KR20110084182A - Ｌｃｍｓ 기술 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 향상된 LCMS 기술 및 이를 면역원 병원체 에피토프의 선택적 식별 및 특성화를 위한 방법에 사용하는 용도, 및 이를 백신 개발에 사용하는 용도에 관한 것이다. T 세포 에피토프에 대한 지식 격차를 연결하는 한 방법은 추출된 펩타이드 시료의 나노스케일 질량 분광계에 의해 항원 표출 세포의 표면에서 에피토프 디스플레이를 직접 평가하기 위해 새로운 플랫폼 기술, "면역프로테오믹스"를 적용하는 것이다. 이는 병원체-유래 단백질로부터 기원한 T 세포 에피토프의 정확한 분자 특성, 다양성, 존재비, 역학범위 및 PTM과 같은 에피토프 특징들을 공정하게 통찰할 수 있는 방법이다. 따라서, 이러한 플랫폼 기술 및 면역프로테오믹스는 백신학의 고유 부분이 되어야 한다.
Description
본 발명은 향상된 LCMS 기술 및 이를 면역원 에피토프의 선택적 식별 및 특성화를 위한 방법에 사용하는 용도, 및 이를 백신 개발에 사용하는 용도에 관한 것이다.
면역 시스템의 T 세포에 의한 면역원 병원체-관련 에피토프의 특이적 리셉터-매개 인식은 감염성 질병에 대한 면역력을 보호하기 위한 기초이다. 충분히 자극적인 환경하에서 초기 인식 후, 이러한 에피토프는 특정 T 세포의 클로날 집단의 확장, 분화 및 유지를 유도한다. 감염 도중에 이러한 T 세포 집단은 병원체를 무장해제시키고 제거한다. 그 후, T 세포 집단은 강한 수축을 겪지만, 소 분획은 특정 항원과 다시 접하게 될 때 신속한 메모리 반응을 시작하도록 유지된다. 이러한 개념은 백신 개발에 채택된다. 감염성 질병에 대한 백신은 특정 메모리 T 세포의 보호 수준의 생성을 유도하기 위해 관련 병원체-유래 에피토프에 면역 시스템을 노출시켜야 한다.
병원체 관련 T 세포 에피토프는 항원 표출 세포(이후 APC라 함)의 세포 표면에서 주요 조직 적합 유전자 복합체(이후 MHC라 함) 분자의 리간드와 같이 세포내 프로세싱 후 노출된 병원체-암호 단백질의 소 단백질 프레그먼트이다. MHC 분자에 의한 펩타이드 에피토프의 절제, 생존, 경합 및 최후의 표출에 대해 책임있는 프로세스 및 효소는 거의 이해되고 있지 않다. 두 타입의 MHC 분자가 T 세포의 두 기능성 부류에 대한 에피토프 표출에 관련된다. MHC 클래스 I 분자는 CD8+ T 세포에 에피토프를 표출하는 반면, MHC 클래스 II 분자는 CD4+ T 세포에 에피토프를 각각 표출한다.
미래의 백신을 디자인하기 위해, T 세포 에피토프에 대한 새로운 생각이 요구된다. 특히 고 가변성 표면 항원을 디스플레이하는 병원체에 대해 또는 (새로이) 출현하는 병원체에 대해 보호용 T 에피토프 및 이의 항원은 회피되도록 유지된다.
본 발명자들은 병원체-관련 에피토프의 두 구별가능한 부류, MHC 클래스 I 리간돔 및 MHC 클래스 II 리간돔에 있어서 당 기술분야의 현재 상태에서 지식 격차가 현재 백신학에서의 주요 컨벤션에 의해 유지되고 있음을 현재 알게되었다.
우선, 게놈-기초 항원 발견(리버스 백신학)이 백신학에 들어왔으며, 전체 병원체 프로테옴이 나타나기 시작하였다. 면역정보학에 의해, 후보 보호 항원일 수 있는 주요 박테리아 병독성 인자 및 바이러스 표면 항원과 같은 표면 구조가 인 실리코(in silico)로 예측된다. 그 다음, 리버스 백신학 방법은 재조합 항원 발현 기술 및 실험 동물에서 면역원성 연구를 필요로 한다. 실제로, 이 방법은 PorA 베이즈드 나이세리아 메닝지티디스(Neisseria meningitidis) 혈청군 B 백신에 대한 대체물로서 성공적으로 유망한 백신 후보의 선별을 이끌어 내었다(Masignani et al. 2002). 그러나, 그럼에도 불구하고 에피토프에 대한 지식 격차는 남아있다. 리버스 백신학 방법: (i) 병원체의 내부 단백질인 경우 리버스 백신학은 면역우성적 T 세포 항원을 드러내지 않을 것이며, 그리고 (ii) 동물에서의 면역원성은 사람에서의 면역원성 및 면역우성에 대해 예측될 수 없다.
둘째, 후보 단백질, 알고리즘-예측 에피토프 또는 심지어 고 처리 MHC 바인딩 및 T 세포 어세이에서 오버래핑 합성 펩타이드로서 전체 프로테옴으로 부터 얻어진 합성 펩타이드 세트의 사용에 기초한 고전적인 T 세포 에피토프 식별 방법은 병원체-관련된 것을 포함하는 상당한 수의 T 세포 에피토프의 생성이 예측되었다. 그러나, 본 발명자들은 이러한 방법이 다음과 같이 제한적인 것으로 고려된다: 이러한 통상적인 방법은 각각 에피토프의 생존, 선별 및 경합에 대조적으로 세포내 자연적 프로세싱, 파괴의 영향 뿐만 아니라, 감염중에 그리고 다른 세포 타입에 대한 T 세포 에피토프의 일차 서열, 다양성, 정확한 분자 길이 및 길이 다형성, 풍부, 자연적 변이 및 궁극적인 역학 관계와 같은 에피토프 특징의 면역원성에 대한 중요성을 부인한다. 또한, T 세포 에피토프는 일반적으로 일차 유전자 서열의 트루 인 실리코(true in silico) 예측가능 번역으로 간주된다. 그러나, 인산화, 글리코실화, 디아미드화, 메틸화 및 스플라이싱 뿐만 아니라 게놈의 아웃 오브 프래임 번역을 포함하는 일차 단백질 서열의 여러 타입의 번역후 변형(이후 PTM이하 함)은 인 실리코 프로테오믹스만으로 기초하여 예측된 것보다 상당히 보다 다양한 면역학적으로 관련된 에피토프의 집단이 형성될 수 있다는 증거가 축적되고 있다(Temmerman et al. 2004, Engelhard et al. 2006).
또한, 본 발명자들은 '둘째'하에서 상기한 바와 같이 T 세포 에피토프를 식별하는 기술은 관심있는 병원체에 대해 보통 이전 감염을 잔존시킴으로써 면역이 된 개체로부터 분리된 주변 혈 단핵 세포(PBMC)의 시험관내 반응에 의존하는 것을 알게 되었다. 전형적으로, 이러한 개체는 병원체가 드물거나 새로이 출현된 경우 매우 드물다. 따라서, 감염성 질병을 유발시키는 것과 관련된 에피토프 식별은 이전에 감염된 개체로부터 PBMC의 사용에 독립적인 새로운 기술에 기초해야한다.
또한, 본 발명자들은 병원체-관련 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 에피토프 리간드(소위 리단돔)의 식별은 기술적으로 최종적인 정량적이고 질적인 민감도가 요구되는 도전이 요구되고 있음을 알게 되었다. 다양한 실험실의 개척적인 작업은 액체 크로마토그래피(LCMS)와 결합된 질량 스펙트럼 분석이 이러한 타입의 리간돔으로 편파적이지 않은 통찰을 제공하기 위한 단연 가장 유용한 분석 도구임을 나타내었다(Hunt et al. 1992). 그러나, 현재의 방법은 병원체-유래 단백질로부터 기원한 면역유발 에피토프의 정확한 서열, 다양성, 풍부, PTM 및 역학 관계와 같은 에피토프 특징에 편파적이지 않은 통찰을 얻기위한 충분한 면역학적 및 기술학적 민감도, 및 선별성을 달성하지 못한다. 따라서, 병원체-관련 에피토프에 대한 지식 격차를 연결하기 위해 백신학에서 '면역프로테오믹스'가 요구되는 실정이다. 그제서야 면역원성 및 보호성 에피토프를 진실되게 인식할 수 있을 것이고 병원체가 이들의 특이적 인식을 회피할 수 있는 전략을 이해할 수 있을 것이다. 그러나, 방법론의 주요 개선이 없이는 현재까지 알려진 에피토프 빙산의 일각 아래에 무엇이 있는지 통찰할 수 없다.
MHC 에피토프 분석은 매우 도전적이다. APC상에 MHC 분자는 큰 농도 범위로 매우 다양한 다른 펩타이드 에피토프를 표출한다. 이 시스템의 민감도는 완치시 컬럼상에 10-100 attomole의 펩타이드 질량과 동등한 107-108 cells을 함유하는 APC 세포 배양물의 추출물에서, 세포당 단일 카피로 발현될 경우에도 병원체-관련 에피토프를 검출하기에 충분해야한다. 상기 시스템의 선별성은 수십만개의 다른 관련 MHC 에피토프 중에서 이러한 개체 에피토프를 식별하기에 충분해야 한다.
본 출원은 포괄적인 에피토프 발굴시 민감도, 범위 및 역학 범위와 관련된 컬럼 기술에 있어 향상을 개시한다. 따라서, 본 발명의 목적은 단일 분석 에피토프 시료에서 보호성 T 세포에 의해 MHC 클래스 I 및 II 리간드로 인지되는 면역성 병원체-관련 에피토프를 민감하고, 선별적이며 단순한 형태로 식별할 수 있는 새로운 플랫폼 기술을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 이러한 목적이 3가지 발견을 결합함으로써 해결되는 것을 알게 되었다: (i) 고 복합 펩타이드 혼합물에서 미량의 미지 펩타이드 종의 검출 및 식별을 위한 향상된 고 민감성의 강력한 플랫폼 LCMS 기술을 (ii) 각 부류의 면역원성 병원체-관련 에피토프를 이의 공급 단백질로부터 그리고 하나의 단일 용액으로 관련 방식으로 유리시키는 맞춤(tailor-made) 시험관내 면역학적 실험 디자인 및 (iii) 시료에서 관련 병원체-관련 에피토프의 신속하고 분명한 인지 및 식별을 촉진하는 항원의 선택적 화학 또는 물리적 변형의 (임의의) 적용과 병합한다.
액체 크로마토그래피-질량 스텍트로미터(LCMS) 장치는 US 2002/146349에 알려져 있으며, 이는 본 명세서에 참고문헌으로 편입되며, 특히 상기 장치의 견지와 관련되어 참고문헌으로 편입된다.
LCMS 장치의 목적
시료에서 분석물(여기서 펩타이드)의 크로마토그래프 분리는 액체 크로마토그래피(LC) 컬럼을 사용하여 수행된다. 바람직하게, 컬럼의 내부 직경 및 길이는 다음과 같이 되도록 한다:
(i) 가능한 가장 높은 민감도가 (ii) 최대 분리 효율과 함께 획득된다.
본 발명의 목적은 나노스케일 컬럼이 장착된 향상된 LCMS 장치를 제공하는 것이다. 본 출원에서 LCMS 장치의 다른 견지가 향상된다. 향상된 LCMS 플랫폼이 제공된다. 향상된 LCMS 플랫폼은 종래 기술의 LCMS 플랫폼에 비해 보다 정밀한 분석이 가능한 것으로 입증되었다.
본 발명의 다른 목적은 현저히 보다 긴 총 분석 시간이 이루어질 수 있도록 하는 것이다.
본 발명의 일 견지는 액체 크로마토그래피 질량 스펙트럼 분석(LCMS) 장치에 관한 것이다. LCMS 장치를 이용한 분석을 위한 향상된 방법이 제공된다. 이의 부품을 제조하기 위한 보다 향상된 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 견지는 크로마토그래피, 특히 2차원 액체 크로마토그래피 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 견지는 무염 2차원 고성능 나노스케일 액체 크로마토그래피 분리 기술에 관한 것이다.
다른 견지에 따르면, 본 발명은 액체 크로마토그래프, 특히 액체 크로마토그래프 질량 스펙트럼 분석 적용에 사용되는 나노스케일 액체 크로마토그래피 컬럼 및 이러한 컬럼의 제조에 관한 것이다.
본 발명의 다른 견지는 액체 크로마토그래프, 바람직하게 일렉트로 스프레이 이온화 질량 스펙트럼 분석(LC-ESI/MS)시 컬럼과 함께 사용되는 ESI(Electro Spray Ionisation) 에미터 및 이러한 에미터의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 견지는 나노스케일 LC 컬럼을 연결하기 위한 커넥션 및 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 견지는 나노스케일 액체 크로마토그래프 컬럼에서 (제로-데드 볼륨) 연결을 위한 커넥션 및 방법에 관한 것이다. 일 구현으로, 좁은 보어(모세관) 나노스케일 액체 크로마토그래프 컬럼이 제공된다.
다른 견지로, 본 발명은 본 발명의 LCMS 장치를 에피토프의 식별을 위한 방법에 사용하는 용도에 관한 것이다.
다른 견지로, 본 발명은 a) MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 에피토프(리간돔) 중 적어도 하나를 포함하며, 이때 상기 에피토프는 항원 표출 세포에 의해 프로세싱되고 표출되는 시료를 준비하는 단계; 및 b) a)에서 획득된 시료를 본 발명의 LCMS 장치에서 분석하는 단계를 포함하는, 에피토프를 식별하는 방법에 관한 것이다.
일 견지로, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 식별된 에피토프를 포함하는 분자의 화학적 합성 및 재조합 발현 중 적어도 하나를 포함하는, 본 발명의 방법에 따라 식별된 에피토프를 포함하는 조성물을 생성하는 방법에 관한 것이다.
다른 일 견지로, 본 발명은 본 발명의 LCMS 장치의 사용 및/또는 본 발명의 에피토프 식별 방법에 의해 획득가능한 에피토프에 관한 것이다.
본 발명의 다른 견지는 본 발명에 따라 식별된 에피토프의 용도 및 상기 에피토프를 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다. 상기 에피토프 또는 상기 에피토프를 포함하는 조성물은 이러한 에피토프를 운반하는 병원체에 의해 야기되는 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 백신의 제조용으로 사용되거나, 포유류의 면역 상황을 평가하기 위해 사용된다.
도 1은 1차 구현으로 LCMS 셋업의 개요도이며;
도 2는 2차 구현으로 LCMS 셋업에서 전기 스프레이 및 전기 스프레이와 함께 사용되는 분석 컬럼에 대한 이의 조립을 위한 에미터의 단면도이며;
도 3a-3d는 2차 구현에 따라 팁을 제조하는 방법을 도식적으로 나타낸 것이며;
도 4는 3차 구현에 따른 연결 요소의 단면도를 나타낸 것이며;
도 5는 분석 컬럼을 패킹하는 방법에서 일 단계의 단면을 나타낸 것이며;
도 6은 분석 컬럼을 패킹하는 방법에서 제 2 단계를 나타낸 것이며;
도 7은 7차 구현으로 트래핑 컬럼을 도식적으로 나타낸 것이며;
도 8은 MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II 분자에 의해 표출되는 T 세포 에피토프의 할당에 대한 질량 스펙트럼 인식 패턴을 도식적으로 나타낸 것이며;
도 9는 복합 시료 분석시 LCMS 기술에서 결합된 향상성의 유용성을 나타낸 것이다.
도 10은 복합 시료 분석시 고 품질 나노스케일 LC 기술의 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 휴먼 MDDC로부터 MHC 리간돔의 LCMS 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 바이러스 감염-관련 상향조절된 MHC 클래스 I 셀프 에피토프의 LCMS 식별을 가이드하는 안정한 동위원소 표지의 사용 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 복합 병원체 전 세포 제조물로부터 병원체-유래 MHC 클래스 II 리간드의 LCMS 식별을 가이드하는 안정한 동위원소의 사용 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 단일 재조합 발현 단백질로부터 병원체-유래 MHC 클래스 II 리단드의 LCMS 식별을 가이드하는 안정한 동위원소의 사용 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 박테리아 막 제조물로부터 병원체-유래 MHC 클래스 II 리간드의 LCMS 식별을 가이드하는 안정한 동위원소의 사용 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 예기치 않은 PTM으로 MHC 클래스 II 에피토프의 식별을 가능케 하는 안정한 동위원소의 사용 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 휴먼 MB71.5 T 세포에 의한 P1.5-2,10 및 P1.7-2,4 '리전 4' 에피토프의 다른 인식을 나타낸 것이다.
도 2는 2차 구현으로 LCMS 셋업에서 전기 스프레이 및 전기 스프레이와 함께 사용되는 분석 컬럼에 대한 이의 조립을 위한 에미터의 단면도이며;
도 3a-3d는 2차 구현에 따라 팁을 제조하는 방법을 도식적으로 나타낸 것이며;
도 4는 3차 구현에 따른 연결 요소의 단면도를 나타낸 것이며;
도 5는 분석 컬럼을 패킹하는 방법에서 일 단계의 단면을 나타낸 것이며;
도 6은 분석 컬럼을 패킹하는 방법에서 제 2 단계를 나타낸 것이며;
도 7은 7차 구현으로 트래핑 컬럼을 도식적으로 나타낸 것이며;
도 8은 MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II 분자에 의해 표출되는 T 세포 에피토프의 할당에 대한 질량 스펙트럼 인식 패턴을 도식적으로 나타낸 것이며;
도 9는 복합 시료 분석시 LCMS 기술에서 결합된 향상성의 유용성을 나타낸 것이다.
도 10은 복합 시료 분석시 고 품질 나노스케일 LC 기술의 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 휴먼 MDDC로부터 MHC 리간돔의 LCMS 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 바이러스 감염-관련 상향조절된 MHC 클래스 I 셀프 에피토프의 LCMS 식별을 가이드하는 안정한 동위원소 표지의 사용 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 복합 병원체 전 세포 제조물로부터 병원체-유래 MHC 클래스 II 리간드의 LCMS 식별을 가이드하는 안정한 동위원소의 사용 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 단일 재조합 발현 단백질로부터 병원체-유래 MHC 클래스 II 리단드의 LCMS 식별을 가이드하는 안정한 동위원소의 사용 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 박테리아 막 제조물로부터 병원체-유래 MHC 클래스 II 리간드의 LCMS 식별을 가이드하는 안정한 동위원소의 사용 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 예기치 않은 PTM으로 MHC 클래스 II 에피토프의 식별을 가능케 하는 안정한 동위원소의 사용 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 휴먼 MB71.5 T 세포에 의한 P1.5-2,10 및 P1.7-2,4 '리전 4' 에피토프의 다른 인식을 나타낸 것이다.
본 발명의 일 견지는 액체 크로마토그래피 질량 스펙트럼 분석(LCMS) 장치에 관한 것이다. LCMS 장치를 이용한 분석을 위한 향상된 방법이 제공된다. 이의 부품을 제조하기 위한 보다 향상된 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 견지는 크로마토그래피, 특히 2차원 액체 크로마토그래피 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 견지는 무염 2차원 고성능 나노스케일 액체 크로마토그래피 분리 기술에 관한 것이다.
다른 견지에 따르면, 본 발명은 액체 크로마토그래프, 특히 액체 크로마토그래프 질량 스펙트럼 분석 적용에 사용되는 나노스케일 액체 크로마토그래피 컬럼 및 이러한 컬럼의 제조에 관한 것이다.
