als Entropiewert bezeichnet wird. Der Entropiewertansatz der vorliegenden Erfindung verbessert die Datenverarbeitung durch Bereitstellung von weniger unklaren Schwellenwerten für die Datenauswahl. Als Folge beschleunigt zum Beispiel die vorliegende Erfindung die Datenverarbeitung, indem der Zeitumfang, den ausgebildetes Personal zum persönlichen Prüfen und Auswählen der Daten benötigt, verringert wird.
Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zur Datenverarbeitung, bei der die Trennung zwischen Scheinwertspitzen und Rauschen auf der einen Seite und relevanten Daten aus der anderen Seite genauer und klarer abläuft, wodurch die Datenanalysezeit verkürzt wird. Folglich kann ausgebildetes Personal die Zeit zum Auswerten der Daten verwenden. Gleichzeitig stellt die vorliegende Erfindung die Möglichkeit bereit, Fingerabdrücke von komplexen Mischungen zu erzeugen, die in wachsendem Maße auf verschiedenen Gebieten verwendet werden (Chemie, Pharmazie, Biologie, Biotechnologie und dergleichen), besonders aber in den Biowissenschaften, zum Beispiel aus der Analyse von biologischen Materialien, die auf DNA-Fragmente, Proteine und Stoffwechselkomponenten ausgerichtet sind.
In einer Erscheinungsform liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Datenverarbeitung und -auswertung, das die Schritte des Glättens der Datenpunkte eines Chromatogramms und des Bestimmens eines Entropiewertes für das geglättete Chromatogramm aufweist. Das Verfahren weist auch den Schritt der Korrektur der Datenpunkte eines Chromatogramms für die Grundlinie vor der Bestimmung eines Entropiewertes für das geglättete und korrigierte Chromatogramm auf. Das Chromatogramm kann entweder ein Massenchromatogramm oder ein Gesamtionenstrom-Chromatogramm (TIC-Chromatogramm) sein. Man muss erkennen, dass die Reihenfolge der Schritte des Glättens und der Grundlinienkorrektur für die vorliegende Erfindung unwichtig ist. Das heißt, ein Chromatogramm kann geglättet und dann die Grundlinie korrigiert werden, oder die Grundlinie wird korrigiert und dann das Chromatogramm geglättet. Dementsprechend versteht es sich, dass der Begriff "geglättet-korrigiertes Chromatogramm" keine spezielle Reihenfolge der Ausführung andeutet.
In einer weiteren Ausführungsform bestimmt das Verfahren der Erfindung weiters einen Qualitätsfaktor (d.h. einen "IQ-Wert") für ein Chromatogramm auf der Basis der Auswertung der Entropiewerte für mehrere Chromatogramme eines Datensatzes. In einer bevorzugten Ausführungsform wählt das Verfahren einzelne Chromatogramme (entweder von korrigierten Chromatogrammen und/oder von geglättet-korrigierten Chromatogrammen) auf der Basis ihrer IQ-Werte aus. Das Verfahren verwendet dann diese ausgewählten Chromatogramme zur Erzeugung eines rekonstruierten Gesamtionenstrom-Chromatogramms (RIC-Chromatogramms). Das Verfahren kann weiters ein oder mehrere Massensignale aus dem RIC-Chromatogramm ausschließen. In einer Ausführungsform wird das eine oder werden die mehreren Massensignale auf der Basis eines Massensignal-Qualitätswertes für die einzelnen Massensignale für den Aus schluss ausgewählt. In einer weiteren Ausführungsform verwendet das Verfahren diese ausgewählten Chromatogramme zum Erzeugen eines rekonstruierten Massenchromatogramms für einen oder mehrere Massenwerte. Weiters werden in verschiedenen Ausführungsformen die RIC-Chromatogramme als Fingerabdruck für den Vergleich mit anderen Chromatogrammen desselben Datensatzes oder anderer Datensätze verwendet.
In einer weiteren Erscheinungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren der Datenverarbeitung und -auswertung bereit, das entweder ein geglättetes Chromatogramm oder ein geglättet-korrigiertes Chromatogramm mit mehreren Chromatogrammen eines Datensatzes korreliert. Das Chromatogramm vom Typ des geglättet-korrigierten Chromatogramms (oder geglätteten Chromatogramms) und die Datensatzchromatogramme können zum Beispiel ein Massenchromatogramm, Gesamtionenstromchromatogramm oder ein RIC-Chromatogramm sein. In einer bevorzugten Ausführungsform weist der Schritt der Bestimmung einer Korrelation die Verwendung einer multivarianten Analyse auf. Geeignete Formen der multivarianten Analyse sind u.a., ohne darauf beschränkt zu sein, die Hauptkomponentenanalyse ("PCA"), die Diskriminanzanalyse ("DA"), das Partial Least Squares-Verfahren ("PLS"), die prognostische lineare Diskriminanzanalyse ("PLDA"), neuronale Netze und Mustererkermungsverfahren.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Entropiewerte von mehreren geglätteten Massenchromatogrammen jeweils berechnet und gespeichert, woran sich, falls gewünscht, die Weiterverarbeitung dieser Entropiewerte, oder, gegebenenfalls, von Bestandteilen, die entsprechend dieser Entropiewerte ausgewählt werden, mittels chemometrischer und biometrischer Verfahren anschließt. Bevorzugte Formen der Komponentenauswahl sind u.a. Verfahren der Multivariantenanalyse (PCA, DA, PLS, PLDA, neuronale Netze), Mustererkennungsverfahren und Fourier-Transformationsverfahren. In einer weiteren Ausführungsform werden die ausgewählten Komponenten weiters dazu verwendet, einen Fingerabdruck zu erstellen, und dieser wird in Verbindung mit chemometrischen und biometrischen Verfahren als Bestimmungsverfahren für komplexe Mischungen verschiedenen Ursprungs verwendet.
In einer weiteren Erscheinungsform stellt die vorliegende Erfindung ein System zur Datenverarbeitung und -auswertung bereit. Das System ist dadurch gekennzeichnet, dass es eine Glättungsvorrichtung zur Glättung der Datenpunkte eines Massenchromatogramms und eine Entropieberechnungsvorrichtung zur Bestimmung des Entropiewertes eines Massenchromatogramms aufweist. In einer Ausführungsform weist das System weiters eine Grundlinienkorrek turvorrichtung zum Korrigieren der Grundlinie eines Chromatogramms auf. Das System weist vorzugsweise einen Chromatographen zur Trennung der Komponenten der Mischung auf und ein Spektrometer, dem die getrennten Komponenten zugeführt werden. In einer Ausführungsform weist das System weiters eine Speichervorrichtung zur Speicherung der Entropiewerte auf.
In einer weiteren Erscheinungsform betrifft das Verfahren und System der vorliegenden Erfindung Verfahren zum Identifizieren und Quantifizieren chemischer Komponenten einer Mischung von Materialien; das Verfahren weist allgemein folgende Schritte auf: (1) Anwenden eines Trennverfahrens auf die Mischung zur Trennung der Komponenten der Mischung in getrennte Materialien; (2) Zuführen der getrennten Materialien zu einer Massenspektrometrie zur Erkennung und Identifizierung der Komponenten und zur Gewinnung eines Gesamtionenstrom-Chromatogramms ("TIC-Chromatogramms") (oder Ionenelektropherogramms) und von Massenspektren; (3) Auswählen von Massen aus den Massenspektren und (4) Erlangen von Massenchromatogrammen für jede Masse.
Die vorhergehenden und anderen Merkmale und Vorteile der Erfindung sowie die Erfindung selbst sind besser aus der folgenden Beschreibung, den Zeichnungen und Ansprüchen zu verstehen.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt ein Beispiel für ein Gesamtionenstrom-Chromatogramm (TIC-Chromatogramm), wie es mittels eines Flüssigkeitschromatographen in Kombination mit einem Massenspektrometer (LC/MS) erhalten wird.
2 zeigt ein Beispieldiagramm für berechnete IQ-Werte von Chromatogrammen, d.h. ein IQ-Spektrum.
3 zeigt ein rekonstruiertes Gesamtionenstrom-Chromatogramm (RIC-Chromatogramm) für das TIC-Chromatogramm von 1.
Die 4a und 4b sind Flussdiagramme von Ausführungsformen von Verfahren der vorliegenden Erfindung.
