JP2012502296A - Ｌｃｍｓ技術及びその使用 - Google Patents

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デ スタート デル ネダーランデン、フェルト．ドール デ ミニスター ファン フォルクスヘーゾンドハイド、フェルジイン アン スポルト
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Abstract

本発明は、改善したＬＣＭＳ技術、並びに免疫原性病原体関連エピトープの選択的同定及び特徴づけを行うための方法における当該技術の使用、並びにワクチン開発での当該技術の使用に関する。Ｔ細胞エピトープに関する知識ギャップを埋める１つの方法は、抽出されたペプチドサンプルをナノスケール質量分析によって、抗原提示細胞の表面のエピトープ提示を直接評価するための新規プラットフォーム技術、「免疫プロテオミクス」を適用することである。これは、病原体由来タンパク質に起因するＴ細胞エピトープの正確な分子的性状、多様性、存在量、動態、及びＰＴＭ等のエピトープの諸特性について偏りのない洞察を提供することができる唯一の方法である。したがって、かかるプラットフォーム技術、及び免疫プロテオミクスは、ワクチン学の本質的部分となるはずである。

Description

本発明は、改善したＬＣＭＳ技術、並びに免疫原性エピトープの選択的同定及び特徴づけを行うための方法における当該技術の使用、並びにワクチン開発での当該技術の使用に関する。
免疫原性病原体関連エピトープの免疫系Ｔ細胞による特異的受容体媒介型認識は、感染症に対する防御免疫の基礎である。十分に刺激性の状況下で初期認識が行われると、その後かかるエピトープは、特異的Ｔ細胞のクローン集団の増殖、分化、及び維持を促進する。感染期間中、かかるＴ細胞集団は病原体を不活性化し、及び排除する。その後、Ｔ細胞集団は強い収縮作用を受けるが、特異抗原と再度遭遇した際に迅速なメモリー応答が生じるようにわずかな一部分が維持される。この概念はワクチン開発で採用される。抗感染症ワクチンは、関連する病原体由来エピトープに免疫系を暴露して、防御レベルの特異的メモリーＴ細胞の生成を誘発する必要がある。
病原体関連Ｔ細胞エピトープは、病原体によりエンコードされたタンパク質に由来する小タンパク質断片であり、細胞内プロセシング後に主要組織適合遺伝子複合体（以後ＭＨＣと呼ぶ）分子のリガンドとして抗原提示細胞（以後ＡＰＣと呼ぶ）の細胞表面に露出する。ＭＨＣ分子によるペプチドエピトープの切除、存続、競合、及び最終的な提示に関係するプロセス及び酵素ついては、ほとんど分かっていない。２種類のＭＨＣ分子が、２つの機能的分類に属するＴ細胞に対するエピトープ提示に関わっている。ＭＨＣクラスＩ分子は、ＣＤ８＋Ｔ細胞に対してエピトープを提示し、一方、ＭＨＣクラスＩＩ分子はＣＤ４＋Ｔ細胞に対してエピトープをそれぞれ提示する。
将来のワクチンを設計するために、本発明者らはＴ細胞エピトープについて新規概念を必要とする。特に、非常に変化しやすい表面抗原を提示する病原体、又は（新規）新生病原体の防御的Ｔエピトープ及びその抗原はいまだなおとらえ難い。
本出願の発明者らは、現在の技術水準において、病原体関連エピトープの２種類の区別可能な分類、すなわちＭＨＣクラスＩリガンドーム及びＭＨＣクラスＩＩリガンドームに関する知見のギャップが、最新のワクチン学の主要会議においてなおも存在していることに今気付いた。
第１に、抗原ゲノム創薬（ｇｅｎｏｍｅ−ｂａｓｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）（逆ワクチン学（ｒｅｖｅｒｓｅ ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ））はワクチン学の扉を開き、病原体プロテオームの全体像を明らかにすることを我々に約束した。免疫インフォーマティクスの恩恵により、防御的抗原候補となり得る表面構造、例えば主要な細菌毒性因子、及びウイルス表面抗原等が、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで予測される。したがって、逆ワクチン学アプローチでは、実験動物による組換え抗原発現技術、及び免疫原性研究が必要となる。確かに、かかるアプローチにより、ＰｏｒＡに基づく髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の血清学的グループＢワクチンに代わる有望なワクチン候補が選択され、成功を収めている（Ｍａｓｉｇｎａｎｉら、２００２年）。しかし、逆ワクチン学アプローチによってもなお、エピトープに関する知見のギャップは存在する：（ｉ）病原体の内部タンパク質の場合、逆ワクチン学によって免疫優勢Ｔ細胞抗原は明らかにされない、及び（ｉｉ）動物における免疫原性から、ヒトにおける免疫原性及び免疫優勢性を予測することはできない。
第２に、候補タンパク質、アルゴリズム予測エピトープに由来する一連の合成ペプチドの利用に基づく古典的なＴ細胞エピトープ同定法、又はハイスループットＭＨＣ結合アッセイ及びＴ細胞アッセイにおける、オーバーラッピング合成ペプチドのような全プロテオームさえも、病原体関連エピトープを含む非常に多くのＴ細胞エピトープについて知識をもたらした。しかし、本発明者らは、本アプローチにも限界があると考えた：かかる従来法は、細胞内自然プロセシングの効果、すなわちエピトープの破壊と、それに対する生き残り、それぞれ選択と競合の効果の他、エピトープの諸特徴、例えば一次配列、多様性、正確な分子長及び長さの多型、存在量、自然変異体等の免疫原性に関する重要性、並びに最終的に感染の進行に伴う、及び異なる細胞型に基づくＴ細胞エピトープの動態の重要性を無視している。また、Ｔ細胞エピトープは、一般的に、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで予測可能な一次遺伝子配列の真の翻訳物とみなされている。しかし、リン酸化、グリコシル化、脱アミド化、メチル化、及びスプライシングを含む複数種類からなる一次タンパク質配列の翻訳後修飾（以後ＰＴＭと呼ぶ）、並びにゲノムのフレーム外翻訳は、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏプロテオミクスのみに基づき予測される場合よりも一層多様な集合からなる免疫学的に重要なエピトープをもたらし得るという証拠が蓄積している（Ｔｅｍｍｅｒｍａｎら、２００４年、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄら、２００６年）。
更に、上記「第２」で記載したような、Ｔ細胞エピトープを同定する技術は、通常、前回感染から生き延びることにより対象とする病原体に対して免疫を獲得した個人から単離した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ反応に依存することに本発明者らは気付いた。一般的に、病原体が稀又は新規出現の場合には、かかる個人は非常に稀である。したがって、新規感染症に関連したエピトープの同定は、これまでに感染した個人から得られたＰＢＭＣの使用に依存しない新規技術に基づく必要がある。
更に、病原体関連ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩエピトープリガンド（いわゆるリガンドーム）の同定は技術的に困難な課題であり、最高度の定量的感度及び定性的感度を必要とすることに本特許出願の発明らは気付いた。様々な研究室で先駆的な研究が行われ、液体クロマトグラフィー（ＬＣＭＳ）を併用した質量分析法がとりわけ最も有用な分析ツールであり、かかる種類のリガンドームについて偏りのない洞察をもたらすことを明らかにした（Ｈｕｎｔら、１９９２年）。しかし、現行のアプローチは、病原体由来タンパク質に起源する免疫原性エピトープの正確な配列、多様性、存在量、ＰＴＭ、及び動態等のエピトープの特徴について、偏りのない洞察を得るための免疫学的及び技術的に十分な感度及び選択性を実現できていない。ワクチン学では、病原体関連エピトープに関する知見のギャップを埋めるための「免疫プロテオミクス」に対するニーズがなおも存在する。これを前提とした場合に限り、真に免疫原性で防御性のエピトープを識別し、及び病原体が特異的に識別されるのを免れる仕組みを理解することができる。しかし、方法論に顕著な改善がなければ、今日までに分かっているエピトープという氷山の一角に潜むものについて理解を得ることはできない。
ＭＨＣエピトープ分析は極めてチャレンジングである。ＡＰＣ上のＭＨＣ分子は、多種多様の異なるペプチドエピトープを幅広い濃度範囲で提示する。システムの感度は、１０７〜１０８細胞を含むＡＰＣ細胞培養物から得られた抽出物中において、１細胞当たり１コピーが発現される、すなわち完全に回収されたとして、カラム上で１０〜１００アトモルのペプチド質量に等しい場合であっても、病原体関連エピトープを検出するのに十分である必要がある。システムの選択性は、何百、何千ものその他の無関係のＭＨＣエピトープの中から、かかるエピトープそれぞれを識別するのに十分である必要がある。
本特許出願は、感度、総合的なエピトープマイニングにおける対象範囲、及びダイナミックレンジの観点からカラム技術の進歩を開示する。したがって、本発明の目的は、高感度、高選択性、及び簡便な方式で、単一の分析用エピトープサンプル中の防御的Ｔ細胞により、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩリガンドとして認識される、免疫原性病原体関連エピトープを同定することができる、新規プラットフォーム技術を提供することにある。
かかる目的は下記３つの新知見を組み合わせることにより達成されると本発明者らは気付いた：（ｉ）非常に複雑なペプチド混合物中の痕跡量の未知ペプチド試料を検出し、同定するための改善された高感度で堅牢なプラットフォームＬＣＭＳ技術、これと併用される（ｉｉ）原タンパク質から関連する方式で各クラスの免疫原性病原体関連エピトープを単一溶液内に遊離するための、オーダーメードされたｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫学的実験デザイン、及び（ｉｉｉ）サンプル中の関連する病原体関連エピトープを迅速且つ確実に認識及び同定するのに役立つように（任意選択的に）適用される、抗原の選択的化学修飾又は物理修飾。
液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）デバイスは、米国特許出願公開第２００２／１４６３４９号により公知であり、これをそのまま、特にデバイス関連の態様に関連して本明細書に参考として援用する。
ＬＣＭＳデバイスの目的
サンプル中の分析対象物（本明細書ではペプチド）のクロマトグラフィー分離は、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）カラムを用いて行われる。好ましくは、かかるカラムの内径及び長さは下記のように設定される：
（ｉ）可能な限り最高感度が（ｉｉ）と組み合わせて得られる
（ｉｉ）最高分離効率
ナノスケールカラムを装備した改良型ＬＣＭＳを提供することが本発明の目的である。本出願ではＬＣＭＳデバイスの異なるいくつかの態様が改良されている。改良型ＬＣＭＳプラットフォームが提供される。改良型ＬＣＭＳプラットフォームでは、先行技術ＬＣＭＳプラットフォームよりも詳細な分析が可能となり得ることが証明された。
総分析時間を有意に延長可能にすることも、本発明の更なる目的でもある。
本発明の１つの態様は、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）デバイスに関する。ＬＣＭＳデバイスを用いた分析について改良法が提供される。当該デバイスの部品を製造する更に改良された方法も提供される。
本発明の別の態様は、クロマトグラフィー法、特に２次元液体クロマトグラフィーに関する。
本発明の更なる態様は、塩を含まない２次元高性能ナノスケール液体クロマトグラフィー分離技術に関する。
なおも更なる態様によれば、本発明はナノスケール液体クロマトグラフィーカラム、及び液体クロマトグラフィーの用途で、特に液体クロマトグラフィー質量分析で用いられる、かかるカラムの作製に関する。
本発明の別の態様は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）エミッター、及び液体クロマトグラフィー用カラムと共に用いる、好ましくは、エレクトロスプレーイオン化質量分析器（ＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ）に連結されるエミッターの製造方法に関する。
本発明の別の態様は、接続部、及びナノスケールＬＣカラムを接続する方法に関する。
本発明のなおも別の態様は、接続部、及びナノスケール液体クロマトグラフィーカラムにおける（デッドボリュームの無い）接続方法に関する。１つの実施形態では、小内径（キャピラリー）ナノスケール液体クロマトグラフィーカラムが提供される。
更なる態様では、本発明は、エピトープの同定法で本発明のＬＣＭＳデバイスを使用することに関連する。
なおも更なる態様では、本発明はエピトープを同定する方法に関し、同方法は、ａ）サンプルを調製するステップであって、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩエピトープ（リガンドーム）を含み、前記エピトープが抗原提示細胞によりプロセシング及び提示されるステップと、ｂ）ａ）で得られたサンプルを本発明のＬＣＭＳデバイス内で分析するステップとを含む。
１つの態様では、本発明は、本発明の方法に基づき同定されたエピトープを含む組成物を製造する方法に関し、当該方法は、当該エピトープを含む分子の化学合成及び組換え発現のうちの少なくとも１つを含む。
１つの別の態様では、本発明は、本発明のＬＣＭＳデバイス、及び／又は本発明のエピトープ同定法を利用することにより入手可能なエピトープに関する。
本発明の別の態様は、本発明に基づき同定されたエピトープの利用、又は前記エピトープを含む組成物の利用に関する。当該エピトープ又は当該エピトープを含む組成物は、かかるエピトープを担持する病原体によって引き起こされる疾患を予防及び／又は治療するための、又は哺乳動物の免疫状態を評価するためのワクチンを製造するために用いられる。
本発明の上記全ての態様は以下で議論される。
ＬＣＭＳデバイス
１つの実施形態では、ＬＣＭＳデバイスは、カラム、好ましくはクロマトグラフィーを実施するためのナノスケールカラムを含む。ＬＣＭＳデバイスは、毎分ナノリットル（ｎｌ／分）の範囲の流速で稼働するように配置、及び構成された液体クロマトグラフィー（ＬＣ）カラムを備える。かかるナノスケールカラムは、質量分析（ＭＳ）において改善した分析を可能にする高分離効率のクロマトグラフィー用カラムを実現する。
質量分析法がペプチドを同定するための強力な技術として登場して以来、質量分析法と組み合わされたナノスケール液体クロマトグラフィーは、低アトモル量で個々のペプチドの配列情報を提供する能力を有する技術であるが故に、今日、ＭＨＣ提示ペプチドを同定するための第一選択法である。しかし、本発明の実施形態を応用する場合、それはＬＣＭＳ用途に限られない。
一般的に、ＬＣＭＳデバイスの実施形態は、ポンプ、好ましくは高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）ポンプを有する混合ポンプ構成物を含み、１つの実施形態では、非常に正確な方法で所望の低流速混合溶媒系を生み出すための便利な方式として用いられる、フロー分離デバイス、分析用カラム、及び質量分析器と組み合わされる。
ＬＣＭＳデバイスは、エミッター、コーティング物、及び専用エレクトロスプレーイオン化源を備えるエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）ユニットを更に有する。ＬＣＭＳデバイスは各キャピラリーチューブを接続するための接続要素を備える。好ましい実施形態について以下に詳細に議論する。
液体クロマトグラフィー
物理的には、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）は、カラム、例えば内部に材料を収納するための空間（空孔）を有する円筒状の構築物内で実施される。当該カラム材料及び使用溶出液は、通常クロマトグラフィーの種類を決定する。空孔内で材料は保持され、これは固定相として定義される。好ましい実施形態では、サンプルは移動相に溶解される。サンプル及び移動相は固定相を通過し、ここでは分析対象物の分離が、その測定前又は分析前に行われる。以降のステップで、更なる単離も可能である。
サンプルを分画した後、好ましい実施形態では複数のペプチド、及びＬＣＭＳデバイス装置の好ましい実施形態では、個々のペプチドが質量分析器で同定される。質量分析器は、同定され得るペプチドに基づき、質量（Ｍｗ）及び構造上の情報（アミノ酸配列）を生成する。
ＬＣＭＳ分析
本発明の目的は、タンパク質分解されたタンパク質の多次元ＬＣＭＳ／ＭＳ分析により実現可能であり、同分析では、逆相（ＲＰ）分離と併用して強カチオン交換体（ＳＣＸ）による分画化が用いられた。かかる分析技法は、分析の分離効率及びダイナミックレンジを向上させるために併用される。
１つの実施形態では、第１次元分離用のアニオン交換粒子及びカチオン交換粒子からなる混合ベッドを用いたオンライン多次元ＬＣ法が提供される。
トラッピングカラム
１つの実施形態では、ＬＣＭＳデバイスは、固相抽出（ＳＰＥ）トラッピングカラム、又は分析カラム若しくは分離カラムの上流にトラッピングカラムを備える。トラッピングカラムでは、強カチオン交換（ＳＣＸ）樹脂若しくは弱アニオン交換（ＷＡＸ）樹脂、又はＳＣＸ樹脂及びＷＡＸ樹脂からなる混合ベッドが利用可能である。これはＬＣＭＳ／ＭＳ分析のうちの１つの次元を構成する。分析カラム下流にＣ１８逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーにより、第２次元の分析を付加することができる。更に、トラッピングカラムは、比較的大きなサンプルボリュームを、ナノスケールＬＣカラム内に比較的迅速にロード（移送）することができる。したがって、トラッピングカラムの内径は、分析カラムの内径とバランスが取れている必要がある。
１つの実施形態では、ペプチド（少なくとも１つのペプチドを意味する）を含むサンプルが、トラッピングカラム内に導入される。好ましくは、本明細書で後ほど特定されるように、エピトープを含むサンプルが同定される。１つの実施形態では、その後トラッピングカラム内に溶媒が注入され、同溶媒は結合したペプチドをトラッピングカラムから逆相Ｃ１８分析カラムに移送する。
１つの実施形態では、アニオン−カチオン交換体（ＡＣＥ）固相トラッピングカラムは、強カチオン樹脂及び弱アニオン樹脂の両方からなる混合物を含む。かかる混合ベッドは、Ｍｏｔｏｙａｍａ（Ｍｏｔｏｙａｍａら、２００７年）より公知であり、当該ベッドでは酢酸アンモニウムが結合ペプチドの回収に用いられる。
先行技術の問題点として、結合した分析対象物を回収するために酢酸アンモニウムを含むカチオン性の塩を使用すると、第２次元目のオンライン逆相ナノスケールＬＣシステム性能に悪影響を及ぼすことが挙げられる。
本発明の更なる態様によれば、第１次元目で結合した分析対象物を回収する際に、塩を含まない方法でかかる回収を実現することができる。塩を含まない溶液を使用すると、下流の逆相樹脂の劣化が予防される。
好ましくは、移動溶媒又は溶出溶媒は塩を含まない溶媒である。好ましくは、ギ酸（メタン酸）が移動溶媒として用いられる。換言すれば、ギ酸が結合したペプチドの溶出に用いられる。文献では、ギ酸の溶出強度はイオン交換樹脂からペプチドを回収するのに低すぎることが知られているが、驚くべきことに、ギ酸が移動溶媒として利用可能であることが実験で明らかとなった。かかる驚くべき効果に対する説明は、結晶構造を有する架橋分子の多かれ少なかれ開放した構造を含む、シリカ粒子上のＷＡＸ樹脂の構造に見出すことができるが、ここでは、ギ酸のＣＯＯ−基が結合した分析対象物（ペプチド）を貫通し、これと置換することができる。
１つの実施形態では、塩酸（ＨＣｌ）がかかる目的のために用いられたが、但し、これはそれほど好ましくない。
ＬＣＭＳデバイス、又はかかるデバイスの操作方法に関する１つの実施形態では、所定量（例えば、１０μｌ）のギ酸とジメチルスルホキシドとからなる、（濃度が）増強された等モル混合物が、トラッピングカラム経由で添加される。ＡＣＥトラッピングカラムから流出したペプチドは、逆相カラムスイッチングシステムのＣ１８逆相トラッピングカラム上で再トラップされる。
ＬＣ分析カラム
サンプル中の分析対象物（ここではペプチド）をクロマトグラフィー分離する場合、これはＬＣ分析カラムを用いることにより達成される。１つの実施形態では、カラムは少なくとも５０ｃｍ、好ましくは少なくとも７５ｃｍ、より好ましくは少なくとも８５ｃｍ、及びなおもより好ましくは少なくとも９０ｃｍの長さを有する。カラムの長さは、ＬＣカラム性能にとって、特にカラムの分離効率の観点から重要なパラメーターである。
１つの実施形態では、７０μｍ未満、好ましくは５５μｍ未満の内径を有する、及び１つの実施形態では、５μｍのＣ１８粒子が充填された５０μｍ未満の内径を有する、少なくとも７５ｃｍ、例えば９０ｃｍの分析カラムがＨＬＡ−Ａ２溶出サンプルの深さ分析で組み込まれた。サンプルは４時間グラジエントで流された。質量分析器は、１サイクル当たり１ＭＳ及び３回の連続したＣＡＤ ＭＳ／ＭＳスキャンを実施するようにプログラムされた。
１つの実施形態では、溶融シリカが用いられる。好ましい実施形態では、溶融シリカキャピラリーカラムが用いられる。当該カラムは、液体クロマトグラフィー用の充填物を含む。カラム充填するための好適な方法が提供される。
１つの実施形態では、ＬＣＭＳデバイスはナノスケールカラムを備える。１つの実施形態では、かかるカラムは、外径及び内径を有する溶融シリカ（キャピラリー）チューブを備えることができ、当該内径は、溶融シリカ全体に広がる空孔に関連する。好ましくは、ナノスケールチューブの外径は、１５０〜１４００μｍの範囲である。チューブの外径は、好ましくは２００〜８００μｍの範囲内にある。
カラムは、７５μｍ未満、好ましくは５５μｍ未満、より好ましくは５０μｍ未満、なおもより好ましくは３０μｍ未満、及びなおも更に好ましくは２６μｍ未満の内径を備える。内径が小さいほどＬＣＭＳデバイスの感度及び分離効率が改善する。内部空孔は、好ましくは５〜１００μｍの範囲内、及びより好ましくは１６〜７０μｍの範囲内、及びなおもより好ましい実施形態では１８〜５０μｍの範囲内の直径を有する。かかるキャピラリーチューブは、５〜５０ｎｌ／分の範囲内の、及びより好ましくは１０〜３０ｎｌ／分の範囲の流速で用いることができる。
ＬＣ分析カラムの製造
本発明の１つの態様によれば、内径が最大５５μｍの内部空孔を有する、少なくとも４５、好ましくは少なくとも７５ｃｍの長さのカラムを備えるＬＣカラムを製造し、カラムの一端にフリット（ｆｒｉｔ）を設け、及びカラム内に適する液体クロマトグラフィー固相材料を充填するための方法が提供されるが、当該液体クロマトグラフィー固相材料は、低粘度溶媒中のスラリーとして提供される。好ましい実施形態では、低粘度溶媒は、２０℃で０．３２ｃＰの粘度を有するアセトンである。
ＬＣ分析カラムの充填
本発明の更なる態様によれば、内径が最大５５μｍの内部空孔を有する、少なくとも４５ｃｍ、好ましくは少なくとも７５ｃｍの長さのカラムを備えるＬＣ分析カラムを製造し、カラムの一端にフリットを設け、及びカラム内に適する液体クロマトグラフィー固相材料を充填するための方法が提供されるが、当該カラムは充填中に振動が加えられ、又は超音波で処理される。１つの実施形態では、カラムは超音波処理される。
先行技術で公知の問題は、「長尺」ＬＣ分析カラムの充填スピードである。
１つの実施形態では、本発明に基づく改良された充填方法は、充填中に好ましくは超音波振動を用いてカラムに振動を加えるステップを含む。
１つの実施形態では、超音波振動は充填中に実施される。好ましくは、カラムに進入するスラリーに振動が加えられる。こうすることにより、充填効率が改善し、充填ベッドに空隙／空孔が生ずるのを阻止する。
１つのなおも更なる態様によれば、非粘性溶媒、例えばアセトンが、カラム充填法と併用される。好ましい実施形態では、非粘性溶媒はスラリーと併用される。好ましくは、イソプロパノールの少なくとも１／２未満の粘度の溶媒が用いられる。
１つの特定の実施形態では、溶融シリカカラムのフリット処理された末端部は超音波バス（例えば、Ｂｒａｎｓｏｎ ２００）内に配置される。１つの更なる実施形態では、超音波処理は、固相粒子が溶融石英シリカカラム内にフラッシングされた後に限り実施される。