본 발명의 다른 견지는 액체 크로마토그래프, 바람직하게 일렉트로 스프레이 이온화 질량 스펙트럼 분석(LC-ESI/MS)시 컬럼과 함께 사용되는 ESI(Electro Spray Ionisation) 에미터 및 이러한 에미터의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 견지는 나노스케일 LC 컬럼을 연결하기 위한 커넥션 및 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 견지는 나노스케일 액체 크로마토그래프 컬럼에서 (제로-데드 볼륨) 연결을 위한 커넥션 및 방법에 관한 것이다. 일 구현으로, 좁은 보어(모세관) 나노스케일 액체 크로마토그래프 컬럼이 제공된다.
다른 견지로, 본 발명은 본 발명의 LCMS 장치를 에피토프의 식별을 위한 방법에 사용하는 용도에 관한 것이다.
다른 견지로, 본 발명은 a) MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 에피토프(리간돔) 중 적어도 하나를 포함하며, 이때 상기 에피토프는 항원 표출 세포에 의해 프로세싱되고 표출되는 시료를 준비하는 단계; 및 b) a)에서 획득된 시료를 본 발명의 LCMS 장치에서 분석하는 단계를 포함하는, 에피토프를 식별하는 방법에 관한 것이다.
일 견지로, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 식별된 에피토프를 포함하는 분자의 화학적 합성 및 재조합 발현 중 적어도 하나를 포함하는, 본 발명의 방법에 따라 식별된 에피토프를 포함하는 조성물을 생성하는 방법에 관한 것이다.
다른 일 견지로, 본 발명은 본 발명의 LCMS 장치의 사용 및/또는 본 발명의 에피토프 식별 방법에 의해 획득가능한 에피토프에 관한 것이다.
본 발명의 다른 견지는 본 발명에 따라 식별된 에피토프의 용도 및 상기 에피토프를 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다. 상기 에피토프 또는 상기 에피토프를 포함하는 조성물은 이러한 에피토프를 운반하는 병원체에 의해 야기되는 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 백신의 제조용으로 사용되거나, 포유류의 면역 상황을 평가하기 위해 사용된다.
본 발명의 이러한 모든 견지는 다음과 같이 설명된다.
LCMS 장치
일 구현으로, LCMS 장치는 컬럼, 바람직하게는 크로마토그래피 수행용 나노스케일 컬럼을 포함한다. LCMS 장치는 분당 나노리터(nl/min)의 범위내 흐름속도로 작동하도록 배열 및 구성된 액체 크로마토그래피(LC) 컬럼을 포함한다. 이러한 나노스케일 컬럼은 질량 스펙트로미터(MS)에서 향상된 분석이 이루어지는 크로마토그래프 컬럼의 고 분리 효율을 가능케 한다.
질량 분광분석법은 펩타이드의 식별을 위한 강력한 기술로서 출현되었기 때문에, 질량 분광계와 결합된 나노스케일 액체 크로마토그래피는 현재 MHC-표출 펩타이드의 식별을 위한 가장 첫번째 선택방법이며, 이는 저 아토몰 양으로 각 펩타이드의 서열 정보를 제공할 수 있는 기술이다. 그러나, 본 발명의 구현의 적용은 LCMS 적용만으로 한정되지 않는다.
일반적으로, LCMS 장치의 구현은 매우 정확한 방식으로 혼합 용매 시스템, 분석 컬럼 및 질량 스펙트로미터의 원하는 저 흐름 속도를 생성하는데 편리한 방법으로서 흐름 스플리팅 장치와 함께 결합된 구현으로, 펌프, 바람직하게 고압 액체 크로마토그래피(HPLC) 펌프를 갖는 혼합 펌프 배열을 포함한다.
상기 LCMS 장치는 또한 에미터, 코팅 및 전용 전기 스프레이 이온화 공급원을 포함하는 전기 스프레이 이온화(ESI) 유니트를 갖는다. 상기 LCMS 장치는 각 모세 배관을 연결하는 연결 요소를 포함한다. 바람직한 구현은 이하 상세히 설명된다.
액체 크로마토그래피
물리적으로, 액체 크로마토그래피(LC)는 예를 들어, 물질을 함유하도록 내부에 공간(캐버티)을 갖는 실린더류 구조물과 같은 컬럼에서 수행된다. 사용된 컬럼 재료 및 용출 유체는 일반적으로 크로마토그래피의 타입을 결정한다. 캐버티안에 물질이 고정되고, 이는 정지상으로 정의된다. 바람직한 구현으로, 시료는 이동상에 용해된다. 시료 및 이동상은 정지상을 통해 통과하며, 여기서 분석물의 분리가 일어난 후 이들의 측정 또는 분석이 이루어진다. 후속적인 단계로 추가 분리가 가능하다.
시료를 분획화한 후, 바람직한 구현으로, 펩타이드, 보다 바람직한 구현의 LCMS 장치 셋업으로, 각각의 펩타이드들이 질량 분광계에 의해 식별된다. 질량 분광계는 질량(Mw) 및 구조 정보(아미노산 서열)를 생성하며, 이에 기초하여 펩타이드가 식별될 수 있다.
LCMS 분석
본 발명의 목적은 단백질 분해 소화된 단백질의 다차원 LCMS/MS 분석에 의해 달성될 수 있으며, 여기서 SCX(Strong Cation eXchange) 분획화가 RP(Reversed Phase) 분리와 함께 사용되었다. 이러한 분석 기술들은 결합되어 분석의 분리 효율 및 역학 범위를 증가시킨다.
일 구현으로, 일차 분리 차원을 위해 음이온 및 양이온 교환 파티클의 혼합 베드를 이용한 온라인 다차원 LC 방법이 제공된다.
트래핑 컬럼
일 구현으로, LCMS 장치는 분석 또는 분리 컬럼으로부터 상류에 고상 추출(SPE) 트래핑 컬럼 또는 트래핑 컬럼을 포함한다. 트래핑 컬럼에서 SCX(Strong Cation eXchange) 또는 WAX(Weak Anion eXchange) 수지 또는 SCX와 WAX 수지의 혼합 베드가 사용될 수 있다. 이는 1차원의 LCMS/MS 분석을 구성한다. 2차원은 하향 분석 컬럼에서 C18 역상(RP) 크로마토그래피에 의해 부가될 수 있다. 또한, 트래핑 컬럼은 나노스케일 LC 컬럼내로 상대적으로 큰 시료량의 상대적으로 신속한 로딩(트랜스퍼)을 가능케 한다. 따라서, 트래핑 컬럼의 내부 직경은 분석 컬럼의 내부 직경과 균형이 맞아야 한다.
일 구현으로, 펩타이드(적어도 하나의 펩타이드를 의미함)를 포함하는 시료가 트래핑 컬럼내로 도입된다. 바람직하게, 이후에 식별되는 바와 같이, 시료는 식별하고자 하는 에피토프를 포함한다. 일 구현으로, 후속적으로 용매가 트래핑 컬럼내로 주입되며, 이는 트래핑 컬럼으로부터 바인딩된 펩타이드를 역상 C18 분석 컬럼내로 이송한다.
일 구현으로, ACE(Anion-Cation Exchange) 고상 트래핑 컬럼은 강 양이온 및 약 음이온 수지 모두의 혼합물을 포함한다. 이러한 혼합 베드는 Motoyama(Motoyama et al. 2007)로부터 알려져 있으며, 여기서 바인딩된 펩타이드의 회수를 위해 암모늄 아세테이트가 사용된다.
종래 기술이 가진 문제는 바인딩된 분석물의 회수를 위해 사용되는 암모늄 아세테이트를 포함하는 양이온 염의 사용이 2차원에서 온라인 역상 나노스케일 LC 시스템의 수행에 악영향을 미친다는 것이다.
본 발명의 다른 견지에 따르면, 1차원에서 바인딩된 분석물의 회수가 무염 방식으로 수행될 수 있다. 무염 용액의 사용은 하향 역상 수지의 악화를 방지한다.
바람직하게, 트랜스퍼 또는 용출 용매는 무염 용매이다. 바람직하게, 포름산(메타노익산)이 트랜스퍼 용매로 사용된다. 즉, 포름산이 바인딩된 펩타이드의 용출을 위해 사용된다. 문헌적으로 포름산의 용출 강도는 이온 교환 수지로부터 펩타이드를 회수하기에는 너무 낮은 것으로 알려져 있으나, 포름산이 트랜스퍼 용매로 사용될 수 있다는 것이 실험적으로 예기치않게 발견되었다. 이러한 놀라운 효과의 이유는 포름산의 COO- 기가 침투하고 바인딩된 분석물(펩타이드)의 변위를 수행할 수 있는 결정 구조를 가지며 거의 오픈 구조의 가교 분자를 포함하는 실리카 파티클 상의 WAX 수지의 구조에서 발견될 수 있다.
일 구현으로, 염산(HCl)이 이러한 목적으로 사용되었으나, 이는 덜 바람직하다.
LCMS 장치 또는 이러한 장치를 작동하는 방법의 일 구현으로, 포름산과 증가된 강도(농도)를 갖는 디메틸설폭시드의 등몰 혼합물의 특정량(예, 10μl)이 트래핑 컬럼을 통해 첨가된다. ACE 트래핑 컬럼을 떠난 펩타이드는 역상 컬럼 스위칭 시스템의 C18 역상 트래핑 컬럼상에 다시 트래핑된다.
LC 분석 컬럼
시료내 분석물(여기서는 펩타이드)의 크로마토그래프 분리는 LC 분석 컬럼을 사용하여 수행된다. 일 구현으로, 상기 컬럼은 적어도 50cm, 바람직하게 적어도 75cm, 보다 바람직하게 적어도 85cm, 그리고 보다 바람직하게 적어도 90cm의 길이를 갖는다. 상기 컬럼의 길이는 특히, 상기 컬럼의 분리 효율과 관련하여 LC 컬럼의 성능에 중요한 파라미터이다.
일 구현으로, 예를 들어 70μm이하, 바람직하게 55μm이하의, 그리고 일 구현으로, 5μm C18 파티클로 패킹된 50μm이하의 내부 직경을 갖는 90cm 분석 컬럼과 같이 적어도 75cm 분석 컬럼이 HLA-A2 용출 시료의 면밀한 분석을 위해 장착된다. 이 시료는 4-h 구배로 운전되었다. 질량 스펙트로미터는 사이클당 1 MS 및 3연속 CAD MS/MS 스캔을 수행하도록 프로그램되었다.
일 구현으로, 융합 실리카 컬럼이 사용된다. 바람직한 구현으로, 융합 실리카 모세관 컬럼이 사용된다. 상기 컬럼은 액체 크로마토그래피용 패킹을 포함한다. 상기 컬럼을 패킹하는 적절한 방법이 제공된다.
일 구현으로, LCMS 장치는 나노스케일 컬럼을 포함한다. 일 구현으로, 이러한 컬럼은 외부 반경 및 내부 반경을 갖는 융합 실리카(모세) 배관을 포함할 수 있으며, 상기 내부 반경은 융합 실리카에 걸쳐 확장된 캐버티(cavity)에 상응한다. 바람직하게 상기 나노스케일 배관의 외부 직경은 150-1400μm의 범위내이다. 상기 배관의 외부 직경은 바람직하게 200-800μm의 범위내이다.
상기 컬럼은 75μm이하, 바람직하게 55μm이하, 보다 바람직하게 50μm이하, 보다 바람직하게 30μm이하, 그리고 보다 바람직하게 26μm이하의 내부 직경을 포함한다. 보다 작은 내부 직경은 LCMS 장치의 감도 및 분리 효율을 향상시킬 것이다. 내부 캐버티는 바람직하게 5-100μm, 그리고 보다 바람직하게 16-70μm, 그리고 보다 바람직한 구현으로 18-50μm 범위내 직경을 갖는다. 이러한 모세관은 5-50nl/min, 보다 바람직하게 10-30nl/min의 범위내 흐름 속도에 사용될 수 있다.
LC 분석 컬럼의 제조
본 발명의 일 견지에 따라, 컬럼의 일 말단에 프릿(frit)을 제조하고, 상기 컬럼내에 적절한 액체 크로마토그래피 고상 물질을 패킹하며, 여기서 상기 액체 크로마토그래피 고상 액체 물질은 저 점도 용매내에 슬러리로 제공되는, 최대 55μm의 내부 직경으로 내부 캐버티를 갖는 적어도 45, 바람직하게 적어도 75cm 길이의 컬럼을 포함하는 LC 컬럼 제조 방법이 제공된다. 바람직한 구현으로, 저점도 용매는 20℃에서 0.32cP의 점도를 갖는 아세톤이다.
LC 분석 컬럼의 패킹
본 발명의 다른 견지에 따라, 컬럼의 일 말단에 프릿(frit)을 제조하고, 상기 컬럼내에 적절한 액체 크로마토그래피 고상 물질을 패킹하며, 여기서 상기 컬럼은 패키도중에 진동되거나 초음파 처리되는, 최대 55μm의 내부 직경으로 내부 캐버티를 갖는 적어도 45cm, 바람직하게 적어도 75cm 길이의 컬럼을 포함하는 LC 분석 컬럼을 제조하는 방법이 제공된다. 일 구현으로 상기 컬럼은 초음파처리된다.
종래 기술에서 알려진 문제점은 '긴' LC 분석 컬럼의 패킹 속도이다.
본 발명에 따른 향상된 패킹 방법은 패킹 도중에 컬럼을 진동시키는 것을 포함하며, 바람직하게 초음파 진동을 이용하여 진동시키는 것을 포함함다.
일 구현으로, 초음파 진동은 패킹 도중에 수행된다. 바람직하게, 컬럼에 들어가는 슬러리가 진동된다. 이는 패킹 효율을 향상시키며 페킹된 베드에서 보이드/홀의 형성을 억제한다.
다른 견지에 따르면, 아세톤과 같은 비점성 용매가 컬럼을 패킹하는 방법과 함께 사용된다. 바람직한 구현으로, 상기 비점성 용매는 슬러리와 함께 사용된다. 바람직하게 용매는 이소프로판올보다 적어도 두 배 적은 점도의 것으로 사용된다.
특정 구현으로, 융합 실리카의 프릿화된 말단은 초음파조(예, Branson 200)내에 배치된다. 다른 구현으로, 초음파 처리는 고상 파티클이 융합 실리카 컬럼내로 플러싱된 후에만 수행된다.
일 구현으로, 상기 슬러리는 1ml의 아세톤내로 서스펜딩된 적어도 150mg 역상 파티클을 함유한다. 패킹 도중 컬럼을 통한 아세톤 대 이소프로판올의 선형 속도는 7±1의 놀라운 팩터와 동등하다.
ESI(Electro Spray Ionization) 및 에미터 제조
일 구현으로, LCMS 장치는 전기 스프레이를 위한 팁을 가진 전기 스프레이 이온화 질량 분광계(LC-ESI/MS)와 결합된 액체 크로마토그래피에 사용되는 에미터를 포함한다. 전기 스프레이 이온화 유니트의 일부이며, 코팅 및 전기 스프레이 이온화 공급원을 또한 포함하는 상기 팁은 바람직하게 분석 컬럼으로부터 받은 나노리터 흐름 속도의 흐름을 전기 스프레이하도록 구성 및 배열된다.
공지된 에미터들의 문제점은 특히 팁 말단 근처에서 골드층의 악화이며, 이는 진동 스프레이를 일으킬 수 있다. 본 발명의 목적은 에미터를 향상시키는 것으로, 특히 에미터가 보다 긴 LCMS-ESI 실행을 이룰 수 있도록 향상시키는 것이다.
바람직하게, 상기 팁/에미터는 일차 코팅, 바람직하게 전기 전도성 코팅, 바람직하게 금과 같은 귀금속을 포함한다. 2차 코팅은 보호층으로 사용된다. 일 구현으로, 2차 코팅은 전도성 탄소계 코팅이다. 다른 구현으로, 실리콘계 코팅이 2차 코팅으로 사용된다. 다른 구현으로, 전도성 폴리머 코팅이 사용된다.
바람직하게, 상기 에미터는 배관, 바람직하게 융합 실리카 모세 배관으로 형성된다. 일 구현으로, 상기 에미터는 최대 55μm, 바람직하게 최대 30μm의 내부직경을 갖는다.
본 발명의 일 구현으로, 상기 에미터를 형성하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 감소된 내부 반경을 갖는 팁을 형성하기 위해 배관을 가열하고 풀링하는 것을 포함한다. 이러한 감소된 내부 반경은 LCMS 분석의 성능을 더욱 증진시킨다. 일 견지에 따라, 본 발명은 이러한 향상된 에미터를 제조하는 방법을 제공한다. LCMS 셋업에 사용되는 향상된 팁을 제조하는 방법은 팁을 코팅하는 단계 및 특히 전도성 탄소계 코팅제로 팁의 말단을 코팅하는 단계를 포함한다. 이의 테이퍼드 말단 부근에서 팁의 내부 직경은 바람직하게 약 2-30μm, 보다 바람직하게 3-10μm의 범위내이다. 일 구현으로, 상기 에미터/팁은 테이퍼드 말단에서 에미터의 내부직경이 최대 10μm로 형성된다.
일 구현으로, 배관은 양 말단에서 당겨지고 중간 부분에서 가열된다. 가열 도중에, 유리는 중간 부분 부근에서 보다 약하게 되며, 신장되고, 결국 부러진다. 이러한 구현에서, 2개의 테이퍼드 에미터가 형성된다.
일 구현으로, 신장된 팁은 금과 같은 귀금속으로 코팅된다. 그 후, 상기 팁은 커팅되고, 바람직하게 감소된 내부 직경의 유출구를 형성하도록 테이퍼드(신장된/당겨진) 말단 가까이에서 커팅된다.
일 구현으로, 상기 에미터는 분석 컬럼의 말단상에 일체적으로 형성된다. 이는 분석 컬럼의 말단과 에미터의 상향 말단 사이에 연결을 방지한다.
일 견지에 따르면, 예를 들어 액체 크로마토그래피 컬럼으로부터 시료를 받는 상향 말단 및 상기 시료를 전기 스프레이하는 테이퍼드 말단을 포함하며, 에미터는 전기 스프레이 이온화 유니트의 일부이며, 융합 실리카로부터 형성되고 55μm이하의 내부 직경을 가지며, 여기서 에미터의 테이퍼드 말단은 금으로 이루어진 전도성 1차 코팅 및 2차의 전도성 탄소계 코팅을 갖는 것으로 제공되는, 나노스케일 흐름을 위한 에미터가 제공된다.
또한, 예를 들어 액체 크로마토그래피 컬럼으로부터 시료를 받는 상향 말단 및 상기 시료를 전기 스프레이하는 테이퍼드 말단을 포함하며, 에미터는 전기 스프레이 이온화 유니트의 일부이며, 융합 실리카로부터 형성되고 최대 55μm의 내부 직경을 가지며, 여기서 에미터의 테이퍼드 말단은 실리콘 합금 또는 전도성 폴리머를 포함하는 코팅을 갖는 것으로 제공되는, 나노스케일 흐름을 위한 에미터가 제공된다.
T-커넥터
나노스케일 LCMS 장치에서, 흐름 경로의 내부 직경에 상당한 크기를 갖는 데드 볼륨은 밴드(피크) 폭에 극적인 영향을 미침에 따라, 데드 볼륨, 즉, 공극을 피하는 것이 중요하다. 확산에 기인한 피크 폭 넓힘은 시스템의 감도 및 역학적 범위 모두에 해로운 영향을 미칠 것이다.