5 ist ein Flussdiagramm von Ausführungsformen der Verarbeitung der ausgewählten oder entropiegewichteten Komponenten mittels biometrischer oder chemometrischer Verfahren.
Die 6A und 6B zeigen einen Vergleich von MCQ- und IQ-Diagrammen für einen LC/MS-Lauf von digeriertem BSA 55 nM gemäß Beispiel 1.
Die 7A und 7B zeigen die Wertspitzen, die in den 6A und 6B mit "A" bzw. "B" markiert sind.
8 zeigt einen Score-Plot für einen Satz von drei verschiedenen BSA-Auszügen gemäß Beispiel 2.
Die 9A-9D zeigen gaschromatographische/massenspektrometrische (GC/MS) TIC-Chromatogramme für die Menge von Experimenten, die in Beispiel 1 und 2 mit H gekennzeichnet werden.
10 zeigt einen Score-Plot von PC1 zu PC2 gemäß Beispiel 2.
Die 11A und 11B zeigen Ladungsdiagramme für PC1 und PC 2 gemäß Beispiel 2.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Nachweis, Identifizierung und Quantifizierung von Komponenten in einer Mischung (oder einem Material) machen häufig von der Kombination aus Chromatographie (oder Elektromigration) und Spektrometrie Gebrauch. 1 zeigt ein Beispiel für ein Gesamtionenstrom-Chromatogramm ("TIC-Chromatogramm"), das mit einer Kombination von Flüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie ("LC/MS") erhalten wurde.
Die Chromatographie wird hauptsächlich als Trennverfahren verwendet. Die zu trennenden Moleküle der Mischung werden viele Male zwischen einer mobilen Phase und einer stationären Phase ausgetauscht. Die Rate, mit der dies geschieht, hängt von vielen Faktoren ab, zum Beispiel von der Beweglichkeit der einzelnen Moleküle, der Temperatur und den Bindungskräften. Der Unterschied in der Zeit, die jede Art von Molekülen in der mobilen Phase bleibt, führt zu Unterschieden in der Transportrate und zur Trennung von Substanzen. Trotz der Unterschiede in den Transportraten für verschiedene Arten ist die Genauigkeit der konventionellen Chromatographie im Allgemeinen nicht ausreichend, um die Identifizierung der abgesonderten Komponenten zu ermöglichen. Daher wird ein Chromatographieverfahren normalerweise in Reihe mit anderen Analyseverfahren eingesetzt. Ein Verfahren, das häufig in Kombination mit der Chromatographie verwendet wird, ist die Massenspektrometrie.
In einem konventionellen LC/MS-Verfahren ist das Chromatographiegerät (oder der Chromatograph) mit einem Massenspektrometer verbunden, das die mobile Phase wiederholt abtastet, wenn sie aus dem Chromatographen austritt. Jeder Abtastvorgang des Massenspektrometers erzeugt ein Massenspektrum. Daher wird eine große Zahl von Massenspektren für jede Analyse aufgezeichnet, was einen sehr umfangreichen Datensatz erzeugt. Es werden normalerweise mehrere Spektren erhalten, die nur "Hintergrund" enthalten, da normalerweise, wenn das Massenspektrometer mit dem Abtasten beginnt, keine Komponenten von Interesse aus dem Chromatographen austreten. Wenn eine mobile Phase, die eine Komponente enthält, aus dem Chromatographen austritt, weisen die Massenspektren im allgemeinen eine Änderung auf, die zum Beispiel von der Art der in das Massenspektrometer eintretenden Komponente abhängt. Jedes Massenspektrum (oder jede Abtastung) enthält normalerweise eine Reihe von Ionen, die zusammen einen Gesamtionenstrom bilden, welcher mit diesem Spektrum zusammenhängt. 1 zeigt für ein LC/MS-Verfahren ein Beispieldiagramm dieses Gesamtionenstroms (z.B. die Intensität) für jedes Massenspektrum (d.h. jede Abtastung) als Funktion der Zeit (z.B. Abtastnummer). 1 illustriert daher ein Gesamtionenstrom-Chromatogramm ("TIC-Chromatogramm"). Dieses Gesamtionenstrom-Chromatogramm stellt im allgemeinen die Rohdaten des LC/MS-Verfahrens dar und bildet die Basis für den Komponentennachweis. Ein alternatives Diagramm ist das eines individuellen Masse-Ladungs-Verhältnisses als Funktion der Zeit (z.B. Abtastnummer); wobei dieses Diagramm im allgemeinen als Massenchromatogramm bekannt ist.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können Daten verwenden, die aus einer Kombination eines chromatographischen Verfahrens (d.h. Trennverfahrens) und eines massenspektrometrischen Verfahrens gewonnen wurden. Geeignete chromatographische Verfahren (d.h. Trennverfahren) sind u.a. Gaschromatographie ("GC"), Flüssigchromatographie ("LC"), Elektromigrationsverfahren, Elektrophorese, Kapillarelektrochromatographie ("CE"), isoelektrische Fokussierung und die überkritische Flüssigchromatographie. Geeignete Arten der Massenspektrometrie sind z.B., ohne darauf beschränkt zu sein, Ionenfallen, Flugzeit-Massenspektrometrie, Fourier-Transformations-Massenspektrometrie, Quadrupole, magnetische Sektorfeldinstrumente oder mehrfache Kombinationen von Massenspektrometrie-Hardwareanordnungen. Mehrfachkombinationen von Massenspektrometrie-Hardware sind u.a. Dreifach-Quadrupole (QQQ), QTOF, Ionenfallen-/Sektorinstrumente, Quadrupolsektoren und hochauflösende Massenchromatographie. Andere Kombinationen von Chromatographie und Massenspektrometrie können eingesetzt werden, dazu gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, LC/NMR, LC/UV, LC/MS/MS, GC/MS, CE/MS, CEC/MS, ITP/MS, IEF/MS, SFC/MS.
Die Datenglättung gemäß der Erfindung kann mit einer Reihe von Verfahren durchgeführt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Die Glättung wird vorzugsweise mittels einer Savitsky-Golay-Funktion durchgeführt. In einer Ausführungsform wird die Savitsky-Golay-Funktion mit einem auswählbaren Glättungsfenster W und einer auswählbaren Glättungsordnung O verwendet. In einer Ausführungsform werden die Werte W=8 und O=2 verwendet. In einer Ausführungsform bestimmt das Verfahren der vorliegenden Erfindung dann einen Entropiewert für das geglättete Chromatogramm. In einer weiteren Ausführungsform geht der Entropiewertbestimmung die Korrektur der Grundlinie des Massenchromatogramms voraus, so dass ein geglättet-korrigiertes Chromatogramm erzeugt wird.
Die Grundlinienkorrektur gemäß der Erfindung beruht auf den Annahme, dass die Grundlinie alle Wertspitzen eines Chromatogramms durchläuft, selbst wenn keine Wertspitzen vorhanden sind. In einer Ausführungsform werden zuerst die erste und zweite Ableitung des Chromatogramms gebildet, um zu entscheiden, wo Wertspitzen vorhanden sind. Eine Grundlinienfunktion wird dann durch die restlichen Datenpunkte des Chromatogramms aufgetragen. In einer Ausführungsform weist die Grundlinienfunktion eine Spline-Funktion, wie zum Beispiel eine kubische Spline-Interpolation auf. Mit dieser Grundlinienfunktion wird jeder Datenpunkt des originalen Chromatogramms durch die prognostizierte Höhe der Grundlinie an diesem Punkt korrigiert. Damit wird ein korrigiertes Chromatogramm erzeugt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird diese Funktion mit Hilfe des Savitsky-Golay-Algorithmus aufgetragen.
Der Savitsky-Golay-Algorithmus und die "Glättung" werden in Numerical Recipes in C, 2. Ausgabe, The Art of Scientific Computing, W.H. Press, B.P. Flannery, S.A. Teukolsky, W.T. Vetterling, Cambridge University Press, 1988, ISBN 0-521-35465-X, beschrieben.
In einer Ausführungsform werden zuerst die erste und die zweite Ableitung des Chromatogramms gebildet, um festzustellen, wo Wertspitzen vorhanden sind, und Massenchromatogramme, die chemische Informationen (z.B. Wertspitzen) enthalten, werden für die Einbeziehung in das TIC-Chromatogramm ausgewählt, wohingegen Massenchromatogramme, die im wesentlichen nur Hintergrundrauschen oder Scheinwertspitzen enthalten, von der Einbeziehung in das TIC-Chromatogramm ausgeschlossen werden. So wird das Signal-Rausch-Verhältnis im resultierenden TIC-Chromatogramm durch den selektiven Ausschluss von Chromatogrammen, die im wesentlichen nur Rauschen enthalten, beträchtlich erhöht.