１つの実施形態では、スラリーは、１ｍｌのアセトンに懸濁された少なくとも１５０ｍｇの逆相粒子を含む。充填中にカラムを通過するアセトンの線速度は、イソプロパノールに比較して、驚くべきことに７±１倍に等しい。
エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）及びエミッターの製造
１つの実施形態では、ＬＣＭＳデバイスは、エレクトロスプレー用のチップを有するエレクトロスプレーイオン化質量分析器（ＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ）と連結した液体クロマトグラフィーで用いられるエミッターを備える。当該チップは、コーティング物及びエレクトロスプレーイオン化源をやはり備えるエレクトロスプレーイオン化ユニットの部品であり、同チップは、好ましくは分析カラムより引き継いだナノリットル流速でエレクトロスプレーするように構成及び配置される。
公知のエミッターの問題として、チップ末端部に特に近接する金層の劣化が挙げられ、かかる劣化は脈動性のスプレーを引き起こし得る。特により長期間ＬＣＭＳ−ＥＳＩ稼働が可能となるようにエミッターを改良することが本発明の目的である。
好ましくは、チップ／エミッターは、１次コーティング物、好ましくは金等の貴金属製の導電性コーティング物を含むのが好ましい。２次コーティング物が保護層として用いられる。１つの実施形態では、２次コーティング物は導電性カーボンベースのコーティング物である。別の実施形態では、シリコンベースのコーティング物が２次コーティング物として用いられる。別の実施形態では、導電性ポリマーコーティング物が用いられる。
好ましくは、エミッターはチューブ、好ましくは溶融シリカキャピラリーチューブからなる。１つの実施形態では、エミッターは最大５５μｍ、好ましくは最大３０μｍの内径を有する。
本発明の１つの実施形態では、エミッター形成方法が提供される。当該方法は、チューブを加熱するステップ、及び内径が細くなったチップを形成するように延伸するステップを含む。このように内径を細くすると、ＬＣＭＳ分析の性能が更に高まる。１つの態様によれば、本発明はかかる改良型エミッターの製造方法を提供する。ＬＣＭＳ装置で用いられる改良型チップの製造方法は、当該チップを、特に当該チップ末端部を、導電性カーボンベースコーティング物でコーティングするステップを含む。先細りのチップ末端部近傍のチップ内径は、好ましくは約２〜３０μｍ、より好ましくは３〜１０μｍの範囲内である。１つの実施形態では、エミッター／チップは、先細りの末端部におけるエミッターの内径が最高１０μｍとなるように形成される。
１つの実施形態では、チューブは両端で引っ張られ、中央部分が加熱される。加熱中、ガラスは中央部付近でより柔軟となり、伸長された状態となり、そして最終的に引きちぎられる。かかる実施形態では、２つの先細りのエミッターが形成される。
１つの実施形態では、引き延ばされたチップは金等の貴金属でコーティングされる。その後、当該チップは、内径が細くなった出口が形成されるように、好ましくは先細りした（伸長した／引っ張られた）末端近傍で切断される。
１つの実施形態では、エミッターは分析カラムの一端に一体的に形成される。こうすることにより、分析カラム末端部及びエミッターの上流末端部間での接続が省ける。
１つの態様によれば、例えば液体クロマトグラフィーカラム、及びサンプルをエレクトロスプレーするための先細りの末端部等からサンプルを受容するための上流末端部を備える、ナノスケールフローのためのエミッターが提供されるが、当該エミッターはエレクトロスプレーイオン化ユニットの部品であり、当該エミッターは溶融シリカから形成され、且つ５５μｍ未満の内径を有し、当該エミッターの上記先細りの末端部には、金からなる導電性１次コーティング物及び２次導電性カーボンベースコーティング物が設けられる。
更に、例えば液体クロマトグラフィーカラム、及びサンプルをエレクトロスプレーするための先細りの末端部等からサンプルを受容するための上流末端部を備える、ナノスケールフローのためのエミッターが提供されるが、当該エミッターはエレクトロスプレーイオン化ユニットの部品であり、当該エミッターは溶融シリカから形成され、且つ最大５５μｍの内径を有し、当該エミッターの上記先細りの末端部には、シリコン合金又は導電性ポリマーを含むコーティング物が設けられる。
Ｔ−コネクター
ナノスケールＬＣＭＳデバイスでは、流路の内径に匹敵するような大きさのデッドボリュームはバンド（ピーク）幅に劇的な効果を及ぼすので、流路中のデッドボリューム、すなわち空隙を無くすことが重要である。拡散によるピークのブロード化は、システムの感度及びダイナミックレンジの両方に有害な影響を及ぼす。
１つの実施形態では、ＬＣＭＳデバイス流路内のデッドボリュームの存在量を、少なくとも顕著に低減する改良型接続要素が提供される。
したがって、一般的に固定されるチューブの外径に等しい直径を有する断面を持った内部ボリュームを備える接続要素が提供される。
チューブの突合せ接続
本発明の１つの態様は、高圧（＞４×１０４ｋＰａ）に耐え得るナノスケールカラムの突合せ接続方法を提供することに関する。
本発明の１つの実施形態では、接続されるチューブの末端部は、チューブの長さ方向に対して垂直に「直線切削」が得られるようにダイアモンドカッターを用いて切断される。かかる直線切削は、接続要素内でチューブ末端部の接合を可能にし、上流カラムから下流カラムの入口に流入する際に、少なくとも移動相についてデッドボリュームの存在量を低減する。直線端部を有するチューブの各末端部での接続は、一般的に突合せ接続と呼ばれる。直線切削は、バリやフィンの形成を無くす。
チューブの末端は接合状態にあるが、かかる突合せ接続は完全に又は強固に密閉されていないのでリークが生じる可能性がある。漏出容積は、３方向の接続要素からなる本実施形態の接続要素の第３の接続アセンブリに到達可能である。
本発明は、具体的な実施形態を用いて記載されるが、本発明が、提示された実施形態に限定されないことは明白であろう。より具体的には、提示された実施形態はＬＣＭＳ技術の応用形態である。しかし、本発明はＬＣＭＳにおける応用形態に限定されない。本発明は具体的な実施形態を用いて説明されるけれども、本発明は本明細書で開示される明示の特徴に限定されず、あらゆる黙示的特徴又は同等の特徴も含む。本出願には具体的な特許請求の範囲が添付されはするものの、本出願の開示は当該特許請求の範囲に限定されるものではなく、全ての黙示及び明示の特徴を含み、並びに後続の分割申請出願はかかる特徴との任意の組合せにおいて関連し得る。
本開示に基づく実施形態は併用可能であることは、熟練した読者にとって明白であろう。別途明示しない限り、本明細書に開示された実施形態のいずれも、別に開示された実施形態の特徴（の一部分）と併用可能である。
本発明は、後ほど図を参照しながら、より詳細に記載される。
出願全体を通じて、用語ＬＣＭＳは、ＬＣＭＳプラットフォーム技術、又はＬＣＭＳ装置と交換可能に用いられる。
ＬＣＭＳデバイスの使用
更なる態様では、エピトープを同定するために、本発明の上記態様で定義したようなデバイスの使用ができるようになる。
エピトープが何かは当業者にとって公知である。簡潔には、エピトープはタンパク質の断片、好ましくはペプチドである。通常、エピトープは、ＭＨＣクラスＩリガンドについて、約８〜１０個のアミノ酸からなる長さ、またＭＨＣクラスＩＩリガンドについて、約１１〜３４個、好ましくは１４〜１６個のアミノ酸からなる長さを有するが、但し、他の長さのペプチドも予想され得る。かかるペプチドは、ＰＴＭにより更に変化する場合がある（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄら、２００４年）。任意のエピトープについて、本発明のＬＣＭＳデバイスを用いて同定できる可能性がある。１つの好ましい実施形態では、ＭＨＣクラスＩ Ｔ細胞エピトープが同定される。別の好ましい実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ Ｔ細胞エピトープが同定される。当業者は、１つのサンプルを用いて数種類のエピトープが同定可能であることを理解するであろう。１つのサンプルを用いてＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ Ｔ細胞エピトープを同定することも可能である。
ＭＨＣクラスＩエピトープ
第１の好ましい実施形態では、Ｔ細胞エピトープはＭＨＣクラスＩエピトープである。当業者に公知の、及び「背景技術」ですでに説明したような、ＭＨＣクラスＩエピトープは、ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化するように、ＡＰＣによりＭＨＣクラスＩ分子上に提示されるエピトープである。ＭＨＣクラスＩエピトープは、好ましくは哺乳動物細胞内に発現するタンパク質に起因又は由来し、好ましくは細胞内感染中のウイルスに由来する。ＭＨＣクラスＩエピトープは、その他の非自己タンパク質にも由来し、これはＭＨＣクラスＩ分子に関連してＡＰＣ内でプロセシング及び提示される細菌性タンパク質であり得る。好ましくは、かかるタンパク質は、細胞内ライフスタイル、すなわち哺乳動物ＡＰＣ、好ましくはヒトＡＰＣに侵入し得ることを意味するかかるライフスタイルを採用し得る細菌に由来する。ＭＨＣクラスＩエピトープは、非自己の細菌性又はウイルス性のタンパク質にも由来する場合があり、同タンパク質はＡＰＣにより細胞外環境から取り込まれ、そして交差提示を経由してＭＨＣクラスＩプロセシングコンパートメントに到達し得る。また、ＭＨＣクラスＩエピトープは、宿主タンパク質に由来する場合があり、当該タンパク質の発現は新規誘発性であり、又はＡＰＣの細胞内感染により上方制御されており、したがって感染関連又は病原体関連である。
本発明のＬＣＭＳデバイスを利用しながら、いくつかの戦略を、ＭＨＣクラスＩエピトープを同定するために用いることができる。ウイルス性病原体の場合、第１に、ＭＨＣクラスＩエピトープを同定する必要のある、同定対象ウイルスを選択する必要がある。好ましいウイルスとして、非限定的にあらゆるウイルスが挙げられるが、かかるウイルスは前記哺乳動物で病状又は疾患を誘発することができる。好ましくは、当該哺乳動物はヒトである。ＭＨＣクラスＩエピトープが同定され得るヒトのウイルスとして以下のものが挙げられる：ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）等のレトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）；風疹ウイルス（ｒｕｂｅｌｌａｖｉｒｕｓ）；パラミクソウイルス科（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、例えばパラインフルエンザウイルス、麻疹、流行性耳下腺炎、呼吸器合胞体ウイルス、ヒトメタニューモウイルス等；インフルエンザウイルス等のオルトミクソウイルス科（ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）；フラビウイルス科（ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、例えば黄熱病ウイルス、デングウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）、ダニ媒介脳炎、セントルイス脳炎又はウェストナイルウイルス等；ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）、例えば単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス等；ブニヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）；アレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）；ハンタウイルス等のハンタウイルス科（Ｈａｎｔａｖｉｒｉｄａｅ）；コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）；ヒトパピローマウイルス等のパポバウイルス科（Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ）；狂犬病ウイルス等のラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）。ヒトコロナウイルス等のコロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）；アルファウイルス科（Ａｌｐｈａｖｉｒｉｄａｅ）、アルテリウイルス科（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ）、エボラウイルス等のフィロウイルス科（ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、アレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）、天然痘ウイルス等のポックスウイルス科（ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）、及びアフリカ豚コレラウイルス。麻疹ウイルス、インフルエンザウイルス、及び呼吸器合胞体ウイルスは、実験パートで実施例として取り上げる。
次のステップでは、選択したウイルスから得られたＭＨＣクラスＩエピトープを含む混合物が調製され、かかる混合物又はサンプルはＬＣＭＳデバイスに提供されるが、同デバイスは、前記ＭＨＣクラスＩエピトープ同定用として本明細書ですでに特定されている。ＭＨＣクラスＩエピトープを同定するために、いくつかの戦略が利用可能である。かかる好ましい実施形態（ＭＨＣクラスＩエピトープ）では、ＭＨＣクラスＩエピトープを含む混合物は、好ましくは前記エピトープを含む細胞に由来する。したがって、同定対象となるＭＨＣクラスＩエピトープがウイルスに起因又は由来する場合には、当業者はまず、哺乳動物細胞を前記ウイルスで感染させて前記混合物を得なければならない。これは、当業者にとって公知の技術を用いて実施可能であり、また麻疹ウイルス、又はインフルエンザウイルスを例とする実験において幅広く記載されている。好ましくは、ＡＰＣが感染対象として用いられる。ＡＰＣは細胞系に由来することも、又は哺乳動物、好ましくはヒトから単離することもできる。プロフェッショナルＡＰＣを単離及び同定する方法。使用される好ましいＡＰＣは、実験パートに記載するようにヒトＤＣ、より好ましくはヒト単球由来樹状細胞（ＭＤＤＣ）である。ＡＰＣは、好ましくは数日間（約４〜６日間）、任意選択により所定の栄養物を補充した、適する培地内で培養される。これに続き、公知の技法によりＡＰＣを選択したウイルスに感染させる。ウイルスの同一性に応じて、どの感染プロトコールに従わなければならないか、当業者にとって公知である。感染後、ＡＰＣは捕集、洗浄、計測、及び任意選択によりペレット化され、そして更に分析する前に凍結される。対照として、非感染ＡＰＣを用いることができる。実験デザインに応じて、少なくとも２つの並行培地中でＡＰＣを培養することが可能であるが、そのうちの１つは選択されたウイルスに感染している。並行培地間のその他の唯一の相違として、感染培地は、１３Ｃ６−Ｌ−ロイシン、及び／又は１３Ｃ５，１５Ｎ１−Ｌ−メチオニン、及び／又は１３Ｃ５，１５Ｎ１−Ｌ−バリン等の、安定な同位体で標識されたアミノ酸（単数又は複数）が５０％、並びにこれらに対応する天然アミノ酸であるＬ−ロイシン、Ｌ−メチオニン、及びＬ−バリンが５０％存在することにより識別されることが挙げられる。その他のアミノ酸、好ましくは実験のＨＬＡバックグラウンドに関連するＭＨＣアンカー残基に相当するアミノ酸も標識用途で選択可能である。１つのＭＨＣクラスＩエピトープ組成物を溶出する前に、感染ＡＰＣ及び対照ＡＰＣの１：１混合物（細胞／細胞）を使用すれば、正常不変の自己エピトープに関する同位体イオンクラスターと比較して、ウイルス感染関連自己エピトープに関する同位体イオンクラスターでは影響が異なるであろう。これにより、その後、ウイルス感染関連ＭＨＣクラスＩエピトープをより良く同定可能となる。
実験デザインに応じて、特定のＨＬＡバックグラウンドから得られるＡＰＣを使用するように選択することもできる。例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１バックグラウンドから得られたＡＰＣを使用する場合、これに関連して特異的に提示されるエピトープが同定されるであろう。また、数種類のバックグラウンドに関連して提示され得るエピトープを同定するために、異なるＨＬＡバックグラウンドから得られたＡＰＣを並行して使用することも選択可能である。ＡＰＣを１：１混合（細胞／細胞）した後には、当該細胞混合物は、更にエピトープ分析を実施する前に凍結可能である。
ＡＰＣが凍結されている場合には、分析を実施する際にＡＰＣは解凍される。その後、ＭＨＣクラスＩ分子を可溶化するために、公知の技法に基づきＡＰＣは溶解される。好ましい方法は、ＭＨＣクラスＩＩエピトープと題するセクションに記載する方法に類似する。より好ましい方法は、実験パートにも記載されている。溶出組成物内に存在する各エピトープを同定するために、本発明のデバイス内にダウンロードするのに適するＭＨＣクラスＩエピトープを含む組成物又はサンプルを調製する場合、かかる調製は、本発明のデバイスにダウンロードされるＭＨＣクラスＩＩエピトープを含む組成物の調製に類似する。
本発明のデバイスに適する組成物をダウンロードするステップ、及びＭＨＣクラスＩエピトープが同定されるように得られた結果を分析するステップは、当業者にとって公知の技法に基づき実施され、かかる技法は実施例で説明した。
かかるアプローチにより、哺乳動物に感染することが公知の、ある種のウイルスのＭＨＣクラスＩエピトープについて、おそらくはその全てが同定可能となる。また、同アプローチは、所定のＭＨＣクラスＩエピトープの相対的な量についても洞察をもたらす。また、これは、溶出組成物に含まれる複数の長さ変異体の存在が反映されるエピトープの長さ変化、並びにエピトープの翻訳後修飾（ＰＴＭ）を含むその他の特徴、又はある種のＨＬＡの状態において提示物上に現れるタンパク質多型又はエピトープ多型の役割についても洞察をもたらす。かかる技法は強力で、機能的ワクチンの開発に必要とされる。選択したウイルスが、既存療法に対して極めて迅速に自己を適応させることが公知のウイルスである場合には、本発明に含まれる好ましい実施形態は、１種類のウイルスの少なくとも２種類の株に由来する共通ＭＨＣクラスＩエピトープを同定することであるが、好ましくは、かかる好ましい実施形態では、当該ウイルスはインフルエンザウイルスである。
ＭＨＣクラスＩＩエピトープ
別のより好ましい実施形態では、Ｔ細胞エピトープはＭＨＣクラスＩＩエピトープである。本発明の好ましい利用形態では、ＭＨＣクラスＩＩエピトープは、ＡＰＣと共にエピトープ源を含む混合物を抗原パルス実験でインキュベーションし、そしてその後にＡＰＣによりプロセシング及び提示されたエピトープを含むサンプルを本明細書で定義するデバイスに提供した後に同定される。好ましくは、エピトープ源は、エピトープの原タンパク質である。
ＭＨＣクラスＩＩエピトープは、当業者が理解する通り、及び「背景技術」ですでに説明したように、ＡＰＣによりＭＨＣクラスＩＩ分子上に提示されてＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化させるエピトープである。本明細書で用いるＭＨＣクラスＩＩエピトープは、好ましくは非自己タンパク質に起因又は由来する。非自己タンパク質は、好ましくは、本明細書で後ほど特定する病原体から得られたタンパク質であり、同タンパク質は、前記病原体に感染している可能性がある哺乳動物にとって非自己である。本発明のＬＣＭＳデバイスを利用しながら、いくつかの戦略が病原体関連ＭＨＣクラスＩＩエピトープを同定するために用いることができる。第１に、ＭＨＣクラスＩＩエピトープを同定する必要のある病原体を選択しなければならない。好ましい病原体として、非限定的にあらゆる哺乳動物の病原体が挙げられ、かかる病原体は、前記哺乳動物において病状又は疾患を誘発することができる。好ましくは、当該哺乳動物はヒトである。ＭＨＣクラスＩＩエピトープが同定され得るヒトの病原体として以下のものが挙げられる：原核細胞又は真核細胞。好ましくは、原核細胞はバクテリアである。好ましいバクテリアとして、例えばヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）等のヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）等のヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）等の連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ）等のビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、並びに、例えばサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、カンピロバクター菌（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、及びエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）等を含むグラム陰性腸内病原菌、並びに炭疽病、ハンセン病、結核、ジフテリア、ライム病、梅毒、腸チフス、淋病、及びＱ熱を引き起こすバクテリア、が挙げられる。好ましいバクテリアはボルデテラ属又はナイセリア属に属する。より好ましいボルデテラ属として、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、パラ百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、又は気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）が挙げられる。より好ましいナイセリア属として、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）が挙げられる。病原体は寄生虫、例えばウシ脳性バベシア症原虫（Ｂａｂｅｓｉａ ｂｏｖｉｓ）、プラスモジウム原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、リーシュマニア種（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｓｐｐ）トキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、及びクルーズ・トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）等のトリパノソーマ属（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）等の原生動物であってもよい。好ましい真核生物として真菌類が挙げられる。より好ましい真菌類として、酵母菌又は糸状菌が挙げられる。好ましい酵母菌の例は、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）に属する。好ましい真菌類として、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）等のクリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、及びヒストプラスマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）が挙げられる。病原体は、本明細書で後ほど定義するウイルス性病原体でもあり得る。この場合、病原細胞と呼ぶ際には、好ましくはウイルス感染細胞を指す。
次のステップでは、選択した病原体に由来する１つ又は複数のＭＨＣクラスＩＩエピトープ（単数又は複数）の、１つの原タンパク質、又は複数の原タンパク質を含む混合物を調製し、抗原パルス実験においてＡＰＣと共にかかる混合物をインキュベーションし、及びＡＰＣによりプロセシング及び提示された１つのエピトープ、又は複数のエピトープを含むサンプルを、本明細書ですでに特定した前記ＭＨＣクラスＩＩエピトープを同定するためのＬＣＭＳデバイスに提供する。１つ又は複数の原タンパク質（単数又は複数）からなる数種類の混合物が、実験の目的、及び／又は選択した病原体について当業者が有する知識に応じて、及び／又は病原体の同一性に応じて利用可能である。