일 구현으로, LCMS 장치의 흐름 경로에서 데드 볼륨의 존재를 적어도 유의하게 감소시키는 향상된 연결 요소가 제공된다.
따라서, 맞추어진 배관의 외부 직경과 일반적으로 동등한 직경을 갖는 단면을 갖는 내부 체적을 포함하는 연결 요소가 제공된다.
배관의 버트(butt) 연결
본 발명의 일 견지는 고압(>4x104kPa)에 견딜 수 있는 나노스케일 컬럼의 버트(butt) 연결 방법을 제공하는 것과 관련된다.
본 발명의 일 구현으로, 연결되는 배관의 말단은 배관의 길이 방향에 대해 수직으로 "직선 컷"을 얻기위한 다이아몬드 커터를 이용하여 커팅된다. 이러한 직선 컷은 연결 요소내 배관의 말단의 교대(abutment)를 형성하며, 상향 컬럼으로부터 하향 컬럼의 입구로 플러싱될 경우 이동상에 대한 데드 볼륨의 존재를 적어도 감소시킬 것이다. 이의 말단에 직선 엣지를 갖는 배관의 연결은 일반적으로 버트 연결로 칭하여진다. 직선 컷은 버(burrs) 또는 핀(fins)의 형성을 회피한다.
배관의 말단이 교대(abutment)로 존재하더라도, 이러한 버트 연결은 완전하거나 단단하게 폐쇄되지 않고 누출이 일어날 수 있다. 누출 량은 3방향 연결요소의 구현에서 연결요소의 3차 연결 어셈블리에 도달할 수 있다.
본 발명은 특정 구현으로 설명되나, 본 발명이 이와 같이 나타낸 구현으로 한정되는 것은 아니라는 것은 명확할 것이다. 특히, 이와 같이 나나탠 구현은 LCMS 기술의 적용을 나타낸다. 그러나, 본 발명자들은 LCMS에서의 적용으로 한정하지 않는다. 본 발명은 특정 구현을 이용하여 설명되나, 본 발명은 본 명세서에 나타낸 분명한 특징들로 한정되는 것은 아니나, 어느 내포된 특징 또는 균등한 특징을 포함한다. 특정 청구항들이 본 출원에 첨부되었으나, 본 출원의 명세서는 청구범위로 한정되지 않으며, 모든 내포된 특징들 및 분명한 특징들을 포함하며, 후속적인 분할 출원은 이러한 특징들의 어느 조합에 관한 것일 수 있다.
본 명세서에 따른 구현이 조합될 수 있음은 숙련된 당업자에게 알 수 있을 것이다. 분명하게 나타내지 않는다면, 본 명세서에 개시된 어느 구현은 개시된 다른 구현의 특징(의 일부)과 조합될 수 있다.
본 발명은 도면을 참조로 보다 상세히 설명된다.
본 출원서에서 표현 LCMS 장치는 LCMS 플랫폼 기술 또는 LCMS 기구와 상호 호환적으로 사용된다.
LCMS 장치의 용도
다른 견지로, 본 발명의 앞선 견지에서 정의된 장치를 에피토프를 식별하는데 사용하는 용도가 제공된다.
숙련자에게는 에피토프가 무엇인지 알려져 있다. 간략히, 에피토프는 단백질 프레그먼트, 바람직하게 펩타이드이다. 일반적으로, 에피토프는 MHC 클래스 I 리간드에 대해 약 8-10 아미노산, 그리고 MHC 클래스 II 리간드에 대해 약 11-34, 바람직하게 14-16 아미노산의 길이를 갖지만, 다른 길이의 펩타이드가 또한 예상될 수 있다. 이러한 펩타이드는 PTM에 의해 더욱 변환될 수 있다(Engelhard et al. 2004). 어느 에피토프가 본 발명의 LCMS 장치를 사용하여 유효하게 식별될 수 있다. 일 바람직한 구현으로, MHC 클래스 I T 세포 에피토프가 식별된다. 다른 구현으로, MHC 클래스 II T 세포 에피토프가 식별된다. 숙련자는 여러 에피토프가 단일 시료를 이용하여 식별될 수 있음을 이해할 것이다. 또한 단일 시료에서 MHC 클래스 I 및 II T 세포 에피토프를 식별하는 것이 가능하다.
MHC
클래스 I
에피토프
제 1 바람직한 구현으로, T 세포 에피토프는 MHC 클래스 I 에피토프이다. 숙련자에게 알려지고 배경기술에서 이미 설명된 MHC 클래스 I 에피토프는 MHC 클래스 I 분자상에 APC에 의해 표출되어 CD8+ T 세포를 활성화시키는 에피토프이다. MHC 클래스 I 에피토프는 바람직하게 포유류 세포내부에서, 바람직하게는 세포내 감염도중에 바이러스로부터 유래된 포유류 세포내부에서 발현되는 단백질로부터 기원하거나 유래된다. MHC 클래스 I 에피토프는 또한 다른 논셀프 단백질로부터 기원할 수 있으며, 이는 MHC 클래스 I 분자에 따라 APC에서 프로세싱되고 표출된 박테리아 단백질일 수 있다. 바람직하게, 이러한 단백질은 세포내 라이프 스타일을 적응할 수 있는 박테리아로부터 유래하며, 이는 포유류 APC, 바람직하게 휴먼 APC에 들어갈 수 있음을 의미한다. MHC 클래스 I 에피토프는 또한 논셀프 박테리아 또는 바이러스 단백질로부터 기원할 수 있으며, 이는 세포외 환경으로부터 APC에 의해 취해질 수 있으며 크로스-프리젠테이션을 통해 MHC 클래스 I 프로세싱 컴파트먼트에 도달할 수 있다. 또한, MHC 클래스 I 에피토프는 숙주 단백질로부터 기원할 수 있으며, 이의 발현은 APC의 세포내 감염에 의해 처음부터 유도되거나 상향조절되어, 이에 따라 감염- 또는 병원체-관련된 것이다.
본 발명의 LCMS 장치를 사용하여 MHC 클래스 I 에피토프를 식별하기 위해 여러 가지 전략이 사용될 수 있다. 바이러스 병원체에 대해, 우선, 바이러스는 식별하고자 하는 MHC 클래스 I 에피토프가 필요로 하도록 선택되어야 한다. 바람직한 바이러스는 이에 한정하는 것은 아니나, 상기 포유류에서 컨디션 또는 질병을 유도할 수 있는 어느 바이러스를 포함한다. 바람직하게, 상기 포유류는 인간이다. 이에 대한 MHC 클래스 I 에피토프가 식별될 수 있는 인간의 바이러스는 HIV(Human Immunodeficiency virus)와 같은 레트로바이러스과; 루벨라바이러스; 파라인플루엔자 바이러스, 홍역, 볼거리, 호흡기합포체바이러스, 휴먼 메타뉴모바이러스와 같은 파라믹소바이러스과; 인플루엔자 바이러스와 같은 오르소믹소바이러스과; 황열병 바이러스, 뎅기 바이러스, 헤파타이티스 C 바이러스(HCV), 일본 뇌염 바이러스(JEV), 진드기매개뇌염 바이러스, 세인트 루이스 엔세팔라이티스 또는 웨스트 나일 바이러스와 같은 플라비바이러스과; 헤르페스 심플렉스 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 엡스테인-바 바이러스와 같은 헤르페스바이러스과; 버냐바이러스과; 아레나바이러스과; 한탄과 같은 한타바이러스과; 코로나바이러스과; 휴먼 파필로마바이러스와 같은 파포바이러스과; 래비스 바이러스와 같은 랩도바이러스과; 휴먼 코로나바이러스와 같은 코로나바이러스과; 알파바이러스과, 아르테리바이러스과, 에볼라바이러스와 같은 필로바이러스과, 아레나바이러스과, 스몰폭스 바이러스와 같은 폭스바이러스과, 및 아프리카 돼지 열병 바이러스를 포함한다. 홍역 바이러스, 인플루엔자 바이러스 및 호흡기합포체바이러스가 실험부에 예로 취해졌다.
다음 단계는 선택된 바이러스로부터 MHC 클래스 I 에피토프를 포함하는 혼합물을 준비하는 것이며, 이러한 혼합물 또는 시료를 상기 MHC 클래스 I 에피토프를 식별하기 위해 앞서 식별된 바와 같은 LCMS 장치에 제공한다. MHC 클래스 I 에피토프를 식별하기 위해 여러 전략이 사용될 수 있다. 이러한 바람직한 구현으로(MHC 클래스 I 에피토프), MHC 클래스 I 에피토프를 포함하는 혼합물은 바람직하게 상기 에피토프를 포함하는 세포로부터 유래된다. 따라서, 식별하고자 하는 MHC 클래스 I 에피토프가 바이러스로부터 기원하거나 유래된 경우, 숙련자는 우선 포유류 세포를 상기 바이러스로 감염시켜 상기 혼합물을 얻을 것이다. 이는 숙련자에게 알려진 방법을 사용하여 수행될 수 있으며 예를 들어 홍역 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스에 대한 실험에서 광범위하게 기술되어 있다. 바람직하게, APC가 감염에 사용된다. APC는 포유류, 바람직하게는 인간의 세포주로부터 유래되거나 분리될 수 있다. APC를 분리 및 식별하는 방법은 숙련자에게 잘 알려져 있다. 바람직하게 사용되는 APC는 휴먼 DC, 보다 바람직하게 실시에에 나타낸 휴먼 모노사이트 유래 수상돌기 세포(MDDC)이다. APC는 바람직하게 적절한 배지에서, 임의로 주어진 영양분이 보충된 배지에서 수일간(약 4-6일) 배양된다. APC는 후속적으로 공지 기술에 따라 선택된 바이러스로 감염된다. 바이러스의 정체에 따라, 숙련자는 어떠한 감염 프로토콜이 후속되어야 하는지 알 것이다. 감염 후, APC는 수거되고, 세정되고, 카운팅되고, 임의로 펠렛화되고 동결된 후 추가 분석된다. 컨트롤로서, 비감염 APC가 사용될 수 있다. 실험 디자인에 따라, APC는 적어도 두 개의 병렬 배양으로, 이중 하나는 선택된 바이러스에 의해 감염된 것으로 배양될 수 있다. 병렬 배양물간의 다른 차이점은 감염된 배양물이 13C6-L-루신 및/또는 13C5, 15N1-L-메티오닌 및/또는 13C5, 15N1-발린과 같이 안정한 동위원소로 표지된 아미노산(들) 50% 및 이의 고유 아미노산 상응물들, L-루신, L-메티오닌 및 L-발린 50%의 존재하에서 실현된다는 것이다. 다른 아미노산들은 표지를 위해 선택될 수 있으며, 바람직하게 실험의 HLA 백그라운드와 관련된 MHC 앵커 잔기를 나타내는 아미노산이 선택될 수 있다. 하나의 MHC 클래스 I 에피토프 조성물의 용출 전에, 감염된 APC와 컨트롤 APC(cell/cell)의 1:1 혼합물은 정상 비변환 셀프-에피토프에 비해 바이러스 감염 관련 에피토프에 대한 동위원소 이온 클러스터에 다르게 영향을 미칠 것이다. 이는 이후에 바이러스 감염-관련 MHC 클래스 I 에피토프를 보다 잘 식별하도록 할 것이다.
실험 디자인에 따라, 특정 HLA 백그라운드로부터 APC를 사용하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, HLA-A*0201 백그라운드로부터 APC를 사용할 경우, 이러한 정황에서 특이적으로 표출되는 에피토프가 식별될 것이다. 또한, 여러 백그라운드의 정황에서 표출될 수 있는 에피토프를 식별하기 위해 별개의 HLA 백그라운드로부터 병렬적 APC로 사용되도록 선택될 수 있다. APC(cell/cell)의 1:1 혼합 후, 세포 혼합물은 추가 에피토프 분석이 이루어지기 전에 동결될 수 있다.
분석 수행시, APC가 동결된 경우라면 해동된다. APC는 후속적으로 공지 기술에 따라 MHC 클래스 I 분자의 가용화를 위해 용해된다. 바람직한 방법은 MHC 클래스 II 에피토프로 명명된 섹션에서 기재된 방법과 같다. 보다 바람직한 방법은 또한 실시예부에 기술된다. 용출된 조성물에 존재하는 각 에피토프를 식별하기 위해 본 발명의 장치내로 다운로드하기에 적절한 MHC 클래스 I 에피토프를 포함하는 조성물 또는 시료의 제조는 본 발명의 장치내로 다운로드하는 MHC 클래스 II 에피토프를 포함하는 조성물의 제조와 같다.
본 발명의 장치내로 적절한 조성물을 다운로드하는 것과 MHC 클래스 I 에피토프의 식별을 이끄는 이에 따라 얻어진 결과의 분석은 당 기술분야의 숙련자에게 알려진 기술에 따라 수행되며, 이는 본 실시예에 설명된다.
이러한 방법은 동물을 감염시키는 것으로 알려진 주어진 바이러스의 잠재적으로 어느 MHC 클래스 I 에피토프의 식별을 가능케 한다. 이는 또한 주어진 MHC 클래스 I 에피토프의 관련 존재비를 알려준다. 이는 또한 용출된 조성물에 포함된 다중 기질 변이체의 존재에 의해 반영된 상기 에피토프의 길이 변화 뿐만 아니라 상기 에피토프의 번역 후 변형(PTM), 또는 주어진 HLA 컨텍스트에서 표출시 나타나는 단백질 또는 에피토프 다형성의 역할을 포함하는 에피토프의 다른 특징들을 알려준다. 이러한 기술은 강력하며 기능성 백신의 개발에 요구된다. 선택된 바이러스가 매우 신속히 자체적으로 현존하는 치료법에 적응하는 것으로 알려진 바이러스인 경우에, 본 발명에 의해 포함되는 바람직한 구현은 하나의 바이러스 중 적어도 2 스트레인으로부터 유래된 공유 MHC 클래스 I 에피토프를 식별하는 것이며, 이러한 바람직한 구현에서 바람직하게 상기 바이러스는 인플루엔자 바이러스이다.
MHC 클래스 II 에피토프
다른 보다 바람직한 구현으로, T 세포 에피토프는 MHC 클래스 II 에피토프이다. 본 발명의 바람직한 사용으로, MHC 클래스 II 에피토프는 항원 펄스 실험에서 APC와 함께 에피토프의 공급원을 포함하는 혼합물을 배양하고, 후속적으로 본 명세서에 정의된 바와 같은 장치에 APC에 의해 프로세싱 및 표출되는 에피토프를 포함하는 시료를 제공한 후 식별된다.
숙련자에게 알려져 있으며 배경기술에서 앞서 설명된 바와 같은 MHC 클래스 II 에피토프는 MHC 클래스 II 분자상에 APC에 의해 표출되어 CD4+ T 세포를 활성화시키는 에피토프이다. 여기서 사용되는 MHC 클래스 II 에피토프는 바람직하게 논셀프 단백질로부터 기원하거나 유래한다. 논셀프 단백질은 바람직하게 본 명세서에서 이후에 식별된 병원체의 단백질이며, 상기 단백질은 상기 병원체에 의해 감염될 수 있는 포유류에 대해 논셀프이다. 본 발명의 LCMS 장치를 사용하여 병원체-관련 MHC 클래스 II 에피토프를 식별하기 위해 여러 가지 전략이 사용될 수 있다. 우선, 병원체는 식별하고자 하는 MHC 클래스 II 에피토프가 필요로 하도록 선택되어야 한다. 바람직한 병원체는 이에 한정하는 것은 아니나, 포유류에서 컨디션 또는 질병을 유도할 수 있는 포유류의 어느 병원체를 포함한다. 바람직하게, 상기 포유류는 인간이다. 이에 대한 MHC 클래스 II 에피토프가 식별될 수 있는 인간의 병원체는 원핵생물 또는 진핵생물을 포함한다. 바람직하게, 원핵생물은 박테리아이다. 바람직한 박테리아는 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori), 나이세리아(Neisseria), 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenza)와 같은 헤모필러스(Haemophilus), 보르데텔라(Bordetella), 클라미디아(Chlamydia), 스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae)와 같은 스트렙토코커스(Streptococcus), 비브리오 콜레라(Vibrio cholera)와 같은 비브리오(Vibrio) 뿐만 아니라, 예를 들어, 살모넬라(Salmonella), 쉬겔라(Shigella), 캄필로박터(Campylobacter) 및 에스케리차(Escherichia)를 포함하는 그람-음성 장 병원체, 뿐만 아니라 탄저병, 한센병, 결핵, 디프테리아, 라임병, 매독, 장티푸스, 임질 및 Q 열을 일으키는 박테리아를 포함한다. 바람직한 박테리아는 보르데텔라(Bordetella) 또는 나이세리아(Neisseria) 종을 포함한다. 보다 바람직한 보르데텔라종은 보르데텔라 파라퍼투시스(Bordetella parapertussis) 또는 보르데텔라 브론치셉티카(Bordetella bronchiseptica)를 포함한다. 보다 바람직한 종은 나이세리아 메닝지티디스(Neisseria meningitidis)를 포함한다. 병원체는 바베시아 보비스(Babesia bovis), 플라스모디움(Plasmodium), 레이쉬마니아 spp.(Leishmania spp.), 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondii) 및 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi)와 같은 트리파노소마(Trypanosoma)와 같은 원생동물과 같은 기생체일 수 있다. 바람직한 진핵생물은 균류를 포함한다. 보다 바람직한 균류는 이스트 또는 사상균이다. 바람직한 이스트의 예는 칸디다종을 포함한다. 바람직한 균류는 아스퍼질러스 종(Aspergillus sp.), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 예를 들어 크립토코커스 네오포만스(Cryptococcus neoformans)와 같은 크립토코커스(Cryptococcus) 및 히스토플라스마 캡설라텀(Histoplasma capsulatum)을 포함한다. 병원체는 또한 이하 정의된 바와 같은 바이러스 병원체일 수 있다. 이러한 경우에, 병원체 세포를 참조하면 바람직하게 바이러스 감염 세포를 참조한다.
다음 단계는 선택된 병원체로부터 하나 이상의 MHC 클래스 II 에피토프(들)의 소스 단백질 또는 다중 소스 단백질을 포함하는 혼합물을 준비하는 것이며, 이러한 혼합물을 항원 펄스 실험에 APC와 함께 배양하고, APC에 의해 프로세싱되고 표출된 에피토프 또는 다중 에피토프를 포함하는 시료를 상기 MHC 클래스 II 에피토프를 식별하기 위해 앞서 식별된 바와 같은 LCMS 장치에 제공한다. 실험 목적 및/또는 숙련자가 가진 지식 및/또는 선택된 병원체 및/또는 병원체의 정체에 따라 하나 이상의 다중 소스 단백질(들)의 여러 타입의 혼합물이 사용될 수 있다.