In einer weiteren Ausführungsform werden nur Massenspektren, die in ein bestimmtes Zeitfenster (z.B. einen Bereich von Abtastnummern) fallen, für die Verarbeitung aus gewählt. Zum Beispiel kann es unerwünscht sein, Massenspektren mit niedrigen Abtastnummern (d.h. von früheren Zeitpunkten) zu verarbeiten, weil zum Beispiel solche Spektren nur mobile Phase und keine chemischen oder biologischen Informationen von Interesse (z.B. eine Komponente) enthalten. Analog können Massenspektren mit hohen Abtastnummern (d.h. von späten Zeitpunkten) möglicherweise keine erkennbaren chemischen oder biologischen Informationen enthalten. Das heißt, alle Komponenten von Interesse könnten bereits den Chromatographen verlassen haben.
Nach der Grundlinienkorrektur und/oder der Datenpunktglättung bestimmen Verfahren der vorliegenden Erfindung einen Entropiewert für das geglättete (oder geglättete und korrigierte) Chromatogramm im wesentlichen gemäß der Formel
wobei H der Entropiewert und p_i der Intensitätswert des i-ten Datenpunktes des Chromatogramms ist. Gleichung 1 wird auch in den Numerical Recipes in C in Verbindung mit der Spieltheorie beschrieben. In einer weiteren Ausführungsform wird der Entropiewert im wesentlichen gemäß der Formel
bestimmt, wobei H und p_i dieselbe Bedeutung wie oben besitzen. In weiteren Ausführungsformen ist der Entropiewert H von Gleichung 1 und/oder 2 der negative Wert des Ergebnisses der rechten Seite dieser Gleichungen. Es ist jedoch nicht wesentlich für die vorliegende Erfindung, ob die Entropie als positiver oder negativer Wert ausgedrückt wird.
In einer Ausführungsform wird ein TIC-Chromatogramm aus Massenchromatogrammen erzeugt, die durch ein Gewicht gewichtet werden, das auf dem Entropiewert beruht, der mit jedem einzelnen Massenchromatogramm zugeordnet ist (d.h. entropiegewichtet). Das resultierende TIC-Chromatogramm ist eine Version eines RIC-Chromatogramms gemäß der vorliegenden Erfindung.
In einer weiteren Ausführungsform werden Massenchromatogramme (die korrigiert oder geglättet und korrigiert wurden) für die Einbeziehung in das TIC-Chromatogramm auf der Basis des Entropiewertes des individuellen Chromatogramms ausgewählt. In einer Ausführungsform beruht die Auswahl auf einem Qualitätsfaktor ("IQ"), der der Reziprokwert des Ent ropiewertes ist. In einer weiteren Ausführungsform ist der IQ der negative Reziprokwert der Entropie. Wie vorher erläutert, hat jedoch die einfache Änderung des Vorzeichens eines IQ-Wertes (oder Entropiewertes) im wesentlichen keinen großen Effekt auf die Ausführung der vorliegenden Erfindung. Die IQ-Werte werden durch Teilen der einzelnen IQ-Werte durch den maximalen IQ-Wert, der aus einem Datensatz bestimmt wird, vorzugsweise zwischen 0 und 1 skaliert.
In einer bevorzugten Ausführungsform beruhen die Auswahl von Chromatogrammen und die Bestimmungen, die auf Entropiewerten basieren, auf einem Qualitätsfaktor ("IQ"), der im wesentlichen gemäß der Formel IQ = 1 – (H/Hmax) Gl.(3)bestimmt wird, wobei IQ der Qualitätsfaktor, H der Entropiewert des geglättetkorrigierten Chromatogramms (oder geglätteten Chromatogramms) und H_max der maximale Entropiewert sind, der für die Chromatogramme des Datensatzes bestimmt wird. Wie oben angeführt, sind in weiteren Ausführungsformen die IQ-Werte von Gleichung 3 die negativen Werte der rechten Seite dieser Gleichung. Dementsprechend enthalten Chromatogramme mit einem hohen absoluten IQ-Wert (niedrige Entropie) normalerweise ein intensives Signal und wenig Rauschen. Chromatogramme mit einem niedrigen absoluten IQ-Wert enthalten normalerweise viel Rauschen und ein kleines Signal. Das Ordnen der Chromatogramme (entweder Massen-, TIC- oder RIC-Chromatogramme) nach ihrem IQ-Wert ermöglicht die Differenzierung von Chromatogrammen nach ihrem Informationsgehalt, wodurch sinnvolle Signalspuren von im wesentlichen verrauschten Spuren getrennt werden können.
1 zeigt ein durch LC/MS erhaltenes TIC-Chromatogramm für eine Mischung. Das TIC-Chromatogramm von 1 stellt Rohdaten dar, d.h., Daten, die noch nicht gemäß der vorliegenden Erfindung verarbeitet worden sind. 2 zeigt die Entropiewerte der Massenchromatogramme, die 1 bilden, wobei die Entropiewerte als Qualitätsfaktoren IQ dargestellt werden. Dementsprechend ist die x-Achse von 2 das Massen-Ladungs-Verhältnis ("m/z"), das mit dem Massenchromatogramm verbunden ist, und die y-Achse ist der IQ-Wert des Massenchromatogramms. Als waagerechte Linie wird auch ein gewählter IQ-Schwellenwert gezeichnet. Zusammengefasst, illustriert 2 die Auswahl von Massenchromatogrammen auf der Basis eines Entropiewertes.
In einer Ausführungsform werden die so ausgewählten Massenchromatogramme zur Erzeugung eines rekonstruierten Gesamtionenstrom-Chromatogramms ("RIC- Chromatogramms") verwendet. In einer Ausführungsform werden die ausgewählten Chromatogramme entropiegewichtet. In einer weiteren Ausführungsform wird der Ionenstrom, der einem ausgewählten Massenchromatogramm zugeordnet ist, gleich dem des stärksten Intensitätswertes im Massenchromatogramm gesetzt. Dieser letztere RIC-Chromatogramm-Erzeugungsansatz wird hierin als IQ-intensitätsgewichtetes RIC-Chromatogramm bezeichnet.
3 zeigt ein RIC-Chromatogramm für das TIC-Chromatogramm von 1. Das RIC-Chromatogramm von 3 wurde gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung durch Auswählen von Massenchromatogrammen mit einem IQ-Wert oberhalb des Schwellenwertes erzeugt, der in 2 gezeigt wird. Der Vergleich der Chromatogramme von 1 und 3 zeigt deutlich die beträchtliche Verminderung des Rauschens. Die Wertspitzen sind nun klar oberhalb des Rauschens erkennbar.
In einer Ausführungsform schließt die vorliegende Erfindung weiters ein oder mehrere Massensignale aus dem RIC-Chromatogramm aus. In einer Ausführungsform werden Massen, die mit einer bestimmten Komponente in Zusammenhang stehen, ausgeschlossen. Solche Komponenten können zum Beispiel die mobile Phase, die stationäre Phase und/oder bekannte oder vermutete Verunreinigungen sein. Solche Verunreinigungen können zum Beispiel aus einem Teil der gerade analysierten Mischung bestehen oder aus solchen, die mit dem chromatographischen oder massenspektrometrischen Verfahren verbunden sind. In einer weiteren Ausführungsform werden ein oder mehrere Massensignale, die ausgeschlossen werden sollen, auf der Basis eines Massensignalqualitätswertes für die einzelnen Massensignale ausgewählt. Der Massensignalqualitätsfaktor kann auf einem Entropiewert für ein damit verknüpftes Massenspektrum oder Massenchromatogramm beruhen, wie er durch Gl. (1) bis (3) bereitgestellt wird, oder kann auf einem anderen Maß für die Massensignalqualität beruhen, wie zum Beispiel dem Signal-Rausch-Verhältnis.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein RIC-Chromatogramm erzeugt, das eine ausgewählte Gruppe von einem oder mehreren Signalen daraus ausschließt; diese Ausschlussoperation wird jedoch fortgesetzt, bis keine Wertspitzen im RIC-Chromatogramm verblieben sind.
In einer weiteren Ausführungsform verwendet die vorliegende Erfindung, statt die Intensitätssumme pro Zeiteinheit als Chromatogramm (z.B. als TIC-Chromatogramm) zu nutzen, einen pro Zeiteinheit aufsummierten Entropiewert, was zu einem Gesamtentropie-Chromatogramm ("TEC") führt. Weiters weist das sich ergebende Chroma togramm in einer Version dieser Ausführungsform, bei der Chromatogramme auf der Basis von Entropiewerten ausgewählt werden, ein rekonstruiertes Entropiechromatogramm ("REC") auf.