好ましい実施形態では、前記混合物は細胞に由来し、又は細胞を含む。より好ましくは、この場合の細胞は病原細胞である。好ましい病原体は本明細書ですでに特定されている。病原細胞に由来する混合物は、好ましくは全細胞調製物に由来する混合物である。前記病原体細胞についてエピトープ（単数又は複数）が全く、又はほとんど判明していない場合には、又は追加のエピトープ（単数又は複数）若しくは未知の病原体タンパク質に由来するエピトープ（単数又は複数）を、前記病原体について同定する必要がある場合には、かかるより好ましい実施形態（全細胞調製物に由来する混合物の使用）は通常魅力的である。病原体に由来するその他の既知又は未知のエピトープに対して優位にプロセシング及び提示されるエピトープとして既知又は未知の病原体関連エピトープを同定する必要がある場合には、かかるより好ましい実施形態はやはり魅力的である。また、哺乳動物のＡＰＣ、好ましくはヒトのＡＰＣが、複雑な病原体プロテオーム全体をｉｎ ｖｉｖｏで処理及び提示したときに、その結果に類似した全病原体関連ＭＨＣクラスＩＩリガンドームが１つの分析サンプルに含まれる必要がある場合には、かかるより好ましい実施形態は魅力的である。簡潔には、かかる混合物を調製するために、病原細胞は、２つの並行培養物内の適する培地内で、好ましくは静止期まで培養される。２つの並行培養物の唯一の相違点として、一方の培養物は１４Ｎ（天然窒素同位体）の存在で識別され、また他方は、１５Ｎ安定同位体の存在で識別されるということが挙げられる。ＡＰＣを用いた抗原パルス実験で１４Ｎ−及び１５Ｎ−標識病原細胞の１：１混合物を使用すると、好ましくは等しいコピー数の軽い（１４Ｎ）、及び重い（１５Ｎ）形態のエピトープが生成する。こうすることで、後にＬＣＭＳデバイス内で、病原体関連ＭＨＣクラスＩＩエピトープを認識するのを容易にすることができる。病原体に応じて、使用可能な適当な培地、また任意選択的に当該培地に追加の栄養剤を補充する方法について、当業者は理解している。通常、病原細胞はこれが静止期に達したときに、加熱により不活性化される。静止期とは、好ましくは光学濃度測定を用いて細胞のこれ以上の増殖が認められないことを好ましくは意味する。光学濃度は、好ましくは５９０ｎｍで測定される。その後、適する光学濃度（ＯＤ）、好ましくは０．６〜１の間の光学濃度を有する全細胞調製物を得るために、病原細胞はＰＢＳ等の生理的バッファー内で濃縮され得る。
別の好ましい実施形態では、前記混合物は細胞のタンパク質を含み、又は細胞、好ましくは病原細胞のタンパク質に由来する。病原細胞は、本明細書ですでに定義されている。好ましいタンパク質は、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）に由来するタンパク質であるＰ．６９パータクチンである。病原体に由来するタンパク質が、同定する必要がある、免疫原性の、且つ新規の、進化した、又は支配的なエピトープとしてすでに公知である場合に、この種の混合物が一般的に用いられる。タンパク質は、好ましくは精製された調製物に存在する。精製された調製物は、好ましくは、前記タンパク質を少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％（ｗ／ｗ）含む、又はこれから構成される調製物を意味する。タンパク質は、病原体から直接精製可能であり、又はこれをエンコードする遺伝子を、前記タンパク質を発現する別の宿主にクローン化することができる。かかる宿主の好例として、実験パートで記載するように大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）が挙げられる。タンパク質の入手方法は、調製物の純度が本明細書に規定する通りである限り本発明の具体的な方法に限定されない。前記タンパク質を入手するために、病原体を前段のように適する条件下で培養する。宿主細胞の場合、誘発剤を添加することにより前記タンパク質の発現を誘発することができる。好ましくは、大腸菌の場合、ＩＰＴＧが誘発剤として用いられる。前記タンパク質が細胞内で発現する場合には、前記病原体又は宿主細胞は当業者に公知の界面活性剤を用いて培養の最後に溶解される。次いで、前記タンパク質を含む細胞質内細胞抽出物が調製される。次に、前記タンパク質は前記細胞質抽出物から精製される。大腸菌の場合、前記タンパク質は封入体中に存在し得る。封入体中に存在するタンパク質の精製は、当業者にとって公知であり、実施例に記載するように実施可能である。次に、タンパク質調製物は、ＰＢＳ等の生理的バッファー内で濃縮若しくは稀釈可能であり、又は適する、好ましくは０．３〜２．５ｍｇ／ｍｌの間のタンパク質濃度を有するタンパク質調製物を得るために更に精製可能である。
別の好ましい実施形態では、混合物は細胞のコンパートメントに由来し、又は細胞、好ましくは病原細胞のコンパートメントを含む。病原細胞は、本明細書ですでに定義されている。好ましいコンパートメントは小胞であり、より好ましくは髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｉｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に由来する外膜小胞（ＯＭＶ）である。病原体由来の小胞が病原体の免疫原性の本体としてすでに公知で、且つ同定する必要のある新規で、進化した、又は支配的なエピトープである場合には、この種の混合物が一般的に用いられる。細胞のコンパートメントは、好ましくは、前段記載のタンパク質について説明したものと同様の精製されたコンパートメント調製物内に存在する。精製されたコンパートメント調製物は、好ましくは、前記調製物は、かかる調製物内に存在することが公知である１つの代表的なタンパク質について少なくとも５％を含む、又はこれから構成されることを意味する。前記調製物は、好ましくは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％（ｗ／ｗ）を含み、又はこれから構成される。髄膜炎菌に由来するＯＭＶに存在する代表的なタンパク質の例として、外膜タンパク質、ポーリンＡ（ＰｏｒＡ）が挙げられる。コンパートメントは、好ましくは病原体から直接的に精製される。コンパートメントの入手方法は、前記コンパートメントを含む調製物の必要純度が満たされる限り、本発明の特定の方法に限定されない。前記コンパートメント調製物を得るために、病原体は上記直前２段に記載するような、適する条件下で培養される。選択したコンパートメントの同一性に基づき、培養病原細胞からこれを単離する方法、及び任意選択によりこれを精製する方法について、当業者は理解している。ＯＭＶを含む調製物の好ましい調製方法は実施例に記載されている。次に、当該コンパートメント調製物は、コンパートメントを代表するタンパク質について好適な濃度を有する精製されたコンパートメント調製物が得られるように、ＰＢＳ等の生理的バッファー中で濃縮又は稀釈可能、又は更に精製可能である。例えば、前記コンパートメントとして、髄膜炎菌に由来するＯＭＶを使用する場合には、当該精製されたコンパートメントは、好ましくは、主要な代表的外膜タンパク質、ポーリンＡ（ＰｏｒＡ）を１．２〜２．４ｍｇ／ｍｌの範囲で含む必要がある。
ＭＨＣクラスＩＩエピトープ生成源を含むその他の任意の混合物が本発明で利用可能である。好ましくは、かかる生成源はタンパク質生成源である。ウイルス性エピトープの生成源を含む混合物も利用可能である。好ましいウイルスは本明細書で後ほど定義される。ウイルス性エピトープの生成源を含む混合物は、好ましくはウイルス性タンパク質を含む混合物であり、又は同タンパク質に由来し、又はウイルス性タンパク質の生成源、好ましくは複製型ウイルス性生物である。ＣＤ４＋Ｔ細胞を誘発するウイルス関連ＭＨＣクラスＩＩエピトープを同定する必要がある場合には、かかる好ましい実施形態は通常魅力的である。
ＭＨＣクラスＩＩエピトープの生成源を含む混合物を調製するのと並行して、選択された病原体の標的となり得ることが公知の哺乳動物由来のＡＰＣを含む調製物も調製される。好ましくは、ＡＰＣはヒトから得られる。ヒトからＡＰＣを単離する方法は当業者にとって公知である。これは、通常、ヒト全血の勾配遠心分離技術、好ましくは白血球アフェレーシスのバッフィーコート（ｌｅｕｋａｐｈｅｒｅｓｉｓ ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ）の勾配遠心分離を利用することにより実施される。ＡＰＣの同一性は、好ましくは、ＡＰＣマーカーに特異的な特異抗体を用いるフローサイトメトリーによりチェックされる。使用される好ましいＡＰＣはヒトＤＣ、より好ましくは実験パートに記載するヒト単球由来樹状細胞（ＭＤＤＣ）である。実験デザインに応じて、特定のＨＬＡバックグラウンドに由来するＡＰＣを使用することを選択することができる。例えば、ＨＬＡ−ＤＲ１バックグラウンドに由来するＡＰＣを使用する場合、この条件で特異的に提示されるエピトープを同定することとなる。また、数種類のバックグラウンドに関連して提示され得るエピトープを同定するために、異なる複数のＨＬＡバックグラウンドから得られたＡＰＣを並行して使用することも選択可能である。ＡＰＣとしてその他の細胞型、好ましくは、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、及びＭＤＤＣ以外の樹状細胞の系統等の、免疫系由来のプロフェッショナルＡＰＣを使用することも可能である。また、前記細胞の抗原処理及び提示バックグラウンドに関連して特異的に生成している、又は疾患状態に関連するエピトープ（単数又は複数）を同定するために、その他の哺乳動物細胞型もＡＰＣとして利用可能である。この場合、次にＡＰＣは、好ましくは適する培地内で数日間（約４〜６日間）培養されるが、同培地は栄養剤を補給することができる。培養の最後に、１つのエピトープ又は複数のエピトープ（全細胞、又はタンパク質、又は細胞のコンパートメント）からなる等量の１４Ｎ−及び１５Ｎ−源を含む１：１混合物が、ＡＰＣと共に１〜２日間、適する培地内で培養されるが、同培地は更に補給可能である。補給物はアジュバンドであり得る。好ましいアジュバンドはＬＰＳ（リポ多糖類）である。より好ましくは、ＬＰＳはウマ流産菌（Ｓ．ａｂｏｒｔｉｓ ｅｑｕｉ）に由来する。これは、いわゆる抗原パルス実験である。インキュベーションの最後に、ＡＰＣを捕集、洗浄、及び計測する。かかるＡＰＣは、更なるエピトープ分析を実施する前に凍結可能である。
ＡＰＣが凍結されている場合には、分析を実施する際にＡＰＣ細胞は解凍される。その後、ＭＨＣクラスＩＩ分子を可溶化するために、公知の技法に基づきＡＰＣは溶解される。好ましい溶解バッファーは、実施例で記載するように１％ＣＨＡＰＳを含み、緩衝化され、及びプロテアーゼインヒビターが補給されている。遠心分離後に得られた上清は、その後、１つのエピトープ又は複数のエピトープを含む溶出組成物を得るために、実施例に記載するようにいくつかのＣＮＢｒ活性化トリスブロック化セファロースカラム上で精製可能である。当該溶出組成物はメンブレンろ過により更に精製可能であり、当該溶出組成物中に存在する各エピトープを同定するために、本発明のデバイスにダウンロードされる適する組成物中又はサンプル中で濃縮及び再構成可能である。
本発明のデバイスに、適する組成物又はサンプルをダウンロードし、及び得られた結果を分析してＭＨＣクラスＩＩエピトープを同定する際には、これは当業者に公知の技法に基づき実施され、同技法については実施例で説明した。
かかるアプローチにより、哺乳動物のある種の病原体のＭＨＣクラスＩＩエピトープについて、おそらくはその全てが同定可能となる。また、同アプローチは、所定のＭＨＣクラスＩＩエピトープの相対的な量についても洞察をもたらす。また、これは、エピトープのその他の特徴についても洞察をもたらすが、かかる特徴としては、溶出組成物に含まれる複数の長さ変異体の存在が反映されるエピトープの長さの変化、並びにエピトープの翻訳後修飾（ＰＴＭ）、又はある種のＨＬＡの状況において提示物上に現れるタンパク質多型又はエピトープ多型（髄膜炎菌の領域４に関する実施例で広範囲に示すように）の役割が挙げられる。かかる技法は強力で、機能的ワクチンの開発に必要となる。
同定されたエピトープとその使用
更なる別の態様では、本発明は、本明細書に記載する任意の方法を用いて取得可能なエピトープを提供する。好ましいエピトープは、すでに本明細書において特定されている（実験データ中の表１〜８、配列番号１〜１５３を参照）。実施例で特定される各配列番号は、同定済みのエピトープを表している。カッコ内に特定される各同定済みのエピトープに隣接する残基は、好ましくはエピトープの一部として考慮されない。好ましくは、各配列番号では、本明細書に示すようなあらゆるＰＴＭが考慮されている。
麻疹ウイルスに由来する好ましいエピトープは、表１及び表２で特定され、配列番号１〜４５からなる群より選択される。より好ましいエピトープは、配列番号７〜４５からなる群より選択され、任意選択により、配列番号１〜６のうちの少なくとも１つと組み合わされる。
インフルエンザウイルス感染に関連する好ましいエピトープは、表３で特定され、配列番号４６〜４９、及び配列番号５２〜５８からなる群より選択される。
百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）に由来するエピトープは、表４及び表５で特定され、配列番号５９〜７２からなる群より選択される。
髄膜炎菌由来の好ましいエピトープは、表６、表７、及び表８で特定され、配列番号７３〜１５３からなる群より選択される。好ましいエピトープはＰｏｒＡタンパク質、すなわちポーリンＡの血清亜型Ｐ１．５−２，１０又はポーリンＡの血清亜型Ｐ１．７−２，４のいずれかに由来する。ＰｏｒＡタンパク質は、８つの領域に再分割可能である（表６を参照）：
−領域１はＰｏｒＡタンパク質、好ましくはポーリンＡ血清亜型Ｐ１．５−２，１０又はポーリンＡ血清亜型Ｐ１．７−２，４の最初の２０個のアミノ酸に関連する。
−領域２はアミノ酸３９〜５９に対応、
−領域３はアミノ酸９１〜１１１に対応、
−領域４はアミノ酸１３１〜１６８に対応、
−領域５はアミノ酸１９１〜２２４に対応、
−領域６はアミノ酸２９２〜３０６に対応、
−領域７はアミノ酸３１８〜３４９に対応、
−領域８はアミノ酸３４９〜３７２に対応する。
好ましい実施形態では、１つ又は複数のＰｏｒＡエピトープは下記のように使用される：任意選択により領域１、及び／又は領域２、及び／又は領域３、及び／又は領域７、及び／又は領域８に含まれるＰｏｒＡエピトープと組み合わせて、領域４に含まれるＰｏｒＡエピトープ、及び／又は領域５に含まれるＰｏｒＡエピトープ、及び／又は領域６に含まれるＰｏｒＡエピトープ。各領域に含まれる好ましいエピトープは、表６に示されている：
−領域１に含まれる好ましいエピトープは、配列番号７３〜７６で表され、
−領域２に含まれる好ましいエピトープは、配列番号７７〜７９で表され、
−領域３に含まれる好ましいエピトープは、配列番号８０〜９１で表され、
−領域４に含まれる好ましいエピトープは、配列番号９２〜９５で表され、
−領域５に含まれる好ましいエピトープは、配列番号９６〜９９で表され、
−領域６に含まれる好ましいエピトープは、配列番号１００で表され、
−領域７に含まれる好ましいエピトープは、配列番号１０１で表され、
−領域８に含まれる好ましいエピトープは、配列番号１０２〜１１０で表される。
より好ましい実施形態では、ＰｏｒＡエピトープは、任意選択によりその他の同定済みのＰｏｒＡエピトープの少なくとも１つと併用して、配列番号９２〜９５からなる群より選択される。
表７は、その他（非ＰｏｒＡ）のタンパク質から同定された髄膜炎菌由来エピトープを特定し、配列番号１１１〜１３４で表される。したがって、好ましい実施形態では、髄膜炎菌由来エピトープは配列番号１１１〜１３４からなる群より選択される。
より好ましい実施形態では、上記で特定されたＰｏｒＡエピトープは、表７で特定された別のタンパク質から同定された髄膜炎菌由来エピトープと併用される。最も好ましくは、ＰｏｒＡエピトープは、配列番号１１１〜１３４の少なくとも１つと組み合わせて、配列番号９２〜９５からなる群より選択される。
表８は、ＰｏｒＡ及び非ＰｏｒＡタンパク質から同定された髄膜炎菌由来エピトープを特定し、配列番号１３５〜１５３で表される。したがって、好ましい実施形態では、髄膜炎菌由来エピトープは配列番号１３５〜１５３からなる群より選択される。
より好ましい実施形態では、上記で特定された髄膜炎菌エピトープは、表８の髄膜炎菌由来エピトープと併用される。最も好ましくは、ＰｏｒＡエピトープは、配列番号１３５〜１５３の少なくとも１つと組み合わせて、配列番号９２〜９５からなる群より選択される。
表３、４、及び５に示す各エピトープ、並びに表２、６、７、及び８に示すその他のエピトープの主要部分は新規と考えられ、本発明のＬＣＭＳデバイスの独自性を高める。
かかるエピトープのいずれも、これが起因又は由来するところの病原体又はウイルスに対するワクチンに組み込まれる候補である。したがって、本発明は、かかるエピトープを担持する病原体により引き起こされる疾患を予防及び／又は治療するためのワクチンの製造に用いられる、本明細書に特定するエピトープを含む組成物にも関する。本発明には、１病原体について本明細書で特定する１、２、３、４、５、６、７、８、９、又はこれ以上のエピトープを含む組成物が含まれると理解される。任意選択により、公知のエピトープは、本明細書で特定するエピトープと併用可能である。
本明細書で定義するように、エピトープはある長さを有することにより同定される。前記エピトープを含む組成物は、好ましくはある長さに限定されない。前記組成物は、本明細書で定義する病原体に由来するペプチドを含むことができ、前記ペプチドは、好ましくはＰＴＭを含む天然の処理及び提示を経た同定済みの特徴を有する、同定済みのエピトープを含む。また、組成物は、コア配列として同定済みのエピトープを含むポリペプチドであって、且つｉｎ ｖｉｖｏ投与後の前記エピトープの提示に有利なアミノ酸配列が隣接したポリペプチドも含み得る。また、組成物は、複数の同定済みのエピトープ、及び隣接配列を含むポリペプチドも含み得る。しかし、かかる組成物によるｉｎ ｖｉｖｏ送達後のエピトープは、ＭＨＣクラスＩエピトープについて８〜１２個の範囲内のアミノ酸を、又はＭＨＣクラスＩＩエピトープについては１１〜３４個の、好ましくは１４〜１６個の範囲内のアミノ酸が含まれる長さを有するのが好ましい。前記アミノ酸配列は、好ましくは本明細書で定義する病原体により発現されたタンパク質に全体的又は部分的に由来する。したがって、好ましい実施形態では、本明細書で特定するエピトープを含むペプチドは、組成物内でワクチンとして用いられる。ＭＨＣクラスＩエピトープを含むペプチドは、８〜２０個の範囲の、又はそれ以上のアミノ酸からなる長さを有し得る。ＭＨＣクラスＩＩエピトープを含むペプチドは、８〜４０個の範囲の、又はそれ以上のアミノ酸からなる長さを有し得る。ＭＨＣクラスＩ又はＩＩエピトープを含む前記ペプチドは、エピトープ、及び天然の病原体タンパク質に由来する付加的な隣接配列、又は天然の病原体タンパク質に由来しない付加的な隣接配列を含み得る。
したがって、ペプチドは、同定済みのペプチドから構成され、同定済みのエピトープを含み、複数の同定済みのエピトープを含み、又は本明細書で特定するエピトープ配列の１つと、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の一致性を有するアミノ酸配列を有することができ、また好ましくは、かかるペプチドは、本明細書で特定する病原体に由来する天然のアミノ酸配列ではない。好ましくは、ペプチドは同定済みの配列の１つに対する同ペプチドの一致性によって定義され、また本明細書ですでに特定した長さを有する。同一性は、一致したアミノ酸の数が最も多くなるように両配列を並べた後に、２つの配列間で一致したアミノ酸の数を定義することにより計算される。
本明細書で特定したエピトープを含む組成物は下記事項を意味し得ること、すなわちある病原体について１つ又は複数のエピトープが本明細書ですでに特定される場合には、当該病原体の天然タンパク質がワクチンとして用いられるということを意味し得ることも本発明に更に含まれる。これは、好ましくは、病原体の新しい天然タンパク質が、少なくとも１つのエピトープを有するものとして本明細書で特定された場合である。或いは、前記天然タンパク質の一部を利用することもできる。本発明に関連して、「一部」とは、前記成熟タンパク質配列のアミノ酸数の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％を意味する。実験データでは（表２、４−８−）、いくつかの病原体固有のタンパク質が同定された。かかる表、又はその一部で特定する各タンパク質は、関連病原体に対するワクチンとして組成物内で利用可能である。
本発明で用いられる前記組成物の（ポリ）ペプチドは、容易に合成可能である。別の組成物は、１つ又は複数の同定済みエピトープをその最適な形態で含むポリペプチドに関する遺伝子（ＤＮＡ）コードを含み得る。当技術分野では、現在、前記（ポリ）ペプチド又は前記ＤＮＡを生成する多くの方法が知られている。
したがって、本発明は、本明細書ですでに定義した本発明のエピトープを含む組成物に更に関する。前記組成物は好ましくは医薬組成物であり、好ましくはワクチンとして用いられる。ワクチンは、哺乳動物の予防接種（免疫反応を高める）又はワクチン接種で利用可能である。組成物はアジュバンドを更に含み得る。アジュバンドとは、哺乳動物、好ましくはヒトを免疫するようにエピトープと組み合わせて用いたときに免疫系を刺激し、これにより、好ましくはアジュバンドそれ自身に対する特異的な免疫反応を引き起こすことなく、前記エピトープに対する免疫反応を誘発し、強化し、及び促進するあらゆる物質又は化合物を含めるように定義される。好ましいアジュバンドは、同一条件下にあるがアジュバンドが存在しない前記エピトープに対して引き起こされる免疫反応に比較して、対象エピトープに対する免疫反応を少なくとも１．５、２、２．５、５、１０、又は２０倍増強する。動物又はヒトの群においてアジュバンドにより生み出される対象エピトープに対する免疫反応について、関連する対照群と比較した統計平均増強効果を決定するための試験法を、当技術分野で利用することができる。アジュバンドは、好ましくは少なくとも２つの異なるエピトープに対する免疫反応を強化する能力を有する。本発明のアジュバンドは、通常、哺乳動物にとって外来の化合物であり、これにより哺乳動物にとって内因性の免疫刺激性化合物、例えばインターロイキン、インターフェロン、及びその他のホルモン等を排除する。
更に好ましい実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体を更に含む。当該医薬組成物は、薬学的に許容される安定化剤、浸透圧剤、緩衝剤、分散剤等を更に含む。医薬組成物の好ましい形態は、意図する投与様式、及び治療用途に依存する。医薬担体は、活性成分、すなわちエピトープ及び任意選択によりアジュバンドを患者に送達するのに適した、適合性のある、無毒のあらゆる物質であり得る。鼻腔内送達用の薬学的に許容される担体として、水、緩衝化生理食塩水、グリセリン、ポリソルベート２０、クレモフォール（ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ）ＥＬ、及び（カプリル／カプリン酸）グリセリルの水性混合物が挙げられ、また中性ｐＨ環境を提供するように緩衝化され得る。非経口送達用の薬学的に許容される担体として、滅菌緩衝化された０．９％ＮａＣｌ又は５％グルコースが挙げられ、任意選択により２０％アルブミンが補給される。非経口投与用の調製物は滅菌状態でなければならない。活性成分を投与するための非経口経路は、公知の方法、例えば皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、又は病変内、鼻腔内、皮膚内又は口腔経路による注射又は輸液に基づく。本発明の組成物は、好ましくはボーラス注射により投与される。筋肉内注射用の代表的な医薬組成物は、例えばリン酸緩衝化生理食塩水を１〜１０ｍｌ、及び本発明のエピトープを１〜１００μｇ、好ましくは１５〜４５μｇ含むように調製される。経口投与の場合、活性成分は液状の投薬形態、例えばエリキシル剤、シロップ剤、及び懸濁剤等の状態で投与可能である。経口投与用の液状の投薬形態は、患者許容性を高めるように着色剤及び香味料を含むことができる。非経口、経口、又は鼻腔内投与可能な組成物の調製方法は、当技術分野で周知であり、様々な情報源、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（第１５版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９８０年）等においてより詳細に記載されている（全ての目的のためにこれらをそのまま参考として援用する）。
本発明のエピトープのその他の利用