바람직한 구현으로, 상기 혼합물은 세포로부터 유래되거나 세포를 포함한다. 보다 바람직하게, 이러한 정황에서 세포는 병원체 세포이다. 바람직한 병원체는 이미 식별된 것이다. 병원체 세포로부터 유래된 혼합물은 바람직하게 전 세포 제조물로부터 유래된 혼합물이다. 이러한 보다 바람직한 구현(전 세포 제조물로부터 유래된 혼합물의 사용)은 일반적으로 상기 병원체 세포 또는 부가적인 에피토프(들)에 대해 에피토프가 알려지지 않거나 거의 알려지지 않은 경우 또는 미지의 병원체 단백질의 에피토프(들)이 상기 병원체에 대해 식별되어야 하는 경우에 매력적이다. 이러한 보다 바람직한 구현은 또한 공지되거나 미지의 병원체-관련 에피토프가 상기 병원체로부터 다른 공지되거나 미지의 에피토프를 통해 지배적으로 프로세싱되고 표출되는 것으로 식별되어야 할 경우에 매력적이다. 또한, 이러한 보다 바람직한 구현은 단일 분석 시료에서 전체 병원체-관련 MHC 클래스 II 리간돔이 포함되어야 할 경우 매력적이며, 이는 포유류 APC, 바람직하게 휴먼 APC에 의한 컴플리트 및 복합 병원체 프로테옴의 생체내 프로세싱 및 표출의 결과와 유사하다. 간략히, 이러한 혼합물을 제조하기 위해, 병원체 세포는 2개의 병렬 배양시 적절한 배지에서 배양되며, 바람직하게 정지기까지 배양된다. 두 병렬 배양간의 차이점은 한 배양은 14N(고유 질소 동위원소)의 존재하에서 실현되고, 다른 하나는 15N 안정 동위원소의 존재하에서 실현되는 것이다. APC를 이용한 항원 펄스 실험에서 14N- 및 15N-표지된 병원체 세포의 1:1 혼합물의 사용은 바람직하게 동등한 카피수의 라이트(14N) 및 헤비(15N) 형태의 에피토프를 생성할 것이다. 이는 이후에 LCMS 장치에서 병원체-관련 MHC 클래스 II 에피토프의 인식을 촉진시킨다. 병원체에 따라, 숙련자는 적절한 배지가 사용될 수 있으며, 부가적인 영양분이 얼마나 보충될 수 있는지 알 것이다. 일반적으로, 병원체 세포는 정지기에 도달할 경우 열-불활성화된다. 정지기는 바람직하게 흡광도의 측정을 이용하여 세포의 추가 성장이 검출되지 않는 것을 의미한다. 흡광도는 바람직하게 590nm에서 측정된다. 후속적으로, 병원체 세포는 적절한 흡광도(OD), 바람직하게 0.6-1의 흡광도를 갖는 전 세포 제조물을 얻기 위해 PBS와 같은 생리학적 버퍼에 농축될 수 있다.
다른 바람직한 구현으로, 상기 혼합물은 세포의 단백질을 포함하거나 세포의 단백질, 바람직하게 병원체 세포의 단백질로부터 유래된다. 병원체 세포는 앞서 정의되었다. 바람직한 단백질은 보르데텔라 파라퍼투시스(Bordetella parapertussis)로부터 얻어진 단백질인 P.69 Pertactin이다. 이러한 타입의 혼합물은 전형적으로 병원체의 단백질이 면역원성인 것으로 이미 알려진 경우에 그리고 신규의, 향상된 또는 우성적 에피토프가 식별되는 것이 요구될 경우에 사용된다. 단백질은 바람직하게 정제된 제조물에 존재한다. 정제된 제조물은 바람직하게 제조물이 상기 단백질의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%(w/w)를 포함하거나 구성되는 것을 의미한다. 단백질은 병원체로부터 직접적으로 정제되거나 이의 암호 유전자가 상기 단백질을 발현하게 되는 다른 숙주내로 클로닝될 수 있다. 이러한 숙주의 바람직한 예는 실시예에 나타낸 에스케리차 콜라이(E. coli)이다. 단백질을 얻는 방식은 그 제조물의 순도가 본 명세서에 정의된 바와 같다면 본 발명에서 특정 방식으로 한정되지 않는다. 상기 단백질을 얻기 위해, 병원체는 앞선 단락에서와 같이 적절한 조건하에서 배양된다. 숙주 세포의 경우에, 상기 단백질의 발현은 유도인자를 첨가함으로써 유도될 수 있다. 바람직하게 이. 콜라이(E. coli)에 대해서 IPTG가 유도인자로 사용된다. 상기 단백질이 세포내에서 발현될 경우, 상기 병원체 또는 숙주 세포는 숙련자에게 알려진 디터전트를 이용하여 배양 마지막에 용해된다. 상기 단백질을 포함하는 시토졸 세포 추출물이 후속적으로 제조된다. 상기 단백질은 후속적으로 상기 시토졸 추출물로부터 정제된다. 이. 콜라이(E. coli)의 경우에, 상기 단백질은 봉입체에 존재할 수 있다. 봉입체에 존재하는 단백질의 정제는 숙련자에게 알려져 있으며 실시예에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 후속적으로, 단백질 제조물은 PBS와 같은 생리학적 버퍼에 농축되거나 희석될 수 있으며, 도는 적절한 단백질 농도, 바람직하게 0.3-2.5mg/ml를 갖는 단백질 제조물을 얻기 위해 더욱 정제될 수 있다.
다른 바람직한 구현으로, 혼합물은 세포의 컴파트먼트로부터 유래되거나, 세포, 바람직하게 병원체 세포의 컴파트먼트를 포함한다. 병원체 세포는 앞서 정의된 바와 같다. 바람직한 컴파트먼트는 소포, 보다 바람직하게 나이세리아 메닝지티디스(Neisseria meningitidis)로부터 얻어진 외막 소포(OMV)이다. 이러한 타입의 혼합물은 전형적으로 병원체의 소포가 병원체의 면역원성 엔티티인 것으로 이미 알려진 경우에 그리고 신규의, 향상된 또는 우성적 에피토프가 식별되는 것이 요구될 경우에 사용된다. 세포의 컴파트먼트는 바람직하게 앞선 단락에서 단백질에 대해 설명된 바와 같이 정제된 컴파트먼트 제조물에 존재한다. 정제된 컴파트먼트 제조물은 바람직하게 상기 제조물이 이러한 제조물에 존재하는 것으로 알려진 일 대표적 단백질의 적어도 5%를 포함하거나 구성되는 것을 의미한다. 상기 제조물은 바람직하게 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%(w/w)를 포함하거나 구성된다. 나이세리아 메닝지티디스(Neisseria meningitidis)로부터 얻어진 외막 소포(OMV)에 존재하는 대표적 단백질의 예는 외막 단백질 Porin A(PorA)이다. 컴파트먼트는 바람직하게 병원체로부터 직접 정제된다. 컴파트먼트를 얻는 방법은 상기 컴파트먼트를 포함하는 제조물의 요구되는 순도가 만족되는 한 본 발명에서 특정 방식으로 한정하지 않는다. 상기 컴파트먼트 제조물을 얻기 위해, 병원체는 상기 앞선 두 단락에서와 같이 적절한 조건하에서 배양된다. 선택된 컴파트먼트의 정체에 따라, 숙련자는 배양된 병원체 세포로부터 이를 어떻게 분리하고 임의로 정제하는지 알 수 있을 것이다. OMV를 포함하는 제조물을 제조하는 바람직한 방법은 실시예에 기재된 바와 같다. 후속적으로, 컴파트먼트 제조물은 PBS와 같은 생리학적 버퍼에 농축되거나 희석될 수 있으며, 또는 상기 컴파트먼트를 대표하는 단백질의 적절한 농도를 갖는 정제된 컴파트먼트 제조물을 얻기위해 더욱 정제될 수 있다. 예를 들어, 상기 컴파트먼트로서 나이세리아 메닝지티디스(Neisseria meningitidis)로부터 얻어진 외막 소포(OMV)를 사용할 경우, 정제된 컴파트먼트는 바람직하게 주요 대표적 외막 단백질 Porin A(PorA) 1.2-2.4mg/ml을 함유해야 한다.
MHC 클래스 II 에피토프의 공급원을 포함하는 어느 다른 혼합물이 본 발명에 사용될 수 있다. 바람직하게, 이러한 공급원은 단백질 공급원이다. 바이러스 에피토프의 공급원을 포함하는 혼합물이 또한 사용될 수 있다. 바람직한 바이러스는 이후에 정의된다. 바이러스 에피토프의 공급원을 포함하는 혼합물은 바람직하게 바이러스 단백질을 포함하는 혼합물이거나 또는 이로부터 유래되거거나 바이러스 단백질, 바람직하게 증식 바이러스 유기체의 공급원인 혼합물이다. 이러한 바람직한 구현은 일반적으로 CD4+ T 세포를 유도하는 바이러스-관련 MHC 클래스 II 에피토프가 식별되어야 할 경우에 매력적이다.
MHC 클래스 II 에피토프의 공급원을 포함하는 혼합물의 제조물과 병렬적으로, 선택된 병원체의 잠재적 표적이 되는 것으로 알려진 포유류의 APC를 포함하는 제조물이 또한 제조된다. 바람직하게 APC는 인간으로부터 얻어진다. 숙련자는 인간으로부터 APC를 분리하는 방법을 알 수 있을 것이다. 이는 보통 인간 전혈의 구배 원심분리 기술을 이용하여, 바람직하게 백혈구분리반출법 버피 코트의 구배 원심분리를 이용하여 수행된다. APC의 정체는 바람직하게 APC 마커에 특이적인 특정 항체를 이용하여 플로우 사이토메트리에 의해 분석된다. 바람직하게 사용되는 APC는 휴먼 DC, 보다 바람직하게 실시예에 기재된 휴먼 모노사이트 유래 수상돌기 세포(MDDC)이다. 실험 디자인에 따라, 특정 HLA 백그라운드로부터 APC를 사용하도록 선택할 수 있다. 예를 들어, HLA-DR1 백그라운드로부터 APC를 사용할 경우, 에피토프를 식별할 것이며, 이는 이러한 정황에서 특이적으로 표출된다. 여러 백그라운드의 정황에서 표출될 수 있는 에피토프를 식별하기 위해 별개의 HLA 백그라운드로부터 병렬적으로 APC를 사용하도록 선택할 수 있다. 또한, APC로서 다른 세포 타입, 바람직하게 B 림포사이트, 모노사이트, 마크로파지 및 MDDC가 아닌 수상돌기 세포 계통과 같은 면역 시스템의 프로페셔널 APC를 사용하는 것이 가능하다. 또한, 다른 포유류 세포 타입이 질병 상태에 대한 상기 세포들 또는 관련물들의 항원 프로세싱 및 표출의 정황에서 특이적으로 생성되는 에피토프(들)을 식별하기 위해 APC로서 사용될 수 있다. 여기서, APC는 바람직하게 영양분이 보충될 수 있는 적절한 배지에서 후속적으로 수일간(약 4-6일) 배양된다. 배양 마지막에, 에피토프 또는 다중 에피토프의 14N 및 15N 공급원의 등량을 포함하는 1:1 혼합물(전 세포 또는 세포의 단백질 또는 컴파트먼트)이 적절한 배지에 1-2일간 APC와 함께 배양된다. 보충제는 보조제일 수 있다. 바람직한 보조제는 LPS(LipoPolySaccharide)이다. 보다 바람직하게 LPS는 S. 아보르티스 이퀴(S. abortis equi)로부터 유래된 것이다. 이는 소위 항원 펄스 실험이다. 배양의 마지막에, APC가 수거되고, 세정되고 카운팅된다. 이는 추가적인 에피토프 분석이 수행되기 전에 동결될 수 있다.
분석 수행시, APC가 동결된 경우라면 해동된다. APC는 후속적으로 공지 기술에 따라 MHC 클래스 II 분자의 가용화를 위해 용해된다. 바람직한 용해 버퍼는 1% CHAPS를 포함하며, 실시예에 기재된 바와 같이 완충되고 프로테아제 인히비터로 보충된다. 원심분리 후 얻어지는 상층물은 에피토프 또는 에피토프들을 포함하는 용출 조성물을 얻기 위해 실시예에 기재된 바와 같이 후속적으로 여러 CNBr-활성화, TRIS-블로킹된 세파로즈 컬럼상에서 정제될 수 있다. 용출된 조성물은 또한 막여과에 의해 정제되고, 농축되고, 그리고 용출된 조성물에 존재하는 각 에피토프를 식별하기 위해 본 발명의 장치내로 다운로드하기에 적절한 조성물 또는 시료에 재구성될 수 있다.
본 발명의 장치내로 적절한 조성물 또는 시료를 다운로드하는 것과 MHC 클래스 II 에피토프의 식별을 이끄는 이에 따라 얻어진 결과의 분석은 당 기술분야의 숙련자에게 알려진 기술에 따라 수행되며, 이는 본 실시예에 설명된다.
이러한 방법은 주어진 포유류의 병원체의 잠재적으로 어느 MHC 클래스 II 에피토프의 식별을 가능케 한다. 이는 또한 주어진 MHC 클래스 II 에피토프의 관련 존재비를 알려준다. 이는 또한 용출된 조성물에 포함된 다중 기질 변이체의 존재에 의해 반영된 상기 에피토프의 길이 변화 뿐만 아니라 상기 에피토프의 번역 후 변형(PTM), 또는 주어진 HLA 컨텍스트에서 표출시 나타나는 단백질 또는 에피토프 다형성(N. 메닝지티디스의 리전 4에 대해 실시예에서 광범위하게 입증된 바와 같은)의 역할을 포함하는 에피토프의 다른 특징들을 알려준다. 이러한 기술은 강력하며 기능성 백신의 개발에 요구된다.
식별된 에피토프 및 이의 용도
다른 견지로, 본 발명은 본 명세서에 나타낸 어느 방법을 이용하여 획득가능한 에피토프를 제공한다. 바람직한 에피토프는 본 명세서에서 이미 식별되었다(참조 실시예 데이타에서 표 1-8, SEQ ID NO: 1-153). 실시예에서 식별된 바와 같은 각 SEQ ID NO는 식별된 에피토프를 나타낸다. 괄호사이에 명시된 각각의 식별된 에피토프에 인접한 잔기들은 바람직하게 에피토프의 일부인 것으로 간주되는 것으로 취해지지 않는다. 바람직하게, 각 SEQ ID NO는 본 명세서에 나타낸 어느 PTM을 포함하는 것으로 취해진다.
홍역 바이러스의 바람직한 에피토프는 표 1 및 2에 나타내었으며, SEQ ID NO:1-45로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. 보다 바람직한 에피토프는 SEQ ID NO: 7-45로 구성되는 그룹으로부터 선택되며, 임의로 SEQ ID NO: 1-6중 어느 하나와 조합된다.
인플루엔자 바이러스 감염과 관련된 바람직한 에피토프는 표 3에 나타내었으며, SEQ ID NO:46-49 및 SEQ ID NO:52-58로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
보르데텔라 파라퍼투시스(Bordetella parapertussis)의 바람직한 에피토프는 표 4 및 5에 나타낸 바와 같으며, SEQ ID NO: 59-72로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
나이세리아 메닝지티디스(Neisseria meningitidis)의 바람직한 에피토프는 표 6, 7 및 8에 나타내었으며, SEQ ID NO: 73-153으로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. 바람직한 에피토프는 Porin A 혈청형 P1.5-2,10 또는 Porin A 혈청형 P1.7-2,4인 PorA 단백질로부터 유래된다. PorA 단백질은 8 리전으로 세분될 수 있다(참조 표 6):
-리전 1은 PorA 단백질, 바람직하게 Porin A 혈청형 P1.5-2,10 또는 Porin A 혈청형 P1.7-2,4의 초기 20아미노산에 상응하며,
-리전 2는 아미노산 39 내지 59에 상응하며,
-리전 3은 아미노산 91 내지 111에 상응하며,
-리전 4는 아미노산 131 내지 168에 상응하며,
-리전 5는 아미노산 191 내지 224에 상응하며,
-리전 6은 아미노산 292 내지 306에 상응하며,
-리전 7은 아미노산 318 내지 349에 상응하며,
-리전 8은 아미노산 349 내지 372에 상응한다.
바람직한 구현으로, 하나 이상의 PorA 에피토프가 다음과 같이 사용된다: 리전 4내에 포함된 PorA 에피토프, 및/또는 리전 5내에 포함된 PorA 에피토프 및/또는 리전 6내에 포함된 PorA 에피토프가 사용되며, 이는 임의로 리전 1 및/또는 2 및/또는 3 및/또는 7 및/또는 8내에 포함된 PorA 에피토프와 함께 사용된다. 각 리전내에 포함되는 바람직한 에피토프는 표 6에 나타내었다:
-리전 1내에 포함되는 바람직한 에피토프는 SEQ ID NO: 73-76으로 나타내었으며,
-리전 2내에 포함되는 바람직한 에피토프는 SEQ ID NO: 77-79로 나타내었으며,
-리전 3내에 포함되는 바람직한 에피토프는 SEQ ID NO: 80-91로 나타내었으며,
-리전 4내에 포함되는 바람직한 에피토프는 SEQ ID NO: 92-95로 나타내었으며,
-리전 5내에 포함되는 바람직한 에피토프는 SEQ ID NO: 96-99로 나타내었으며,
-리전 6내에 포함되는 바람직한 에피토프는 SEQ ID NO: 100으로 나타내었으며,
-리전 7내에 포함되는 바람직한 에피토프는 SEQ ID NO: 101로 나타내었으며,
-리전 8내에 포함되는 바람직한 에피토프는 SEQ ID NO: 102-110으로 나타내었다.
보다 바람직한 구현으로, PorA 에피토프는 SEQ ID NO: 92-95로 구성되는 그룹으로부터 선택되며, 이는 상기 나타낸 다른 PorA 에피토프 중 적어도 하나와 함께 사용된다.
표 7은 다른(논-PorA) 단백질로부터 식별된 나이세리아 메닝지티디스(Neisseria meningitidis) 기원의 에피토프를 나타내며, SEQ ID NO: 111-134로 나타내었다. 따라서, 바람직한 구현으로, 나이세리아 메닝지티디스(Neisseria meningitidis) 기원의 에피토프는 SEQ ID NO: 111-134로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
보다 바람직한 구현으로, 상기 나타낸 Por A 에피토프는 표 7에 나타낸 바와 같은 다른 단백질로부터 식별된 나이세리아 메닝지티디스(Neisseria meningitidis) 기원의 에피토프와 함께 사용된다. 가장 바람직하게, PorA 에피토프는 SEQ ID NO: 111-134 중 적어도 하나와 함께 SEQ ID NO: 92-95로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
표 8은 PorA 및 논-PorA 단백질로부터 식별된 나이세리아 메닝지티디스(Neisseria meningitidis) 기원의 에피토프를 나타내며, 이는 SEQ ID NO: 135-153으로 나타내어진다. 따라서, 바람직한 구현으로, 나이세리아 메닝지티디스(Neisseria meningitidis) 기원의 에피토프는 SEQ ID NO: 135-153으로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
보다 바람직한 구현으로, 상기 나타낸 나이세리아 메닝지티디스 에피토프는 표 8에 나타낸 나이세리아 메닝지티디스 기원의 에피토프와 함께 사용된다. 가장 바람직하게, PorA 에피토프는 SEQ ID NO: 135-153 중 적어도 하나와 함께 SEQ ID NO: 92-95로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
표 3, 4 및 5에 나타낸 각 에피토프 및 표 2, 6, 7 및 8에 나타낸 나머지들의 주요부는 신규한 것으로 여겨지며, 이는 본 발명의 LCMS 장치의 독자성을 강화한다.