Außerdem werden in einer Ausführungsform Massenchromatogramme gemäß der Wahrscheinlichkeit, dass sie relevante Wertspitzen enthalten, oder gemäß der Wahrscheinlichkeit, dass sie mit einer bestimmten Komponente in Zusammenhang stehen, sortiert. Wie unten erläutert wird, liefert die Datenverarbeitung auf der Basis von Entropiewerten einen deutlicheren Schwellenwert für die Auswahl von Chromatogrammen. Zum Beispiel stellen RIC-Chromatogramme, die gemäß der vorliegenden Erfindung erzeugt wurden, eine sehr gute Hilfe für den Anwender bei der Analyse einer Mischung dar.
In den 4a und 4b werden verschiedene Ausführungsformen von Verfahren der Erfindung zur Verarbeitung von Daten, die durch ein chromatographischmassenspektrometrisches Instrument (z.B. LC/MS) erhalten wurden, gezeigt. In einer Ausführungsform beginnt ein Verfahren der vorliegenden Erfindung mit der Auswahl eines Chromatogramms (Kasten A). Das ausgewählte Chromatogramm wird geglättet (Kasten B), und dann wird eine Grundlinienkorrektur vorgenommen (Kasten C). Die Reihenfolge von Glättung und Grundlinienkorrektur kann auch vertauscht werden. Nach dem Glättungsschritt und dem Schritt der Grundlinienkorrektur wird die Entropie des geglättet-korrigierten Chromatogramms bestimmt (Kasten D). Wie durch die Schleife über (N=N + 1) illustriert, können die Schritte von Kasten A, B, C und D für mehrere Chromatogramme ausgeführt werden, bis alle gewünschten Chromatogramme verarbeitet sind (d.h. "JA" zur Frage "Ist alles verarbeitet?").
Mit Bezug auf 4B können die Massenchromatogramme gemäß dem Entropiewert und/oder einem Qualitätsfaktor IQ (Kasten E) geordnet und angezeigt werden, falls dies gewünscht wird (Kasten F). In einer Ausführungsform kann ein Schwellenwert auf der Basis der angezeigten IQ-Werte (z.B. wie in 2) festgelegt werden (Kasten G). In einer Ausführungsform des Verfahrens wird ein RIC-Chromatogramm aus den geglättet-korrigierten Chromatogrammen, die einen IQ-Wert oberhalb des Schwellenwertes besitzen, erzeugt.
Mit denjenigen ausgewählten Massenchromatogrammen, deren Entropiewert die festgelegte Entropieschwelle (wie durch die Schleifenlinie zwischen Kasten H und G angezeigt) übersteigt, wird dann ein rekonstruiertes TIC-Chromatogramm (d.h., ein RIC-Chromatogramm), Kasten J, erzeugt. In einer Ausführungsform erzeugt das Verfahren auch (Kasten K) eine Liste von relevanten Entropiewerten und zeigt die ausgewählten geglättetkorrigierten Chromatogramme, Kasten L, an. Weiters können in einer Ausführungsform die Chromatogramme und/oder die ausgewählten Massenspektren, wie durch Kasten M und N angedeutet, in jedem der Schritte von Kasten F, G und H angezeigt werden, falls gewünscht, um die Analyse der Daten zu erleichtern.
In einer weiteren Erscheinungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Datenverarbeitung und -auswertung bereit, das Chromatogramme (die durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung verarbeitet oder erzeugt wurden) mit mehreren Chromatogrammen eines Datensatzes korreliert. In einer Ausführungsform korreliert die vorliegende Erfindung ein RIC-Chromatogramm mit einem oder mehreren TIC-Chromatogrammen oder RIC-Chromatogrammen desselben Datensatzes oder unterschiedlicher Datensätze. Dementsprechend kann das RIC-Chromatogramm in verschiedenen Ausführungsformen als Fingerabdruck für eine Mischung dienen, die später mit anderen bekannten oder unbekannten Mischungen mittels chemometrischer/biometrischer Verfahren verglichen werden kann. In einer weiteren Ausführungsform wird ein entropiegewichtetes RIC-Chromatogramm als Fingerabdruck verwendet. In einer weiteren Ausführungsform wird ein IQ-Spektrum als Fingerabdruck verwendet.
Die vorliegende Erfindung liefert verschiedene Ausführungsformen der Erzeugung eines Fingerabdrucks einer Mischung, wie in 5 illustriert. Jede Ausführungsform von 5 beginnt mit einem Datensatz, der aus Massenchromatogrammen (d.h. m/z-Spuren über der Zeit) besteht. In einer Ausführungsform werden IQ-Werte als Funktion des m/z-Wertes bestimmt, um ein IQ-Spektrum zu erzeugen (wofür ein Beispiel in 2 gezeigt wird), und das IQ-Spektrum wird dann als Eingabe für ein multivariantes Datenverarbeitungsverfahren verwendet. In einer Ausführungsform wird das gesamte IQ-Spektrum verwendet, und in anderen Ausführungsformen wird ein IQ-Schwellenwert eingesetzt. In noch einer weiteren Ausführungsform wird das IQ-intensitätsgewichtete RIC-Chromatogramm als Eingabe für eine multivariante Datenverarbeitungsoperation verwendet.
In einer weiteren in 5 illustrierten Ausführungsform wird ein RIC-Chromatogramm als Eingabe für ein multivariantes Datenverarbeitungsverfahren verwendet. In einer weiteren Ausführungsform wird statt der Verwendung der Intensitätssumme pro Zeiteinheit als Eingabechromatogramm ein Entropiewert, pro Zeiteinheit summiert, d.h. ein REC-Chromatogramm, als Eingabe für ein multivariantes Datenverarbeitungsverfahren verwendet. In einer weiteren Ausführungsform wird, z.B. im Fall, dass keine Auswahl unter den Massenchromatogrammen auf der Basis von Entropiewerten getroffen wird, das TIC-Chromatogramm als Eingabe für ein multivariantes Datenverarbeitungsverfahren verwendet. In gleicher Weise nutzt eine Ausführungsform ein TEC-Chromatogramm als Eingabe in dem Fall, dass keine Auswahl getroffen wird. Die Kombination von Auswertungen durch eine multivariante Analyse sowohl der m/z-Dimension als auch der Zeitdimension in einer oder mehr Formen, mit oder ohne Entropieauswahl, stellt einen neuartigen Weg zum Kennzeichnen komplexer Mischungen mit Hilfe von Trennverfahren dar, die mit der Spektrometrie in Zusammenhang stehen.
In bestimmten Ausführungsformen werden geglättete Massenchromatogramme (oder geglättet-korrigierte Massenchromatogramme) als Fingerabdrücke zur Identifizierung einer chemischen Komponente verwendet. In einer Ausführungsform wird die Korrelation zwischen dem geglätteten Massenchromatogramm (oder geglättet-korrigierten Massenchromatogramm), das mit einer ausgewählten Masse in Zusammenhang steht, und allen anderen Massenchromatogrammen bestimmt. Die Massenchromatogramme können dann auf der Basis ihrer Korrelationskoeffizienten ausgewertet werden.
In einigen Ausführungsformen kann die Funktionalität der oben beschrieben Verfahren als Software auf einem Mehrzweckcomputer implementiert werden. Weiters kann ein solches Programm Teile des Arbeitsspeichers eines Computers reservieren, um eine Grundlinienkorrekturvorrichtung, Glättungsvorrichtung, eine Entropiewertevorrichtung zur Bestimmung von Entropiewerten, eine Auswahlvorrichtung zum Auswählen von Chromatogrammen auf der Grundlage ihrer Entropiewerte und die Funktionen mit und an den Massenchromatogrammen und Massenspektren bereitzustellen. In einer solchen Ausführungsform kann das Programm in einer aus einer Reihe von höheren Programmiersprachen, wie zum Beispiel FORTRAN, PASCAL, C, C++ oder BASIC, geschrieben werden. Weiters kann das Programm in einem Skript, Makro oder einer Funktionalität geschrieben werden, die in handelsüblich erhältlicher Software eingebettet sein kann, wie zum Beispiel EXCEL oder VISUAL BASIC. Außerdem könnte die Software in einer Assembler-Sprache implementiert werden, die für einen in einem Computer eingebetteten Mikroprozessor bestimmt ist. Die Software könnte zum Beispiel in Intel 80 × 86 Assembler-Sprache implementiert werden, wenn sie gestaltet ist, um auf einem IBM-PC oder PC-Klon lauffähig zu sein. Die Software kann in ein Industrieerzeugnis eingebettet werden, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, einem "computer-lesbaren Medium", wie zum Beispiel einer Diskette, einer Festplatte, einer optischen Speicherplatte, einem Magnetband, einem PROM, einem EPROM oder einem CD-ROM.