更なる態様では、哺乳動物の免疫状態を評価するために、本発明のエピトープを更に利用できるようにする。かかる態様では、病原体のエピトープを含む混合物は、当業者にとって公知の技術を用いて、前記哺乳動物に由来するＡＰＣ又はＴ細胞と共にｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベーション可能である。哺乳動物の免疫状態を評価するということは、好ましくは、前記哺乳動物がすでに対象病原体に感染しているかどうか、又は投与したワクチンによって、前記哺乳動物が前記病原体に将来的に感染してもなおもこれが保護されるかどうかを評価することを意味する。好ましくは、エピトープは本明細書に記載する任意の方法を用いて取得可能である。好ましいエピトープ、及び好ましい前記エピトープを含む組成物は、本明細書においてすでに定義されている。前記Ｔ細胞の活性化、又はＡＰＣと関連したエピトープの処理及び認識が検出された場合、それは前記哺乳動物が前記病原体からなおも保護されていることを示すと考えられる。Ｔ細胞の活性化は前記エピトープに対して特異的に関連するが、かかる活性化は増殖アッセイで評価可能、又はかかるＴ細胞により産生されたサイトカイン又はその他のエフェクター分子の増加により評価可能である。かかるそれぞれの方法は、当業者にとって公知である。前記利用は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ「防御相関（Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ（ＣｏＰ））」とも呼ばれている。
本文書で、及びその特許請求の範囲では、動詞「含む」及びその活用形は、当該単語に続く事項が含まれ、但し、特に記載されない事項でも排除されないことを意味する非限定的な意味合いで用いられる。更に、動詞「構成される」は、「から実質的に構成される」と置き換えることが可能で、本明細書で定義する生成物又は組成物は、具体的に特定されたもの以外の追加の成分（単数又は複数）、本発明の固有の特徴を変化させない前記追加の成分（単数又は複数）も含み得ることを意味する。更に、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」で引用する要素は、文脈から明らかに１つしか存在せず、たった１つの要素である必要がない限り、２つ以上の要素が存在する可能性を排除するものではない。したがって、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は、通常「少なくとも１つの」を意味する。
本明細書で引用する全ての特許及び文献資料は、これらをそのまま本明細書により参考として援用する。
下記実施例は例示目的に限定して提供され、決して本発明の範囲を限定しようとするものではない。
第１の実施形態におけるＬＣＭＳ装置の線図である。 第２の実施形態におけるＬＣＭＳ装置内の、エレクトロスプレーするためのエミッター、及び同エミッターがエレクトロスプレーと併用して用いられる分析カラムに取り付けられた状態を示す断面図である。 第２の実施形態に基づくチップを作製する方法を概略的に示した図である。 第２の実施形態に基づくチップを作製する方法を概略的に示した図である。 第２の実施形態に基づくチップを作製する方法を概略的に示した図である。 第２の実施形態に基づくチップを作製する方法を概略的に示した図である。 第３の実施形態に基づく接続要素を示す断面図である。 分析カラムを充填する方法における１ステップを示す断面図である。 分析カラムを充填する方法における第２のステップを示す図である。 第７の実施形態におけるトラッピングカラムを示す概略図である。 ＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩ分子により提示されたＴ細胞エピトープのアロケーションに関する質量分析認識パターンを表す概略図である。 複合サンプル分析で用いられるＬＣＭＳ技術において、いくつかの改良を組み合わせて利用した図である。 複合サンプル分析で用いられる高品質ナノスケールＬＣ技術の結果を示す図である。 ヒトＭＤＤＣに由来するＭＨＣリガンドームのＬＣＭＳ分析結果を示す図である。 ウイルス関連上方制御ＭＨＣクラスＩ自己エピトープについて、安定同位体標識ガイディングＬＣＭＳ同定法を利用した結果を示す図である。 複合した病原体の全細胞調製物に由来する病原体由来ＭＨＣクラスＩＩリガンドについて、安定同位体ガイディングＬＣＭＳ同定法を利用した結果を示す図である。 単一の組換え技術により発現したタンパク質に由来する病原体由来ＭＨＣクラスＩＩリガンドについて、安定同位体ガイディングＬＣＭＳ同定法を利用した結果を示す図である。 細菌性膜調製物に由来する病原体由来ＭＨＣクラスＩＩリガンドについて、安定同位体ガイディングＬＣＭＳ同定法を利用した結果を示す図である。 予期しないＰＴＭを伴ったＭＨＣクラスＩＩエピトープの同定を可能にする安定同位体の利用結果を示す図である。 ヒトＭＢ７１．５Ｔ細胞によるＰ１．５−２，１０及びＰ１．７−２，４「領域４」エピトープの差示的認識を示す図である。
図１〜７の詳細説明
図１はＬＣＭＳ装置１の図を概略的に示している。左手には注入バルブ２が概略的に示されている。バルブ２はポンプ、好ましくは混合ポンプと連結した供給部３と連結可能である。当該バルブは注入ループ５を備えるループ４にも連結される。当該注入バルブは、排出部６及び同７、及び次のバルブ、より具体的には図１の右手に概略的に示すいわゆるディーンズバルブ１０と連結した出口８に更に連結可能である。当該バルブは、フローの一部が出口８に分岐して流入可能な構造である。
ディーンズバルブ１０は、カラムフローを切り替え、分岐させ、及び方向決定して分析カラム１１、及び最終的に質量分析器１２に導くために用いられる。ディーンズバルブは、単純な６ポート切り替えバルブを用いて遠隔操作で分岐を行う。カラムヘッド圧力は、レストリクター１３の寸法により生み出される。ディーンズバルブは、プラグ１４、１５、及び排出部１６、１７と更に連結する。
１つの実施形態では、ＬＣＭＳデバイスは、ナノスケールポンプ構成部を備える。ポンプ構成部はポンプを備え、連続的に変化する二成分系溶媒についてｎｌ／分の範囲内の流速を実現することができる。別の実施形態では、従来型の高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）ポンプが用いられる。
ポンプ、好ましくはＨＰＬＣポンプ又は二元若しくは四元ポンプは下記能力を有する必要がある：
（ｉ）所定のカラム流速、又は正確なグラジエントフロー（少なくとも２種類の溶媒を正確、且つ十分定義された比で混合する）において、リニアグラジエント及び非遅延グラジエントを実現する。
（ｉｉ）固相抽出トラップは、（全体的な）分離効率に悪影響を与えてはならない；及び
（ｉｉｉ）ＥＳＩインターフェースでのピークのブロード化が生じない、又は最小限に抑えられる必要がある。ポンプのホールドアップ体積（Ｖｍ）と比較して低すぎる流速（Ｆ）でポンプを稼働すると、非リニアグラジエント及び遅延グラジエントの原因となるおそれがある。
１つの実施形態では、ナノスケールＬＣポンプが、本発明に基づくＬＣＭＳデバイスで用いられる。しかし、かかるポンプは高価であり、また非常に低い流速、すなわち３０ｎｌ／分未満では正確且つ安定なグラジエントを生み出すことができない。
１つの実施形態では、ポンプ構成部はポンプ、好ましくはＨＰＬＣポンプを備えるが、同ポンプは、混合溶媒系の所望の低流速を非常に正確に生み出す便利な方法として、フロー分岐デバイスと併用される。当該システムは、いわゆる割り込みガスクロマトグラフィーのためにこれまでに開発された遠隔方式切り替え機構に基づき、ディーンズ切り替えと呼ばれる。カラムフローの分岐及び方向決定は、１つの実施形態では、６ポート切り替えバルブ（ディーンズバルブと呼ばれる）を用いて遠隔方式で行われる。所望のカラムヘッド圧力は、トラッピングカラム上流に位置するレストリクターの寸法（長さ、内径）、及びポンプの１次出口流速に起因する。レストリクター及び後続する下流カラムを連結するためにＴ−コネクターを使用することも可能である。
ナノスケールＨＰＬＣシステムは、溶媒減圧脱気装置、溶媒混合ポンプ、好ましくは四元混合ポンプ、より好ましくは高圧混合二元ポンプ、少なくとも１０μｌのサンプルボリュームを注入可能なオートサンプラーを備える。好ましくは全ての接続用チューブは１０５μｍ未満、好ましくは５５μｍ、及びより好ましくは３０μｍ未満の内径を有する。チューブは不活性化処理されていない溶融シリカからなる。
ディーンズバルブ１０のうち、分岐及び方向決定システム部分は、２つの３方コネクター２０及び２１の中間に位置するトラッピングカラム１９である。トラッピングカラムは、最大５μｍのサイズを有する粒子を含む固定相ベッドを備え、また前記固定相ベッドの長さは、５ｍｍ、好ましくは少なくとも１０ｍｍ、及びより好ましくは少なくとも２０ｍｍであり、内径は約５０μｍである。
１つの実施形態では、ＬＣＭＳデバイスは、分析カラム１１の上流に固相抽出物（ＳＰＥ）トラッピングカラム、又はトラッピングカラム１９を備える。トラッピングカラムは、ディーンズバルブ１０と並行して配置可能であり、文献よりベント付きカラム又はＶ−カラムとしても公知のシステムである（Ｌｉｃｋｌｉｄｅｒら、２００２年）。トラッピングカラムは、比較的大きなサンプルボリュームをナノスケールＬＣカラム内に比較的速くローディング（移送）することができる。トラッピングカラム１９の内径は、分析カラム又は分離カラム１１の内径と釣り合っている必要がある。
内径（ＩＤ）の大きなトラッピングカラム１９を使用すると、移動相の線速度は最適値の約１ｍｍ／秒よりもはるかに落ち込むことから、トラッピングされた化合物が移動するとき、分析カラム１１上で比較的ブロードなバンドを引き起こす。トラッピングカラム１９内の移動相の線速度は、カラム／トラップＩＤ比の二乗に比例する、又は線速度１ｍｍ／秒で稼働する５０μｍＩＤの分析カラム１１と併用した、３００μｍＩＤ、及び１００μｍＩＤのトラッピングカラム１９の場合、それぞれ０．０３及び０．２５ｍｍ／秒となる。更に、トラッピングカラム１９のＩＤが大きいと、トラッピングカラム１９及び接続チューブのボイドボリュームは、溶出プロセスが開始可能となる前にカラムを通過してしまう必要があるので、顕著な遅延の原因となる。
１つの実施形態では、分析カラム１１は最大３μｍのサイズの粒子を含む固定相ベッドを備えることができ、前記固定相ベッドの長さは２５ｃｍ、好ましくは少なくとも５０ｃｍ、及びより好ましくは少なくとも９５ｃｍであり、また内径は約２５μｍである。かかるカラムの末端部は、導電性ナノスプレーチップ又はエミッターと突合せ接続しており、その例を図２（約２５μｍの内径を有し、先細りのチップ末端部近傍の内径が３．５μｍまで細くなった溶融シリカチューブを備える）に示すが、ここでは本発明に基づく金−カーボンコーティング物を有する。かかる分析カラム１１を備えたＬＣＭＳ装置は、約３０ｎｌ／分の流速で稼働することができる。ペプチドサンプルを分析する前に、クロマトグラフィーシステムを確認することが特に推奨される。
１つの実施形態ではタンデム型の質量分析器１２が用いられる。当該質量分析器は少なくとも１０，０００ＦＷＨＭの質量解像度で稼働することができる。質量スペクトルは、スキャン速度が少なくとも０．９秒／スキャンのプロフィール連続モードで取得される必要がある。質量決定精度は百万分の１００以上である必要がある。
サンプル成分は、分析対象物のいくつかの物理的、化学的、又はその他の固有の特性、例えば分子サイズ、極性、電荷等に基づき分離され得る。いくつかの実施形態では、いくつかの方法（数種類のクロマトグラフィー）が、例えば分子篩クロマトグラフィー、イオン相互作用、又はイオン交換クロマトグラフィー、特異的分子相互作用（例えば、抗体−抗原）等による方法が組み合わされる。また、数種類のかかるクロマトグラフィー法が、サンプルを分画するために利用可能である。
第２次元として用いられる逆相クロマトグラフィーと直交関係にあるＳＣＸクロマトグラフィーを第１次元として採用すると、分離効率が顕著に向上する。２−次元ＬＣＭＳ（２Ｄ−ＬＣ／ＭＳ）の最高性能は、オフラインモードで操作する場合に得られるが、それは当該操作は、両分離システムを独立に最適化する際に、最大の自由度をもたらし、また同操作は分離効率に関するあらゆる障害を排除するためである。ＳＣＸクロマトグラフィーも、ペプチドサンプル中になおも存在し得る、またペプチドの溶出期間中に妨害する可能性の有るあらゆる残留界面活性剤、又はバッファー成分を除去するのに重要である。かかる化合物はボイドボリュームにおいてＳＣＸカラムから溶出し得るので、したがって一般的にペプチドを含まない最初の分画に現れる。
ＬＣカラムの分離効率は、１回の操作で分離可能な成分の数（すなわちピーク容量）で表すことができる。カラム分離効率は、カラム長（Ｌ）と段高さ（Ｈ）との商である。
Ｖａｎ Ｄｅｅｍｔｅｒ（Ｖａｎ Ｄｅｅｍｔｅｒら、１９５６年）によれば、理論的な段高さ（Ｈ）は、固定相粒子の粒子サイズ（ｄｐ）に比例的に依存する。段数の別のパラメーターは、移動層の流速であり、これは最適な線速度（約１ｍｍ／秒）を有する一次関数と双曲線関数との複合関数である。１つの実施形態では、カラムヘッド圧力は、移動相がほぼこの値の線速度を有するように制御される。
ＬＣＭＳ装置は当業者にとって公知であり、同者は非常に多くの代替装置も可能であるという事実に精通している。図１に示す装置は、非常に多くの候補装置がある中の１例に過ぎない。
図２は、概略的に示すエレクトロスプレーイオン化ユニット５００の一部であるエミッター３０のチップを表している。点線で示すユニット５００は、５０２を介してエミッター３０と接続されている、特にコーティング物と接続されている電流源５０１を備える。
エミッター３０は、コネクター３２を用いて分析カラム３１の末端部に接続されている。コネクター３２は概略的にしか表されていない。図２は、カラム３１の末端部３３に接続されたエミッター３０の断面図を表す。特定の実施形態では、エミッター３０及びカラム末端部３３の間の接続は、突合せ接続である。更なる実施形態では、カラム及びチップの間で好適な突合せ接続を可能にするように、カラム３１の遠位末端部３３、及びエミッター３０の近位末端部３４を作製するためにダイアモンドカッターが用いられる。カラム３１の外径３６は、好ましくは２００〜８００μｍの範囲である。チューブは溶融シリカを含み得る。溶融シリカチューブでは、内部空孔３７は、好ましくは約１０μｍ〜約２００μｍ、より好ましくは１５μｍ〜５０μｍの範囲の内径３８を有するように形成される。
エミッター３０は、カラム末端部３３と接続される近位末端部３４、及び先細りの形状を有する遠位末端部３９を備える。先細りの末端部３９は、細くなった外径と細くなった内径の両方を有する。
図３ａ〜３ｄでは、提示されるエミッター３０のチップを作製する方法の例を示す。第１ステップでは、図３ａに示すように、溶融シリカチューブ４３のコーティング物４２が、例えばブタントーチ４４を用いて（少なくとも部分的に）除去される。次のステップでは、溶融シリカ４３の加熱された末端部４６は（図３ｂに概略的に示す手段により）、４５の方向に引っ張られ、エミッター３０は前記方向に延長又は伸長される。チューブは互いに圧迫され、内部空孔は細くなり、最終的に閉鎖される。次に、溶融シリカチューブは、その外部表面にコーティング物４７が設けられ、電流が流れ、そしてその先細りの末端部４６に達するようにして、エレクトロスプレー操作を可能にする。チップの先細り末端部４６近傍のチップ内径４１は、好ましくは約２〜３０μｍ、より好ましくは３〜１０μｍの範囲である。内径が小さくなるほど、その後の質量分析感度を更に向上させる。
図３ｃでは、すでに記載したチップ上へのコーティング物の塗布を表している。１つの実施形態では、金等の貴金属を含む第１のコーティング物がチップ４６上に塗布される。しかし、金コーティング物はエレクトロスプレー中に劣化し、長期間持続した導電性を提供することができないことが判明している。二者択一的に、又は付加的に、カーボンベースの導電性コーティング物がチップ４６上に塗布される。かかるコーティング物は、スプレープロセスによりチップ上に塗布可能である。１つの実施形態では、カーボンはエアゾール沈着法又は蒸着法を用いて沈着される。カーボン粒子はイソプロパノール中で懸濁可能である。
本発明に基づく１つの実施形態では、コーティング物を塗布するステップは１回又は１回よりも多く繰返すことができる。１つの実施形態では、複数のコーティング物が互いに重なり合って塗布される。
好ましくは、コーティング物を組み合わせたものが、チップをコーティングするために用いられる。１つの実施形態では、金コーティング物が最初に塗布され、その後にカーボンベースの導電性コーティング物が塗布される。更なる実施形態では、金コーティング物が最初に塗布され、次に当該金コーティング物はカーボンベースの導電性コーティング物の層で被覆される。カーボンベースの導電性コーティング物の層は、Ｌｅｉｔ−Ｃ（商標）カーボン粒子５０ｍｇをイソプロパノール１ｍｌに懸濁して調製し、そしてこれをエミッター（すなわちチップ上）にスプレーすることにより塗布される。Ｌｅｉｔ−Ｃ−ｐｌａｓｔ（商標）は、高導電性で永久的な可塑性を備えた接着剤で、Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＥＭＳ）、Ｈａｔｆｏｒｄ、英国より入手可能である。
１つの実施形態では、導電性耐酸化性材料が、チップの先細り末端部にある金コーティング物上の更なるコーティング物として用いられる。１つの実施形態では、カーボンベースの導電性コーティング物が用いられる。
別の実施形態では、シリコン合金が用いられる。
更なる実施形態では、導電性ポリマーが本発明に基づくコーティング物又は追加のコーティング物として用いられる。
追加のコーティング物は金コーティング物に接着可能である。追加のコーティング物は保護を提供する。１つの実施形態では、コーティング物はエミッターの先細り末端部にスプレーされる。別の実施形態では、耐酸化性コーティング物が先細りの末端部に塗布される。イソプロパノール等の適する溶媒がスプレーするために用いられる。別の実施形態では、エミッターの先細り末端部にスプレーされるスラリーは、イソプロパノール１ｍｌ中に導電性カーボンセメントを３０〜７０ｍｇ、好ましい実施形態では４５〜５５ｍｇ含む。
図３ｄに示す次のステップでは、エミッター３０の閉鎖した末端部４８は、カッター４９、例えばダイアモンドカッターを用いて取り除かれる。切断することにより、内径が細くなった先細りの末端部３９を有するエミッター３０が得られる。チューブ４３を圧迫する効果とチューブ４３の自由末端部において引張り力を加える効果が組み合わされて、内径はスムーズに減少する。
１つの実施形態では、溶融シリカチューブ用のコネクターが、トラッピングカラム及び／又は分析カラムの各部分を接続するために用いられる。ＬＣＭＳ装置では、３方コネクター、又はＴ−コネクターが、カラム又はバルブを接続するために用いられる。先行技術では、Ｕｐｃｈｕｒｃｈ（登録商標）の３方コネクター（当技術分野ではＵｐｃｈｕｒｃｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｏａｋ Ｈａｒｂｏｒ、ＷＡより入手可能なスルーホールユニオンとして公知）が用いられる。好ましくは、外径及び内径を有し、内径が空孔を画定する溶融シリカからなるチューブが、かかるコネクターを用いて接続される。好ましい実施形態では、コネクターはスルーホールコネクターである。
１つの実施形態では、ＬＣＭＳデバイスは、内径２５μｍのナノスケールカラムを備える。ペプチドを用いる応用形態では、かかるペプチドは、一般的に１ナノリットル以下の容積の濃縮したバンドの状態でかかるカラムを通過する。
別の実施形態では、ナノスケールチューブ用のコネクターにはデッドボリュームがなく、これは、好ましくは４００ｂａｒ（すなわち４×１０４ｋＰａ）を超える圧力で用いるのに適する。
１つの実施形態では、コネクターは改変されたＵｐｃｈｕｒｃｈスルーホールＴ−コネクターである。
１つの実施形態では、Ｔコネクターは少なくとも１つの、おそらくは２つのフェルール、好ましくは３つのフェルールを備える。チューブ、及び特にマイクロキャピラリーナノスケールカラムが、当該フェルールの空孔に受容可能である。こうして、接続要素の内部ボリューム内にチューブを嵌め込むことが可能となる。フェルールの空孔は適するサイズである。フェルールの空孔は、一般的にフェルールの空孔に受容されるチューブの外径と等しい又はこれに近い内径を有するスルーキャビティー（ｔｈｒｏｕｇｈ ｃａｖｉｔｙ）である。フェルールの空孔は、挿入されたチューブのチューブ外径と摩擦接触する。
コネクターと併用されるフェルールは、チューブの空孔と接続要素の空孔とを一致させるために用いられる。接続要素は、フェルールを固定するための受容用の空孔を備え、当該固定用の空孔とフェルールは共同的に働き、また脱着可能である。接続した状態では、フェルールは、内部空孔が接続要素の内部空孔に適合するようにチューブを配置する。好ましくは、当該接続要素は、２つのフェルール固定用空孔コンビネーションを備える。現在のＵｐｃｈｕｒｃｈ設計では、コネクターの内部ボリュームはデッドボリュームを含む。
現在のＵｐｃｈｕｒｃｈ設計では、内部空孔はかなり拡大されている。これは当業者の公知技術とは反対である。
図４は、図１に基づく装置１の３方接続要素又は切り替え要素２０、２１の詳細を示している。当該図の縮尺は一定ではない。より具体的には、ここに示す要素の直径の比は、ここに示す比に限定されない。
３方接続要素２０は３つのフェルール５１〜５３を備える。フェルールとは、３方コネクター２０の３つの末端部で受容用の空孔と嵌合する本体である。１つの実施形態では、３つのフェルールは異なるサイズを有する。取り付けられるフェルールは、その形状が空孔の形状に本質的に関連するため、当該空孔にセルフアライメントし得る。より具体的には、ここに示す実施形態では、フェルールは、空孔の円錐状の形状に関連して円錐状の形状を有し得る。セルフアライメントすることにより、フェルールの受容用の空孔を接続要素２０に関して事前決定された位置に配置できるようにする。
フェルール５１〜５３は空孔を備えることができる。チューブ５４〜５６の外径、及び当該空孔の内径は、フェルールがいずれのチューブ５４〜５６をもその空孔内に受容できるように調節されている。
フェルール５１〜５３は、接続した状態で示されており、接続要素２０、２１の各空孔内に収まっている。キャップ５７〜５９が設けられるが、当該キャップは、コネクターに当該キャップ５７〜５９を固定するための固定システム（詳細に示していない）を備え、これによりフェルール５１〜５３の位置を固定する。１つの実施形態では、固定システムは係止システム、例えばスクリュー状の接続部を備える。固定システムは、接続状態においてフェルール５１〜５３を固定及びクランプするように構成及び配置されてもよく、その結果チューブ５４〜５６の外径上にクランプ力がもたらされる。こうしてチューブ５４〜５６はその各位置で係止される。
接続要素２０、フェルール５１〜５３、及びキャップ５７〜５９は、様々な製造技術を用いて、特に射出成形により製造可能である。
チューブ５４、５６はフェルールに収納された状態にあり、当該フェルールは実質的にアライメントされて接続要素に接続されている。これは、チューブ５４、５６の内部空孔もやはり実質的にアライメントされていることを意味する。
別の実施形態では、接続要素の内部ボリュームは、好ましくはコネクターのＴ字形本体の内部ボリュームは、チューブを収納するためのフェルールの空孔に一致する。かかる改変された接続要素、好ましくは接続要素の内部本体の一部が掘削により取り除かれたＵｐｃｈｕｒｃｈ要素では、チューブが接続要素の水平方向の２つの各末端部で直線状に配置するのを可能にする接続要素が提供され、当該チューブは、当該接続要素内、すなわちコネクター、好ましくは３方コネクターの内部空孔内で、その末端部を突き合わせた状態で配置可能となる。
ここに示す実施形態では、溶融シリカチューブ５４、５６の末端部６０、６１は、フェルール５１、５３が接続状態にあるときに、チューブ５４、５６は突合せた状態になるのを可能にする直線切削が得られるように、ダイアモンドカッターを用いて切断されている。こうして、接続要素２０の本体内にデッドボリュームが生ずるのを防止する。突合せ接続であっても、チューブ５４、５６内を経由する液体は、突合せ末端部を通って漏出する可能性があり、チューブ５５を経由する液の通過を可能にする。
別の実施形態では、接続要素はフェルールを接続要素と固定するための固定要素を備える。１つの実施形態では、当該固定デバイスはクランピング手段を備える。１つの実施形態では、フェルールをクランピングすると、その結果フェルール内に収納されているチューブをその位置でクランピングする。当該固定デバイスは、チューブ及びフェルールをその位置で固定するように構成及び配置される。