이러한 어느 에피토프는 이로부터 기원하거나 유래된 병원체나 바이러스에 대한 백신에 편입하고자 하는 잠재적 후보이다. 따라서, 본 발명은 또한 이러한 에피토프를 운반하는 병원체에 의해 야기되는 질병의 예방 및/또는 치료용 백신의 제조를 위해 사용되는 본 명세서에 나타낸 에피토프를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 주어진 병원체에 대해 본 발명에서 식별된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 그 이상의 에피토프를 포함하는 조성물을 포함하는 것으로 이해된다. 임의로, 공지된 에피토프가 본 발명에서 식별된 에피토프와 함께 사용될 수 있다.
본 명세서에 정의된 바와 같이, 에피토프는 특정 길이를 갖는 것으로 식별된다. 상기 에피토프를 포함하는 조성물은 바람직하게 특정 길이로 한정되지 않는다. 상기 조성물은 본 명세서에 정의된 바와 같은 병원체로부터 유래된 펩타이드를 포함할 수 있으며, 상기 펩타이드는 식별된 에피토프를 포함하며, 바람직하게는 PTM을 포함하는 자연적 프로세싱 및 표출 후 식별되는 특징들을 갖는다. 또한, 조성물은 코어 서열로서 식별된 에피토프를 포함하며, 생체내 투여 후 상기 에피토프의 표출에 유익한 아미노산 서열에 플랭킹되는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 또한, 조성물은 다중 식별 에피토프 및 플랭킹 서열을 포함하여 구성된 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 그러나, 이러한 조성물에 의해 생체내 운반 후, 에피토프가 MHC 클래스 I 에피토프에 대해 8-12 아미노산내에 포함되는 길이 또는 MHC 클래스 II 에피토프에 대해 11-34 아미노산내에, 바람직하게 14-16 아미노산내에 포함되는 길이를 갖는 것이 바람직하다. 상기 아미노산 서열은 바람직하게 본 명세서에 정의된 바와 같은 병원체에 의해 발현되는 단백질로부터 완전히 또는 부분적으로 유래된다. 따라서, 바람직한 구현으로, 본 발명에서 식별된 에피토프를 포함하는 펩타이드가 백신으로서 조성물에 사용된다. MHC 클래스 I 에피토프를 포함하는 펩타이드는 8-20 또는 그 이상의 아미노산 길이범위를 가질 수 있다. MHC 클래스 II 에피토프를 포함하는 펩타이드는 8-40 또는 그 이상의 아미노산 길이범위를 가질 수 있다. MHC 클래스 I 또는 II 에피토프를 포함하는 상기 펩타이드는 에피토프와 그리고 고유 병원체 단백질의 부가적인 플랭킹 서열 또는 상기 고유 병원체 단백질로부터 기원하지 않은 부가적인 플랭킹 서열을 포함할 수 있다.
따라서, 펩타이드는 식별된 에피토프로 구성될 수 있으며, 식별된 에피토프를 포함할 수 있으며, 다중 식별 에피토프를 포함하거나 본 발명에서 식별된 에피토프 서열 중 하나와 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 그리고 여기서 바람직하게 이러한 펩타이드는 본 발명에서 식별된 병원체로부터 기원한 고유 아미노산 서열이 아니다. 바람직하게, 펩타이드는 상기 식별된 서열 중 하나와 이의 동일성으로 정의되며 본 발명에서 상기 식별된 것과 같은 길이를 갖는다. 동일성은 가장 많은 수의 동일한 아미노산이 얻어지도록 두 서열을 정렬한 후 두 서열간의 동일한 아미노산의 수를 나타냄으로써 계산된다.
본 발명에서 식별된 에피토프를 포함하는 조성물은 하나 이상의 에피토프가 본 발명에서 식별된 병원체의 고유 단백질이 백신으로 사용되는 것을 의미한다. 이는 바람직하게 병원체의 신규한 고유 단백질이 적어도 하나의 에피토프를 갖는 것으로 본 발명에서 식별된 경우이다. 택일적으로, 상기 고유 단백질의 일부가 사용될 수 있다. 본 발명의 정황상, "일부"는 상기 성숙 단백질 서열의 아미노산 수의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100를 의미한다. 실험 데이타에서(참조 표 2, 4-8), 여러 병원체 특이 단백질이 식별되었다. 이러한 표에서 식별된 각 단백질 또는 이의 일부가 이에 상응하는 병원체에 대한 백신으로서 조성물에 사용될 수 있다.
본 발명에 사용되는 상기 조성물의 (폴리)펩타이드는 쉽게 합성될 수 있다. 다른 조성물은 이의 최적 형태로 하나 이상의 다중 식별 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드에 대한 유전자(DNA) 암호를 포함할 수 있다. 현재의 기술로는 상기 (폴리)펩타이드 또는 상기 DNA를 생성하는 다수의 방법이 알려져 있다.
본 발명은 따라서 또한 본 명세서에서 앞서 정의된 바와 같은 본 발명의 에피토프를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 바람직하게 약학 조성물이며, 바람직하게 백신으로 사용된다. 백신은 포유류의 면역화(면역반응 상승) 또는 백신화에 사용될 수 있다. 조성물은 또한 보조제를 포함할 수 있다. 보조제는 에피토프와 함께 사용될 경우 포유류, 바람직하게 인간을 면역화하고, 면역 시스템을 자극시키고, 이에 따라 바람직하게는 보조제 자체에 대한 특이적 면역반응을 생성시키지 않고, 상기 에피토프에 대한 면역반응을 유발, 증진 또는 촉진하는 어느 물질 또는 화합물을 포함하는 것으로 정의된다. 바람직한 보조제는 동일한 조건하에서, 하지만 보조제의 부재하에서 상기 에피토프에 대해 생성되는 면역반응에 비해 적어도 1.5, 2, 2.5, 5, 10 또는 20의 팩터로 주어진 에피토프에 대해 면역반응을 증진시킨다. 동물 또는 인간 그룹에서 대조군에 비해 보조제에 의해 생성되는 주어진 에피토프에 대한 면역반응의 통계학적 평균 향상을 측정하기 위한 시험은 당 기술분야에 알려져 있다. 보조제는 바람직하게 적어도 두 개의 다른 에피토프에 대한 면역 반응을 증진시킬 수 있다. 본 발명의 보조제는 포유류에 대해 이질적인 화합물일 것이며, 이에 따라 예를 들어, 인터루킨, 인터페론 및 다른 호르몬과 같이 포유류에 내생적인 면역자극 화합물을 배제한다.
다른 바람직한 구현으로, 약학 조성물은 또한 약학적으로 허용되는 캐리어를 포함한다. 약학 조성물은 또한 약학적으로 허용되는 안정화제, 삼투압제, 완충제, 분산제 등을 포함할 수 있다. 바람직한 형태의 약학 조성물은 의도된 투여방식 및 치료 적용에 따라 달라진다. 약학적 캐리어는 활성 성분, 즉, 에피토프 및 임의로 보조제를 환자에게 운반하기에 적절한 어느 호환성, 무독 물질일 수 있다. 비강내 운반을 위한 약학적으로 허용되는 캐리어는 예를 들어, 물, 완충 염용액, 글리세린, 폴리소르베이트 20, 크레모포 EL 및 카프릴릭/카프릭 글리세라이드의 수성 혼합물일 수 있으며, 중성 pH 환경을 제공하기위해 완충될 수 있다. 비경구 운반을 위한 약학적으로 허용되는 캐리어는 예를 들어, 멸균 완충 0.9% NaCl 또는 5% 글루코즈이며, 임의로 20% 알부민이 보충된다. 비경구 투여를 위한 제조물은 반드시 멸균되어야 한다. 활성 성분의 투여를 위한 비경구 경로는 예를 들어, 피하, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내 또는 병변내, 비강내, 피내 또는 구강 경로에 의한 주사 또는 주입과 같이 공지된 방법에 따른다. 본 발명의 조성물은 바람직하게 볼러스 주사에 의해 투여된다. 근육내 주사를 위한 전형적인 약학 조성물은 예를 들어, 1-10ml의 PBS 및 1-100μg, 바람직하게 15-45μg의 본 발명의 에피토프를 함유하도록 제조될 수 있다. 구강 투여를 위해, 활성 성분은 엘릭시르, 시럽 및 서스펜션과 같은 액체 투여형으로 투여될 수 있다. 구강 투여용 액체 투여형은 환자 수용성을 증가시키기 위해 착색제 및 향료를 함유할 수 있다. 비경구, 구강 또는 비강내 투여가능한 조성물을 제조하는 방법은 당 기술분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Science(15th ed., Mack Publishing, Easton, PA, 1980)(본 명세서에 참고문헌으로 편입됨)을 포함하는 다양한 공급처에 보다 상세하게 설명되어 있다.
본 발명의 에피토프의 다른 용도
다른 견지로, 포유류의 면역 상태를 평가하는데 사용되는 본 발명의 에피토프의 다른 용도가 제공된다. 이러한 견지에서, 병원체의 에피토프를 포함하는 혼합물은 숙련자에게 알려진 기술을 이용하여 상기 포유류로부터 APC 또는 T 세포와 함께 시험관내에서 배양될 수 있다. 포유류의 면역 상태를 평가하는 것은 상기 포유류가 주어진 병원체로 이미 감염되었는지 또는 투여된 백신이 상기 병원체에 의한 미래의 감염으로부터 상기 포유류를 여전히 보호하는지 평가하는 것을 의미한다. 바람직하게, 에피토프는 본 명세서에 나타낸 어느 방법을 이용하여 획득가능하다. 바람직한 에피토프 및 상기 에피토프를 포함하는 바람직한 조성물은 앞서 이미 정의된 바와 같다. 상기 T 세포의 활성화 또는 APC와 관련된 에피토프의 프로세싱 및 인식의 검출은 상기 포유류가 상기 병원체에 대해 여전히 보호되고 있음을 나타낼 수 있다. 상기 에피토프에 대해 특이적인 T 세포의 활성화는 증식 어세이에서 평가되거나, 이러한 T 세포에 의해 생성되는 사이토카인 또는 다른 이펙터 분자의 증가에 의해 평가될 수 있다. 이러한 각 방법은 숙련자에게 알려져 있다. 상기 용도는 또한 시험관내 '보호 연관성(Correlates of Protection)(CoP)'으로 칭하여진다.
본 명세서 및 청구범위에서, 동사 "포함하는" 및 이의 활용형은 비제한적인 견지로 그 단어에 후속하는 아이템이 포함되는 것을 의미하지만, 특별히 언급되지 않은 아이템이 배제되는 것은 아니다. 또한, 동사 "구성하는"은 본 명세서에 정의된 바와 같은 생성물 또는 조성물이 특이적으로 식별된 하나 이상의 부각적인 성분들을 포함할 수 있는 것으로 의미하는 "필수적으로 구성하는"으로 대체될 수 있으며, 상기 부가 성분들은 본 발명의 독특한 특성을 변화시키지 않는 것들이다. 또한, 부정관사 "하나(a 또는 an)"는 정황상 분명히 하나이거나 단지 하나만의 요소가 존재하는 것을 요구하는 경우를 제외하고 하나 이상의 요소가 존재하는 가능성을 배제하지 않는다. 부정관사 "하나(a 또는 an)"는 따라서 보통 "적어도 하나"를 의미한다.
본 명세서에 인용된 모든 특허 및 문헌적 참고문헌들은 본 명세서에 참고문헌으로 편입된다.
이하 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명하나, 본 발명을 이에 한정하는 것은 아니다.
도 1-7의 상세한 설명
도 1은 LCMS 셋업 1의 일 견지를 개략적으로 나타낸 것이다. 좌측편에 주입 밸브 2를 도식적으로 나타내었다. 밸브 2는 펌프, 바람직하게 혼합 펌프와 연결된 공급 3와 연결될 수 있다. 상기 밸브는 또한 주입 루프 5를 포함하는 루프 4에 연결된다. 주입 밸브는 또한 폐기물 출구 6 및 7과 그리고 다음 밸브, 보다 구체적으로 도 1의 우측에 도식적으로 나타낸 소위 딘스(Deans) 밸브 10에 연결된 배출구 8에 연결될 수 있다. 상기 밸브는 흐름의 일부가 배출구 8내로 분할되도록 형성된다.
상기 딘스 밸브 10은 상기 컬럼 흐름을 분석 컬럼 11내로 스위칭, 분할 및 배향하여 질량 스펙트로미터 12내로 유입시키기 위해 사용된다. 상기 딘스 밸브는 간단한 6-포트 스위칭 밸브를 이용하여 리모트 센스로 분할을 수행한다. 컬럼 헤드 압력은 리스트릭터 13의 치수에 의해 생성된다. 딘스 밸브는 또한 플러그 14, 15 및 폐기물 16, 17에 연결된다.
일 구현으로, LCMS 장치는 나노스케일 펌프 배열을 포함한다. 펌프 배열은 펌프를 포함하며 연속적으로 변하는 바이너리 용매에 대해 ml/min 범위로 흐름 속도를 운반할 수 있다. 다른 구현으로, 통상적인 고압 액체 크로마토그래피(HPLC) 펌프가 사용된다.
펌프, 바람직하게 HPLC 펌프 또는 바이너리 또는 쿼터너리 펌프는
(i) 주어진 컬럼 흐름 속도 또는 정밀한 구배 흐름으로 선형 및 지연되지 않은 구배를 운반할 수 있어야 하고(정밀하고 잘 정의된 비율로 적어도 두 용매의 혼합),
(ii) 고상 추출 트랩은 (전체) 분리 효율에 악영향을 주지 않아야 하며; 그리고
(iii) ESI 인터페이스에서 피크 증폭은 없거나 최소이어야 한다. 비선형 및 지연 구배는 정체 부피(Vm)를 펌핑하는 것과 비교하여 너무 낮은 흐름 속도(F)로 펌프를 작동시킴으로써 야기될 수 있다.
일 구현으로, 나노스케일 LC 펌프는 본 발명에 따라 LCMS 장치에 사용된다. 그러나, 이들은 고가이며 매우 낮은 흐름 속도, 즉, 30nl/min이하의 속도에서 정밀하고 안정한 구배를 생성할 수 없다.
일 구현으로, 상기 펌프 배열은 혼합 용매 시스템의 원하는 저 흐름 속도를 매우 정확한 방식으로 생성하기에 편리한 방법으로서 흐름 분할 장치와 함께, 펌프, 바람직하게 HPLC 펌프를 포함한다. 상기 시스템은 소위 컷팅 인 가스 크로마토그래피를 위해 종래에 개발된 리모트 스위칭 메카니즘에 기초하며, 이는 딘스(Deans) 스위칭으로 칭하여진다. 상기 컬럼을 분할 및 배향하는 것은 일 구현으로 6구 스위칭 밸브(딘스 밸브로 칭하여짐)를 사용하여 리모트 센스로 수행된다. 원하는 컬럼 헤드압력은 트래핑 컬럼의 상향흐름에 위치한 리스트릭터의 치수(길이, 내부 직경) 및 펌프의 일차 배출구 흐름 속도로부터 형성된다. T-커넥터가 상기 리스트릭터와 후속적인 하향흐름 컬럼을 연결하는데 사용될 수 있다.
나노스케일 HPLC 시스템은 용매 진공 디개서, 용매 혼합 펌프, 바람직하게 쿼터너리 혼합 펌프, 보다 바람직하게 고압 혼합 바이너리 펌프, 적어도 10μl 시료량을 주입할 수 있는 오토샘플러를 포함한다. 바람직하게, 모든 연결 배관은 105μm이하, 바람직하게 55μm이하, 그리고 보다 바람직하게 30μm이하의 내부 직경을 갖는다. 상기 배관은 비활성화되지 않은 융합 실리카로 구성된다.
딘스 밸브 10의 분할 및 배향 시스템의 일원은 두 개의 3웨이 커넥터 20,21 사이에 위치한 트래핑 컬럼 19이다. 트래핑 컬럼은 최대 5μm의 크기를 갖는 파티클을 포함하는 정지기 베드를 포함하며, 상기 정지기 베드의 치수는 5mm의 길이, 바람직하게 적어도 10mm 및 바람직하게 적어도 20mm의 길이 및 약 50μm의 내부직경을 갖는다.
일 구현으로, LCMS 장치는 고상 추출(SPE) 트래핑 컬럼을 포함하거나 또는 분석 컬럼 11로부터 상향흐름에 트래핑 컬럼 19를 포함한다. 트래핑 컬럼은 딘스 밸브 10과 병렬적으로 위치할 수 있으며, 이는 또한 문헌적으로 Vented Column 또는 V-컬럼으로 알려진 시스템이다(Licklider et al. 2002). 트래핑 컬럼은 상대적으로 많은 시료량을 나노스케일 LC 컬럼내로 상대적으로 신속하게 로딩할 수 있다. 트래핑 컬럼 19의 내부 직경은 분석 또는 분리 컬럼 11의 내부 직경과 맞추어져야 한다.
큰 내부직경(ID)을 갖는 트래핑 컬럼의 사용은 약 1mm/s의 최적 값보다 훨씬 낮은 이동상 적가의 선형 속도에 기인하여 분석 컬럼 11상에 상대적으로 넓은 밴드로 트래핑된 화합물을 이송한다. 트래핑 컬럼 19에서 이동상의 선형 속도는 1mm/s의 선형 속도에서 작동되는 50μm ID 분석 컬럼 11과 함께 사용할 경우 컬럼/트랩 ID 비율의 제곱에 비례하거나, 또는 300μm ID 및 100μm ID 트래핑 컬럼에 대해 각각 0.03 및 0.25mm/s이다. 또한, 라지 ID 트래핑 컬럼 19는 용출 프로세스가 시작되기 전에 트래핑 컬럼 19의 공극 부피 및 연결 배관이 상기 컬럼을 통과해야하기 때문에 현저한 지연을 일으킨다.
일 구현으로, 분석 컬럼 11은 최대 3μm의 크기를 갖는 파티클을 포함하는 정지기 베드를 포함할 수 있으며, 상기 정지기 베드의 치수는 25cm, 바람직하게 적어도 50cm, 그리고 보다 바람직하게 적어도 95cm의 길이를 가지며, 그리고 약 25μm의 내부 직경을 갖는다. 이러한 컬럼의 말단은 전도성 나노스프레이 팁 또는 에미터와 인접한 연결에 있으며, 이의 예를 도 2에 나타내었으며(약 25μm의 내부직경을 가지며, 상기 팁의 테이퍼드 말단 부근에 3.5μm 내부 직경으로 테이퍼드된 융합 실리카 배관을 포함함), 이는 본 발명에 따른 골드-카본 코팅을 갖는다. 이러한 분석 컬럼 11을 포함한 LCMS 셋업은 약 30nl/min의 흐름 속도로 작동할 수 있다. 펩타이드 시료의 분석 전에 상기 크로마토그래픽 시스템을 인증하는 것이 매우 권장된다.
일 구현으로, 탠덤 질량 스펙트로미터 12가 사용된다. 질량 스펙트로미터는 적어도 10,000 FWHM의 질량 해상도로 작동할 수 있다. 질량 스펙트럼은 적어도 0.9sec/scan의 스캔 속도로 프로필 컨티뉴 모드에서 습득되어야 한다. 질량 측정의 정확도는 100ppm(parts per milion)이상이어야 한다.
시료 성분들은 여러 물리적, 화학적 또는 이들의 분자 크기, 극성, 전하 등과 같이 다른 분석물의 특이적 특성에 기초하여 분리될 수 있다. 일 구현으로, 예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 상호작용 또는 이온 교환 크로마토그래피, 특정 분자 상호작용(예, 항체-항원) 등과 같은 여러 방법의 조합(여러 타입의 크로마토그래피)이 이루어진다. 또한 여러 가지의 이러한 크로마토그래피 방법은 시료를 분획화하는데 사용될 수 있다.