EXPERIMENTELLER ANSATZ DER BEISPIELE
Die Beispiele haben den unten beschriebenen experimentellen Ansatz gemeinsam. Die Beispiele beschreiben die Auswertung der mittels CE/MS-, LC/MS- und/oder GC/MS- Verfahren erhaltenen Daten.
Reagenzien und Materialien
Acetonitril wurde von Biosolve B.V. (Valkenswaard, Niederlande) bezogen, während Methanol, Ameisensäure und Essigsäure von Merck (Darmstadt, Deutschland) stammten. Wasser wurde durch ein ELGA-System gereinigt. Ammoniumacetat, Trypsin, Rinderserumalbumin (BSA), Dithiothreitol (DTT) und Cytochrom C wurden von Sigma (Deisenhofen, Deutschland) bezogen. Iodacetamid kam von Fluka (Buchs, Schweiz). Hexametrindibromid (Polybren) kam von Aldrich (Steinheim, Deutschland).
CE/MS-Verfahren
Die CE/MS-Messungen wurden auf einem LCQ (Thermoquest, San Jose, CA, USA) durchgeführt, das mit einem Nanoelektrospray-x-y-z-Positioniergerät von Protana (Odense, Dänemark) statt der konventionellen ESI-Schnittstelle bestückt war. Das CE-Instrument war ein Prince von Prince Technologies (Emmen, Niederlande). Die verwendeten CE-Kapillaren, 20 μm Innendurchmesser (ID), 65 cm lang, verjüngt und goldbeschichtet, waren von New Objective (Cambridge, MA, USA); sie wurden an der Düse des x-y-z-Positioniergerätes mittels Leitpaste Leit C (Protana) angeschlossen. Die Innenwände der CE-Kapillare wurden bei Tagesbeginn mit einer 5 gew.-/vol. %igen Polybrenlösung in 2 vol.-/vol. %igem Ethylenglykol beschichtet, wobei eine Modifikation des von Bateman et al. in Rapid Comm. Mass Spectrom., Vol. 11, S. 307 (1997), beschriebenen Verfahrens verwendet wurde. Die Folge der Beschichtungsschritte wurde bei 2 bar Druck ausgeführt und war folgende: Polybrenlösung (20 Minuten), Wasser (5 Minuten), Hintergrundelektrolyt (20 Minuten). Die Hintergrundelektrolyt ("BGE") bestand aus 50 mM AcOH in 50 vol.-/vol. % MeOH. Der Abscheidungsschritt wurde durch Anlegen eines Potenzials von –25 kV an das Injektionsende der Kapillare und +1,7 kV an die Nanoelektrospray-Spitze ausgeführt. Das Injektionsvolumen betrug etwa 3 nl.
LC/MS-Verfahren
Die LC/MS-Messungen wurden auf einem LCQ DECA (Thermoquest, San Jose, CA, USA) unter Verwendung einer konventionellen ESI-Quelle in einer Ermittlungsweise für positive Ionen durchgeführt. Die Sprühspannung betrug 3,5 kV, während die Temperatur der beheizten Kapillare 250 °C betrug. Der Eluentfluss von 25 μl/min wurde von einem Eldex-Mikro-LC (Separations) geliefert. Die Analysen wurden an einer 15 cm × 800 μm Innendurchmesser großen Säule ausgeführt, die mit Spherisorb C₁₈-Silika, Teilchengröße 5 μm, bezogen von LC Packings (Amsterdam, Niederlande), gefüllt waren. Die Injektionsschleife war 5 μl. Es wurde eine Gradientenelution ausgeführt. Mobile Phase A: 10 mM NH₄OAc in 0,1 % HCOOH v/v; mobile Phase B: 10 mM NH₄OAc in 0,1 % HCOOH v/v 80 % MeCN v/v. Gradient: 0 min –10 % B/10 min –30 % B/25 min –60 % B/30 min –100 % B.
GC/MS-Verfahren
Die massenspektrometrische Erfassung wurde mit einem HP 5973 MSD-System über eine Elektronenstoß-Quelle ausgeführt. Die Elektronenenergie betrug 70 eV, die Quellentemperatur 230 °C. Die Gaschromatographie wurde mit einem HP 6890 GC-System auf einer 30 m × 320 μm Innendurchmesser großen Säule ausgeführt, die mit DB5-MS beschichtet war. Der Heliumfluss betrug 48 cm/s, und der Temperaturgradient war: 0 min –5 °C/4 min –25 °C/10 min –75 °C/22 min –135 °C/24 min –250 °C/30 min –250 °C. Vor der multivarianten Analyse wurde ein Verschiebungsprogramm auf die TIC-Chromatogramme des gesamten Datensatzes angewendet, um kleine Schwankungen in der Verweilzeit zu korrigieren. Die Datenanalyse der GC-MS-TIC-Profile wurde mit MATLAB (The MathWorks, Inc., Natick, MA, USA) ausgeführt.
Proteindigerierung
Rinderserumalbumin wurde unter Verwendung von Iodacetamid vor der Digerierung mit Trypsin (Enzym-Substrat-Verhältnis von 1:30) mittels DTT reduziert und carbamidomethyliert. Cytochrom C wurde ohne vorherige Denaturierung digeriert. Das Digerieren wurde über Nacht bei 37 °C in 100 mM NH₄HCO₃-Puffer, pH 7,5, ausgeführt. Die Endkonzentration von BSA-digerierten Proben, die für die PCA-Analyse verwendet wurden, betrug 10 μM.
Wurstfermentierung
GC/MS-Profile von flüchtigen Verbindungen wurden aus Wurstmassen gewonnen, die mit Bakterienstämmen (Lactobacillus FC1, Staphylococcus carnosus) und ihren entsprechenden zellfreien Enzymextrakten beimpft wurden (Tabelle 1). Die Probennahme (Likens-Nickerson-Extraktion) und die nachfolgende Analyse durch GC-MS wurden vor der Beimpfung und zu drei verschiedenen Zeitpunkten (t = 24, 66 h und 3 Wochen) während der Fermentierung vorgenommen. Weiters wurde ein Kontrollexperiment ohne Beimpfung durchgeführt.
Tabelle 1 Experimentierschema für die Beimpfung von Wurstmassen
BEISPIEL 1: VERGLEICH MIT DEM MCQ-ANSATZ
Das erste Beispiel vergleicht die Auswertung von LC/MS- und CE/MS-Daten mit Hilfe des CODA-Algorithmus aus Windig et al., Anal. Chem., Vol. 68, S. 3602 (1996) und mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung. Der Vergleich wurde an LC/MS- und CE/MS-Daten vorgenommen. Bezüglich der CE/MS-Daten stellten das Vorhandensein von Spikes im Elektropherogramm und die Schärfe der Wertspitzen zusätzliche Herausforderungen dar.
Der CODA-Algoritlmus weist allen Massenchromatogrammen mit ganzzahligem m/z-Wert einer rohen Datendatei einen MCQ-Wert zu. Ein hoher MCQ-Wert ist ein Zeichen dafür, dass eine bestimmte Massenspur eine Wertspitze enthält. Durch Wählen eines Schwellen-MCQ und durch Zurückweisen der Massenspuren (d.h. Massenchromatogramme), die einen MCQ-Wert unterhalb des gewählten Schwellenwertes haben, werden nur bestimmte Chromatogramme zur Erzeugung eines RIC-Chromatogramms ausgewählt.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung wurden auch zur Verarbeitung der Daten und zum Zuweisen eines IQ-Wertes (im wesentlichen gemäß Gleichung 3 bestimmt) für alle Massenchromatogramme einer rohen Datendatei mit ganzzaliligen m/z-Werten verwendet. Ein hoher IQ-Wert ist ein starker Hinweis, dass eine bestimmte Massenspur eine Wertspitze enthält. Wie oben beschrieben, wird ein IQ-Schwellenwert dazu verwendet, Massenchromatogramme auszuwählen, um ein TIC-Chromatogramm zusammenzustellen und/oder ein RIC-Chromatogramm zu erzeugen.
Für LC/MS-Daten zeigen die Verfahren der vorliegenden Erfindung eine verbesserte Leistung gegenüber dem CODA-Algorithmus, wie in 6A und 6B gezeigt, wo MCQ- und IQ-Darstellungen vergleichen werden. Die in diesem Beispiel untersuchte Probe war eine LC/MS-Analyse eines BSA-Auszugs bei 500 nM Konzentration. Es ist leicht aus dem Vergleich von 6A (dem MCQ-Diagramm) mit 6B (dem IQ-Diagramm) zu ersehen, dass das Einstellen eines genauen Grenzwertes im IQ-Diagramm (6B) viel einfacher war. Im Gegensatz dazu musste im MCQ-Diagramm ein Kompromiss gefunden werden: Durch die Verwendung eines zu hohen Schwellenwertes wären einige potenziell relevante Informationen in der unteren m/z-Region verloren gegangen (siehe 6A), während das Einstellen eines zu niedrigen Schwellenwertes zu viele hohe m/z-Werte ausgewählt hätte, die nur Hintergrundrauschen waren.
Als Beleg dafür, dass die vorliegende Erfindung in der Lage war, sehr niedrige S/R-Wertspitzen zu entdecken, werden zwei Beispiel-Wertspitzen aus 6A und 6B in 7A und 7B gezeigt. Wertspitze A wird in 7A gezeigt, während Wertspitze B in 7B gezeigt wird. Die zwei tryptischen Digerierungsfragmente Wertspitze A und B wurden durch LC/MS mit einem S/R-Verhältnis von 3 bzw. 7 erkannt; trotzdem wurden ihnen MCQ- und IQ-Werte gut oberhalb des Schwellenwertes zugewiesen.