更なる実施形態では、１つのチューブを構成する２つのピースが３方コネクターに接続され、ここでは接続要素の入口側ポート及び出口側ポートが直線状に配置し、そして第３のコネクターはかかる直線に対して垂直に接続されている。当該チューブは突合せ接続位置で配置されるが、但し、第３のコネクターは接続チャンネルを有し、液体クロマトグラフィーで用いられる高圧により、漏出した容積がかかる接続チャンネルに到達可能となるので、かかる突合せ接続は、接続部材の中央部において正確に中心に位置する必要がない。
図５及び図６は加圧容器又はボンベ７０を表す。ボンベ７０はクロマトグラフィー粒子の懸濁物を、好ましくは懸濁したクロマトグラフィー固定相を含むバイアルを収納することができる。
１つの実施形態では、チューブは、例えば温度がプログラムされたオーブン内に当該チューブを配置することにより加熱される。好ましくは、プログラムされた温度が用いられる。１つの実施形態では、最初の温度は３０℃設定で５分間継続されるが、その後１５分間のうちに１００℃まで高められ、そしてかかる温度は５時間維持される。次いで、フリット及びチューブは周囲温度まで冷却される。その後、硬化したフリット及び溶融シリカは室温まで冷却される。次に、溶融シリカカッターを用いてセラミックフリットを切り取り、約１〜２ｍｍの長さにする。好ましくは直線切削される。
別の実施形態では、カラム充填することによりナノスケールＬＣカラムが製造され、及び提供される。カラムに充填する方法は、溶融シリカ（ＦＳ）チューブ内に粒子保持フリットを作製するステップを含む。当該チューブは所望の長さに切断される。特定の実施形態では、９０／１０（ｖ／ｖ）の比で、ケイ酸カリウム溶液（本明細書ではＫＡＳＩＬとも呼ぶ）とホルムアミドの混合物が提供される。当該混合物は激しく振とうされる。１つの実施形態では、ボルテックス混合が、例えば１０秒間用いられる。好ましくは、長さ数ｃｍの当該混合物からなるプラグをチューブ内に吸入させるように、その後速やかに溶融シリカはかかる混合物に短時間（厳密ではなく、例えば１秒間）浸漬される。
１つの実施形態では、ＬＣ分析カラムを充填するステップは、フリットが設けられた溶融シリカチューブを加圧容器（ボンベ）内に組み込むステップを含む。加圧容器は、所望の粒子からなるスラリーを収納し得る。好ましくは、フェルールがチューブを加圧容器に組み込むために用いられる。好ましくは、本発明の接続部品が、当該チューブを加圧容器に接続するために用いられる。
好ましくは、カラム全体を振動させるために振動要素７４が用いられる。本発明に基づく方法に関する実施形態では、カラムは、カラムの長さ方向において少なくとも２箇所で振動を受ける。１つの実施形態では、少なくとも２種類の周波数、好ましくは超音波周波数が振動に用いられる。
特定の実施形態では、溶融シリカカラムのフリット化された末端部は超音波バス（例えば、Ｂｒａｎｓｏｎ ２００）中に置かれる。更なる実施形態では、超音波処理は、固相粒子が溶融シリカカラム内に流れ込んだ後に限り実施される。
カラムを充填する方法に関する１つの実施形態では、高度に濃縮した（濃厚な）スラリーが用いられる。スラリーの利用は、細く（２５μｍＩＤ）、延長されたカラムに充填するのに最も便利な方法である。
１つの実施形態では、スラリーは、アセトン１ｍｌに懸濁した逆相粒子を少なくとも１５０ｍｇ含む。充填時にカラムを通過するアセトンの線速度は、驚くべきことに、イソプロパノールに対して７±１倍に等しい。
充填カラムを製造する別の実施形態では、フリット化されたＦＳチューブは、０．５ｍｍの孔を有するフェルールを経由して加圧容器内の所望の粒子からなるスラリー内に配置（フリットアップ）される。当該フェルールは当該容器に接続される。次に、例えばヘリウムシリンダーに取り付けられた減圧器の二次圧は約５０ｂａｒに調整され、例えばバルブ（例えば、Ｓｗａｇｅｌｏｋ ＳＳ−４１ＧＳＸ２バルブ）を開くことによりボンベに圧力が加えられる。
カラムの準備が整うと、充填物の稠密度が双眼鏡（２５×）を用いて目視により検査される。使用する前に、ＨＰＬＣポンプを用いて２５０ｂａｒの圧力で、アセトニトリル／水（８５／１５、ｖ／ｖ）及び０．１Ｍ酢酸によりカラムをフラッシュする。
好ましくは、カラムは使用前に試験される。カラムの背圧（ｂａｒ／ｃｍ）をチェックすることができる。カラムのフリット化された末端部にスリーブ（内径０．４ｍｍ）を配置する。スリーブ内のメニスカスの変位（ｍｍ）を１分間測定する。体積は次式から得られる：
流速（ｎｌ／分）＝変位（ｍｍ）×１００（ｎｌ／ｍｍ）
ポンプの圧力を読み取り、カラム全体について標準化された圧力損失（Ｐｂ、ｂａｒ／カラム長、ｃｍ）を計算する：
Ｐｂ＝［時間／体積］×［（ＩＤ／５０）２×１２５］×Ｐ／Ｌ
式中、「時間」は分で表された流量測定時間、「体積」はｎｌで表された回収体積、「ＩＤ」はμｍで表されたカラム内径、「Ｐ」はｂａｒで表された流量測定中のカラムヘッド圧力、及び「Ｌ」はｃｍで表されたカラム長である。
溶融シリカチューブ７１が提供され、多孔性のセラミック製フリット７２がチューブ７１の一方の末端部に形成される。もう一方の末端部は高圧容器７０に接続される。高い圧力により、懸濁粒子の一部が空孔内に運ばれる。粒子が空孔内を流れる間、粒子内でボイドボリュームが形成されるのを防止するために、超音波振動要素７４を用いてカラム７１又は当該カラムの一部を振動させることができる。１つの実施形態では、振動要素７４は、カラム内で材料が密集している近傍に配置される。
下流で目詰まりが生じた場合には、カラムをスラリーから引き上げ、取り出し（但し、まだ容器の中にある）、そして液をフラッシュして乾燥することができる。次に、ＦＳをスラリー内に戻し、所望のベッド長が得られるまで充填プロセスを再開する。
図７は、本発明に基づく実施形態の１つと併用される、２次元液体クロマトグラフィーの応用形態を概略的に示す。第１次元目として、強カチオン交換体（ＳＣＸ）が、また図解による実施形態ではＳＣＸ及び弱アニオン交換（ＷＡＸ）樹脂からなる混合ベッドが用いられる。アニオン及びカチオン交換粒子からなる混合ベッド、例えばＭｏｔｏｙａｍａ（Ｍｏｔｏｙａｍａら、２００７年）が記載するものが好ましい。第２次元目は、例示のようにＣ１８逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーであり得る。
ＳＣＸと逆相クロマトグラフィーとの相性は、特にカチオン性の溶媒、バッファー、又は媒体との併用において乏しい。本発明の実施形態によれば、ギ酸又は塩酸（ＨＣｌ）等の溶媒８１が用いられる。かかる媒体の溶出強度は低いが、特にギ酸は、アニオンカチオン交換（ＡＣＥ）樹脂に結合した結合ペプチドの回収において高い効率を示す。
タンパク質分解されたタンパク質の多次元ＬＣＭＳ／ＭＳ分析の１つの実施形態では、ＳＣＸ分画法が、ＲＰ分離法と併用して用いられた。当該分析技術は、分析の分離効率及びダイナミックレンジを向上させるために組み合わされた。１つの実施形態では、第１次元目の分離用としてアニオン交換粒子及びカチオン交換粒子からなる混合ベッドを用いたオンライン多次元ＬＣ法が提供される。
１つの実施形態では、Ｍｏｔｏｙａｍａ（Ｍｏｔｏｙａｍａら、２００７年）に基づく混合型イオン交換ベッドが用いられる。
ＬＣＭＳデバイスの１つの実施形態では、サンプルはオンライン方式で分画される。好ましくは、２次元クロマトグラフィーがＬＣＭＳデバイス内に構成、配置される。好ましくは、少なくとも１つの分離機構がサンプル成分の疎水特性を利用する。更なる実施形態では、用いられる複数の分離機構のうちの少なくとも１つはＳＣＸであり、これは、好ましくはＨＬＡ−ＤＲ溶出サンプルの分画に用いられる。
１つの実施形態では、直交した分画法が用いられる。１つの好ましい実施形態では、ＳＣＸ分画法が用いられる。複合された装置では、総分析時間は、一般的に１５倍まで容易に増加し得る。ＳＣＸの次元は、オンライン方式及びオフライン方式の両方で利用可能である。
ＳＣＸ樹脂は、陰性に強く荷電した基を粒子表面に有する粒子を含み、陽性に荷電した分子との結合を可能にする。ＳＣＸ樹脂は陽性に荷電したペプチドを保持（維持／結合）する能力を有する。
適するカチオン性の塩水溶液の強度を増加させるグラジエント（連続／不連続の）により、樹脂をフラッシングするかかる手段を用いて置換／溶出することにより、通常、結合した分子は遊離／回収される。グラジエントにより、ほんの緩く結合している分子は強く結合している分子よりも速やかに遊離する。こうして、複合サンプルについて所望の分離が実現する。
第２次元目は逆相クロマトグラフィーであり得る。１つの実施形態では、第２の分離ステップは、好ましくはＣ１８ＲＰクロマトグラフィーを含む。１つの実施形態では、Ｃ１８逆相のＬＣＭＳデバイスは、混合型のアニオン及びカチオン交換体固相抽出トラッピングカラムを備える。
ＳＣＸ法及びＲＰ分離法間の直交性は、ＳＣＸはペプチドを保持するために静電相互作用を利用するという事実に基づく。実際には、ＳＣＸでペプチドを分離する際の保持力は、静電相互作用（主）と疎水的相互作用（副）の組合せからなり、後者はスルホニルポリマー骨格の疎水的性質に起因する。かかる「混合モード」特性は、ＳＣＸが同一の正味荷電を有する構造的に類似したペプチドを分離できる理由の１つとして認識されている。
イオン交換法（ＩＥＸ）及びＲＰ分離法間の直交性は、静電相互作用及び疎水性に基づく。実際には、ＩＥＸでペプチドを分離する際の保持力は、静電相互作用（主）と疎水的相互作用（副）の組合せからなり、後者はシリカ粒子表面性におけるシラノール基との疎水的相互作用に起因する。かかる「混合モード」特性は、ＩＥＸが同一の正味荷電を有する構造的に類似したペプチドを分離できる理由の１つとして認識されている。
好ましくは、ＬＣＭＳ法は、弱アニオン交換体（Ｐｏｌｙ ＷＡＸ ＬＰ（商標）、Ｔｈｅ Ｎｅｓｔ Ｇｒｏｕｐ、Ｉｎｃ．４５ Ｖａｌｌｅｙ Ｒｏａｄ Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ ０１７７２−１３２３、本明細書ではＷＡＸとも呼ぶ）を用いて分画するステップを含む。ＷＡＸ粒子は、好ましい実施形態においては、陽性のカチオン粒子を含む架橋コーティング物の層を含む。より好ましくは、ＷＡＸ粒子は直鎖状のポリエチレンイミンと架橋したシリカベースの物質を含む。
ＬＣＭＳデバイスは、好ましくは結合ペプチドの回収を可能にする第１次元目としてＡＣＥ固相抽出カラムを備える。
１つの実施形態では、ＳＣＸにおけるペプチド溶出は、酢酸アンモニウム等の揮発性の有機塩を用いて実現可能である。酢酸中の酢酸アンモニウムが、ＡＣＥカラムからペプチドを分離するのに適する溶媒として提案されてきた。
図８は、ＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩ分子により提示されたＴ細胞エピトープのアロケーションに関する質量スペクトル認識パターンの概略図である。
上段：天然アミノ酸残基及び同位体標識アミノ酸残基（感染の際に培地に等モル量存在する）の取込みに起因する質量スペクトル同位体二項分布により、ＭＨＣクラスＩ関連ペプチドを特徴づけている。自己ペプチドの上方制御の程度は、天然エピトープ（ｍ）と１つだけ標識されたエピトープ（ｍ＋Δ）のモノアイソトピック質量の強度比に基づき計算可能である。新規に合成されたタンパク質、及び病原体由来タンパク質の場合には、理論的同位体パターンは完全な二項分布を示す。最大２個の標識アミノ酸残基を含むエピトープに関する理論的同位体分布パターンを上段に示す：自己ペプチドのそのままの発現、並びに５倍、２０倍、及び１００倍上方制御された発現、並びに感染後の新規の上方制御された自己ペプチド又はウイルス性ペプチド。下段：実験法ＩＩに記載するように、病原体由来のＭＨＣクラスＩＩ関連ペプチドは、その特徴的な質量スペクトルのダブレットに基づき、明らかに自己ペプチドと区別することができる。
図９は、実験法Ｉに記載する標準ＬＣＭＳ技術（上段）を利用した後、及びプラットフォームＬＣＭＳ技術（下段）を利用した後に得られた、ＭＶ−感染ＷＨ細胞に由来する未分画のＨＬＡ−Ａ２リガンドームから求めたＬＣＭＳ基準ピークイオン図を表している。
図１０は、複合サンプル分析における高品質ナノスケールＬＣ技術の利用を示す。９０ｃｍ長のＣ１８カラム（５０μｍＩＤ、ｄｆ＝５μｍ）上でのトリプシン処理ペプチドの分離であり、有機変性アセトニトリルを２％／分（上段）、アセトニトリルを６．７％／時（中段）、及びアセトニトリルを４％／時（下段）と増加させた、かかる範囲の異なるグラジエントプロフィールを用いた。半値幅（ＦＷＨＭ）は３秒から約３０秒に増大した。ピーク容量は、急速なグラジエントにおける約３００（上段）から、緩やかなグラジエントにおける約９００（下段）まで増大した。デューティサイクル（稼働時間の割合（％）として表された溶出ウィンドウ）が増大し、及びＭＳ源中の化合物の存在が拡張されると、量が少ないペプチドにおいても、総合的なデータ依存性−多段階ＬＣＭＳ分析（すなわち、ペプチドマイニング）が可能となる。
図１１では、ヒトＭＤＤＣに由来する複合ＭＨＣクラスＩＩリガンドームを、３μｍ Ｃ１８粒子、及び５μｍ Ｃ１８粒子がそれぞれ充填された２５μｍＩＤカラム（図Ａ、基準ピークイオン図）、及び５０μｍＩＤカラム（図Ｂ、基準ピークイオン図）上で、等しいグラジエントスロープを用いて分析した。固相パラメーターが、ＭＨＣクラスＩＩリガンドーム分析におけるＬＣＭＳ性能を決定する。２５μｍＩＤカラムでは、ＬＣＭＳ性能が感度及びピーク分解度に関して顕著に向上していることが明白である。図Ｃ及び図Ｄは、それぞれ２５μｍＩＤカラム、及び５０μｍＩＤカラム上で得られたＬＣ性能の相違を、本サンプル中の２つの同重体ペプチド（すなわち、ペプチド配列は一致しないが、［Ｍ＋２Ｈ］２＋＝６１５．４Ｄａに等しい質量を有する）について詳細に示す。
図１２では、インフルエンザウイルスに感染させ、及び実験法Ｉ（アプローチＣ）に記載する安定同位体標識アミノ酸を利用した後の、ヒトＭＤＤＣから単離されたＨＬＡ−Ａ２リガンドームについて、ＬＣＭＳ分析を行った。上段は、ほぼ二項分布の同位体パターンが認められる二価の電荷を有する上方制御されたエピトープを示す。３個の標識残基がエピトープに取り込まれている。ｍ／ｚ ５７３．３Ｄａで得られた本ペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトル（下段）は、ペプチド配列がＶＶＳＥＶＤＩＡＫＡＤであることを示す（ｙ−タイプイオンシリーズ、及び正確な質量測定に基づく）。かかる特別な実験は、感染の際に、標識残基としてロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、及びメチオニン（Ｍ）を培地内で用いて実施された。本ペプチド中の３個の標識残基は全てバリン（Ｖ）であった。本エピトープの上方制御の程度は、ｍ／ｚ ５７３．３０６Ｄａにおける天然エピトープのモノアイソトピック質量ｍと、ｍ／ｚ ５７６．３１３Ｄａにおける１個標識されたアイソマーのモノアイソトピック質量［ｍ＋３］との質量スペクトル強度比に基づき計算可能である（実験法Ｉを参照）。かかる特別なエピトープの場合、インフルエンザウイルス感染による上方制御の程度は１６倍に等しい。
図１３では、実験法ＩＩ（アプローチＤ）に記載するように、１４Ｎ−、及び１５Ｎ−標識百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）全細胞調製物でパルシングした後のヒトＭＤＤＣから単離されたＨＬＡ−ＤＲ２リガンドームについて、ＬＣＭＳ分析を行った。上段はＥＳＩ質量スペクトルを示し、ｍ／ｚ ７８８．９４Ｄａ及び７９７．４２Ｄａにおいて二価に荷電した質量スペクトルのダブレットを含む。挿入図は、１７個の窒素原子を含む百日咳菌ペプチドの候補を示す解析済みの質量スペクトルを示す。ＭＳスペクトルは、安定同位体アプローチ（本文参照）を用いた細菌由来エピトープのポジティブアロケーションに関する一般基準に従う。下段は、ｍ／ｚ ７８８．９４Ｄａにおける本ペプチドの解析済みＭＳ／ＭＳスペクトルを表し、推定周辺タンパク質（Ｐｕｔａｔｉｖｅ Ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ）（受入番号ＣＡＥ４３６０６）由来のペプチドＡＡＦＩＡＬＹＰＮＳＱＬＡＰＴの配列（ｂ−タイプイオンシリーズ）を示している。
図１４では、実験法ＩＩ（アプローチＥ）に記載するように、１４Ｎ−、及び１５Ｎ−標識百日咳菌ｒＰ．６９Ｐｒｎ１でパルシングした後の様々なヒトＭＤＤＣの不均質混合物から単離されたＨＬＡ−ＤＲリガンドームについて、ＬＣＭＳ分析を行った。上段はＥＳＩ質量スペクトルを表し、ｍ／ｚ ７７０．４３Ｄａ及び７８０．３９Ｄａにおいて二価に荷電した質量スペクトルのダブレットを含む。挿入図は、２０個の窒素原子を含むｒＰ．６９Ｐｒｎ１由来ペプチドの候補を示す解析済みの質量スペクトルを示す。ＭＳスペクトルは、質量タグ支援アプローチ（本文参照）を用いたｒＰ．６９Ｐｒｎ１由来エピトープのポジティブアロケーションに関する一般基準に従う（実験法ＩＩ）。下段は、ｍ／ｚ ７７０．４３Ｄａにおける本ペプチドの解析済みＭＳ／ＭＳスペクトルを表し、ｒＰ．６９Ｐｒｎ１由来ペプチドＬＲＤＴＮＶＴＡＶＰＡＳＧＡＰＡの配列（ｂ−タイプイオンシリーズ）を示している。
図１５では、実験法ＩＩ（アプローチＦ）に記載するように、異なる１４Ｎ−、及び１５Ｎ−標識髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ＯＭＶ調製物でパルシングした後のヒトＭＤＤＣから単離されたＨＬＡ−ＤＲ１／Ｐ１．７−２，４、及びＨＬＡ−ＤＲ２／Ｐ１．５−２，１０リガンドームについて、ＬＣＭＳ分析を行った。探索アルゴリズムにより、図ＡのＨＬＡ−ＤＲ１／Ｐ１．７−２，４サンプル、及び図ＢのＨＬＡ−ＤＲ２／Ｐ１．５−２，１０サンプルに関する両リガンドームにおいて、スペクトルのダブレットが検出された。ＭＳ配列分析により、Ｐ１．７−２，４由来エピトープＳＰＤＦＳＧＦＳＧＳＶＱＦＶＰＩＱＮＳＫ（図Ｂ）、及びそのＰ１．５−２，１０類似体ＳＰＥＦＳＧＦＳＧＳＶＱＦＶＰＡＱＮＳＫ（図Ｄ）が同定された。かかるエピトープの位置３及び位置１６の残基は株特異的である。質量タグ支援アプローチを用いたＬＣＭＳスペクトルは、細菌由来エピトープに関する一般基準に従う（実験法ＩＩ）。更に、各エピトープ内に含まれる窒素原子数は、ＬＣＭＳスペクトルから推定可能である。図Ａにおける二価に荷電した質量スペクトルのダブレット間の質量差（Δ＝１２Ｄａ）、及び図Ｂにおける三価に荷電した質量スペクトルのダブレット間の質量差（Δ＝８．０Ｄａ）は、各エピトープは２４個の窒素原子を含むことを示す。確かに、両同定エピトープは上記データに従う。
図１６では、実験法ＩＩ（アプローチＦ）に記載するように、１４Ｎ−、及び１５Ｎ−標識髄膜炎菌Ｐ１．７−２，４ＯＭＶ調製物でパルシングした後のヒトＭＤＤＣから単離されたＨＬＡ−ＤＲ１リガンドームについて、ＬＣＭＳ分析を行った。領域８に相当する一連の長さ変異体の１つとして、髄膜炎菌Ｐ１．７−２，４由来エピトープＩＧＮＹＴＱＩＮＡＡＳＶＧＬ（図Ａ及びＣ）が同定された。本天然エピトープの存在量が１％のとき、二価に荷電した質量スペクトルのダブレットが検出されたが、これは変則的なＰ１．７−２，４由来エピトープが、＋１Ｄａしか相違しないＣ末端アミノ酸残基を除き、天然のエピトープと顕著な類似性を示すことを表している。ＩＧＮＹＴＱＩＮＡＡＳＶＧ−［＋１１４Ｄａ］（図Ｂ及び図Ｄ）（変則的なエピトープに含まれる病原体由来窒素原子数は、そのイオン対から推定されるように、天然エピトープの１７とは異なり１８個であったことに留意されたい）。その結果、非天然エピトープ（Ｄ）の完全なｙ−タイプイオンシリーズは、天然のエピトープ（Ｃ）と比較して＋１Ｄａだけシフトしているが、一方、ｂ−タイプイオンシリーズは無変化のままである。ダブレットの重イオン及び軽イオンの両方からなるｙ−タイプ及びｂ−タイプイオンシリーズは、これら合わせて、かかる非天然エピトープが病原体由来タンパク質のタンパク質スライシング事象の結果、またその後に、同じＰ１．７−２，４分子の異なる複数の断片が分子内でライゲーションした結果であり、その結果スプライスされたＭＨＣクラスＩＩリガンドが生じたことを示している。
図１７は、ヒトＭＢ７１．５ Ｔ細胞によるＰ１．５−２，１０「領域４」エピトープ、及びＰ１．７−２，４「領域４」エピトープの差示的認識を示す。Ａ：ＭＢ７１．５ Ｔ細胞。これは、ドナーＭＢ７１から得られたＰＢＭＣを、組換えＰ１．５−２，１０タンパク質を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで再刺激（２Ｘ）した後に生成し、合成ペプチドＰＤＦＳＧＦＳＧＳＶＱＦＶＰＩＱＮＳ（Ｓ００４．２９）又はＳＧＳＶＱＦＶＰＩＱＮＳＫＳＡＹＴＰ（Ｓ００４．３０）ではなく、ＰＥＦＳＧＦＳＧＳＶＱＦＶＰＡＱＮＳ（Ｓ０１１−２４）、及びＳＧＳＶＱＦＶＰＡＱＮＳＫＳＡＹＴＰ（Ｓ０１１−２５）でパルシングされた自己ＰＢＭＣ存在下で増殖した。Ｂ：ＭＢ７１．５ Ｔ細胞は、「領域４」配列のＣ−末端部分内のイソロイシン（Ｉ）を発現するＰｏｒＡ変異体、すなわちＰ１．７−２，４、Ｐ１．７，１６、及びＰ１．１９，１５ではなく、アラニン（Ａ）を発現するＰｏｒＡ変異体、すなわち、それぞれＰ１．５−２，１０、Ｐ１．５−１，２−２、及びＰ１．２２，１４のみを認識する（「結果」の本文を参照）。
実験方法Ｉ：ＭＨＣクラスＩリガンドーム
麻疹ウイルス、インフルエンザウイルス、及び呼吸器合胞体ウイルス
Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ Ｂ株（以後ＭＶと呼ぶ）のプラーク精製麻疹ウイルスを、ベロ細胞（Ｖｅｒｏ ｃｅｌｌ）内で増殖させた。インフルエンザウイルス（Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５株）を、ＭＤＣＫ１細胞内で増殖させた。プラーク精製呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ−Ａ２ ｎｏ．ＶＲ−１３０２、ＡＴＴＣ）を、ｈｅｐ−２細胞内で増殖させた。
ヒトＢ細胞系ＷＨ及びＭＢ０２、並びにヒト単球由来樹状細胞
ＥＢＶにより形質転換されたＢ細胞系ＷＨを発現するＨＬＡ−Ａ＊０２０１、及びＥＢＶにより形質転換されたＢ細胞系ＭＢ−０２を発現するＨＬＡ−Ａ＊０２０１、ＨＬＡ−Ｂ＊０７０１を、抗生物質及び５％ウシ胎仔血清（以後ＦＢＳと呼ぶ、Ｈａｒｌａｎ、米国）が補給されたＲＰＭＩ １６４０培地内で培養した。
ヒト単球由来樹状細胞（以後ＭＤＤＣと呼ぶ）を、Ｓａｌｌｕｓｔｏ（Ｓａｌｌｕｓｔｏら、１９９４年）が記載する手順に基づき培養した。簡潔には、同意を得た上で、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、ＨＬＡ−Ｂ＊０７０１ホモ接合型血液ドナーから得た、白血球アフェレーシスのバッフィーコート（ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ）のリンホプレップ（ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ）（Ａｘｉｓ−ｓｈｉｅｌｄ、ノルウェイ）を用いて、密度遠心分離法により１×１０９個のＰＢＭＣを新たに単離した。ＰＢＭＣを、抗生物質（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、米国）及び１％ＦＢＳが補給されたイスコフ改変ダルベッコ培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、米国）を含む１５０ｍｍの組織培養ディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ、米国）内に５×１０６個／ｍｌで播種し、５％ＣＯ２を含む加湿インキュベータ中に３７℃で２時間置いた。非付着性の分画を除去した後、接着細胞を、抗生物質、１％ＦＢＳ、５００Ｕ／ｍｌ組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、米国）、及び２５０Ｕ／ｍｌ組換えヒトＩＬ−４（Ｓｔｒａｔｈｍａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ）を含む培地内で更に６日間培養した。培地及び増殖因子を３日毎に取り替えた。６日目に、ＭＤＤＣはいつでもウイルス感染できるようになった。ウイルス感染前後に、ＭＤＤＣの１％量について、ＭＤＤＣの純度並びに成熟度を確認するためにフローサイトメトリーにより特徴づけを行った（図示せず）。
ペプチド合成
ＳＹＲＯ ＩＩ同時多品種ペプチド合成装置（ＭｕｌｔｉＳｙｎｔｅｃｈ ＧｍｂＨ、Ｗｉｔｔｅｎ、ドイツ）を用いて固相ＦＭＯＣケミストリーにより、合成ペプチド標準品を作製した。合成したペプチドの純度及び同一性を、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により評価した。