분리 효율은 1차원으로 SCX 크로마토그래피를 사용함으로써 유의하게 증가되며, 이는 2차원으로 사용되는 역상 크로마토그래피에 직교한다. 2차원 LCMS(2D-LC/MS)에서 최상의 성능은 두 가지 분리 시스템을 독립적으로 최적화하는데 있어 가장 고도의 자유상태를 제공하고, 분리 효율에 대한 어느 타협을 못하게 함으로써 오프라인 작동모드에서 획득된다. SCX 크로마토그래피는 또한 펩타이드 시료에 여전히 존재할지 모르며 펩타이드 용출 도중에 방해할 수 있는 어느 잔류 세제나 버퍼 성분을 제거하는데 중요하다. 이러한 화합물은 공극 부피에서 SCX 컬럼으로부터 용출될 수 있으며, 따라서 일반적으로 펩타이드를 함유하지 않는 1차 분획에 나타날 것이다.
LC 컬럼의 분리 효율은 단일 러닝으로 분리될 수 있는 성분수(즉, 피크 용량)로 표현될 수 있다. 상기 컬럼 분리 효율은 컬럼의 길이(L) 및 플래이트 높이(H)의 몫이다.
Van Deemter(Van Deemter et al. 1956)에 따르면, 이론적 플래이트의 높이(H)는 정지상 파티클의 파티클 크기(dp)에 비례하여 의존한다. 플래이트 카운트에서 다른 파라미터는 이동상의 흐름 속도이며, 이는 최적 선형 속도(1mm/s에 가까운)와 조합된 선형의 쌍곡선 함수이다. 일 구현으로, 상기 컬럼 헤드 압력은 이동상이 대략 이러한 값의 선형 속도를 갖도록 조절된다.
LCMS 셋업은 숙련자에게 알려져 있으며, 다수의 택일적인 셋업이 가능하다는 사실은 잘 알려져 있다. 도 1에 나타낸 셋업은 단지 다수의 가능한 셋업 중 하나의 예일 뿐이다.
도 2는 도식적으로 나타낸 전기 스프레이 이온화 유니트 500의 일부인 에미터 30의 팁을 나타낸다. 점선으로 나타낸 상기 유니트 500은 에미터 30에 연결된 502에, 특히 코팅에 연결된 전류 공급원 501을 포함한다.
에미터 30은 커넥터 32를 이용하여 분석 컬럼 31의 말단에 연결된다. 커넥터 32는 단지 도식적으로 나타내었다. 도 2는 컬럼 31의 말단에 연결된 에미터의 단면을 나타낸다. 특정 구현으로, 에미터 30과 컬럼 말단 33 사이의 연결은 버트(butt) 연결이다. 다른 구현으로, 컬럼과 팁 사이에 적절한 버트 연결을 이루기 위해 다이아몬드 컷터가 컬럼 31의 원위 말단 33 및 에미터 30의 근위 말단을 제조하는데 사용된다. 컬럼 31의 외부 직경 36은 바람직하게 200-800μm 범위내이다. 상기 배관은 융합 실리카를 포함할 수 있다. 융합 실리카 배관에서, 내부 캐버티 37은 내부 직경 38, 바람직하게 약 10-200μm, 보다 바람직하게 15-50μm 범위내로 내부 직경을 갖도록 형성된다.
에미터 30은 컬럼 말단 33에 연결되는 근위 말단 34 및 테이퍼드 형태를 갖는 원위 말단 39를 포함한다. 테이퍼드 말단 39는 감소된 외부 직경 및 감소된 내부 직경 모두를 갖는다.
도 3a-3d에 에미터 30의 팁을 제조하는 방법예를 나타내었다. 도 3a에 나타낸 바와 같은 1차 단계로, 융합 실리카 배관 43의 코팅 42는 (적어도 부분적으로) 예를 들어, 부탄 토치 44를 이용하여 제거된다. 후속적인 단계로, (도 3b에 도식적으로 나타낸 수단에 의해) 융합 실리카 43의 가열된 말단은 방향 45로 당겨지며, 이는 에미터 30이 상기 방향으로 신장 또는 연장되도록 한다. 배관은 함께 스퀴징되고, 이는 내부 캐버티를 감소시켜 결국 이를 폐쇄시킨다. 그 다음, 융합 실리카 배관은 이의 외부 표면상에 코팅 47과 함께 제공되며, 이는 전류가 전도되도록 하고 이의 테이퍼드 말단 46에 이를 수 있도록 하여, 전기 스프레이 작업을 가능케 한다. 이의 테이퍼드 말단 46 부근에서 팁의 내부 직경 41은 바람직하게 약 2-30μm, 보다 바람직하게 3-10μm의 범위내이다. 보다 작은 내부 직경은 후속적인 지량-스펙트럼 분석의 감도를 더욱 증가시킬 것이다.
도 3c에서, 상기 언급된 팁상의 코팅 적용을 나타내었다. 일 구현으로, 금과 같은 귀금속을 포함하는 1차 코팅이 팁 46상에 적용된다. 그러나, 금 코팅은 전기 스프레이 도중에 질을 저하시키며, 장기간에 연속적 전기 전도를 제공할 수 없는 것으로 나타났다. 택일적으로 또는 부가적으로, 탄소계 전도성 코팅이 팁 46상에 적용된다. 이러한 코팅은 스프레이 공정에 의해 팁상에 적용될 수 있다. 일 구현으로, 탄소가 에어로졸 또는 증기 증착을 이용하여 증착된다. 탄소 입자는 이소프로판올에 현탁될 수 있다.
본 발명에 따른 일 구현으로, 코팅을 적용하는 단계는 1회 이상 반복될 수 있다. 일 구현으로, 다중 코팅이 교대로 상부상에 적용된다.
바람직하게, 코팅의 조합이 팁 코팅에 사용된다. 일 구현으로, 일차 금 코팅이 적용된 후, 탄소계 전도성 코팅이 적용된다. 다른 구현으로, 금 코팅이 일차로 적용된 다음, 금 코팅은 탄소계 전도성 코팅층으로 덮힌다. 탄소계 전도성 코팅의 층은 1ml의 이소프로판올에 현탁된 50mg의 Leit-CTM 탄소 입자를 제조하고 이를 에미터상에(즉, 팁상에) 스프레이함으로써 적용된다. Leit-C-plastTM은 고 전기 전도성 및 영구적인 가소성을 갖는 접착제이며, Electron Microscopy Sciences(EMS), Hatford, UK로부터 구입가능하다.
일 구현으로, 전도성 내산화성 물질이 팁의 테이퍼드 말단에 금 코팅의 상부에 추가적인 코팅제로서 사용된다. 일 구현으로, 탄소계 전도성 코팅이 사용된다.
다른 구현으로, 실리콘 합금이 사용된다.
다른 구현으로, 전기 전도성 폴리머가 본 발명에 따른 코팅에 또는 부가적인 코팅으로 사용된다.
부가적인 코팅은 금 코팅에 접착될 수 있다. 부가적인 코팅은 보호를 제공한다. 일 구현으로, 상기 코팅은 에미터의 테이퍼드 말단상에 스프레이된다. 다른 구현으로, 내산화성 코팅이 테이퍼드 말단상에 적용된다. 이소프로판올과 같은 적절한 용매가 스프레이에 사용된다. 다른 구현으로, 에미터의 테이퍼드 말단상에 스프레이되는 슬러리는 30-70mg, 바람직한 구현으로 45-55mg 전도성 탄소 시멘트를 1ml의 이소프로판올에 함유한다.
도 3d에 나타낸 후속적인 단계로, 에미터 30의 폐쇄 말단은 예를 들어, 다이아몬드 컷터와 같은 컷터 49를 이용하여 제거된다. 컷팅은 감소된 내부 직경을 갖는 테이퍼드 말단 39를 갖는 에미터를 형성한다. 배관 43을 스퀴징하고 배관 43의 프리 말단에서 당기는 힘을 가하는 조합된 영향은 내부 직경의 매끄러운 감소를 일으킨다.
일 구현으로, 융합 실리카 배관에 대한 커넥터는 트래핑 컬럼 및/또는 분석 컬럼의 각 부분을 연결하는데 사용된다. LCMS 셋업에서 3-웨이 커넥터 또는 T-커넥터가 상기 컬럼들 또는 밸브들을 연결하는데 사용된다. 종래기술에서, Upchurch®의 3-웨이 커넥터(Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA로부터 스루-홀 유니온으로 당 기술분야에 알려짐)가 사용된다. 바람직하게, 외부 직경 및 내부 직경을 갖는 융합 실리카, 상기 내부 직경을 규정짓는 캐버티(cavity)로 구성된 배관은 이러한 커넥터를 이용하여 연결된다. 바람직한 구현으로, 상기 커넥터는 스루-홀 커넥터이다.
일 구현으로, LCMS 장치는 25μm의 내부직경을 갖는 나노스케일 컬럼을 포함한다. 펩타이드를 이용한 적용에서, 이러한 펩타이드는 전형적으로 1나노리터이하의 양으로 농축 밴드에서 이러한 컬럼을 통해 이동한다.
다른 구현으로, 나노스케일 배관용 커넥터는 데드볼륨이 없이 제공되며, 이들은 바람직하게 400bar(즉, 4x104kPa)이상의 압력에서 사용되기에 적절하다.
일 구현으로, 상기 커넥터는 어뎁티드 업처치 스루-홀 T-커넥터이다.
일 구현으로, T-커넥터는 적어도 하나의, 아마도 두 개의 페룰 및 바람직하게 세 개의 페룰을 포함한다. 배관 및 특히 마이크로캐필러리 나노스케일 컬럼은 상기 페룰의 캐버티에서 받을 수 있다. 이는 연결 요소의 내부 체적내에 배관의 설치를 가능케 한다. 페룰 캐버티는 적절한 크기를 갖는다. 페룰 캐버티는 일반적으로 페룰 캐버티내에 받게되는 배관의 외부 직경과 동등하거나 근접한 내부 직경을 갖는 스로우 캐버티이다. 페룰 캐버티는 삽입된 배관의 배관 외부직경과 마찰접촉을 가질 것이다.
상기 커넥터와 함께 페룰은 배관의 캐버티를 연결 요소의 캐버티에 맞춰 조정하는데 사용된다. 연결 요소는 페룰을 맞추기 위한 수신 캐버티를 포함하며, 여기서 캐버티와 페룰을 맞추는 것은 협조적이며 분리가능하다. 연결된 상태에서, 페룰은 연결 요소의 내부 캐버티에 대한 내부 캐버티를 갖는 배관을 배치할 것이다. 바람직하게 상기 연결 요소는 두 페룰 맞춤 캐버티 조합을 포함한다. 현재의 업처치 디자인에서, 커넥터의 내부 체적은 데드 볼륨을 포함한다.
현재의 업처치 디자인과 관련하여, 내부 캐버티는 매우 상당히 확장되어 있다. 이는 숙련자의 공지 기술과 상반되는 것이다.
도 4는 도 1에 따른 셋업의 3-웨이 연결 또는 스위칭 요소 20, 21을 상세하게 나타낸 것이다. 이 도면은 비율에 따른 것이 아니다. 보다 상세하게, 나타낸 요소들의 직경비는 나타낸 비율로 한정되지 않는다.
3-웨이 연결 요소 20은 3 페룰 51-53을 포함한다. 페룰들은 3-웨이 커넥터 20의 3 말단에서 수신 캐버티에 맞춰지는 바디이다. 일 구현으로, 3 페룰은 다른 크기를 갖는다. 맞춰진 페룰은 캐버티의 형태에 본질적으로 상응하는 이의 형태에 기인하여 캐버티에서 자가-정렬될 수 있다. 보다 상세하게, 이러한 구현에서 페룰은 캐버티의 원뿔형에 상응하는 원뿔형을 가질 수 있다. 자가-정렬은 연결요소 20에 대해 페룰의 수신 캐버티를 예정된 위치로 가져오게 할 수 있다.
페룰 51-53은 캐버티를 포함할 수 있다. 배관 54-56의 외부 직경 및 캐버티의 내부 직경은 페룰이 이의 캐버티내에 어느 배관 54-56을 받을 수 있도록 적응된다.
페룰 51-53은 연결 요소 20, 21의 각 캐버티에서 받는 연결 상태로 보여진다. 캡 57-59가 제공되며, 상기 캡은 커넥터에 캡 57-59를 고정하기 위한 고정 시스템(상세히 나타내지 않았음)을 포함하며, 이에 따라 페룰 51-53의 위치를 고정한다. 일 구현으로, 고정 시스템은 예를 들어, 나사 연결과 같은 잠금 시스템을 포함한다. 고정 시스템은 또한 연결 상태에서 페룰 51-53을 고정하고 조이도록 구성되고 배열될 수 있어, 그 결과 배관 54-56의 외부 직경상에 가해지는 클램핑 힘이 형성된다. 이는 배관 54-56이 이들 각 위치에 잠겨지도록 한다.
연결 요소 20, 페룰 51-53 및 캡 57-59는 다양한 제조기술로, 특히 사출 성형에 의해 제조될 수 있다.
배관 54, 56은 이들이 페룰에서 받아지고, 페룰은 연결 요소와 실질적으로 일직선으로 연결되는 상태로 존재한다. 이는 배관 54,56의 내부 공동이 실질적으로도 일직선으로 존재함을 의미한다.
다른 구현으로, 연결 요소의 내부 체적, 바람직하게 커넥터에 대한 T-바디의 내부 체적은 배관을 받는 페룰의 캐버티와 정렬된다. 이러한 보정된 연결 요소에서, 바람직하게 연결 요소의 내부 바디의 일부가 드릴링에 의해 제거된 업처치 요소에서, 현재 연결 요소는 배관이 연결 요소의 두 각각의 측면 말단에 정렬되도록 하고, 배관은 연결 요소내 접합부에 이들 말단과, 즉, 커넥터, 바람직하게 3-웨이 커넥터의 내부 캐버티내에 배치될 수 있다.
나타낸 구현에서, 융합 실리카 배관 54,56의 말단 60,61은 배관 54,56이 페룰 51,53의 연결 상태에서 접합되도록 직선 컷을 얻기 위해 다이아몬드 커터를 이용하여 절단되었다. 이는 연결 요소 20의 바디내 데드 볼륨의 형성을 억제한다.
이러한 인접 연결에도 불구하고, 배관 54,56내의 액체는 접합 말단을 통해 누출될 수 있으며, 이는 배관 55를 통한 액체의 통과를 가능케 한다.
다른 구현으로, 연결 요소는 연결 요소에 대한 페룰을 고정하는 고정 요소를 포함한다. 일 구현으로, 고정 장치는 클램핑 수단을 포함한다. 일 구현으로, 페룰을 클램핑하는 것은 페룰에서 받게되는 장소에서 배관을 클램핑하게 한다. 고정 장치는 배관 뿐만 아니라 페룰을 위치에 고정하기 위해 구성되고 배열된다.
다른 구현으로, 두 조각의 배관이 3-웨이 커넥터로 연결되며, 여기서 연결 요소의 주입구 및 배출구는 직선으로 위치하고, 제3 커넥터는 이러한 직선에 수직으로 연결된다. 배관은 버트 연결 위치에 위치되며, 제 3 커넥터가 연결 채널을 가지며, 액체 크로마토그래피에 사용되는 고압에 기인하여 누출량은 이러한 연결 채널에 도달할 수 있기 때문에 이러한 인접 연결은 연결 조각의 중간에서 정확히 모일 필요가 없다.
도 5 및 6은 가압 용기 또는 분무기 70을 나타낸다. 분무기 70은 크로마토그래픽 파티클의 서스펜션을 함유하며, 바람직하게 현탁 크로마토그래픽 정지상을 함유하는 바이얼을 함유한다.
일 구현으로, 배관은 예를 들어, 배관을 온도 프로그래밍화된 오븐에 둠으로써 가열된다. 바람직하게, 프로그래밍된 온도가 사용된다. 일 구현으로 초기 온도는 30℃에서 5분, 그 다음 15분내에 100℃로 상승되고, 이 온도는 5시간동안 유지되는 것으로 설정된다. 후속적으로, 프릿 및 배관은 주위 온도로 냉각된다. 그 후, 단단해진 프릿 및 융합 실리카는 실온으로 냉각된다. 그 다음, 융합 실리카 커터를 사용하여 약 1-2mm의 길이로 형성된 세라믹 프릿을 다듬는다. 바람직하게 직선 컷이 적용된다.
다른 구현으로, 상기 컬럼을 패킹함으로써 나노스케일 LC 컬럼이 제조 및 제공된다. 컬럼을 패킹하는 방법은 융합 실리카(FS) 배관내에 프릿을 보유하는 파티클을 제조하는 것을 포함한다. 배관은 원하는 길이를 갖도록 잘려진다. 특정 구현으로, 90/10(v/v) 비율의 포타슘 실리케이트 용액(소위 KASIL이라고도 칭함)과 포름아미드의 혼합물이 제공된다. 그 혼합물을 격렬히 흔든다. 일 구현으로, 보텍스 혼합이 예를 들어, 10s간 사용된다. 바람직하게 직후에 융합 실리카를 이 혼합물에 단기간동안(중요하지 않지만, 예를 들어 1초) 담그어 혼합물의 수 cm 길이의 플러그가 배관내로 적셔지도록 한다.
일 구현으로, LC 분석 컬럼을 패킹하는 것은 가압 용기(분무기)에 프릿과 함께 제공된 융합 실리카 배관을 장착하는 것을 포함한다. 가압 용기는 원하는 파티클의 슬러리를 함유할 수 있다. 바람직하게, 페룰이 배관을 가압 용기에 장착하는데 사용된다. 바람직하게, 본 발명에 따른 연결부는 가압 용기에 배관을 연결하는데 사용된다.
바람직하게, 진동 요소 74가 전체 컬럼을 진동시키는데 사용된다. 본 발명에 따른 방법의 일 구현으로, 컬럼은 컬럼의 길이에 걸쳐 적어도 두 위치에서 진동된다. 일 구현으로, 적어도 2개의 주파수, 바람직하게 초음파 주파수가 진동에 사용된다.
특정 구현으로, 융합 실리카 컬럼의 프릿화된 말단은 초음파조(예, Branson 200)내에 배치된다. 다른 구현으로, 초음파 처리는 고상 파티클이 융합 실리카 컬럼내로 플러싱된 후에만 수행된다.
컬럼을 패킹하는 방법의 일 구현으로, 고농축(두꺼운) 슬러리가 사용된다. 슬러리의 사용은 좁은(25μm ID) 및 긴 길이 컬럼을 패킹하는데 가장 편리한 방법이다.
일 구현으로, 상기 슬러리는 1ml의 아세톤에 현탁된 적어도 150mg 역상 파티클을 함유한다. 패킹 도중에 상기 컬럼을 통한 아세톤 대 이소프로판올의 선형 속도는 7±1의 놀라운 팩터와 동등하다.
패킹된 컬럼을 제조하는 다른 특정 구현으로, 프릿티드 FS 배관이 가압 용기내에 원하는 파티클의 슬러러로 0.5mm의 구멍을 갖는 페룰을 통해 놓여진다(프릿 업). 페룰은 용기와 연결된다. 그 다음, 예를 들어, 헬륨 실린더상에 장착된 리듀서의 제 2 압력은 약 50bar로 조절되고, 예를 들어, 밸브(예, Swagelok SS-41GSX2 밸브)를 열어 분무기에 압력을 적용한다.