BEISPIEL 2: FALLSTUDIEN VON AROMAPROFILEN
Das zweite Beispiel zeigt die Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Verarbeitung und Auswertung von Daten aus einer Probe von beträchtlicher Komplexität. Dieses Beispiel zeigt eine Ausführungsform, die einen Multivariantenanalysen-Ansatz ("MVA-Ansatz") für die Handhabung von MS-Daten aufweist; es werden zwei Untersuchungen beschrieben. In der ersten wird die vorliegende Erfindung zur Durchführung einer Hauptkomponentenanalyse ("PCA") an komplexen Proben verwendet. Bei diesem Ansatz werden Proben durch Bestimmen einer Korrelation zwischen Chromatogrammen verglichen, wobei eine MVA auf der Basis des Informationsgehalts in den unterschiedlichen Massen, die durch LC/MS-Analyse erkannt werden, verwendet wird. Zweidimensionale Diagramme wurden an Stellen erstellt, die repräsentativ für eine gegebene Probe waren. In diesen Diagrammen wurden Proben mit ähnlichen Informationen über ähnliche Massen zusammen gruppiert, während eher unähnliche Proben in größeren Abständen angeordnet sind. Diese zweidimensionalen Diagramme können sehr effektiv als Mittel der Mustererkennung für Peptid-/Proteinprofile sein.
Als zweite Falluntersuchung, die die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung mit Multivariantenanalyse betreffen, wird die Anwendung auf GC/MS-Daten demonstriert. Komplexe Aromaprofile wurden als Modell genommen, weil sie einerseits sehr detailliert mit Bezug auf die Identität der vorhandenen Verbindungen, andererseits auf die Intensitätsverhältnisse zwischen den Verbindungen selbst analysiert werden können. Im Fall der Aromaprofile kann die MVA zur Erkennung komplexer Beziehungen zwischen Verbindungen verwendet werden, zum Beispiel um biochemische Routen zu entwirren. Weiters ermöglicht die MVA die selektive Erkennung von Wertspitzen mit Relevanz für Trends und beobachtete Differenzen. Die Loading-Plots sind für die Sichtbarmachung und Bestimmung dieser Differenzen nützlich. Diese Loading-Plots sind zur Untersuchung der Bildung von Aromaverbindungen in fermentierten Fleischprodukten (Wurstmassen) angewendet worden, die durch zwei Bakterienstämme und ihre entsprechenden zellfreien enzymatischen Extrakte ausgelöst wurde.
Wie oben beschrieben, wird in einer Ausführungsform eine Korrelation zwischen einem Chromatogramm, das gemäß der vorliegenden Erfindung verarbeitet wurde, und den Chromatogrammen von einem Datensatz oder mehreren Datensätzen bestimmt, die auch gemäß der vorliegenden Erfindung verarbeitet worden sein können. Die Korrelation kann zum Beispiel zwischen Massenchromatogrammen, IQ-Spektren, TIC-Chromatogrammen und RIC-Chromatogrammen bestimmt werden. In diesem Beispiel wurde die Multivariantenanalyse zur Bestimmung von Korrelationen eingesetzt. In Fällen, in denen sehr ähnliche Proben von beträchtlicher Komplexität schnell überprüft werden müssen und die Unterschiede von Chromatogramm zu Chromatogramm erkannt werden müssen, kann die MVA gemäß der vorliegenden Erfindung die Datenauswertung beschleunigen. Die Notwendigkeit einer schnellen Analyse von komplexen und ähnlichen Proben stellt sehr oft die reale Situation in der pharmazeutischen und Biotechnologieindustrie dar und wird mehr und mehr zu einem Problem, dem man sich auf Forschungsgebieten wie der Proteomik und der Profilbildung von Körperflüssigkeiten stellen muss.
Zur Bewertung der Mustererkennung an einer biologischen Probe wurden zwei BSA-Chargen von einer Bezugsquelle und eine dritte Charge von einer weiteren Bezugsquelle reduziert, carbamidmethyliert, digeriert und durch LC/MS analysiert, wie oben beschrieben. Die Datendateien wurden der Hauptkomponentenanalyse (PCA) unterworfen, um eine Korrelation zwischen IQ-Spektren zu bestimmen. Wie in 8 zu erkennen ist, wird der gesamte Daten satz, der einem LC/MS-Lauf entspricht, im Score-Plot als ein Punkt gezeigt. Die drei leicht unterschiedlichen Proben wurden in drei unterschiedlichen Bereichen des Score-Plots konzentriert, was darauf hinweist, dass ein Mustererkennungsansatz auf diese spezielle Klasse von LC/MS-Daten angewendet werden kann. Die Auswertung der Loading-Plots zeigte weiters Unterschiede zwischen den Chargen und lieferte ein Qualitätsbewertungskriterium.
Die 9A-9D zeigen Beispiele von GC/MS-TIC-Chromatogrammen der Fermentierungsexperimente, die mit H gekennzeichnet sind (siehe auch Tabelle 1), in denen Lactobacillus, Staphylococcus carnosus und zellfreier Staphylococcus carnosus-Extrakt angewendet wurden. 9A zeigt das Chromatogramm von Experiment E0, Masse vor der Beimpfung, oder Kontrollmasse (siehe auch Tabelle 1). Die 9B-9D zeigen jeweils TIC-Chromatogramme der Beimpfungen von Experiment H2, H4 bzw. H7. In den TIC-Chromatogrammen der Experimente E0, H2, H4 und H7 wurde eine starke Erhöhung in der Konzentration von Hexadecanal (Wertspitze 45), Octadecanal (Wertspitze 49) und den höheren Fettsäuren Myristinsäure, Hexadecensäure, Zetylsäure, Octadecadiensäure, Ölsäure und Stearinsäure während der Fermentierung beobachtet (9A-9A, Wertspitzen 44, 46, 47, 50, 51 bzw. 52). Es war jedoch ein zweiter Haupteffekt sichtbar: steigende Konzentrationen von kleinen Aldehyden und Fettsäuren. Dieser Effekt wurde früh während der Fermentierung (9B) für Wertspitze 4 (Pentanal), 9 (Hexanal), 32 (Decanal), 34 (Decadienal), 35 (Decadienalsiomer) und 36 (Decansäure) beobachtet. Diese kürzerkettigen Oxidationsprodukte fehlten im Kontrollexperiment (9A).
Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) wurde unter Verwendung aller Zeitpunkte (d.h. Massenspektren) der TIC-Chromatogramme angewendet, und Korrelationen wurden zwischen den TIC-Chromatogrammen bestimmt. Dies führte zu Score-Plots und detaillierten Loading-Plots. Unterschiede in der Bildung von Aromaverbindungen während der Reifung, die durch angewendete Bakterienstämme und Enzymmischungen induziert wurden, wurden mit Hilfe dieser Diagramme überwacht. Der Score-Plot (PC1 gegenüber PC2, 10) zeigt eine Übersicht über die Haupttrends, die während der Fermentierung auftreten. Die entsprechenden chromatographischen Loadingmuster von PC1 und PC2 werden in 11A bzw. 11B angeführt. Spektren des Kontrollexperimentes (mit E0, E2, E4 und E7 bezeichnete Punkte) zeigten eine Verschiebung in einer anderen Richtung als die der Beimpfungsexperimente (Datenpunkte mit der Bezeichnung B, D, F, G und H). Weiters trat eine kleinere Verschiebung auf, die kleinere Änderungen in der chemischen Zusammensetzung anzeigte.
Die Experimente mit zugesetzten Bakterien zeigten im allgemeinen einen Anstieg der Konzentration niederer Aldehyde und Fettsäuren. Diese Tendenz wird hauptsächlich durch die Verschiebung entlang PC2 repräsentiert, die die dominierende Achse für kurzkettige Aldehyde und Säuren ist. Der starke Anstieg in der Konzentration längerkettigen Aldehyden und Säuren wird fast ausschließlich durch PC1 repräsentiert. Obwohl ein allgemeiner Trend für die Experimente von Tabelle 1 mit zugesetzten Stämmen und zellfreiem Extrakt sichtbar ist, besonders für die Experimente, die mit F (mit Lactobacillus und Staphylococcus carnosus) und mit H (mit Lactobacillus, Staphylococcus carnosus und zellfreien Extrakten von Staphylococcus carnosus) gekennzeichnet sind, spiegelt sich die Bildung hoher Konzentrationen langkettiger Aldehyde und Fettsäuren während der letzten Fermentierungsphase (F7 und H7) im Score-Plot von 10 wider. Dieses Beispiel illustriert die effektive Verarbeitung und Auswertung komplexer chromatographischer/massenspektrometrischer Daten durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung.