実験アプローチＡ、Ａ’、Ｂ、Ｃ、及びＣ’から、ウイルス感染関連ＭＨＣクラスＩリガンドームを発現するヒト細胞バッチが得られた。アプローチＡでは、５０％組織培養感染量である１０７個／ｍｌのＭＶストックを用いて、抗生物質及び１％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地内で、０．５の感染多重度（以後、ｍ．ｏ．ｉとする）で２時間、２×１０９個のＷＨ細胞からなるＢ細胞バッチを感染させた。その後、細胞を洗浄し、ＭＶ関連ＭＨＣクラスＩリガンドームが発現可能となるように、４０時間放置して増殖させた。２×１０９個の未処理ＷＨ細胞からなる別の細胞バッチを作製し、標準培地内で培養後、対照となるＭＨＣクラスＩリガンドームを発現させた。ＭＨＣクラスＩリガンドームを調製し、個別に分析する前に、両細胞バッチを捕集、洗浄、計測、ペレット化、即時凍結し、そして−７０℃で保存した。
同様に、アプローチＡ’では、５０％組織培養感染量である１０８個／ｍｌのインフルエンザウイルスのストックを用いて、抗生物質及び１％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地内で、５の感染多重度（以後、ｍ．ｏ．ｉとする）で１時間、３．５×１０８個のＭＢ−０２細胞からなるＢ細胞バッチを感染させた。その後、細胞を洗浄し、インフルエンザ関連ＭＨＣクラスＩリガンドームが発現可能となるように、更に９時間放置して増殖させた。ＭＨＣクラスＩリガンドームを調製、分析する前に、当該細胞バッチを捕集、洗浄、計測、ペレット化、即時凍結し、そして−７０℃で保存した。
アプローチＢでは、５０％組織培養感染量である１０７個／ｍｌのＭＶを用いて、抗生物質及び１％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地内で、０．５のｍ．ｏ．ｉで２時間、１．５×１０９個のＷＨ細胞からなるＢ細胞バッチを感染させた。その後、ウイルス感染関連ＭＨＣクラスＩリガンドームが発現可能となるように、Ｌ−ロイシン及びＬ−メチオニンを含まないＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であって、５％ＦＢＣ、並びにＬ−ロイシン及びＬ−メチオニンの標準濃度の５０％量について、安定同位体標識アミノ酸の１３Ｃ６−Ｌ−ロイシン、及び１３Ｃ５，１５Ｎ１−Ｌ−メチオニン（それぞれ、それらの標識されていない軽い同位体と比較して６Ｄａ増加した質量を有する；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、並びに他方の５０％量について未標識アミノ酸のＬ−ロイシン及びＬ−メチオニン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）が補給された前記培地内で、かかる細胞を４０時間インキュベーションした。かかるアミノ酸はＨＬＡ−Ａ２リガンドの主要なアンカー残基である。１．５×１０９個の未感染ＷＨ細胞からなる別のバッチを作製するために、５％ＦＢＳ及び１００％の未標識アミノ酸を含むＲＰＭＩ−１６４０培地を用いた。ＭＨＣクラスＩリガンドームを調製、分析する前に、両細胞バッチを捕集、洗浄、計測し、１：１の細胞比で混合し、次いで１つの単一細胞バッチとしてペレット化し、即時凍結し、そして−７０℃で保存した。
アプローチＣでは、プラーク形成単位である７×１０７個／ｍｌのインフルエンザウイルスを用いて、２．２×１０７個のＨＬＡ−Ａ＊０２０１ホモ接合型ＭＤＤＣからなる細胞バッチを、２のｍ．ｏ．ｉで４時間感染させた。その後、ウイルス感染関連ＭＨＣクラスＩリガンドームが発現可能になるように、Ｌ−ロイシン、Ｌ−メチオニン、及びＬ−バリンを含まないＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であって、５％ＦＢＣ、並びにＬ−ロイシン、Ｌ−メチオニン、及びＬ−バリンの標準濃度の５０％量について、安定同位体標識アミノ酸の１３Ｃ６−Ｌ−ロイシン、１３Ｃ５，１５Ｎ１−Ｌ−メチオニン、及び１３Ｃ５，１５Ｎ１−Ｌ−バリン（それぞれ、それらの標識されていない軽い同位体と比較して６Ｄａ増加した質量を有する；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓより）、並びに他方の５０％量について未標識アミノ酸のＬ−ロイシン、Ｌ−メチオニン、及びＬ−バリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）が補給された前記培地内で、かかる細胞を４０時間インキュベーションした。２．２×１０７個のＨＬＡ−Ａ＊０２０１ホモ接合型ＭＤＤＣからなる別の細胞バッチを作製し、標準培地内で培養した後、対照となるＭＨＣクラスＩリガンドームを発現させた。ＭＨＣクラスＩリガンドームを調製、分析する前に、両細胞バッチを捕集、洗浄、計測し、１：１の細胞比で混合し、次いで１つの単一細胞バッチとしてペレット化し、即時凍結し、そして−７０℃で保存した。
同様に、アプローチＣ’では、プラーク精製した呼吸器合胞体ウイルスを用いて、２．５×１０７個のＨＬＡ−Ａ＊０２０１、ＨＬＡ−Ｂ＊０７０１ホモ接合型ＭＤＤＣからなる細胞バッチを、５のｍ．ｏ．ｉで３時間感染させた。その後、ウイルス感染関連ＭＨＣクラスＩリガンドームが発現可能となるように、完全なＲＰＭＩ−１６４０培地内で、かかる細胞を４８時間インキュベーションした。ＭＨＣクラスＩリガンドームを調製、分析する前に、当該細胞バッチを捕集、洗浄、計測、ペレット化、即時凍結し、そして−７０℃で保存した。
ＭＨＣクラスＩリガンドームの単離
実験アプローチＡ、Ａ’、Ｂ、Ｃ、又はＣ’に基づき増殖させた細胞バッチを、ＭＨＣクラスＩ分子を可溶化し、次にウイルス感染関連ＭＨＣクラスＩリガンドームを単離するために解凍、溶解した。簡潔には、細胞を１％ＣＨＡＰＳ（Ｒｏｃｈｅ）及びプロテアーゼインヒビターを含むｐＨ８．０のトリス−塩酸バッファー内で溶解した。遠心分離後、上清を、３つのＣＮＢｒ活性化トリス−ブロック化セファロースカラムに連続して通した：第１の非免疫グロブリン結合（すなわち、プレクリア１）、正常マウス免疫グロブリンとの第２の結合（すなわち、プレクリア２）、及びヒトＭＨＣクラスＩ分子に特異的な、特異的マウス抗体との第３の結合（すなわち、クリア）。１つの実施例では、ＨＬＡ−Ａ２分子（クローンＢＢ７．２）と反応するマウス抗体を用い、別の実施例ではＨＬＡ−Ｂ分子（クローンＢ１．２３．２）と反応するマウス抗体を用いた。クリアカラムに保持されているＭＨＣクラスＩ分子、及び関連ペプチドを、１０％（ｖ／ｖ）酢酸で溶出し、そして１０ｋＤａ分子量カットオフメンブレンフィルターを通過させた。ろ過物を±１０μｌまで真空遠心分離法を用いて濃縮し、次いで５％ギ酸、５％ジメチルスルホキシド内で最終容積が１００μｌとなるように再構成し、そして分析するまで−７０℃で保存した。当該ペプチド混合物について、既知量の２種類の合成ペプチド標準品（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ−ＩＩＩ及びＯｘｙｔｏｃｉｎ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）でスパイクして、その後のサンプル処理中に生じたサンプルロスを修正した。
標準ＬＣＭＳ技術
ペプチドサンプルを、エレクトロスプレーイオン化質量分析器に連結したナノフロー液体クロマトグラフィー（以後ＬＣＭＳと呼ぶ）により分析した。±１０９個のＢ細胞、又は１〜２×１０７個のＭＤＤＣに相当するペプチドサンプルの一定量を、標準的なナノフローＬＣカラムスイッチングシステムのＣ１８プレカラムであって、標準的なＭｉｃｒｏＴｅｅチューブ要素を介して５μｍＣ１８粒子が充填された、内径（以後ＩＤと表す）５０μｍの２０ｃｍ長の分析カラムに直列に接続している前記Ｃ１８プレカラムにロードした。使用した移動相は、流速が１２５ｎｌ／分のアセトニトリルからなるリニアグラジエントであり、１００％のＡ（水＋０．１Ｍ酢酸）から開始して、５５分間でＡ内のアセトニトリルに限り６０％＋０．１Ｍ酢酸となるまでであった。カラムチップは、金コーティングされ、カラムヘッド圧力は１５０ｂａｒであった。質量スペクトルを、「質量電荷比」（以後、ｍ／ｚで表す）として１秒毎に、３００〜１，５００Ｄａの範囲で少なくとも１０，０００全半値幅（以後ＦＷＨＭ）の分解能を有する質量分析器（Ｑ−ＴＯＦ、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．）で記録した（ＭＳ分析）。
ウイルス感染関連ＭＨＣクラスＩエピトープ候補のＭＳ配列決定（ＭＳ／ＭＳ分析）では、ほとんどの場合ペプチドサンプルのその後の一定量を用いたが、ＭＳ１分析のサイクルは、事前に選択された質量に関する、又は質量分析器流入時において最も多く存在する質量に関する衝突誘起フラグメンテーションのサイクルにより変更された。ＭＳ／ＭＳスペクトルを、スキャン速度が１秒／スキャン、質量範囲が５０〜２，０００Ｄａ、及び質量分解能が５，０００ＦＷＨＭで取得した。最適衝突エネルギーは、エピトープの性質、及び用いた質量分析器に大きく依存したが、本実験では最適化された。ＭＳ／ＭＳスペクトルの解釈は、手作業又はソフトウェアツール、例えばＭａｓｃｏｔ（Ｐｅｒｋｉｎｓら、１９９９年、ｗｗｗ．ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ、Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．、Ｌｏｎｄｏｎ、英国）、ＰｒｏｔｅｉｎＰｒｏｓｐｅｃｔｏｒ（ｗｗｗ．ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、米国）、ＢｉｏＷｏｒｋｓ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、米国）及び／又はＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘ（商標）（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、米国）等を用いて行った。
同定されたエピトープの半定量化では、相対感度係数を計算したが、これは同定されたエピトープの合成類似体の強度−量を、標準ペプチドであるアンジオテンシン−ＩＩＩ及びオキシトシンの強度−量平均値で割ることに基づく。かかる係数は、細胞バッチ内に存在する天然エピトープの数を半定量化するために、その後用いられた。
ＭＶ関連ＭＨＣクラスＩリガンド候補の同定
アプローチＡでは、ＭＶに感染、及び未感染のＷＨに由来するＭＨＣクラスＩリガンドームのＭＳイオン図を、質量毎に比較した。この手順の常套として、両サンプルに存在する豊富なペプチドイオンを、μＬＣ保持時間内に生じた小さなシフトを評価するために用いた。感染したＷＨ細胞にのみ生じているペプチド質量について配列決定し、半定量化を行った。
アプローチＢ及びＣでは、必須の質量スペクトル情報（「質量値」及び「強度値」と定義する）を、ＭＨＣクラスＩリガンドームより得られたＭＳスペクトルから抽出し、アルゴリズム探索に用いた。第１に、シミュレートした同位体パターンを、（ｉ）用いた安定同位体標識の種類と数、（ｉｉ）かかる安定同位体の天然発生率、（ｉｉｉ）エピトープに組み込まれた標識アミノ酸の推定最大数、（ｉｖ）実験デザイン、及び（ｖ）関係するイオンの荷電状態に基づき計算した。個別にシミュレーションされた各同位体パターンを、ＭＳスペクトルの質量軸に沿って数学的に移動した。
図８の上段は、アプローチＢの方法に記載するように、２種類の安定同位体を使用した後のウイルスに感染した細胞バッチから抽出された、ウイルス性及び自己−ＭＨＣクラスＩリガンドについてシミュレーションした同位体パターンを表す。例えば、２箇所でメチオニン及び／又はロイシンを発現するウイルス性エピトープは、質量ｍ（５０）、ｍ＋Δ（１００）、及びｍ＋２Δ（５０）の相対比によって認めることが可能で、ここでΔは、アプローチＢの標識手順及び細胞混合手順に固有の３つの同位体変異体に典型的な単一荷電イオンについて６Ｄａである（図８、上段、右側のパターン）。また、無変化のままの自己エピトープ、又はウイルス感染中に上方制御された自己エピトープは、それぞれが有する同位体パターンにより認識可能である（図８、上段、左側の４つのパターン）。更に、上方制御の程度は、単一標識アイソマー（Ｉ［ｍ＋Δ］）、及び天然エピトープ（Ｉｍ）のモノアイソトピック質量の強度比に基づき計算可能であり、次式に従う：
Figure 2012502296
式中、ｘはエピトープ中に含まれる標識アミノ酸の最大数を表す。感染に有意に関連して、少なくとも２倍上方制御されていると考えられた。したがって、同位体パターンは、例えばアプローチＣでは３種類の標識アミノ酸の利用についてシミュレーションされた。更にＬＣＭＳ／ＭＳ分析を行うために、ウイルス感染関連ＭＨＣクラスＩリガンド候補として、一致する同位体クラスターを選択した。
プラットフォームＬＣＭＳ技術
ウイルス感染関連ＭＨＣクラスＩリガンドームの「ペプチドマイニング」では、感度が１桁以上改善したプラットフォームＬＣＭＳ技術を得るために、例えば、１０７〜１０８個の細胞からなるバッチ内で、細胞１個当たり１つのコピーとして存在するＭＨＣクラスＩエピトープについて検出が可能となるように、ＬＣＭＳシステムのいくつかの独立パラメーターを修正した。
プラットフォームＬＣＭＳ技術は、改変されたＭｉｃｒｏＴｅｅチューブ要素を介して３μｍＣ１８粒子が緊密充填された、２５μｍＩＤの≧９０ｃｍ長の分析カラムに直列に接続している、標準的ナノフローＬＣカラムスイッチングシステムのＣ１８プレカラムから構成された。使用した移動相は、流速が３０ｎｌ／分のアセトニトリルからなる緩やかなリニアグラジエントで、２４０分間においてＡ（水＋０．１Ｍ酢酸）内で８％アセトニトリル＋０．１Ｍ酢酸から開始して、Ａ内でアセトニトリルが２８％になるまでであった。カラムチップは、カーボンコーティングされ、カラムヘッド圧力は≧４００ｂａｒであった。質量スペクトルの解釈、これに続くＭＳ／ＭＳ分析、及びエピトープの半定量化は、標準的なＬＣＭＳ技術について記載した通りに実施した。
プラットフォームＬＣＭＳ技術の優位性を、アプローチＡに記載するＭＶ感染ＷＨ Ｂ細胞バッチ、アプローチＡ’に記載するインフルエンザ感染ＭＢ−０２細胞Ｂ−バッチ、及びアプローチＣ’（本明細書で後ほど示す）に記載するＲＳＶ感染ＭＤＤＣ細胞バッチに由来するペプチドサンプルを用いて分析した。
結果Ｉ：ＭＨＣクラスＩリガンドーム
標準ＬＣＭＳ技術では、限られた数のＨＬＡ−Ａ２−結合ＭＶエピトープしか同定されない。
ＭＶ関連ＭＨＣクラスＩエピトープを標準的なＬＣＭＳ技術により同定するために、ＭＨＣクラスＩリガンドームを記載の通りに、ＭＶ感染後のヒトＷＨ細胞から入手した。２つのＨＬＡ−Ａ２リガンドームサンプル、すなわちアプローチＡ（サブトラクティブ分析）に従い得られたもの、及びアプローチＢ（同位体標識）に従うＨＬＡ−Ａ２リガンドームサンプルについて調べた。各アプローチでは、ＭＳ／ＭＳ配列決定後にＭＶエピトープとして確認された、３つのウイルス関連ＭＨＣクラスＩエピトープ候補が検出可能であった（表１）。公表のように、標準的なＬＣＭＳ技術は、１細胞当たり１００，０００個を超えるコピー数で発現していることが明らかとなった超優位性の（ｓｕｐｒａｄｏｍｉｎａｎｔ）ＭＶ−Ｃ８４〜９２エピトープを含む、全部で４つの異なるエピトープの同定を可能にした。
比較例：プラットフォームＬＣＭＳ技術により、１０〜１５倍多くのＭＶエピトープが同定される
標準的なＬＣＭＳ技術は、複合したＭＨＣクラスＩリガンドームサンプルの中で、数千もの化学的に類似した自己エピトープの中から１フェムトモル未満の範囲でいくつかの、おそらくは最も豊富なウイルス性エピトープについて同定し及び特徴づけるのに役立ち得るが、かかる最新技術をもってしても、重要なこれに付加する準優位性の（ｓｕｂｄｏｍｉｎａｎｔ）ウイルス性エピトープに関する知識のギャップが埋められないままであることは明白であった。
発明者らは、本技術のＬＣ部分について綿密な改変を施せば、準優位性のＭＨＣクラスＩリガンドについても検出及び特徴づけを可能にするプラットフォームＬＣＭＳ技術が構築されないものかと考えた。図９は、標準的なＬＣＭＳ技術（上段）、又は「方法」で記載したいくつかの独立した改変の組合せが含まれるプラットフォームＬＣＭＳ技術（下段）を用いたときの、１つの単一ＭＶ感染関連ＭＨＣクラスＩサンプル（アプローチＡで調製された）の分画に関する代表的なＬＣＭＳピーク成績を示す。下段のＬＣＭＳ実験（プラットフォーム技術）に示すオンラインデータ依存性ＬＣＭＳ／ＭＳ配列決定により、３１個の異なるエピトープに相当する３９個のＭＶ由来ＨＬＡ−Ａ２リガンドが同定された（表２）。かかる天然に提示されたエピトープのうち、２６個のエピトープは新規ＭＶエピトープであり、３個は標準ＬＣＭＳ技術を用いてすでに同定され（表１）、２個は定量化された天然のＨＬＡ−Ａ２リガンドとして新規ではあるが、マウス及びヒトＭＶ ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープとして文献に記載されていた（Ｎｅｕｍｅｉｓｔｅｒら、１９９８年、Ｎａｎａｎら、１９９５年）。したがって、少なくとも１０倍多くのエピトープが、標準的なＬＣＭＳ法のプラットフォーム改良により同定された。
プラットフォームＬＣＭＳ技術によるその他のウイルスに由来するＭＨＣクラスＩリガンドームのエピトープマイニングに関する更なる実施例
かかる技術の優位性を更に分析するために、プラットＬＣＭＳ技術を用いて、アプローチＡ’及びＣ’に記載するような、その他のウイルス感染細胞バッチから調製したＭＨＣクラスＩリガンドームを分析した。標準的なＬＣＭＳ技術では検出されなかった、６個のウイルス性ＭＨＣクラスＩエピトープが同定された：４つのエピトープはインフルエンザウイルス感染に関連し、２つのエピトープはＲＳＶ感染に関連した（表２）。
プラットフォームＬＣＭＳ技術によるＭＨＣクラスＩリガンドームのエピトープマイニングは、ＬＣ法のいくつか独立した改善に起因する
当該方法で、単一の改変をいろいろ行ったときのピーク性能及びペプチドマイニングに対する寄与を理解するために、長尺カラムと併用してグラジエントを急勾配にしたときの効果、及びカラムＩＤと連動させたＣ１８粒子サイズの影響を、個々の裏付け実験で調べた。複合したトリプシンによるタンパク質消化物を利用した図１０に示すように、９０ｃｍ長のカラムと併用して、より緩やかで、延長されたグラジエントスロープを適用すると、クロマトグラムでペプチドのピーク容量が増大し、またピーク幅が拡大する。こうして、化合物がＭＳ源中で広範に存在することが可能となり、存在量が少ないペプチドでも総合的なデータ依存性多段階ＭＳ／ＭＳ分析（ペプチドマイニング）に役立つ。期待したように、３μｍＣ１８粒子が充填された５０μｍＩＤカラム（図１１、上段）とは異なり、３μｍＣ１８粒子が充填されたより小さいＩＤ（２５μｍ）のカラムを用いると、４倍高感度のＬＣＭＳシステムが得られた。思いもよらず、カラムのＩＤをより小さくすることにより（図１１、下段）、分離効率も改善した。
プラットフォームＬＣＭＳ技術により、ＭＶエピトープの特別な特徴を同定することが可能となる
配列情報及び多様性以外のＭＨＣクラスＩリガンドの重要な特徴として、エピトープの長さ変異、存在量、及び考えられるＰＴＭが挙げられる。表２は、ＭＶ由来ＨＬＡ−Ａ２リガンド中に５の異なる長さのペプチドが見出されたことを示す：８マー（ｎ＝２）、９マー（ｎ＝２１）、１０マー（ｎ＝９）、１１マー（ｎ＝５）、及び１２マー（ｎ＝２）。したがって、９マーが最も一般的であり、また半定量データによれば、最も豊富な２つのペプチド種は、それぞれＭＶ由来ＨＬＡ−Ａ２リガンドームの２６％及び１８％に相当するが、いずれも９マーであった。ＫＬＷＥＳＰＱＥＩエピトープは、初期の研究より超優位性のエピトープとして公知であるが（表１）、本分析では十分に示されなかった。これは、かかる特別なエピトープのみを含む少量のＨＰＬＣ分画が、別の研究目的のためにサンプルから選択的に取り出されたためと考えられた。７つのエピトープから、同一のコアエピトープを共有する２つ又は３つの長さ変異体が同定された（表２）。
更に、大構造タンパク質由来のエピトープＲＡＮ＊ＶＳＬＥＥＬ、融合糖タンパク質Ｆ０前駆体由来のＫＬＭＰＮ＊ＩＴＬＬ、及び血球凝集素糖タンパク質由来のＬＳＶＤＬＳｐＰＴＶ（表２）は、翻訳後修飾エピトープであり、翻訳されたゲノム由来のようなものとして推測されるものではない。
かかる修飾は、ウイルスＭＨＣクラスＩエピトープについて文献では報告されていない。
ウイルス感染関連の上方制御されたＭＨＣクラスＩ自己エピトープの同定
図８に示すように、ウイルス特異的エピトープに限らず、新規に誘発された、又は上方制御された自己エピトープも、同位体標識の利用と、ＭＨＣクラスＩ単離及びＬＣＭＳ技術とを組み合わせれば検出可能である。インフルエンザウイルス感染関連ＨＬＡ−Ａ２リガンドームは、アプローチＣに記載するようにヒトＭＤＤＣから単離され、標準ＬＣＭＳ技術が適用された。３つの標識アミノ酸を含む上方制御されたペプチドについてシミュレーションされた同位体パターンに一致する同位体クラスターを調査した。図１２は、３つの同位体標識アミノ酸を取り込んだ同位体クラスターの例を示す。当該エピトープは、ヒトインターフェロンに誘導されたＧＴＰ−結合タンパク質Ｍｘ１（受入番号Ｐ２０５９１）に由来するＶＶＳＥＶＤＩＡＫＡＤとして同定された。６個の別の上方制御された自己エピトープが、インフルエンザ感染後に同定された（表３）。その他の自己エピトープが、ウイルス感染後に上方制御された天然提示のＭＨＣクラスＩリガンドとして報告されているが、本発明で同定されたエピトープは、新規であり、またインフルエンザウイルス感染に特異的に関連するものと考えられる。
実験法ＩＩ：ＭＨＣクラスＩＩリガンドーム
百日咳菌の増殖及び全細胞調製物の生成
百日咳菌株５０９を、天然の１４Ｎ−含有最少Ｂｉｏｅｘｐｒｅｓｓ細胞増殖培地、又は９８％−濃縮１５Ｎ−安定同位体標識最少Ｂｉｏｅｘｐｒｅｓｓ細胞増殖培地（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）、但し、いずれの培地もろ過済みの０．１５％乳酸（Ｆｌｕｋａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）及び１８．６ｍＭ ＮａＯＨを含むが、そのいずれか一方において静止期に至るまで増殖させた。増殖後、１４Ｎ−、及び１５Ｎ−標識細菌培養物の両方を、５６℃で３０分間インキュベーションすることにより加熱不活性化し、及びＰＢＳ内で２，０００ｇ、２０分間遠心分離することにより５回濃縮し、そして１／５容積のＰＢＳ内にペレットを回収した。１４Ｎ−、及び１５Ｎ−標識全細胞調製物の光学濃度を５９０ｎｍで測定し、及び抗原提示細胞の抗原パルス用として、かかる調製物の１：１混合物をＯＤ５９０値に基づき作成した。
百日咳菌に由来する組換えＰ．６９パータクチンの調製
百日咳菌Ｐ．６９パータクチン野生種変異体Ｐ．６９Ｐｒｎ１（受入番号ＡＪ０１１０９１）（Ｈｉｊｎｅｎら、２００５年）の細胞外ドメインをエンコードするプラスミドｐＰＲＮ１を含む、大腸菌株ＢＬ２１−Ｃｏｄｏｎｐｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＰ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を、天然の１４Ｎ−標識最少Ｂｉｏｅｘｐｒｅｓｓ細胞増殖培地、又は９８原子％−濃縮１５Ｎ−標識最少Ｂｉｏｅｘｐｒｅｓｓ細胞増殖培地（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）のいずれか一方において、ＯＤ５９０が０．６〜０．８に達するまで、３７℃、２５０ｒｐｍで増殖させた。その後、培養物を１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘発し、更に４時間インキュベーションした。誘発済みの１４Ｎ−及び１５Ｎ−標識細菌を、５，０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離することにより捕集し、次いでＢｕｇ Ｂｕｓｔｅｒ試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）を用いて溶解した。細胞溶解物を、湿細胞ペースト１グラム当たり５，０００Ｕのリゾチーム、及び１２５Ｕのベンゾナーゼ ヌクレアーゼで処理した。遠心分離により封入体を収集し、１：１０に稀釈したＢｕｇ Ｂｕｓｔｅｒ試薬で３回洗浄した。精製済みの１４Ｎ−及び１５Ｎ−標識封入体を、６Ｍ塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）、１０ｍＭベンザミジン、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、及び５０ｍＭトリス塩酸 ｐＨ８．８に溶解した。ＧｕＨＣｌを含まない同一バッファー内で５０倍に急速に稀釈することにより、１４Ｎ−及び１５Ｎ−標識ｒＰ．６９Ｐｒｎ１タンパク質のリフォールディングを開始した。１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、及び５０ｍＭトリス塩酸 ｐＨ８．８に対して４℃で１晩透析して、タンパク質を完全にリフォールディングさせた。次いで、リフォールディングしたタンパク質を、分子量カットオフ値が５０ｋＤａの透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｒａｎｃｈｏ Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ、ＣＡ）を用いて５０ｍＭトリス塩酸 ｐＨ８．８に対して２回透析した。当該タンパク質を、５０ｋＤａのカットオフ値を有するＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）で濃縮した。最後に、２μｇプロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ、Ｐｅｎｚｂｅｒｇ、ドイツ）を１ｍｇ／ｍｌの濃縮タンパク質に添加した。ヒトＭＤＤＣの抗原パルス用に、１４Ｎ−及び１５Ｎ−標識ｒＰ．６９Ｐｒｎ１タンパク質からなる１：１タンパク質／タンパク質混合物を、ビシンコニン酸（以後、ＢＣＡと呼ぶ）タンパク質アッセイ法（Ｐｉｅｒｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、米国）で測定したタンパク質含量に基づき作成した。