컬럼이 준비되면, 패킹의 다짐도는 바이너큘라(25x)를 이용하여 시각적으로 검사된다. 사용 전, 컬럼을 아세토니트릴/물(85/15, v/v) 그리고 0.1M 아세트산으로 250bar의 압력에서 HPLC 펌프를 이용하여 플러싱한다.
바람직하게 상기 컬럼은 사용 전에 시험된다. 컬럼의 배압(bar/cm)이 체크될 수 있다. 컬럼의 프릿화 말단에 슬리브(내부 직경 0.4mm)를 배치한다. 1분간 슬리브에서 메니스커스의 이동을 측정한다. 용량은 하기로부터 얻어진다:
흐름 속도(nl/min) = 이동(mm) x 100(nl/mm).
펌프상의 압력을 읽고, 컬럼을 지나는 정상화 압력 드롭(Pb, 컬럼 길이의 bar/cm)을 계산한다:
Pb = [시간/용량] x [(ID/50)2 x 125] x P/L
여기서, "시간"은 흐름 측정의 기간(분)이며, "용량"은 수집된 용량(nl)이며, "ID"는 컬럼 내부 직경(μm)이며, "P"는 흐름 측정 도중 컬럼 헤드 압력(bar)이며, 그리고 "L"은 컬럼의 길이(cm)이다.
융합 실리카 배관 71이 제공되며, 상기 배관 71의 일 말단에 다공성 세라믹 프릿 72가 형성된다. 다른 말단은 고압 용기 70에 연결된다. 고압은 현탁된 파티클의 일부를 캐버티내로 가져오게 할 것이다. 파티클이 캐버티내로 흐르는 도중에, 초음파 진동 요소 74가 파티클내 공극 볼륨의 형성을 억제하기 위해 컬럼 71 또는 컬럼 71의 일부를 진동시키는데 사용될 수 있다. 일 구현으로, 진동 요소 74는 컬럼내에 물질이 밀집된 부근에 위치한다.
하향흐름 방해가 일어나는 경우에, 컬럼은 위로 올려질 수 있으며, 슬러리 밖으로 나올 수 있으며(하지만, 여전히 용기내에 있음), 그 액체를 플러싱하여 건조시킬 수 있다. 후속적으로, 융합 실리카(FS)가 슬러리내에 다시 배치되고, 패킹 공정이 원하는 베드 길이가 얻어질 때까지 재개된다.
도 7은 본 발명에 따른 구현들 중 하나와 함께 사용되는 2차원의 액체 크로마토그래피 적용을 도식적으로 나타낸 것이다. 1차원으로서, SCX(Strong Cation eXchange) 및 도식적으로 나타낸 구현에서 SCX와 WAX(Weak Anion eXchange)의 혼합 베드 수지가 사용된다. Motoyama(Motoyama et al. 2007)에 의해 기술된 바와 같은 음이온 및 양이온 교환 파티클의 혼합 베드가 바람직하다.
2차원은 나타낸 바와 같이 C18 역상(RP) 크로마토그래피일 수 있다.
SCX와 역상 크로마토그래피의 호환성은 특히, 양이온 용매, 버퍼 또는 매체의 사용이 함께 이루어지는 경우에 저조하다. 본 발명의 일 구현에 따라, 포름산 또는 염산(HCl)과 같은 용매 매체 81이 사용된다. 이러한 매체의 용출 강도는 낮음에도 불구하고, 특히 포름산은 ACE(Anion-Cation Exchange) 수지에 바인딩된 펩타이드의 회수시 고효율을 나타낸다.
일 구현으로, 단백질 분해 소화된 단백질의 다차원 LCMS/MS 분석으로 SCX 분획화가 RP 분리와 함께 사용되었다. 이러한 분석 기술들은 결합되어 분리 효율 및 분석의 역학 범위를 증가시킨다. 일 구현으로, 1차 분라 차원을 위해 음이온 및 양이온 교환 파티클의 혼합 베드를 사용하는 온라인 다차원 LC 방법이 제공된다.
일 구현으로, Motoyama(Motoyama et al. 2007)에 따른 혼합 이온 교환 베드가 사용된다.
LCMS 장치의 일 구현으로, 시료는 온라인 형태로 분획화된다. 바람직하게, 2차원 크로마토그래피가 LCMS 장치에 구성 및 배열된다. 바람직하게, 적어도 하나의 분리 메카니즘은 시료 성분의 소수성 특성을 이용한다. 다른 구현으로, 적어도 하나의 분리 메카니즘은 SCX이며, 이는 바람직하게 HLA-DR 용출 시료의 분획화를 위해 사용된다.
일 구현으로, 직교 분획화가 사용된다. 바람직한 구현으로 SCX 분획화가 사용된다. 조합된 셋업에서 총 분석 시간은 쉽게 전형적으로 15분 증가될 수 있다. SCX 차원은 온라인 및 오프라인 방식 모두에 사용될 수 있다.
SCX 수지는 파티클 표면에 강하게 음으로 하전된 기를 갖는 파티클을 포함하며, 이는 양으로 하전된 분자를 바인딩하게 한다. SCX 수지는 양으로 하전된 펩타이드를 고정(보유/바인딩)할 수 있다.
일반적으로, 바인딩된 분자는 강도가 증가하는 적절한 수성 양이온염 용액 구배(연속적/불연속적)를 이용하여 수지를 플러싱함으로써 제거/용출하여 방출/회수된다. 구배에 기인하여, 느슨하게 바인딩된 분자는 보다 강하게 바인딩된 분자보다 더 신속히 이동한다. 이는 복합 시료의 원하는 분리를 생성케 한다.
2차원은 역상 크로마토그래피일 수 있다. 일 구현으로, 제 2 분리 단계는 바람직하게 C18 RP 크로마토그래피를 포함한다. 일 구현으로, LCMS 장치의 C18 역상 은 혼합 음이온 및 양이온 교환 고상 추출 트래핑 컬럼을 포함한다.
SCX와 RP 분리간의 직교성은 SCX가 펩타이드를 보유하기 위해 정전기 상호작용을 이용하는 사실에 기인한다. 실제로, SCX 펩타이드 분리시 보유작용은 정전기(주)와 소수성(부) 상호작용의 조합이며, 후자는 설포닐 폴리머 백본의 소수성 특성을 형성한다. 이러한 "혼합-모드" 특성은 SCX가 동일한 순전하를 소유하는 구조적으로 유사한 펩타이드들을 어떻게 분리해 내는지 그 이유 중 하나로서 인식된다.
이온 교환(IEX)과 RP 분리 사이에 직교성은 정전기 상호작용과 소수성에 기초한다. 실제로, IEX 펩타이 분리시 보유작용은 정전기(주)와 소수성(부) 상호작용의 조합이며, 후자는 실리카 파티클 표면에서 실라놀기와의 소수성 상호작용 특성을 형성한다. 이러한 "혼합-모드" 특성은 IEX가 동일한 순전하를 소유하는 구조적으로 유사한 펩타이드들을 어떻게 분리해 내는지 그 이유 중 하나로서 인식된다.
바람직하게, LCMS 방법은 약 음이온 교환(Poly WAX LPTM, The Nest Group, Inc. 45 Valley Road Southborough, MA 01772-1323, 소위 WAX라고 칭함)을 이용한 분획화 방법을 포함한다. WAX 파티클은 바람직한 구현으로 파지티브 양이온 파티클을 포함하는 가교 코팅층을 포함한다. 보다 바람직하게, WAX 파티클은 선형 폴리에틸렌이민과 가교된 실리카계 물질을 포함한다.
LCMS 장치는 바람직하게 바인딩된 펩타이드의 회수를 가능케 하는 1차원으로서 ACE 고상 추출 컬럼을 포함한다.
일 구현으로, SCX에서 펩타이드 용출은 암모늄 아세테이트와 같은 휘발성 유기염을 이용하여 수행될 수 있다. 아세트산에 용해된 암모늄 아세테이트가 ACE 컬럼으로부터 펩타이드를 분리하기에 적절한 용매 매체로서 제안된다.
도 8은 MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II 분자에 의해 표출되는 T 세포 에피토프의 할당에 대한 질량 스펙트럼 인식 패턴을 도식적으로 나타낸 것이다. 상위 패널: MHC 클래스 I-관련 펩타이드는 고유 및 동위원소-표지된 (감염도중 배지에 등가물로 존재하는) 아미노산 잔기의 편입에 기인한 이들의 이항식 질량 스펙트럼 동위원소 분포에 의해 특성화된다. 셀프-펩타이드의 상향조절 정도는 고유 에피토프(m) 및 단일 표지된 에피토프(m+Δ)의 모노아이소토픽 질량의 강도비에 기초하여 계산될 수 있다. 데 노보(de novo) 합성 단백질 및 병원체 기원 단백질에 대해, 이론적 동위원소 패턴은 정밀한 이항식 분포를 나타낼 것이다. 최대 2 표지 아미노산 잔기를 함유하는 에피토프에 대한 이론적 동위원소 분포 패턴은 상위 트레이스(upper trace)로 주어진다: 감염 후 셀프-펩타이드 및 데 노보 상향조절된 셀프- 또는 바이러스 펩타이드의 비변환 발현 및 5-, 20-, 및 100-배 상향조절된 발현. 하위 패널: 병원체로부터 기원한 MHC 클래스 II-관련 펩타이드는 실험 방법 II에 기재된 바와 같이 이들의 특징적인 질량 스펙트럼 더블릿에 기초하여 셀프-펩타이드로부터 분명하게 구별될 수 있다.
도 9는 실험 방법 I에 기재된 바와 같이 표준 LCMS 기술을 이용한 후(상부 트레이스) 및 플랫폼 LCMS 기술을 이용한 후(하부 트레이스)에 획득된 MV-감염 WH 세포로부터 유래된 비분획화된 HLA-A2 리간돔으로부터 얻어진 LCMS 베이스 피크 이온 트레이스를 나타낸다.
도 10은 복합 시료 분석시 고 품질 나노스케일 LC 기술의 유용성을 나타낸 것이다. 유기 변성제 아세토니트릴의 2%/min(상부 트레이스), 시간당 6.7% 아세토니트릴(중간 트레이스) 및 시간당 4% 아세토니트릴(바닥 트레이스)의 증가범위로 차등 구배 프로필을 이용하여 90cm 길이의 C18 컬럼(50μm ID, df=5μm)상에서 트립신 처리 펩타이드를 분리하였다. FWHM(peak-width-at-half-maximum)은 3초에서 약 30초로 증가한다. 피크 캐버티는 급격한 구배(상부 트레이스)에서 약 300에서 얕은 구배(바닥 트레이스)에서 약 900으로 증가한다. MS 공급원에서 듀티 사이클(런닝 시간의 퍼센트로서 용출 윈도우) 증가 및 화합물의 존재 연장은 저 농도 펩타이드(즉, 펩타이드 최소화)의 포괄적인 데이타 의존적 다단계 LCMS 분석을 가능케 한다.
도 11과 관련하여, 인간 MDDC의 복합 MHC 클래스 II 리간돔이 동일한 구배 슬로프를 이용하여 3μm 및 5μm C18 파티클로 패킹된 25μm ID 컬럼(트레이스 A, 베이스 피크 이온 트레이스) 및 50μm ID 컬럼(트레이스 B, 베이스 피크 이온 트레이스)상에서 각각 분석되었다. 고상 파라미터는 MHC 클래스 II 리간돔 분석시 LCMS 성능을 결정한다. 25μm ID 컬럼은 감도 및 피크 해상도 면에서 LCMS 성능을 현저히 향상시킨 것으로 나타난다. 트레이스 C 및 D는 이러한 시료에서 두 동중 펩타이드(즉, 동일하지 않은 펩타이드 서열이나, [M+2H]2+=615.4Da의 동일한 질량을 가짐)에 있어서 각각 25μm ID 및 50μm ID 컬럼상에서의 LC 성능 차이를 나타낸다.
도 12와 관련하여, 인간 MDDC로부터 분리된 HLA-A2 리간돔을 인플루엔자 바이러스로 감염하고, 실험 방법 I(어프로치 C)에 기재된 바와 같은 안정한 동위원소-표지 아미노산을 사용하여 LCMS 분석에 적용하였다. 상위 트레이스는 동위원소 패턴의 거의 이항식적 분포에 의해 가시화된 2중 하전된 상향조절 에피토프를 나타낸다. 3 개의 표지된 잔기들이 상기 에피토프에 편입된다. m/z 573.3Da에서 획득된 이러한 펩타이드의 MS/MS 스펙트럼(하위 트레이스)은 (y-타입 이온 시리즈 및 정밀한 질량 측정에 기초한) 펩타이드 서열을 VVSEVDIAKAD로서 나타낸다. 이러한 특정 실험은 감염 도중에 배지에 표지 잔기로서 루신(L), 발린(V) 및 메티오닌(M)을 이용하여 수행되었다. 이러한 펩타이드에서 3 개의 표지된 잔기는 모두 발린(valine)이었다. 이러한 에피토프의 상향조절 정도는 m/z 573.306 Da에서 고유 에피토프의 모노아이소토픽 질량 m 및 576.313 Da에서 단일 표지된 아이소머의 모노아이소토픽 질량[m+3]의 질량 스펙트럼 강도비에 기초하여 계산될 수 있다(참조 실험 방법 I). 이러한 특정 에피토프에 있어서, 인플루엔자 바이러스 감염에 기인한 상향조절 정도는 16에 해당한다.
도 13과 관련하여, 인간 MDDC로부터 분리된 HLA-DR2 리간돔을 실험 방법 II(어프로치 D)에 기재된 바와 같이 14N- 및 15N-표지 B. pertussis 전세포 집단으로 펄싱한 후 LCMS 분석에 적용하였다. 상부 패널은 m/z 788.94 및 797.42 Da에서 이중 하전 질량 스펙트럼 더블릿을 함유하는 ESI 질량 스펙트럼을 나타낸다. 삽도는 17 질소원자를 함유하는 후보 B. pertussis 펩타이드를 나타내는 디컨볼루티드(deconvoluted) 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다. MS 스펙트럼은 안정한 동위원소 방법을 이용한 박테리아 기원 에피토프의 양성 할당에 대한 일반적 기준에 부합한다(본문 참조). 하위 패널은 m/z 788.94 Da에서 이러한 펩타이드의 디컨볼루티드 MS/MS 스펙트럼을 나타내며, 이는 추정 주변세포질 단백질(accession nr. CAE43606) 기원 펩타이드의 서열(b-타입 이온 시리즈) AAFIALYPNSQLAPT을 나타내는 것이다.
도 14와 관련하여, 다양한 인간 MDDC의 이종 혼합물로부터 분리된 HLA-DR 리간돔을 실험 방법 II(어프로치 E)에 기재된 바와 같이 14N- 및 15N-표지 B. pertussis rP.69 Prn1으로 펄싱한 후에 LCMS 분석에 적용하였다. 상부 패널은 m/z 770.43 Da 및 780.39 Da에서 이중 하전된 질량 스펙트럼 더블릿을 함유하는 ESI 질량 스펙트럼을 나타낸다. 삽도는 20질소원자를 함유하는 후보 rP.69 Prn1 기원 펩타이드를 나타내는 디컨볼루티드 질량 스펙트럼을 나타낸다. MS 스펙트럼은 질량 태그-어시스티드 어프로치를 이용한 rP.69 Prn1의 양성 할당에 대한 일반적 기준에 부합한다(본문 참조). 하위 패널은 m/z 770.43 Da에서 이러한 펩타이드의 디컨볼루티드 MS/MS 스펙트럼을 나타내며, 이는 rP.69 Prn1 기원 펩타이드의 서열 LRDTNVTAVPASGAPA를 나타내는 것이다.
도 15와 관련하여, 인간 MDDC로부터 분리된 HLA-DR1/P1.7-2,4 및 HLA-DR2/P1.5-2,10 리간돔을 실험 방법 II(어프로치 F)에 기재된 바와 같이 다른 14N- 및 15N-표지 N. meningitidis OMV 제조물로 펄싱한 후 LCMS에 의해 분석하였다. 트레이스 A에서 HLA-DR1/P1.7-2,4 시료 및 트레이스 B에서 HLA-DR2/P1.5-2,10 시료에 대해 두 리간돔에서 탐색 알고리즘에 의해 스펙트럼 더블릿이 검출되었다. MS 시퀀싱을 수행하여 P1.7-2,4 유래 에피토프 SPDFSGFSGVQFVPIQNSK(트레이스 B) 및 P1.5-2,10 호몰로그 SPEFSGFSGSVQFVPAQNSK(트레이스 D)을 식별해 내었다. 이러한 네피토프의 위치 3 및 16에서의 잔기는 스트레인 특이적이다. LCMS 스펙트럼은 질량 태그-어시스티드 어프로치(실헙 방법 II)를 이용한 박테리아-유래 에피토프에 대한 일반적 기준에 부합한다. 또한, 각 에피토프내에 함유된 질소 원자의 수는 LCMS 스펙트럼으로부터 추론될 수 있다. 트레이스 A에서 이중 하전된 질량 스펙트럼 더블릿(Δ=12 Da)과 트레이스 B에서 삼중 하전된 질량 스펙트럼 더블릿 사이(Δ=8.0 Da)의 질량 차이는 각 에피토프가 24 N-원자를 함유함을 보여준다. 실제로, 식별된 두 에피토프 모두 이러한 데이타와 부합한다.
도 16과 관련하여, 인간 MDDC로부터 분리된 HLA-DR1 리간돔을 실험 방법 II(어프로치 F)에 기재된 바와 같이 14N- 및 15N-표지 N. meningitidis P1.7-2,4 OMV 제조물로 펄싱한 후 LCMS에 의해 분석하였다. 리전 8을 나타내는 길이 변이체 세트 중 하나로서, N. meningitidis P1.7-2,4 기원 에피토프 IGNYTQINAASVGL(트레이스 A 및 C)가 식별되었다. 이러한 고유 에피토프 1% 농도에서, 이러한 이례적인 P1.7-2,4 유래 에피토프를 나타내는 이중 하전된 질량 스펙트럼 더블릿이 검출되었으며, 이는 단지 +1 Da 차이나는 C-말단 아미노산 잔기를 제외하고 고유 에피토프와 정확한 유사성을 나타내었다. IGNYTQINAASVG-[+114 Da](트레이스 B 및 D)(이의 이온쌍으로부터 추론되는 이러한 이례적인 에피토프에 함유된 병원체-유래 질소 원자의 수는 18이었으며, 이에 반해 고유 에피토프에 대해서는 17이었음). 결과적으로, 비고유 에피토프(D)의 전체 y-타입 이온 시리즈는 고유 에피토프(D)에 비해 +1 Da 변하며, 한편 b-타입 이온 시리즈는 변하지 않은 채로 유지된다. 상기 더블릿의 헤비 및 라이트 이온 모두의 집단적 y- 및 b-타입 이온 시리즈는 이러한 비고유 에피토프가 병원체-유래 단백질의 단백질 슬라이싱 이벤트의 결과이며 동일한 P1.7-2,4 분자의 구별된 프레그먼트의 후속적인 분자내 결찰의 결과이며, 스플라이싱된 MHC 클래스 II 리간드를 형성하는 것임을 보여준다.