Während die Erfindung besonders mit Verweis auf spezifische Ausführungsformen gezeigt und beschrieben wurde, versteht es sich für den Fachmann, dass verschiedene Änderungen in Form und Detail darin vorgenommen werden können, ohne den Geist und den Geltungsumfang der Erfindung, wie durch die angehängten Ansprüche definiert, zu verlassen. Der Geltungsumfang der Erfindung wird daher durch die angehängten Ansprüche angegeben, und alle Änderungen, die innerhalb des Bedeutungs- und des Äquivalenzbereichs der Ansprüche liegen, sollen daher einbezogen sein. DEUTSCHE ÜBERSETZUNG DER FIGUREN FIGUR 1; 3

INTENSITY	INTENSITÄT
SCAN NUMBER	ABTASTNUMMER

FIGUR 2

IQ VALUE

IQ-WERT

FIGUR 4a

RETRIEVE DATA	DATEN ABRUFEN
SELECT CHROMATOGRAM	CHROMATOGRAMM WÄHLEN
SMOOTH CHROMATOGRAM	CHROMATOGRAMM GLÄTTEN
BASELINE CORRECTION	GRUNDLINIENKORREKTUR
CALCULATE ENTROPY OF	ENTROPIE DES CHROMATOGRAMMS
CHROMATOGRAM	BERECHNEN
EVERYTHING PROCESSED?	ALLES VERARBEITET?

FIGUR 4b

ORDER CHROMATOGRAM	CHROMATOGRAMME NACH ENTROPIE
ACCORDING TO ENTROPY	ORDNEN
DISPLAY IQ VALUES	IQ-WERTE ANZEIGEN
SETH THRESHOLD	SCHWELLENWERT FESTLEGEN
DISPLAY RECONSTRUCTED TIC	REKONSTRUIERTES TIC-SPEKTRUM

SPECTRUM	ANZEIGEN
PLOT RECONSTRUCTED TIC	REKONSTRUIERTES TIC ZEICHNEN
GENERATE LIST OF IQ VALUES	LISTE VON IQ-WERTEN ERSTELLEN
DISPLAY CHROMATOGRAMS	CHROMATOGRAMME ANZEIGEN
DISPLAY SPECTRA	SPEKTREN ANZEIGEN
END	ENDE

FIGUR 5

DATA FILE INTEGER NUMBER OF m/z	DATENDATEI GANZZAHLIGE WERTE VON
TRACES VERSUS TIME	m/z-SPUREN ALS FUNKTION DER ZEIT
IQ SPECTRUM IQ VERSUS m/z	IQ-SPEKTRUM IQ ALS FUNKTION VON m/z
CHEMOMETRY BIOMETRY	CHEMOMETRIE BIOMETRIE
IQ INTENSITY SPECTRUM	IQ-INTENSITÄTSSPEKTRUM
INTENSITY VERSUS m/z SPECTRUM	INTENSITÄT ALS FUNKTION DES m/z-
USE MAX INTENSITY IF IQ>	SPEKTRUMS
THRESHOLD	VERWENDE MAX. INTENSITÄT FALLS IQ>
OTHERWISE INTENSITY = 0	SCHWELLENWERT
	ANDERENFALLS INTENSITÄT = 0
RECONSTRUCTED ION	REKONSTRUIERTES IONEN-
CHROMATOGRAM	CHROMATOGRAMM
RECONSTRUCTED ENTROPY	REKONSTRUIERTES ENTROPIE-
CHROMATOGRAM	CHROMATOGRAMM