最少培地内での髄膜炎菌同質遺伝子系統の増殖及びＯＭＶの調製
可変性の主要外膜タンパク質ポーリンＡ（以後、ＰｏｒＡと呼ぶ）（Ｐｅｅｔｅｒら、１９９６年）の血清亜型Ｐ１．５−２，１０又はＰ１．７−２，４をそれぞれ発現する、髄膜炎菌Ｈ４４／７６の２つのクラス３−同質遺伝子系、クラス４−同質遺伝子系を、天然の１４Ｎ−含有最少Ｂｉｏｅｘｐｒｅｓｓ細胞増殖培地、又は９８％−濃縮１５Ｎ−標識最少Ｂｉｏｅｘｐｒｅｓｓ細胞増殖培地（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）のいずれか一方において静止期に至るまで増殖させた。かかる培養物から得られた、１４Ｎ−及び１５Ｎ−標識外膜小胞（以後、ＯＭＶと呼ぶ）のバッチを、Ｃｌａａｓｓｅｎ（Ｃｌａａｓｓｅｎら、１９９６年）に基づき調製し、特徴づけを行った。ヒトＭＤＤＣの抗原パルス用として、１４Ｎ−及び１５Ｎ−標識ＯＭＶバッチからなる１：１タンパク質／タンパク質混合物を、ＢＣＡタンパク質アッセイ法（Ｐｉｅｒｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、米国）で測定したタンパク質含量に基づき作成した。
最少培地内での病原体由来タンパク質の発現及び標識
全細胞百日咳菌調製物のタンパク質分析用として、１４Ｎ−及び１５Ｎ−標識全細胞百日咳菌調製物の少量一定量から膜複合体を調製した。細菌細胞バッチを、７，０００ｇ（１５分、１０℃）で遠心分離し、そしてペレットを１０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ＝８．０中に再懸濁した。細胞膜を分離するためにかかる懸濁物を氷上で超音波処理し、６，５００ｇ（１０分、１０℃）で遠心分離し、そして上清を収集した。膜断片を遠心沈殿させ（４０，０００ｇ、１時間）、そして１％サルコシルを含む１０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ＝８．０中に回収した。膜複合体をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと呼ぶ）で泳動し、次いでタンパク質をポリフッ化ビニリデン膜に移した。公知の毒性因子であり、いずれもオランダのオランダワクチン研究所（Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から入手した、線維状赤血球凝集素（１：５００、クローン３１Ｅ５）、Ｐ．６９パータクチン（１：５０、クローンＰｅｍ４）、百日咳毒素サブユニット１（１：１，０００、クローン１５１Ｃ１）、百日咳毒素サブユニット４（１：１００、クローン１−２２７）、及び線毛２（１：１，０００、クローン２１Ｅ７）に対するモノクロナール抗体を用いて、当該膜について精査した（ウェスタンブロッティング法）。次いで、当該膜をアルカリホスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ（１：５，０００；ＳＢＡ、英国）と共にインキュベーションし、既製のＡＰコンジュゲート基質キット（Ｂｉｏｒａｄ、米国）を用いて信号を検出した。
代表的なタンパク質の例としてＰ．６９パータクチンを用いて、同位体標識効率を調べた。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した後に、１４Ｎ−及び１５Ｎ−標識６９ｋＤａバンドをゲルから切り出した。１４Ｎ−及び１５Ｎ−標識Ｐ．６９パータクチン、及びそのトリプシン消化物を、それぞれＬＣＭＳ（Ｐ．６９パータクチン）及びＬＣＭＳ／ＭＳ（消化物）で分析した。
１４Ｎ−及び１５Ｎ−標識ｒＰ．６９パータクチン調製物内のタンパク質の完全性、及び１４Ｎ−及び１５Ｎ−ＯＭＶ調製物内のＰｏｒＡの完全性、並びにタンパク質及びトリプシン消化物の同位体標識効率を、百日咳菌の膜複合体について上記した同様の技法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロッティング、ＬＣＭＳ、及びＬＣＭＳ／ＭＳ）により、具体的にはＰ．６９パータクチン、及びＰｏｒＡそれぞれをターゲティングすることにより評価した。ＰｏｒＡでは、血清亜型特異的モノクロナール抗体をウェスタンブロッティングで用いた。
実験アプローチＤ、Ｅ、及びＦにより、病原体関連ＭＨＣクラスＩＩリガンドームを発現するヒトＭＤＤＣバッチが得られる
アプローチＤでは、若干の修正を加えて、実験法Ｉに記載する手順に基づきヒトＭＤＤＣを培養した。ここでは、同意を得た上で、ＨＬＡ−ＤＲ２ホモ接合型血液ドナーから得た、白血球アフェレーシスのバッフィーコートを用いて１×１０９個のＰＢＭＣを単離した。第６日目に、依然未成熟のＭＤＤＣを、最終濃度がＯＤ５９０＝０．０２８である、１４Ｎ−及び１５Ｎ−標識全細胞百日咳菌調製物からなる１：１混合物でパルシングした。第８日目に、全細胞百日咳菌でパルシングしたＭＤＤＣを捕集し、ＰＢＳで洗浄し、そして計測した。次に、２０×１０６個のプールされたＭＤＤＣをペレット化、凍結し、そしてペプチドの単離及び分析を行うまで−８０℃で保存した。全細胞百日咳菌でパルシングする前後で、ＭＤＤＣの少量一定量（１％）を、フローサイトメトリーにより特徴づけを行って、ＭＤＤＣの純度並びに成熟度を確認した（図示せず）。
アプローチＥでは、上記のように若干の修正を加えた実験法Ｉに記載する手順に基づきヒトＭＤＤＣを調製した。ここでは、同意を得た上で、異なる血液バンクドナー９名から得た、いくつかのＨＬＡ−ＤＲタイピングからなる異種母集団を代表するＰＢＭＣを、別々に培養（３×１０８個のＰＢＭＣ／ドナー）してＭＤＤＣに成長させた。第６日目に、依然未成熟のＭＤＤＣを、ウマ流産菌（Ｓ．ａｂｏｒｔｉｓ ｅｑｕｉ）由来のＬＰＳが２０ｎｇ／ｍｌで存在し、最終タンパク質濃度が１０μｇ／ｍｌである、１４Ｎ−及び１５Ｎ−標識ｒＰ．６９パータクチン調製物からなる１：１混合物でパルシングした。第８日目に、ｒＰ．６９パータクチンでパルシングされたＭＤＤＣを捕集し（ｎ＝９）、ＰＢＳで洗浄し、プールし、そして計測した。次に、７０×１０６個のプールされたＭＤＤＣをペレット化、凍結し、そしてペプチドの単離及び分析を行うまで−８０℃で保存した。百日咳菌ｒＰ．６９パータクチンでパルシングする前後で、ＭＤＤＣの少量一定量（１％）を、フローサイトメトリーにより特徴づけを行って、ＭＤＤＣの純度並びに成熟度を確認した（図示せず）。
アプローチＦでは、上記の通り、若干の修正を加えた実験法Ｉに記載する手順に基づきヒトＭＤＤＣを調製した。ここでは、ＨＬＡ−ＤＲ１ホモ接合型ドナーから同意を得た上で、及びＨＬＡ−ＤＲ２ホモ接合型ドナーから同意を得た上で得たＰＢＭＣを別々に培養して（２×１０９個のＰＢＭＣ／ドナー）ＭＤＤＣに成長させた。第６日目に、各ＭＤＤＣバッチを２分量に分割し、ウマ流産菌（Ｓ．ａｂｏｒｔｉｓ ｅｑｕｉ）由来のＬＰＳが２０ｎｇ／ｍｌで存在し、タンパク質の最終濃度が２５μｇ／ｍｌである、１４Ｎ−及び１５Ｎ−標識Ｐ１．７−２，４ＯＭＶからなる、又は１４Ｎ−及び１５Ｎ−標識Ｐ１．５−２，１０ＯＭＶからなる１：１混合物のいずれか一方を用いてパルシングした。第８日目に、ＯＭＶでパルシングされた４つの異なるＭＤＤＣバッチを捕集、ＰＢＳで洗浄、計測、ペレット化、凍結し、及び個々のペプチドについて単離及び分析を行うまで−８０℃で保存した。ＯＭＶでパルシングする前後で、各ＭＤＤＣバッチの少量一定量（１％）を、フローサイトメトリーにより特徴づけを行って、ＭＤＤＣの純度並びに成熟度を確認した（図示せず）。
ペプチド合成
ＳＹＲＯ ＩＩ同時多品種ペプチド合成装置（ＭｕｌｔｉＳｙｎｔｅｃｈ ＧｍｂＨ、Ｗｉｔｔｅｎ、ドイツ）を用いて固相ＦＭＯＣケミストリーにより、合成ペプチド標準品を作製した。合成したペプチドの純度及び同一性を、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により評価した。
ＭＨＣクラスＩＩリガンドームの単離
下記のような若干の修正を加えながら、実験法Ｉに記載するＭＨＣクラスＩリガンドームの単離法に従い、ＭＨＣクラスＩＩ分子を可溶化し、次いで免疫化学により病原体関連ＭＨＣクラスＩＩリガンドームを単離するために、アプローチＤ、Ｅ、及びＦに基づき調製したＭＤＤＣバッチを解凍、溶解した。クリアステップでは、ヒトＨＬＡ−ＤＲ分子（クローンＢ８．１１．２）に特異的なマウス抗体を用い、また、１０％（ｖ／ｖ）酢酸でクリアカラムから溶出させた後、ＨＬＡ−ＤＲ分子及び関連ペプチドを１０ｋＤａ分子量カットオフメンブレンフィルターに通し、そして当該ろ過物を７０℃で１５分間加熱した。ＭＨＣクラスＩＩリガンドームの濃縮、再構成、スパイキング、及び保存は、実験法ＩのＭＨＣクラスＩリガンドームについて記載した手順と同様であった。
プラットフォームＬＣＭＳ分析
ペプチドサンプルを、エレクトロスプレーイオン化質量分析器に連結した最適化されたナノフロー液体クロマトグラフィー（プラットフォームＬＣＭＳ）により、本明細書にすでに記載したように分析した。１〜２×１０７個のＭＤＤＣに相当するペプチドサンプルの一定量を、改変されたＭｉｃｒｏＴｅｅチューブ要素を介して３μｍＣ１８粒子が緊密充填された、２５μｍＩＤの２５ｃｍ長の分析カラムに直列に接続しているＣ１８プレカラムにロードした。使用した移動相は、流速が３０ｎｌ／分で、アセトニトリル＋０．１Ｍ酢酸からなる緩やかなリニアグラジエントであり、１００％のＡ（水＋０．１Ｍ酢酸）から開始して、４５分間でＡが６０％アセトニトリル＋０．１Ｍ酢酸になるまでであった。カラムチップは、金コーティング及びカーボンコーティングされ、カラムヘッド圧力は＞２５０ｂａｒであった。質量スペクトルを、スキャン速度が１秒／スキャン、質量範囲が３００〜１，５００Ｄａ、及び質量分解能が少なくとも１０，０００ＦＷＨＭで記録した（ＭＳ分析）。
病原体関連ＭＨＣクラスＩＩエピトープ候補のＭＳ配列決定（ＭＳ／ＭＳ分析）では、ほとんどの場合、ペプチドサンプルの２番目の一定量を用いたが、ＭＳ１分析のサイクルは、事前に選択された質量に関する、又は質量分析器流入時において最も多く存在する質量に関する衝突誘起フラグメンテーションのサイクルにより変更された。ＭＳ／ＭＳスペクトルを、スキャン速度が１秒／スキャン、質量範囲が５０〜２，０００Ｄａ、及び質量分解能が５，０００ＦＷＨＭで取得した。最適衝突エネルギーは、エピトープの性質、及び用いた質量分析器に大きく依存したが、本実験では最適化された。ＭＳ／ＭＳスペクトルの解釈は、手作業で、又はソフトウェアツール、例えばＭａｓｃｏｔ（Ｐｅｒｋｉｎｓら、１９９９年、ｗｗｗ．ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ、Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．、Ｌｏｎｄｏｎ、英国）、ＰｒｏｔｅｉｎＰｒｏｓｐｅｃｔｏｒ（ｗｗｗ．ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、米国）、ＢｉｏＷｏｒｋｓ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、米国）及び／又はＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘ（商標）（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、米国）等を用いて実施した。
同定されたエピトープの定量化では、相対感度係数を計算したが、これは同定されたエピトープの合成類似体の強度−量を、標準ペプチドであるアンジオテンシン−ＩＩＩ及びオキシトシンの強度−量平均値で割ることに基づく。かかる係数は、細胞バッチ内に存在する天然エピトープの数を半定量化するために、その後用いられた。
オンライン２次元プラットフォームＬＣＭＳ分析
ペプチドを、エレクトロスプレーイオン化質量分析器に連結したオンライン２次元ナノスケール液体クロマトグラフィー（２Ｄ−ＬＣＭＳ）により分析した。１〜２×１０７個のＭＤＤＣに相当するペプチドサンプルの一定量を、弱アニオン交換粒子（例えば、ＰｏｌｙＷＡＸ ＬＰ（商標）、ＰｏｌｙＬＣ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＤ、米国、より市販されている）と、強カチオン交換粒子（例えば、ＰｏｌｙＳＵＬＦＯＥＴＨＹＬ Ａｓｐａｒｔａｍｉｄｅ（商標）、ＰｏｌｙＬＣ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＤ、米国、より市販されている）とからなり、乾燥粒子重量で２〜３の比で混合された混合物を含むプレカラム上にロードした。かかる混合されたアニオン−カチオン交換体（ＡＣＥ）固定相は溶融シリカチューブ内にスラリー充填されたものであり、Ｃ１８粒子を含む２つの（カラム）ベッド長（例えば、Ｒｅｐｒｏｓｉｌ−Ｐｕｒ（登録商標）Ｃ１８−ＡＱ、粒子サイズ５μｍ、ポアサイズ１２０Å、Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈより入手可能、ドイツ）の間に挟まれている。プレカラムベッドの各部分の長さは２０ｍｍであり、当該プレカラムの内径は５０μｍであった。Ｃ１８−ＡＣＥ−Ｃ１８サンドイッチプレカラムは、改変されたＭｉｃｒｏＴｅｅチューブ要素を介して３μｍＣ１８粒子が緊密充填された、２５μｍＩＤの２５ｃｍ長の分析カラムに直列に接続された（例えば、Ｒｅｐｒｏｓｉｌ−Ｐｕｒ（登録商標）Ｃ１８−ＡＱ、粒子サイズ３μｍ、ポアサイズ１２０Å、Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈより入手可能、ドイツ）。使用した移動相は、流速が３０ｎｌ／分で、アセトニトリル＋０．１Ｍ酢酸からなる緩やかなリニアグラジエントであり、１００％のＡ（水＋０．１Ｍ酢酸）から開始して、Ａが６０％アセトニトリル＋０．１Ｍ酢酸になるまでであった。カラムチップは、金コーティング及びカーボンコーティングされ、カラムヘッド圧力は＞２５０ｂａｒであった。質量スペクトルを、スキャン速度が１秒／スキャン、質量範囲が３００〜１，５００Ｄａ、及び質量分解能は少なくとも１０，０００ＦＷＨＭで記録した（ＭＳ分析）。それぞれ１ｎＭ、１μＭ、１０ｍＭ、１Ｍ、及び２Ｍの濃度となるようにギ酸及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の量が増加した水を含む塩を含まない溶出溶媒の一定量を注入することにより、これに続いて上記のアセトニトリル＋０．１Ｍ酢酸からなる緩やかなリニアグラジエント、及び質量分析条件を用いてペプチドの分離及びＭＳ分析を行うことにより、５回連続して注入、分析分離、及びＭＳ分析サイクルを実施した。
病原体関連ＭＨＣクラスＩＩリガンド候補の同定
自己由来リガンドから病原体由来ＭＨＣクラスＩＩリガンドを区別するために、必須の質量スペクトル情報（「質量値」及び「強度値」と定義する）を、ＭＳスペクトルから抽出し、そして質量スペクトルダブレットを探索するＭＨＣクラスＩＩ質量スペクトル解釈アルゴリズムに用いた。質量スペクトルのダブレットを病原体関連ＭＨＣクラスＩＩリガンドの候補として確実に帰属するためには、下記５つの基準が満たされなければならない：
（ｉ）「軽い」エピトープと「重い」エピトープのモノアイソトピック質量間の質量の差（Δｍ）は、「軽い」エピトープの質量の約１．２％でなければならない。かかる相対的な質量の差は、タンパク質及びペプチド中の窒素原子の平均自然発生率に基づく。各窒素原子の質量が１Ｄａだけ増加すると、元のペプチド／タンパク質について相対質量が１．２％増加する；
（ｉｉ）「軽い」エピトープと「重い」エピトープの荷電数（ｚ）は等しくなければならない；
（ｉｉｉ）「軽い」エピトープと「重い」エピトープの強度比は約１でなければならない；
（ｉｖ）「重い」エピトープの質量スペクトルパターンは、９８原子％濃縮１５Ｎ同位体の取込みを、［Ｍ＊−１］及び［Ｍ＊−２］同位体ピークとして可視化された状態で表さなければならない（Ｍ＊は、１５Ｎ同位体が均一に取り込まれた「重い」エピトープのモノアイソトピック質量を表す）
（ｖ）エピトープ候補に存在する計算で求めた窒素原子数は整数でなければならない。かかる数は「軽い」エピトープと「重い」エピトープのモノアイソトピック質量の絶対質量差（Δｍ）に、かかるエピトープの荷電数（ｚ）を乗ずることにより計算可能である。
図８（下段、右側のスペクトル）は、抗原でパルシングしたＭＤＤＣから抽出された病原体関連クラスＩＩリガンドについて、安定同位体を用い、上記基準を満たす場合のシミュレーション同位体パターンを示す。シミュレーションした同位体パターンをペプチド溶出物に関するＭＳスペクトルの質量軸に沿って、数学的に移動させることにより、病原体関連ＭＨＣクラスＩＩリガンド候補を探索した。一致した同位体クラスターを更なるＬＣＭＳ／ＭＳ分析用として選択した。
免疫リンパ球
Ｓａｎｑｕｉｎ（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）出身の健常血液バンクドナーから、同意を得た後に末梢血液を得た（Ｓ０３．００１５−Ｘ）。ｆｙｃｏｌｌ−ｈｙｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）上でバッフィーコート細胞を遠心分離して末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離し、そしてこれを新鮮な状態で使用し、又は実験で使用するときまで冷凍保存した。ＰＢＭＣを、２％ヒトＡＢ血清（Ｈａｒｌａｎ、米国）を補給した完全培地、すなわち、ＡＩＭ−Ｖ培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、米国）内で培養した。雌のｓｐｆ Ｂａｌｂ／ｃマウス、及びＣ５７ｂｌａｃｋ／６マウスをＨａｒｌａｎより購入し、従来条件下の舎内で飼育した。全ての実験は、ＮＶＩの動物倫理委員会（Ｔｈｅ Ａｎｉｍａｌ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の承認を受けた。マウス４匹からなる群について、０日目及び２８日目に、ｒＰ１．７−２，４、若しくはｒＰ１．５−２，１０（１．５μｇ）をＰＢＳ中に含む、ＬｐｘＬ１でアジュバンド添加されたリポソームで、又は実験法ＩＩの記載に従い調製したＰ１．７−２，４、若しくはＰ１．５−２，１０ ＯＭＶ（１．５μｇ ＰｏｒＡ／用量）を用いて皮下経由で免疫した。４２日目に切除後、臓器を機械的に分離し、ポアサイズ７０μｍのナイロンフィルターを通して、単一の脾細胞懸濁物及びリンパ節細胞懸濁物を得た。脾細胞懸濁物中の赤血球を、１０ｍＭ ＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ ＥＤＴＡを用い、４℃で２分間溶解した。脾細胞を完全ＩＭＤＭ−１０培地、すなわち１０％ＦＣＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ、米国）、及びｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ／ｇｌｕ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、米国）が補給されたイスコフ改変ダルベッコ培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、米国）に回収した。リンパ節細胞を、５％正常マウス血清（Ｈａｒｌａｎ、米国）、及びｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ／ｇｌｕが補給された完全ＩＭＤＭ−５培地に回収した。
ＰｏｒＡペプチド及びタンパク質
各Ｐ１．７−２，４及びＰ１．５−２，１０タンパク質全体に及ぶオーバーラッピング合成１８マーペプチドは、１２個のアミノ酸の重複部分を有し、前記のように調製されたが、これをスマートプーリング法により、すなわち各合成ペプチドが、８つのペプチドを含むプールのうち異なる２つのプールに現れるように１６種類のプール（Ａ〜Ｈ、及び１〜８）にプールした。すでに記載した髄膜炎菌Ｈ４４／７６の同質遺伝子系統に由来するＰｏｒＡ遺伝子を用いて、当技術分野で公知の組換えタンパク質発現技術により、組換えＰ１．７−２，４、及びＰ１．５−２，１０タンパク質（以後、ｒＰ１．７−２，４、及びｒＰ１．５−２，１０と呼ぶ）を得た。
増殖アッセイ
Ｐ．６９パータクチン特異的ヒト増殖アッセイでは、関連ペプチド（単数又は複数）の存在／不存在下、１５０μｌ／ウェル、１又は１０μＭ、３７℃の条件、５％ＣＯ２雰囲気の中にある完全培地内で１０５個のＰＢＭＣをインキュベーションした。ＰｏｒＡ特異的ヒト増殖アッセイでは、関連ペプチド（単数又は複数）、ペプチドプール、又はＰｏｒＡ ｒＰ１．７−２，４、Ｐ１．５−２，１０、Ｐ１．７，１６、Ｐ１．１９，１５、又はＰ１．２２，１４が表示の濃度で存在／不存在下、１５０μｌ／ウェル、３７℃の条件、５％ＣＯ２雰囲気の中にある完全培地内で、１０５個のＰＢＭＣ、又は２×１０４個のＭＢ７１．５Ｔ細胞をインキュベーションした。４日目に、サイトカインを判定するために１００μｌ容量を取り出した。次に、０．５μＣｉ（１８．５ｋＢｑ）３Ｈ−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ、米国）を、細胞を捕集する１８時間前に培養物に添加した。免疫脾細胞の増殖アッセイについては、ＣＰＭ測定及び結果の計算を実施した。少なくとも３つのウェルに基づき、結果をＳＩ±ＳＤで表した。完全培地中で、０．５μｇ／ｍｌの濃度のｒＰ１．５−２，１を用いて、ＭＢ７１ ＰＢＭＣを繰返しｉｎ ｖｉｔｒｏで再刺激することにより、領域４に特異的なＴ細胞系ＭＢ７１．５を産生させた。マウス増殖アッセイでは、Ｐ１．７−２，４、又はＰ．１５−２，１０で免疫されたＢａｌｂ／ｃ又はＣ５７Ｂｌａｃｋ／６マウスに由来する脾細胞を、ＩＭＤＭ−１０内にｒＰｏｒＡ若しくは１８マーオリゴペプチドが存在する、又は培地のみが存在する中、９６ウェル丸底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）において１．５×１０５個の細胞／１５０μｌにて培養した。４日目に、０．５μＣｉ（１８．５ｋＢｑ）３Ｈ−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ、米国）をウェルに添加し、細胞を更に１８時間培養した。細胞を捕集し、３Ｈ−チミジンの取込みを、Ｗａｌｌａｃ １２０５βプレート液体シンチレーションカウンターを用いて、カウント／分（ＣＰＭ）として求めた。結果を、抗原存在下の培養物のＣＰＭを、培地のみが存在する培養物のＣＰＭで割った商として算出した、３つのウェルに基づく刺激指数（ＳＩ）±ＳＤとして表す。
結果ＩＩ：ＭＨＣクラスＩＩリガンドーム
最少培地内でのタンパク質の発現、及び１４Ｎ及び１５Ｎ同位体ラベリング効率
