CN115356425A - 一种应用于培养基上清蛋白定量的nanoHPLC-Titer系统 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种应用于培养基上清蛋白定量的nanoHPLC‑Titer系统。该系统包括nano亲和色谱柱、nanoHPLC色谱泵、自动进样系统和检测器。所述的nano亲和色谱柱的制备方法为：（1）取干净的色谱柱管，管末端使用筛板及两通封堵，将亲和色谱填料装填至色谱柱管中；（2）装填完成后，在色谱柱的入口端封上筛板及两通；（3）在色谱柱的正常使用压力下，使用流动相冲洗装好的色谱柱；（4）色谱柱冲洗完成后，将两端接口使用堵头密封待用。本发明开发了一套新型的nanoHPLC‑Titer系统，能够实现低浓度小体积上清样品的表达量测定，在蛋白定量分析领域具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生化检测领域，尤其涉及一种应用于培养基上清蛋白定量的nanoHPLC-Titer系统。
背景技术
高效液相色谱法（英语：high performance liquid chromatography，缩写HPLC），又译高效液相层析法，以前曾指高压液相层析法（high pressure liquidchromatography），是一种色谱分析技术，用来分离混合物，以确认并量化各个成分的比例。它依赖泵加压样品以令其通过填充有固定相的压力柱，导致样品的各个成分因与固定相的相互作用力不同而分离。高效液相色谱法常用于生物化学和分析化学。
现有的HPLC-Titer系统，虽然能准确测定细胞培养液上清中的蛋白表达量，但是由于使用的是常规色谱，因此需要的样品体积一般为毫升级别，且定量限约0.5 mg/mL。在细胞株筛选阶段，一般会先进行96孔板的铺板。由于96孔板中的培养基一般只有约100 μL，所以在96孔板阶段，一般不能做基于HPLC-titer的表达量分析。在一些项目中，会出现表达量低于0.1 mg/mL的样品，使用常规的HPLC-titer系统不能对这些样品准确定量。
综上，目前还没有一种行之有效的仪器分析手段，能够使用约10 μL体积的细胞培养液上清，对上清中的蛋白质进行定量，且定量限低于0.1 mg/mL。
发明内容
现有技术中的HPLC-Titer分析系统需要的样品体积大，定量限高，限制了其在定量分析中的作用，针对上述缺陷，本发明开发了一种应用于培养基上清蛋白定量的nanoHPLC-Titer系统，技术方案如下：
本发明的第一个方面公开了一种新型nanoHPLC-Titer系统，包括nano亲和色谱柱、nanoHPLC色谱泵、自动进样系统和检测器，其特征在于，所述的nano亲和色谱柱的制备方法为：
（1）取干净的色谱柱管，管末端使用筛板及两通封住，将亲和色谱填料装填至色谱柱管中；
（2）装填完成后，在色谱柱的入口端封上筛板及两通；
（3）在色谱柱的正常使用压力下，使用流动相冲洗装好的色谱柱；
（4）色谱柱冲洗完成后，将两端接口使用堵头密封待用。
进一步地，步骤（1）所述色谱柱管的材质为熔融石英毛细管，聚醚醚酮管或不锈钢管。进一步地，步骤（1）所述色谱柱管的内径小于等于500 μm。
进一步地，步骤（1）所述色谱柱管的管长为1-25 cm。
进一步地，步骤（1）所述的填料为Protein A填料，Protein G填料或Captol L填料。
进一步地，步骤（3）所述的流动相选自甲醇、乙腈、乙醇或异丙醇等有机相；或者前述有机相与水的混合物。
进一步地，自动进样系统至nano亲和色谱柱之间的死体积小于2 μL，nano亲和色谱柱至检测器之间的死体积小于1 μL。
本发明还公开了根据上述的新型nanoHPLC-Titer系统用于培养基上清蛋白定量的用途。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果：
（1）所需样品体积大幅下降，由1 mL（HPLC-Titer）降低至10 μL，缩小了100倍；
（2）定量限由0.5 mg/mL（HPLC-Titer）降低至0.01 mg/mL，降低了50倍。
附图说明
图1为本发明实施例1所装填的色谱柱图。
图2为本发明的nanoHPLC-Titer系统示意图，黑色连接线为连接管路。
图3为标准曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明的具体实施方式做进一步的详细描述。以下实施例和附图用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1 nano亲和色谱柱的制作
nano亲和色谱柱为自制色谱柱，其制备方法如下。使用的色谱柱管材质为熔融石英毛细管；使用的色谱管内径小于等于500 μm，管长1-25 cm之间。取一根干净的上述色谱柱管，管末端使用筛板及两通封住。将亲和色谱填料装填至色谱柱管中，使用的填料是Protein A填料。装填完成后，在色谱柱的入口端封上筛板及两通。在对应的色谱柱的正常使用压力下，使用流动相冲洗装好的色谱柱，冲洗时间大于等于1 h，使用的流动相是甲醇。色谱柱冲洗完成后，将两端接口使用堵头密封待用。在显微镜下观察色谱柱柱床是否密实完整，装填完成的色谱柱显微镜图见图1。
实施例2 nano亲和色谱柱的制作
nano亲和色谱柱为自制色谱柱，其制备方法如下。使用的色谱柱管材质为聚醚醚酮管；使用的色谱管内径小于等于500 μm，管长1-25 cm之间。取一根干净的上述色谱柱管，管末端使用筛板及两通封住。将亲和色谱填料装填至色谱柱管中，使用的填料是Protein G填料。装填完成后，在色谱柱的入口端封上筛板及两通。在对应的色谱柱的正常使用压力下，使用流动相冲洗装好的色谱柱，冲洗时间大于等于1 h，使用的流动相是乙腈。色谱柱冲洗完成后，将两端接口使用堵头密封待用。
实施例3 nano亲和色谱柱的制作
nano亲和色谱柱为自制色谱柱，其制备方法如下。使用的色谱柱管材质为不锈钢管；使用的色谱管内径小于等于500 μm，管长1-25 cm之间。取一根干净的上述色谱柱管，管末端使用筛板及两通封堵。将亲和色谱填料装填至色谱柱管中，使用的填料是Captol L填料。装填完成后，在色谱柱的入口端封上筛板及两通。在对应的色谱柱的正常使用压力下，使用流动相冲洗装好的色谱柱，冲洗时间大于等于1 h，使用的流动相是乙醇和水的混合物。色谱柱冲洗完成后，将两端接口使用堵头密封待用。