FIGUR 7A, 7B

REL. ABUND.	RELATIVE HÄUFIGKEIT
TIME (MIN)	ZEIT (MIN)
PEAK	WERTSPITZE

FIGUR 8

SUPPLIER	BEZUGS QUELLE
BATCH	CHARGE

FIGUR 11

LOADINGS

LADUNGEN

Claims

Verfahren zur Datenverarbeitung und -auswertung, das die folgenden Schritte aufweist: (a) Korrigieren der Datenpunkte eines Chromatogramms bezüglich einer Basislinie, um ein korrigiertes Chromatogramm zu schaffen; (b) Glätten der Datenpunkte des Chromatogramms, um ein geglättetes, korrigiertes Chromatogramm zu schaffen; und (c) Bestimmen eines Entropiewertes für das geglättete, korrigierte Chromatogramm auf der Grundlage des Produktes aus einem Datenpunkwert und einem Logarithmus des Datenpunktwertes für mehrere Datenpunkte des geglätteten, korrigierten Chromatogramms, um die Datenverarbeitung zu vereinfachen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Entropiewert eines geglätteten, korrigierten Chromatogramms im Wesentlichen durch
definiert ist, wobei H der Entropiewert ist und p_i der Intensitätswert des i-ten Datenpunktes des geglätteten, korrigierten Chromatogramms ist.
Verfahren nach Anspruch 2, das ferner die folgenden Schritte aufweist: Wiederholen der Schritte (a) bis (c) für mehrere Chromatogramme eines Datensatzes; und Bestimmen eines Gütefaktors für ein geglättetes, korrigiertes Chromatogramm auf der Grundlage der Entropiewerte der mehreren Chromatogramme des Datensatzes, wobei der Gütefaktor im Wesentlichen durch IQ = 1 – (H/Hmax)definiert ist, wobei IQ der Gütefaktor, H der Entropiewert des geglätteten, korrigierten Chromatogramms und H_max der maximale Entropiewert der mehreren Chromatogramme des Datensatzes ist.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, das ferner den Schritt der Erzeugung eines rekonstruierten Gesamtionenstrom-Chromatogramms aus mehreren geglätteten, korrigierten Chromatogrammen, die auf der Grundlage des Gütefaktors der einzelnen geglätteten, korrigierten Chromatogramme ausgewählt sind, aufweist.
Verfahren nach Anspruch 4, das ferner den folgenden Schritt aufweist: Zuordnen eines Massensignal-Gütewertes zu dem einen Massensignal oder zu jedem von mehreren Massensignalen auf der Grundlage der Differenz zwischen Datenpunkwerten, die einem Massensignal vor den Schritten (a) und (b) entsprechen, und Datenpunktwerten, die einem Massensignal nach den Schritten (a) und (b) entsprechen; wobei der Schritt der Erzeugung eines rekonstruierten Gesamtionenstrom-Chromatogramms einschließt, dass ein oder mehrere Massensignale, die auf der Grundlage des Massensignal-Gütewertes der einzelnen Massensignale ausgewählt sind, aus dem rekonstruierten Gesamtionenstrom-Chromatogramm ausgeschlossen werden.
Verfahren nach Anspruch 1, das ferner den Schritt der Zuordnung eines Massensignal-Gütewertes zu jedem von einem oder mehreren Massensignalen auf der Grundlage der Differenz zwischen Datenpunktwerten, die einem Massensignal vor den Schritten (a) und (b) entsprechen, und Datenpunktwerten, die einem Massensignal nach den Schritten (a) und (b) entsprechen, aufweist.
Verfahren nach Anspruch 6, das ferner den Schritt der Bestimmung einer Korrelation zwischen jedem von mehreren Chromatogrammen eines Datensatzes und einem geglätteten, korrigierten Chromatogramm, dem ein oder mehrere Massensignale zugeordnet sind, die auf der Grundlage der Massensignal-Gütewerte der einzelnen Massensignale ausgewählt sind, aufweist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Schritt der Bestimmung einer Korrelation das Durchführen einer mehrdimensionalen Analyse der Chromatogramme des Datensatzes in Bezug auf die geglätteten korrigierten Chromatogramme, denen ein oder mehrere Massensignale zugeordnet sind, die auf der Grundlage des Massensignal-Gütewertes der einzelnen Massensignale ausgewählt sind, aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt der Glättung das Anwenden einer Methode einschließt, die im Wesentlichen durch einen Savitsky-Golay-Algorithmus definiert ist.
Verfahren zur Datenverarbeitung und -auswertung, das die folgenden Schritte aufweist: (a) Korrigieren der Datenpunkte eines Chromatogramms bezüglich einer Basislinie, um ein korrigiertes Chromatogramm zu schaffen; (b) Glätten der Datenpunkte des Chromatogramms, um ein geglättetes, korrigiertes Chromatogramm zu schaffen; und (c) Bestimmen eines Entropiewertes für das geglättete, korrigierte Chromatogramm auf der Grundlage des Produktes aus einem Datenpunkwert und einem Logarithmus des Datenpunktwertes für mehrere Datenpunke des geglätteten, korrigierten Chromatogramms; (d) Wiederholen der Schritte (a) bis (c) für mehrere Chromatogramme eines Datensatzes; (e) Bestimmen eines Gütefaktors für ein geglättetes, korrigiertes Chromatogramm auf der Grundlage der Entropiewerte mehrerer Chromatogramme des Datensatzes; (f) Zuordnen eines Massensignal-Gütewertes zu jedem der einen oder mehreren Massensignale auf der Grundlage der Differenz zwischen Datenpunktwerten, die einem Massensignal vor den Schritten (a) und (b) entsprechen, und Datenpunktwerten, die einem Massensignal nach den Schritten (a) und (b) entsprechen; (g) Bestimmen einer Korrelation zwischen jedem von mehreren Chromatogrammen eines Datensatzes und einem geglätteten, korrigierten Chromatogramm, dem ein oder mehrere Massensignale zugeordnet sind, die auf der Grundlage des Massensignal-Gütewertes der einzelnen Massensignale ausgewählt sind.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Schritt der Bestimmung einer Korrelation das Durchführen einer mehrdimensionalen Analyse der Chromatogramme des Datensatzes in Bezug auf das geglättete, korrigierte Chromatogramm, dem ein oder mehrere Massensignale zugeordnet sind, die auf der Grundlage des Massensignal-Gütewertes der einzelnen Massensignale ausgewählt sind, einschließt.
System zur Datenverarbeitung und -auswertung, das aufweist: eine Basislinienkorrektureinrichtung; eine Glättungseinrichtung, um die Datenpunkte eines Chromatogramms zu glätten; eine Entropiewerteinrichtung zur Bestimmung eines Entropiewertes für das Chromatogramm auf der Grundlage des Produktes aus dem Wert eines Datenpunktes und einem Logarithmus des Datenpunktwertes für mehrere Datenpunkte des Chromatogramms; und eine Auswahleinrichtung zur Auswahl von Chromatogrammen auf der Grundlage ihrer Entropiewerte.
System nach Anspruch 12, das ferner eine Summierungseinrichtung aufweist, die ein rekonstruiertes Gesamtionenstrom-Chromatogramm auf der Grundlage der von der Auswahleinrichtung ausgewählten Chromatogramme erzeugt.
System nach Anspruch 13, wobei die Auswahleinrichtung ferner so ausgelegt ist, ein oder mehrere Massensignale auszuwählen, und die Summierungseinrichtung so ausgelegt ist, ein oder mehrere ausgewählte Massensignale aus dem rekonstruierten Gesamtionenstrom-Chromatogramm auszuschließen.
System nach den Ansprüchen 12 bis 14, das ferner eine Korrelationseinrichtung aufweist, die eine Korrelation zwischen mehreren Chromatogrammen eines Datensatzes und einem Chromatogramm, dem ein oder mehrere ausgewählte Massensignale zugeordnet sind, bestimmt.
System nach Anspruch 15, wobei die Korrelationseinrichtung einen mehrdimensionalen Analysator aufweist, der eine mehrdimensionale Analyse wenigstens eines ausgewählten Chromatogramms und eines oder mehrerer ausgewählter Massensignale in Bezug auf mehrere Chromatogramme eines Datensatzes durchführt.
System nach den Ansprüchen 12 bis 16, wobei die wenigstens eine Einrichtung ein Computer ist.
Computerprogrammprodukt, das ein Computerprogramm zur Ausführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 11 beinhaltet.