実験法ＩＩのアプローチＤに記載するように作製された１４Ｎ−及び１５Ｎ−標識全細胞百日咳菌調製物の膜複合体中の細菌性タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ウェスタンブロッティング法で分析した。線維状赤血球凝集素、Ｐ．６９パータクチン、百日咳毒素サブユニット１と４、及び線毛２が１４Ｎ−及び１５Ｎ−標識調製物中に類似した割合で発現したが、これは重い同位体で標識された培地中で正常にタンパク質が発現したことを示唆する。１４Ｎ−及び１５Ｎ−Ｐ．６９パータクチンバンドから抽出されたタンパク質のＬＣＭＳ分析では、Ｐ．６９パータクチンタンパク質の重い形態は、その軽い形態と比較して１．２％の質量増加が確認された。更に、１４Ｎ−及び１５Ｎ−Ｐ．６９パータクチン由来のトリプシン消化物から得られたＭＳ／ＭＳスペクトルにより、重いアミノ酸、及び軽いアミノ酸への典型的なフラグメンテーションが明らかとなり、Ｐ．６９パータクチンタンパク質の全配列において、安定同位体標識が成功したことが確認された。
同様に、タンパク質の発現、及び１４Ｎ及び１５Ｎ−標識効率を、実験法ＩＩに基づき、ｒＰ．６９パータクチンについてアプローチＥに記載するように、髄膜炎菌に由来するＯＭＶ調製物についてアプローチＦに記載するように評価した。ｒＰ．６９パータクチン及びＰｏｒＡ調製物のそれぞれについて、全タンパク質においてタンパク質が完全であること、及び標識が成功したことが認められた。
実験アプローチＤにおけるＨＬＡ−ＤＲ２結合百日咳菌エピトープの同定
病原体関連ＨＬＡ−ＤＲリガンドを、実験法ＩＩに記載するように、１４Ｎ−及び１５Ｎ−標識全細胞百日咳菌調製物からなる１：１（ＯＤ／ＯＤ）混合物でパルシングしたＨＬＡ−ＤＲ２ホモ接合型ＭＤＤＣから抽出した。百日咳菌ＭＨＣクラスＩＩリガンド候補に相当する質量スペクトルのダブレットを、数学的な探索アルゴリズムを用いて、ＬＣＭＳスペクトル中で探索した。図１３（上段）は、７８８．９４Ｄａ及び７９７．４２Ｄａのｍ／ｚにおいて検出された一致する同位体クラスターの例を示し、１７個の窒素原子を含むエピトープ候補に相当する（図１３、挿入図）。エピトープのＭＳ／ＭＳスペクトル（図１３、下段）により、部分配列が明らかとなり、百日咳菌から得られた推定周辺タンパク質（受入番号ＣＡＥ４３６０６）に由来するエピトープとして同定された。６つのその他のスペクトルダブレットについても配列決定され、これらは、百日咳菌の４つの異なるタンパク質に由来する４つのエピトープの長さ変異体に相当した（表４）。内部標準を用いて当該エピトープの半定量化を行った。
実験アプローチＥにおけるＨＬＡ−ＤＲ結合百日咳菌ｒＰ．６９パータクチンエピトープの同定
病原体関連ＨＬＡ−ＤＲリガンドを、実験法ＩＩに記載するように、１４Ｎ−及び１５Ｎ−標識ｒＰ．６９パータクチンからなる１：１（ＯＤ／ＯＤ）混合物でパルシングしたＨＬＡ−ＤＲホモ接合型ＭＤＤＣプールバッチから抽出した。Ｐ．６９パータクチンＭＨＣクラスＩＩリガンド候補に相当する質量スペクトルのダブレットを、数学的な探索アルゴリズムを用いて、ＬＣＭＳスペクトル中で探索した。図１４（上段）は、７７０．４３Ｄａ及び７８０．３９Ｄａのｍ／ｚにおいてスペクトルダブレットとして検出された一致する同位体クラスターの例を示し、２０個の窒素原子を含むエピトープ候補に相当する（図１４、挿入図）。エピトープのＭＳ／ＭＳスペクトル（図１４、下段）により、Ｐ．６９Ｐｒｎ１（受入番号ＡＪ０１１０９１）の一致するペプチド配列ＬＲＤＴＮＶＴＡＶＰＡＳＧＡＰＡを含むｂ−タイプイオンシリーズが明らかとなった。全部で、５つのスペクトルダブレットについて配列決定され、これらは百日咳菌Ｐ．６９パータクチン由来の２つのエピトープ領域に関する長さ変異体に相当した（表５）。内部標準を用いて当該エピトープの半定量化を行った。
本発明者らは、健常成人ドナー集団から得られたＰＢＭＣを、エピトープに相当する合成標準品を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで再刺激することにより、２箇所百日咳菌Ｐ．６９パータクチンエピトープ領域の免疫原性をヒトで調査した。ＡＳＴＬＷＹＡＥＳＮＡＬＳＫＲＬＧ配列を含む第２のエピトープ領域では、少なくとも２名のドナーにおいて免疫認識が認められ（表５）、当該エピトープは機能的ヒトエピトープであることを示唆した。
実験アプローチＦにおけるＨＬＡ−ＤＲ１及び２結合髄膜炎菌エピトープの同定
実験法ＩＩの記載に従い、標識されたＯＭＶ調製物でパルシングした４つのＭＤＤＣバッチから、ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子とＰｏｒＡ血清亜型とからなる下記の組合せ：すなわち、ＨＬＡ−ＤＲ１／Ｐ１．７−２、４、ＨＬＡ−ＤＲ２／Ｐ１．７−２，４、ＨＬＡ−ＤＲ１／Ｐ１．５−２，１０、及びＨＬＡ−ＤＲ２／Ｐ１．５−２，１０でそれぞれ表されるような病原体関連ＨＬＡ−ＤＲリガンドを抽出した。Ｐ１．７−２，４又はＰ１．５−２，１０に由来するＭＨＣクラスＩＩリガンド候補に相当する質量スペクトルのダブレットを、数学的な探索アルゴリズムを用いてＬＣＭＳスペクトル中で探索した。図１５はスペクトルダブレットの２つの例、すなわち、ＨＬＡ−ＤＲ１／Ｐ１．７−２，４リガンドーム（Ａ図）では、１０６５．０１Ｄａ及び１０７６．４７Ｄａのｍ／ｚにおいて検出された１対の［ＭＨ２］２＋イオン、及びＨＬＡ−ＤＲ２／Ｐ１．５−２，１０リガンドーム（Ｂ図）では、７０１．０１Ｄａ及び７０８．６７Ｄａのｍ／ｚにおいて検出された１対の［ＭＨ３］３＋イオンを示している。両質量スペクトルダブレットにおける質量増加は、各エピトープ候補内に２４個の窒素原子が存在することを示唆する。１０６５．０１Ｄａのｍ／ｚにおける［ＭＨ２］２＋イオン、及び７０１．０１Ｄａのｍ／ｚにおける［ＭＨ３］３＋イオンのそれぞれについてＭＳ／ＭＳ配列決定を行うと、スペクトルが一致するＰｏｒＡ類似エピトープＳＰＤＦＳＧＦＳＧＳＶＱＦＶＰＩＱＮＳＫ（Ｐ１．７−２，４、Ｃ図）、及びＳＰＥＦＳＧＦＳＧＳＶＱＦＶＰＡＱＮＳＫ（Ｐ１．５−２，１０、Ｄ図）が明らかになった。総じて、実験法ＩＩに記載するように、アプローチＦに基づき調製された４つのリガンドームでは、３８個のスペクトルダブレットが、髄膜炎菌ＰｏｒＡに由来する８個のエピトープ領域から得られた長さ変異体、血清亜型変異体、及び／又はＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子特異的リガンドとして特徴づけられた（表６）。内部標準を用いて当該エピトープの半定量化を行った。天然に提示されるエピトープのうち、２８個が新規のＰｏｒＡ ＨＬＡ−ＤＲリガンドであったが、このうち１０個が公知の４つのエピトープ領域（領域１、３、７、及び８）に位置し、すでに記載された。したがって、新規４つの天然に提示されるＰｏｒＡエピトープ領域（領域２、４、５、及び６）が開示され、このうち領域２はヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞を刺激することが報告されている（Ｗｉｅｒｔｚら、１９９２年）。調査した全４リガンドームにおいて、領域８のエピトープが豊富に発現していた。ＨＬＡ−ＤＲ１／Ｐ１．７−２，４リガンドームについて質量スペクトルダブレットのＭＳ配列決定を行い、かかるエピトープ領域で２つの変異体が明らかとなったが、これらは、領域８リガンドーム全体の約１％に相当し、ＩＧＮＹＴＱＩＮＡＡＳＶＧコア配列を含み、但し、Ｃ−末端が＋１１４Ｄａ又は＋２７０Ｄａだけ延長しており、ＰｏｒＡ内のこれほどに高度に保存的な領域内にあるエピトープの天然型Ｃ−末端隣接残基とは一致しない（図１６）。かかる変異体、及びこの目的のために作製された合成標準品の、１４Ｎ−及び１５Ｎ−標識された対応部分のＬＣＭＳの特徴により、当該延長は、アミノ酸ＧＧ（若しくはＮ）又はＧＧＲ（若しくはＮＲ）をそれぞれ含むコア配列の非正統的な延長に一致し、かかる延長は分子内スプライシング事象に起因するはずであることが明らかになった。ＭＨＣクラスＩＩリガンドのスプライシングは記載されていない。ＭＨＣクラスＩＩリガンドのＰＴＭとして、初めてスプライシングが実証されたが、これは専用の免疫学実験デザイン及びＬＣＭＳと併用した安定同位体の利用に直接関連した結果である。したがって、ＭＨＣクラスＩＩリガンドのＰＴＭ現象について無知であることは、ＭＨＣクラスＩリガンドの場合もそうであるように、Ｔ細胞エピトープに関する本発明者らの知識にとって現実的脅威であり、解決されるべき上記アプローチを必要とする。
実験法のアプローチＦに記載するように、得られた４つのリガンドームの質量スペクトルダブレットについて総合的なＬＣＭＳ分析を行い、これから得られた別の結果として、ＰｏｒＡタンパク質に由来しない２４個の更なるエピトープが同定された。総じて、当該エピトープは、髄膜炎菌ＯＭＶ調製物に関連する１３種類の異なるタンパク質に由来する１８個のエピトープ（の長さ変異体）に相当した（表７）。かかる新知見により、エピトープ領域、及びＴ細胞の標的となり得る当該エピトープの各前駆体タンパク質が開示される。
オンライン２次元プラットフォームＬＣＭＳ技術を用いたＭＨＣリガンドームのハイスループット分析
ＭＨＣリガンドームのハイスループット分析を促進するために、アプローチＦに記載するＯＭＶでパルシングしたＭＤＤＣバッチに由来するＭＨＣクラスＩＩペプチドサンプルの同一物の半量を、オンライン２次元プラットフォームＬＣＭＳ技術で分析した。プラットフォームＬＣＭＳ分析を用いて、オフラインで調製されたアプローチＦのＳＣＸ分画についてすでに同定されているエピトープに加えて、オンライン２−Ｄアプリケーションにより、髄膜炎菌のＰｏｒＡ及び非ＰｏｒＡタンパク質に由来する、これまでに同定されていなかった１９個の更なるペプチドエピトープが、迅速且つサンプル消費量が少ないやり方で得られた（表８）。
ＭＨＣリガンドームは免疫原性及び防御と（相互に）相関している
したがって、この種類の分析を行うことにより、抗原由来の顕在しないＣＤ４Ｔ細胞エピトープ領域の多様性が明らかになるばかりでなく、Ｔ細胞反応の免疫原性及び質、並びに最終的なＰＴＭを制御するエピトープの相対的な量についても洞察がもたらされる。重要なこととして、本実施例が示すように、当該実験装置を同位体標識及び専用ＬＣＭＳ技術と併用すると、病原体抗原変異体、及びＴ細胞免疫におけるヒトＨＬＡ−ＤＲ多型の役割を調査するのに役立つ。複数の公知の髄膜炎菌ＰｏｒＡ血清亜型について配列アラインメントを行うと、表６に記載する天然に存在する領域のうち、３領域（領域１、４、及び５）においてマイクロ多型が生じていることが明らかとなった。本発明者らは、健常成人ドナーから得たＰＢＭＣ、及び免疫したＢａｌｂ／ｃマウス、及びＣ５７ｂｌａｃｋ／６マウスから得た脾細胞を用いて、新規のマイクロ多型領域である領域４の機能的役割について調査した。第１に、本発明者らは、Ｐ１．７−２，４又はＰ１．５−２，１０をそれぞれ有する様々なドナーから得たＰＢＭＣを繰返し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで再刺激することにより、ＳＰＤＦＳＧＦＳＧＳＶＱＦＶＰＩＱＮＳＫ（Ｐ１．７−２，４変異体、以後Ｄ／Ｉと呼ぶ）、又はＳＰＥＦＳＧＦＳＧＳＶＱＦＶＰＡＱＮＳＫ（Ｐ１．５−２，１０変異体、以後Ｅ／Ａ）それぞれに特異的なＴ細胞系が産生されるかどうか調べた。ドナー１名から、特異的Ｔ細胞系（ＭＢ−７１．５）が産生され、これはオーバーラッピング合成１８マーペプチドであるＰＥＦＳＧＦＳＧＳＶＱＦＶＰＡＱＮＳ（ｃｏｄｅ Ｓ０１１−２４）、及びＳＧＳＶＱＦＶＰＡＱＮＳＫＳＡＹＴＰ（ｃｏｄｅ Ｓ０１１−２５）でパルシングした自己抗原提示細胞を認識し、Ｐ１．７−２，４の対応部分に相当するオーバーラッピング合成１８マーペプチドである、ＰＤＦＳＧＦＳＧＳＶＱＦＶＰＩＱＮＳ（ｃｏｄｅ Ｓ００４−２９）、及びＳＧＳＶＱＦＶＰＩＱＮＳＫＳＡＹＴＰ（ｃｏｄｅ Ｓ００４−３０）ではなく、１．５−２，１０エピトープ変異体に相当する（図１７Ａ）。ＭＢ−７１．５ Ｔ細胞も増殖し（図１７Ｂ）、又はＰ１．５−２，１０タンパク質でパルシングした自己抗原提示細胞で刺激するとサイトカインを産生した（図示せず）。その他のＰｏｒＡ変異体、５種類からは、Ｐ１．５−１，２−２（Ｅ／Ａ）、及びＰ１．２２，１４（Ｄ／Ａ）変異体のみがＭＢ−７１．５ Ｔ細胞を再刺激したが、Ｐ１．７−２，４（Ｄ／Ｉ）、Ｐ１．７，１６（Ｅ／Ｉ）、又はＰ１．１９，１５（Ｄ／Ｉ）はそうではなく、これは、自然にプロセシングされる「領域４」エピトープのＣ−末端側半分に含まれるアラニン（Ａ）残基がＴ細胞認識に必須であることを示唆する。更に、テストした個体（ｎ＝５）のいずれからも、非Ｄ／Ｉ又はＡ／Ｉ特異的Ｔ細胞を検出することができた。前臨床動物試験で、本発明者らは同様の観察結果を得た：すなわち、Ｐ１．５−１，２−２（Ｐ１．５−２，１０のようなＥ／Ａ「領域４」変異体）で免疫したＢａｌｂ／ｃマウスから得た脾細胞は、Ｐ１．５−２，１０「領域４」ペプチドＳ０１１−２４、及びＳ０１１−２５に反応したが、Ｐ１．７−２，４特異的、領域４変異体Ｓ００４−２９、及びＳ００４−３０には反応しなかった（データは示されていない）。Ｐ１．７−２，４で免疫したマウスは、領域４に対して（測定可能な）Ｔ細胞反応を示さなかった（表９）。更に、Ｐ１．５−２，１０で免疫したＢａｌｂ／ｃマウスに由来するＴ細胞ハイブリドーマは、６野生型ＰｏｒＡ変異体存在下で、ヒトＭＢ−７１．５細胞と同じ反応パターンを有した（データは示されていない）。また、Ｃ５７ｂｌａｃｋ／６マウスでも、Ｐ１．７−２，４は、「領域４」に対して（測定可能な）Ｔ細胞反応を誘発することができなかったが、Ｐ１．５−１，２−２「領域４」は免疫原性であった。両ＰｏｒＡは、専用ＬＣＭＳ技術により同定された別のエピトープ領域、「領域６」に対するＴ細胞反応を等しく誘発することが可能であり、これは、Ｐ１．７−２，４はＴ細胞抗原として全く機能不能なわけではないことを示唆した（表９）。Ｐ１．７−２，４は、ヒトの他マウスにおいても殺菌性抗体を誘発する能力に乏しいが（参考文献１５及び１６）、これはワクチン開発上問題である。Ｂａｌｂ／ｃマウスでは、抗「領域４」脾細胞が増殖する程度は、各マウスにおいてＰ１．５−１，２−２に対する殺菌力価のレベルに相関した（Ｒ＝０．７８）。総じて、かかる免疫原性データにより、「領域４」はＰｏｒＡの重要な機能性Ｔ細胞エピトープとして位置づけられる。
考察：ＭＨＣクラスＩ及びＩＩリガンドーム
初めての試みとして、いくつかの方法を新規に組み合わせると、プラットフォームＬＣＭＳ技術と呼ばれる改良型ＬＣＭＳデバイスがもたらされ、これは標準的なＬＣＭＳ技術を用いたのでは、これまで限られた数のエピトープしか得られなかった、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩペプチドサンプルのエピトープマイニングに寄与した。更に、具体的なエピトープの特徴、例えば長さ、長さ変異体、量、及びＰＴＭが、本プラットフォーム技術により明らかにされた。
関連する免疫学的実験デザイン及び同位体標識を併用することで、本プラットフォームＬＣＭＳ技術は、先例のない高いレベルの精度と感度で、病原体関連ＭＨＣクラスＩ及びＩＩリガンドームを確実に同定することができる。
プラットフォームＬＣＭＳ技術は、必要とされるより長尺の、そしてより信頼性のある液体スプレープロセスと併用して低流速、高カラムヘッド圧力を可能にすることにより、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩリガンドーム分析でこれまでに用いられた（標準的な）ＬＣＭＳ法と、同技術そのものとを区別する。総じて、同技術はＭＳ／ＭＳサイクル時の強度及びイオンの滞留時間を向上させ、したがって、ＬＣＭＳ／ＭＳの同定性能を、優位的及び準優位的なペプチド種を確実に特徴づけることが可能なレベルまで高める。
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（参考文献）
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Claims (30)

  1. ポンプ構成物、分析カラム、エレクトロスプレーイオン化ユニット、及び質量分析器を備える、サンプルを分析するための液体クロマトグラフィー質量分析デバイスであって、ポンプ構成物が、分析カラムにナノスケールフローを提供するように構成、及び配置され、分析カラムが液体クロマトグラフィー用の固定相を備え、分析カラムが７０μｍ未満の内径を有し、エレクトロスプレーイオン化ユニットが、サンプルの流路における、前記分析カラムの下流に位置するエレクトロスプレーするためのエミッターを備え、前記エミッターが７０μｍ未満の内径を有し、質量分析器がエミッターの下流に位置し、エミッターが、サンプルをスプレーするための先細りの末端部を備え、前記先細りの末端部には、導電性１次コーティング物、及び保護２次コーティング物が設けられている、上記液体クロマトグラフィー質量分析デバイス。
  2. 分析カラム及びエミッターが５５μｍ未満の内径、好ましくは最大５５μｍの内径を有する、請求項１に記載の液体クロマトグラフィー質量分析デバイス。
  3. エミッターが分析カラムと一体的に形成されている、請求項１又は２に記載の液体クロマトグラフィー質量分析デバイス。
  4. 保護２次コーティング物がカーボン、好ましくは導電性カーボンセメントを含む、請求項１から３までのいずれか一項に記載の液体クロマトグラフィー質量分析デバイス。
  5. 保護２次コーティング物が、シリコン合金、又は電導性ポリマーである、請求項１から３までのいずれか一項に記載の液体クロマトグラフィー質量分析デバイス。
  6. エミッターの先細りの末端部が２０μ未満、好ましくは１０μｍ未満の内径を有する、請求項１から５までのいずれか一項に記載の液体クロマトグラフィー質量分析デバイス。
  7. 第１のコーティング物が金等の貴金属である、請求項１から６までのいずれか一項に記載の液体クロマトグラフィー質量分析デバイス。
  8. エミッターが、第１及び第２のコーティング物を備えた溶融シリカを含む、請求項１から７までのいずれか一項に記載の液体クロマトグラフィー質量分析デバイス。
  9. 液体クロマトグラフィーカラムからのサンプルなどのサンプルを受容するための上流末端部と、サンプルをエレクトロスプレーするための第２の先細りの末端部とを備える、ナノスケールフローのためのエミッターであって、エミッターがエレクトロスプレーイオン化ユニットの一部であり、エミッターが溶融シリカから形成され、最大５５μｍの内径を有し、エミッターの先細りの末端部が、金の導電性１次コーティング物、及び２次導電性カーボンベースコーティング物を備える、上記エミッター。
  10. 先細りの末端部近傍のエミッターの内径が最大１０μｍである、請求項９に記載のエミッター。
  11. ポンプ構成物、分析カラム、エレクトロスプレーイオン化ユニット、及び質量分析器を備える、サンプルを分析するための液体クロマトグラフィー質量分析デバイスであって、ポンプ構成物が、分析カラムにナノスケールフローを提供するように構成、及び配置され、分析カラムが液体クロマトグラフィー用の固定相を備え、分析カラムが７０μｍ未満の内径を有し、エレクトロスプレーイオン化ユニットが、サンプル流路における、分析カラムの下流に位置するエレクトロスプレーするためのエミッターを備え、前記エミッターが７０μｍ未満の内径を有し、質量分析器がエミッターの下流に位置し、液体クロマトグラフィー質量分析デバイスが少なくとも２次元のクロマトグラフィーを含み、１次元目は少なくとも強カチオン交換（ＳＣＸ）を含み、２次元目は逆相クロマトグラフィーを含み、溶出溶媒が一般に塩を含まない溶液である、上記液体クロマトグラフィー質量分析デバイス。
  12. 前記塩を含まない溶液が酢酸を含む、請求項１１に記載の液体クロマトグラフィー質量分析デバイス。
  13. 前記塩を含まない溶液がギ酸を含む、請求項１１又は１２に記載の液体クロマトグラフィー質量分析デバイス。
  14. ポンプ構成物、分析カラム、エレクトロスプレーイオン化ユニット、及び質量分析器を備える、サンプルを分析するための液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）デバイスであって、ポンプ構成物が、分析カラムにナノスケールフローを提供するように構成、及び配置され、分析カラムが、内径７０μｍ未満の空孔を有するチューブ要素により形成され、液体クロマトグラフィー用の固定相が前記空孔に収納され、エレクトロスプレーイオン化ユニットが、サンプル流路における、分析カラムの下流に位置するエレクトロスプレーするためのエミッターを備え、前記エミッターが７０μｍ未満の内径を有し、質量分析器が、エミッターの下流に位置し、ＬＣＭＳデバイスが、ＬＣＭＳデバイスの少なくとも２つのチューブ要素を接続するための接続要素を備え、前記チューブ要素が外径を有し、空孔が内径を有し、接続要素が、少なくとも２つのフェルール、及びフェルールを収納するための少なくとも２つの収納用の空孔を備え、前記フェルールが、チューブ部分を収納するのに適合した内径を有する内部空孔を有し、収納スペース内に収納された２つのフェルールがチューブ要素とアライメントされ、接続要素が、フェルールの内部空孔と接続し、及びアライメントされた内部ボリュームを備え、前記内部ボリュームが、チューブ部分の末端部を収納するように適合した、及びチューブ部分の末端部が内部ボリューム内で突合せ状態になるのを可能にする接続状態の内径を有する、上記液体クロマトグラフィー質量分析デバイス。
  15. 接続要素が、収納用の空孔内でフェルールを係止するための係止システムを備える、請求項１４、又は請求項７と組み合わせた請求項１から１３までのいずれか一項に記載の液体クロマトグラフィー質量分析デバイス。
  16. 内部ボリューム及びフェルール内部空孔の内径が、チューブ部分の外径に概ね等しい、請求項１４若しくは１５、又は請求項１４と組み合わせた請求項１から１３までのいずれか一項に記載の液体クロマトグラフィー質量分析デバイス。
  17. 接続要素が３方接続要素である、請求項１４から１６までのいずれか一項、又は請求項１４と組み合わせた請求項１から１３までのいずれか一項に記載の液体クロマトグラフィー質量分析デバイス。
  18. ３方接続要素の第３の接続が、内部ボリュームの出口を形成する、請求項１７に記載の液体クロマトグラフィー質量分析デバイス。
  19. 最大５５μｍの内径を有する内部空孔を有する少なくとも４５ｃｍ長のカラムを提供し、カラムの１つの末端部にフリットを設け、適する液体クロマトグラフィー固相材料をカラム内に充填することにより、液体クロマトグラフィーカラムを作製する方法であって、カラムが充填中に振動を受ける、上記方法。
  20. 最大５５μｍの内径を有する内部空孔を有する少なくとも４５ｃｍ長のカラムを提供し、カラムの１つの末端部にフリットを設け、適する液体クロマトグラフィー固相材料をカラム内に充填することにより、液体クロマトグラフィーカラムを作製する方法であって、液体クロマトグラフィー固相材料が、低粘度溶媒中のスラリーとして提供される、上記方法。
  21. 低粘度溶媒がアセトンである、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記低粘度溶媒の粘度が最大０．３５ｃＰである、請求項２０又は２１に記載の方法。
  23. 内径が最大３５μｍである、請求項１９から２２までのいずれか一項に記載の方法。
  24. カラムが溶融シリカカラムである、請求項１９から２３までのいずれか一項に記載の方法。
  25. エピトープを同定する方法における、請求項１から８までのいずれか一項、又は請求項１１から１８までのいずれか一項に記載のデバイスの使用。
  26. エピトープを同定する方法であって、
    ａ）ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩエピトープのうちの少なくとも１つのエピトープを含むサンプルを調製するステップであって、エピトープが抗原提示細胞によってプロセシング及び提示されるステップと、
    ｂ）エピトープを同定するために、請求項１から８までのいずれか一項、又は請求項１１から１８までのいずれか一項に記載するデバイスにおいて、ａ）で得られたサンプルを分析するステップと
    を含む、上記方法。
  27. 請求項２５又は２６に記載のエピトープを含む組成物を生成する方法であって、前記エピトープを含む分子の化学的合成及び組換え発現のうちの少なくとも１つを含む、上記方法。
  28. 請求項２５に記載の使用又は請求項２６に記載の方法により取得可能なエピトープ。
  29. 請求項２５若しくは２６に記載のエピトープ、又は前記エピトープを含む組成物の使用であって、このエピトープを有する病原体により引き起こされる疾患を予防及び／又は治療するためのワクチンの製造を目的とする、上記使用。
  30. 請求項２５若しくは２６に記載のエピトープ、又は前記エピトープを含む組成物の使用であって、哺乳動物の免疫状態を評価することを目的とする、上記使用。
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