实施例4新型的nanoHPLC-Titer系统定量测定培养基上清蛋白
将实施例1中制备好的nano色谱柱安装在nano色谱仪中，nano色谱仪至少包括nano色谱泵、自动进样系统和检测器。通过合适管路的连接，确保自动进样系统至nano色谱柱之间的死体积小于2 μL，nano色谱柱至检测器之间的死体积小于1 μL。nanoHPLC-Titer系统图见图2。
将装有需要分析表达量样品的96孔板放入板式离心机，1000转离心10 min，每个样品孔分别取10 μL上清至锥形底色谱进样瓶。色谱分析时进样量1 μL。
使用磷酸盐缓冲液流动相稀释标准品，标准品为所预备分析的目标蛋白质：贝伐珠单抗。将标准品分别稀释至0.50 mg/mL、0.20 mg/mL、0.10 mg/mL、0.05 mg/mL、0.03 mg/mL、0.02 mg/mL、0.01 mg/mL，并使用Lunatic高通量微流控光谱分析仪测定其准确浓度。使用搭建的nanoHPLC-Titer系统依次分析得到的各浓度标准品工作液和样品，得到标准曲线（图3）和样品滴度值（表1）。
表1
结果显示标准曲线相关系数＞0.99，各浓度标准品工作液的谱峰的信噪比均大于10，且各浓度样品三重复RSD均小于10%。即本系统能够使用约10 μL体积的细胞培养液上清，对上清中的蛋白质进行定量，且定量限低至0.01 mg/mL。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种新型nanoHPLC-Titer系统，包括nano亲和色谱柱、nanoHPLC色谱泵、自动进样系统和检测器，其特征在于，所述的nano亲和色谱柱的制备方法为：
（1）取干净的色谱柱管，管末端使用筛板及两通封堵，将亲和色谱填料装填至色谱柱管中；
（2）装填完成后，在色谱柱的入口端封上筛板及两通；
（3）在色谱柱的正常使用压力下，使用流动相冲洗装好的色谱柱；
（4）色谱柱冲洗完成后，将两端接口使用堵头密封待用。
2.根据权利要求1所述的新型nanoHPLC-Titer系统，其特征在于，步骤（1）所述色谱柱管的材质为熔融石英毛细管，聚醚醚酮管或不锈钢管。
3.根据权利要求1所述的新型nanoHPLC-Titer系统，其特征在于，步骤（1）所述色谱柱管的内径小于等于500 μm。
4.根据权利要求1所述的新型nanoHPLC-Titer系统，其特征在于，步骤（1）所述色谱柱管的管长为1-25 cm。
5.根据权利要求1所述的新型nanoHPLC-Titer系统，其特征在于，步骤（1）所述的填料为Protein A填料，Protein G填料或Captol L填料。
6.根据权利要求1所述的新型nanoHPLC-Titer系统，其特征在于，步骤（3）所述的流动相选自甲醇、乙腈、乙醇或异丙醇这四种有机相；或者前述有机相与水的混合物。
7.根据权利要求1所述的新型nanoHPLC-Titer系统，其特征在于，自动进样系统至nano亲和色谱柱之间的死体积小于2 μL，nano亲和色谱柱至检测器之间的死体积小于1 μL。
8.根据权利要求1-7任一项所述的新型nanoHPLC-Titer系统用于培养基上清蛋白定量的用途。
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| Celma et al. | Simultaneous determination of new psychoactive substances and illicit drugs in sewage: potential of micro-liquid chromatography tandem mass spectrometry in wastewater-based epidemiology | |
| Liang et al. | Recent advances of online coupling of sample preparation techniques with ultra high performance liquid chromatography and supercritical fluid chromatography | |
| Kataoka et al. | Simple and rapid determination of amphetamine, methamphetamine, and their methylenedioxy derivatives in urine by automated in-tube solid-phase microextraction coupled with liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry | |
| Hyötyläinen | Principles, developments and applications of on-line coupling of extraction with chromatography | |
| Liu et al. | Automated on-line liquid chromatography–photodiode array–mass spectrometry method with dilution line for the determination of bisphenol A and 4-octylphenol in serum | |
| Callahan et al. | Profiling of polar metabolites in biological extracts using diamond hydride‐based aqueous normal phase chromatography | |
| CN110208401B (zh) | 固相脱水萃取-超临界流体色谱-质谱在线分析系统及方法 | |
| Desai et al. | Analysis of native amino acid and peptide enantiomers by high‐performance liquid chromatography/atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry | |
| Gou et al. | On‐line coupling of in‐tube solid phase microextraction (SPME) to HPLC for analysis of carbamates in water samples: Comparison of two commercially available autosamplers | |
| López et al. | Development of a mixed-mode solid phase extraction method and further gas chromatography mass spectrometry for the analysis of 3-alkyl-2-methoxypyrazines in wine | |
| CN115356425A (zh) | 一种应用于培养基上清蛋白定量的nanoHPLC-Titer系统 | |
| Santos-Neto et al. | Simultaneous analysis of five antidepressant drugs using direct injection of biofluids in a capillary restricted-access media-liquid chromatography–tandem mass spectrometry system | |
| Arinobu et al. | High-throughput determination of theophylline and caffeine in human serum by conventional liquid chromatography-mass spectrometry | |
| Teske et al. | Determination of cannabinoids by gas chromatography–mass spectrometry and large-volume programmed-temperature vaporiser injection using 25 μl of biological fluid | |
| Presta et al. | Determination of flavonoids and resveratrol in wine by turbulent-flow chromatography-LC-MS | |
| Cheng et al. | Supported liquid extraction (SLE) in LC‐MS bioanalysis | |
| Hooijschuur et al. | In‐line sample trap columns with diatomite for large‐volume injection in CZE–IM–MS | |
| Felgate et al. | The determination of Δ9-tetrahydrocannabinol and 11-nor-9-carboxy-Δ9-tetrahydrocannabinol in whole blood using solvent extraction combined with polar solid-phase extraction | |
| Walles et al. | Comparison of sub‐2‐μm particle columns for fast metabolite ID | |
| Xia et al. | Utility of porous graphitic carbon stationary phase in quantitative liquid chromatography/tandem mass spectrometry bioanalysis: quantitation of diastereomers in plasma | |
| Magic | Determination of β-cetotetrine in plasma and urine using high-performance liquid chromatography with electrochemical detection | |
| Rogatsky et al. | Two‐dimensional reverse phase‐reverse phase chromatography: A simple and robust platform for sensitive quantitative analysis of peptides by LC/MS. Hardware design | |
| Yang et al. | Determination of M+ 4 stable isotope labeled cortisone and cortisol in human plasma by µElution solid‐phase extraction and liquid chromatography/tandem mass spectrometry | |
| Šatínský et al. | On-line coupling of sequential injection extraction with restricted-access materials for sample clean-up and analysis of drugs in biological matrix | |
| Santos et al. | Integrated 2‐D CE |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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