도 17은 인간 MB71.5 T 세포에 의한 P1.5-2,10 및 P1.7-2,4 '리전 4' 에피토프의 차등 인식을 나타낸다. A: MB71.5 T 세포는 재조합 P1.5-2,10 단백질을 이용하여 도너 MB71로부터 PBMC의 시험관내 재자극(2x) 후 생성되고, 합성 펩타이드 PEFSGFSGSVQFVPAQNS(S011-24) 및 SGSVQFVPAQNSKSAYTP(S011-25)로 펄싱되었지만, PDFSGFSGSVQFVPIQNS(S004.29) 또는 SGSVQFVPIQNSKSAYTP(S004.30)으로는 펄싱되지 않은 자기유래 PBMC의 존재하에 증식되었다. B: MB71.5 T 세포는 각각 '리전 4' 서열의 C-말단에서 알라닌(A)를 발현하는 PorA 변이체들만, 즉, P1.5-2,10, P1.5-1.2-2 및 P1.22,14만 인식하며, 이소루신(I), 즉, P1.7-2,4, P1.7,16 및 P1.19,15를 인식하지 못한다(본문 결과 참조).
실시예
실험 방법 I: MHC 클래스 I 리간돔
홍역 바이러스, 인플루엔자 바이러스 및 호흡기 합포체 바이러스
Edmonston B 스트레인의 플래크-정제된 홍역 바이러스(이하 MV라 칭함)를 Vero 세포에서 증식시켰다. 인플루엔자 바이러스(A/Wisconsin/67/2005 스트레인)를 MDCK1 세포에서 증식시켰다. 플래크-정제된 호흡기 합포체 바이러스(RSV-A2 no. VR-1302, ATTC)를 hep-2 세포에서 증식시켰다.
휴먼 B-세포주 WH 및 MB02 및 휴먼 모노사이트-유래 수상돌기 세포
HLA-A*0201를 발현하는 EBV-형질변형 B 세포주 WH 및 HLA-A*0201,-B*0701을 발현하는 EBV-형질변형 B 세포주 MB-02를 항생제 및 5% FBS(Fetal Bovine Serum, Harlan, USA)이 보충된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다.
휴먼 모노사이트-유래 수상돌기 세포(이하 MDDC라 칭함)를 Sallusto(Sallusto et al. 1994)에 의해 기술된 방법에 따라 배양하였다. 간략히, 1x109 PBMC를 HLA-A*0201, -B*0701 동형 접합성 혈액 도너로부터 고지에 입각한 동의를 받아 얻어진 백혈구분리반출법 버피 코트의 림포프렙(lymphoprep)(Axis-shield, Norway)을 이용하여 밀도 원심분리에 의해 분리하였다. PBMC를 항생제(GibcoBRL, USA) 및 1% FBS가 보충된 Iscove's Modified Dulbecco's Medium(GibcoBRL, USA)이 담긴 150mm 조직배양 디쉬(Corning Costar, USA)dp 5x106/ml로 시딩하고, 37℃, 5% CO2 습식 배양기에서 2시간동안 배양하였다. 비부착 분획을 제거한 후, 부착된 세포를 항생제, 1% FBS, 500U/ml 재조합 휴먼 GM-CSF(PeproTech, USA) 및 250U/ml 재조합 휴먼 IL-4(Strathman Biotech, Deutschland)를 함유하는 배지에서 6일간 더 배양하였다. 배지 및 성장 인자는 3일에 새로 갈아주었다. 6일에, MDDC가 바이러스 감염에 준비되었다. 1% 분액의 MDDC를 바이러스 감염 전 및 후에 플로우 사이토메트리에 의해 특성화하여 순도 및 MDDC의 성숙도를 확인하였다(나타내지 않음).
펩타이드 합성
합성 펩타이드 스탠다드는 SYRO II 동시 다중 펩타이드 합성기(Multisyntech GmbH, witten, Germany)를 이용하여 고상 FMOC 화학에 의해 제조되었다. 합성된 펩타이드의 순도 및 정체는 역상 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 평가되었다.
바이러스 감염 관련-MHC 클래스 I 리간돔을 발현하는 인간 세포 뱃치를 형성하는 실험 어프로치 A, A', B, C 및 C'
어프로치 A에서, 107 조직 배양 감염 치사량50/ml MV 스톡을 항생제 및 1% FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지에 2시간동안 0.5의 m.o.i.(multiplicity of infection)로 2x109 WH 세포의 B-세포 뱃치를 감염시키는데 사용하였다. 그 후, 세포를 세정하고, 40시간동안 성장하도록 하여 MV-관련 MHC 클래스 I 리간돔의 발현이 이루어지도록 하였다. 다른 세포 뱃치의 2x109 미처리 WH 세포를 제조하였으며, 표준 배지에서 배양 후 컨트롤 MHC 클래스 I 리간돔이 발현되도록 하였다. 두 세포 뱃치를 수거하고, 세정하고, 카운팅하고, 펠렛화하고, 스냅-동결하고 -70℃에 보관하였으며, 그 후 MHC 클래스 I 리간돔을 제조하고 개별적으로 분석하였다.
마찬가지로, 어프로치 A'에서, 107 조직 배양 감염 치사량50/ml 인플루엔자 바이러스 스톡을 항생제 및 1% FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지에 1시간동안 5의 m.o.i.(multiplicity of infection)로 3.5x108 MB-02 세포의 B-세포 뱃치를 감염시키는데 사용하였다. 그 후, 세포를 세정하고, 9시간동안 성장하도록 하여 인플루엔자-관련 MHC 클래스 I 리간돔의 발현이 이루어지도록 하였다. 세포 뱃치를 수거하고, 세정하고, 카운팅하고, 펠렛화하고, 스냅-동결하고 -70℃에 보관하였으며, 그 후 MHC 클래스 I 리간돔을 제조하고 개별적으로 분석하였다.
어프로치 B에서, 107 조직 배양 감염 치사량50/ml MV를 항생제 및 1% FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지에 2시간동안 0.5의 m.o.i.로 1.5x109 WH 세포의 B-세포 뱃치를 감염시키는데 사용하였다. 이들 세포를 후속적으로 40시간동안 배양하여 L-루신 및 L-메티오닌(Invitrogen)이 없는 5% FBS가 보충된 RPMI-1640 배지에서, 그리고 50%는 안정한 동위원소 아미노산 13C6-L-루신 및 13C5, 15N1-L-메티오닌(각각 이들의 비표지 라이트 동위원소에 비해 6Da의 질량 증가를 가짐; Cambridge Isotope Laboratories)과 함께 L-루신 및 L-메티오닌의 표준 농도를 함유하며, 나머지 50%는 비표지 아미노산 L-루신 및 L-메티오닌(Sigma-Aldrich)을 함유하는 5% FBS가 보충된 RPMI-1640 배지에서 바이러스 감염-관련 MHC 클래스 I 리간돔 발현이 이루어지도록 하였다. 이러한 아미노산은 HLA-A2 리간드의 우세한 앵커 잔기이다. 5% FBS 및 100%의 비표지 아미노산을 함유하는 RPMI-1640 배지는 또 다른 뱃치의 1.5x109 비감염 WH 세포를 제조하는데 사용되었다. 모든 세포 뱃치들을 수거하고, 세정하고, 카운팅하고, 1:1 세포비로 혼합한 다음, 하나의 세포 뱃치로 펠렛화하고, 스냅-동결하고 -70℃에 보관하였으며, 그 후 MHC 클래스 I 리간돔을 제조하고 분석하였다.
어프로치 C에서, 7x107 플래크-형성-유니트/ml 인플루엔자 바이러스가 2.2x107 HLA-A*0201 동형 접합성 MDDC의 세포 뱃치를 2 m.o.i.로 4시간동안 감염시키는데 사용되었다. 이들 세포를 후속적으로 40시간동안 배양하여 L-루신, L-메티오닌 및 L-발린(Invitrogen)이 없는 5% FBS가 보충된 RPMI-1640 배지에서, 그리고 50%는 안정한 동위원소 아미노산 13C6-L-루신 및 13C5, 15N1-L-메티오닌(각각 이들의 비표지 라이트 동위원소에 비해 6Da의 질량 증가를 가짐; Cambridge Isotope Laboratories)과 함께 L-루신, L-메티오닌 및 L-발린의 표준 농도를 함유하며, 나머지 50%는 비표지 아미노산 L-루신, L-메티오닌 및 L-발린(Sigma-Aldrich)을 함유하는 5% FBS가 보충된 RPMI-1640 배지에서 바이러스 감염-관련 MHC 클래스 I 리간돔 발현이 이루어지도록 하였다. 표준 배지에서 배양한 후 컨트롤 MHC 클래스 I 리간돔을 발현하는 2.2x107 HLA-A*0201 동형 접합성 MDDC의 또 다른 세포 뱃치를 제조하였다. 모든 세포 뱃치들을 수거하고, 세정하고, 카운팅하고, 1:1 세포비로 혼합한 다음, 하나의 세포 뱃치로 펠렛화하고, 스냅-동결하고 -70℃에 보관하였으며, 그 후 MHC 클래스 I 리간돔을 제조하고 분석하였다.
마찬가지로 어프로치 C'에서, 플래크-정제된 호흡기 합포체 바이러스가 2.2x107 HLA-A*0201, -B*0701 동형 접합성 MDDC의 세포 뱃치를 5 m.o.i.로 3시간동안 감염시키는데 사용되었다. 이들 세포들을 후속적으로 48시간동안 배양하여 바이러스 감염-관련 MHC 클래스 I 리간돔 발현이 완전 RPMI-1640 배지에서 이루어지도록 하였다. 세포 뱃치를 수거하고, 세정하고, 카운팅하고, 펠렛화하고, 스냅-동결하고 -70℃에 보관하였으며, 그 후 MHC 클래스 I 리간돔을 제조하고 분석하였다.
MHC 클래스 I 리간돔의 분리
MHC 클래스 I 분자의 가용화 및 바이러스 감염-관련 MHC 클래스 I 리간돔의 후속적인 분리를 위해 실험 어프로치 A, A', B, C 또는 C'에 따라 배양된 세포 뱃치들을 해동하고 용해하였다. 간략히, 세포들을 1% CHAPS(Roche) 및 프로테아제 인히비터(pH=8.0)를 함유하는 TRIS-HCl 버퍼에 용해하였다. 원심분리후, 상층물을 3개의 CNBr-활성화 TRIS-블로킹된 세파로즈 컬럼에 걸쳐 연속적으로 통과시켰다: 첫번째 비-면역글로블린-결합된 것(즉, 프리클리어 1), 두번째 노말 마우스 면역글로블린이 결합된 것(즉, 프리클리어 2), 그리고 세번째 휴먼 MHC 클래스 I 분자에 특이적인 특정 마우스 항체와 결합된 것(즉, 클리어). 일 예로, HLA-A2 분자와 반응적인 마우스 항체(클론 BB7.2)가 사용되었으며, 다른 예로 HLA-B 분자와 반응적인 마우스 항체((클론 B1.23.2)가 사용되었다. 클리어 컬럼상에 보유된 MHC 클래스 I 분자 및 관련 펩타이드는 10%(v/v) 아세트산으로 용출되고 10-kDa 분자량 컷-오프 막 필터를 통해 통과되었다. 여과물을 진공 원심분리를 이용하여 ±10μl로 농축되고, 후속적으로 5% 포름산 및 5% 디메틸설폭시드로 100μl의 최종 부피로 재구성되고, 분석시까지 -70℃에 보관되었다. 시료의 후속공정 도중에 일어나는 시료 손실을 바로잡기 위해 펩타이드 혼합물을 두 합성 펩타이드 스탠다드(Angiotensin-III 및 Oxytocin, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)의 공지량을 이용하여 스파이킹하였다.
스탠다드 LCMS 기술
펩타이드 시료는 전기 스프레이 이온화-질량 분광계에 결합된 나노플로우 액체 크로마토그래피(이하 LCMS라 칭함)에 의해 분석되었다. ±109 B-세포 또는 1-2x107 MDDC를 나타내는 펩타이드 시료의 분액들을, 5-μm C18 파티클로 패킹된 50μm 내부 직경(이하 ID라 칭함)을 갖는 20cm 길이 분석 컬럼에 스탠다드 MicroTee 배관 요소를 통해 연속적으로 연결된 스탠다드 나노플로우 LC 컬럼 스위칭 시스템 C18 프리컬럼상에 로딩하였다. 사용된 이동상은 아세토니트릴 125nl/min의 흐름속도에서 55분내에 100% A(물 + 0.1-M 아세트산) 내지 A에 용해된 60%의 아세토니트릴 + 0.1-M 아세트산의 선형 구배이었다. 컬럼 팁은 금-코팅되었으며, 컬럼 헤드 압력은 150bar이었다. 질량 스펙트럼은 적어도 10,000FWHM(Full Width at Half Maximum)의 분해도에서 300-1,500 Da(MS 분석)의 범위에 걸쳐 질량 스펙트로미터(Q-TOF, Waters Corp.)상에서 매 1초마다 '질량 대 전하 비'로 기록되었다.
주로 에피토프 시료의 후속적인 분액을 사용하여 후보 바이러스 감염-관련 MHC 클래스 I 에피토프의 MS 시퀀싱(MS/MS 분석)을 위해, MS1 분석 사이클은 미리선택된 질량상에서 또는 질량 스펙트로미터내로 용출되는 시점에 가장 풍부하게 되는 질량상에서 충돌 유도된 프레그먼트화의 사이클로 변환되었다. MS/MS 스펙트럼은 50-2,000 Da의 질량 범위 및 5,000FWHM의 질량 분해도에서 1sec/scan의 스캔 속도로 습득되었다. 최적 충돌 에너지는 에피토프의 특성 및 사용된 스펙트로미터의 타입에 따라 크게 달라졌으며, 이러한 실험에서 최적화되었다. MS/MS 스펙트럼의 해석은 수동적으로 또는 Mascot(Perkins et al., 1999 at www.matrixscience.com, Matrix Science Ltd., London UK), ProteinProspector(www.prospector.ucsf.edu, University of California, San Francisco, CA, USA), BioWorksTM(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) 및/또는 ProtenLynxTM(Waters Corp., Milford, MA, USA)와 같은 소프트웨어 도구를 이용하여 이루어진다.
식별된 에피토프의 준정량화(semiquantification)를 위해, 관련 반응 인자들을 식별된 에피토프의 합성 유사체의 강도량을 표준 펩타이드 Angitensin-III 및 Oxytocin의 강도량의 평균으로 나누어 계산하였다. 이러한 인자들은 후속적으로 세포 뱃치에 존재하는 천연 에피토프의 수를 준정량화하는데 사용되었다.
후보 MV-관련 MHC 클래스 I 리간드의 식별
어프로치 A에서, MV-감염 및 비감염 WH 세포로부터 유래된 MHC 클래스 I 리간돔에서 MS 이온 트레이스는 각 무리마다 비교되었다. 이러한 방법에 대한 스탠다드로서, 두 모든 시료에 존재하는 풍부한 펩타이드 이온이 μLC 체류시간에 일어나는 작은 변환을 평가하는데 사용되었다. 감염된 WH 세포에서만 일어나는 펩타이드 무리들을 시퀀싱하고 준정량화하였다.
어프로치 B 및 C에서, 본질적인 질량 스펙트럼 정보("질량 값" 및 "강도 값"으로 정의됨)는 MHC 클래스 I 리간돔으로부터 획득된 MS 스펙트럼으로부터 추출되었으며, 알고리즘 조사에 사용되었다. 우선, 시뮬레이티드 동위원소 패턴을 (i) 사용된 안정한 동위원소 표지의 타입 및 수, (ii) 이러한 안정한 동위원소의 자연 빈도, (iii) 에피토프에 편입된 표지 아미노산의 추정 최대수, (iv) 실험 디자인 및 (v) 포함된 이온들의 전하 상태에 기초하여 계산하였다. 각 개별적으로 시뮬레이션된 동위원소 패턴은 MS 스펙트럼의 질량축을 따라 수학적으로 이동하였다.
도 8, 상위 패널은 어프로치 B에서 기재된 방법으로 두 안정한 동위원소를 사용한 후 바이러스 감염 세포 뱃치로부터 추출된 바이러스 및 셀프-MHC 클래스 I 리간드의 시뮬레이션된 동위원소 패턴을 나타낸 것이다. 예를 들어, 메티오닌 및/또는 루신과 같이 두 위치에서 발현하는 바이러스 에피토프는 질량 m(50), m+Δ(100) 및 m+2Δ(50)의 상대적 비율에 의해 인식될 수 있으며, 여기서 Δ는 단일 하전된 이온에 대해 6Da이며, 어프로치 B에서 표지 및 세포 혼합 방법에 대해 내재하는 3가지 동위원소 변이체에 대해 전형적인 것이다(도 8, 상위 패널, 우측 패턴). 또한, 바이러스 감염 도중에 비변환되거나 상향조절된 셀프-에피토프는 이들의 동위원소 패턴에 의해 인식될 수 있다(도 8, 상위 패널, 좌측 4 패턴). 또한, 상향조절 정도는 단일 표지 동위원소(I[m+Δ]) 및 고유 에피토프의 모노아이소토픽 질량의 강도비에 기초하여 계산될 수 있으며, 하기 식으로 주어진다.
상향조절의 정도 = 2x·{강도비/(x-강도비)}
여기서, x는 에피토프내에 함유된 표지 아미노산의 최대 수를 나타낸다. 적어도 팩터 2의 상향조절이 감염과 관련하여 유의한 것으로 간주되었다. 따라서, 동위원소 패턴은 어프로치 C에서와 같이 3 표지 아미노산의 사용에 대해 시뮬레이션되었다. 정합 동위원소 클러스터는 추가적인 LCMS/MS 분석을 위해 후보 바이러스 감염 관련 MHC 클래스 I 리간드로서 선택되었다.
플랫폼 LCMS 기술
바이러스 감염 관련 MHC 클래스 I 리간돔의 '펩타이드 발굴'을 위해, 예를 들어, 107-108 cells의 뱃치에서 세포당 단일 카피로 존재하는 MHC 클래스 I 에피토프의 검출이 가능하도록 하나 이상의 등급으로 향상된 감도를 갖는 플랫폼 LCMS 기술을 얻기 위해 LCMS 시스템의 여러 독립적인 파라미터들을 변형하였다.
플랫폼 LCMS 기술은 변형 MicroTee 배관요소를 통해 3μm C18 파티클로 밀집하게 패킹된 25μm ID의 ≥90cm 길이 분석 컬럼에 연속적으로 연결된 스탠다드 나노플로우 LC 컬럼 스위칭 시스템 C18 프리컬럼으로 구성되었다. 사용된 이동상은 아세토니트릴 30nl/min의 흐름속도에서 240분내에 A(물 + 0.1-M 아세트산)에 용해된 8% 아세토니트릴 + 0.1M 아세트산 내지 A에 용해된 28%의 아세토니트릴의 얕은 선형 구배이었다. 컬럼 팁은 탄소-코팅되었으며, 컬럼 헤드 압력은 ≥400bar이었다. MS 스펙트럼, 후속적인 MS/MS 분석 및 에피토프의 준정량화의 해석을 상기 스탠다스 LCMS 기술에 대해 기재된 바와 같이 수행되었다.
플랫폼 LCMS 기술의 우수성은 어프로치 A에 기재된 MV-감염 WH B-세포 뱃치, 어프로치 A'에 기재된 인플루엔자-감염 MB-02 세포 B-뱃치, 및 어프로치 C'(본 명세서에 이후에 나타낸 바와 같은)에 기재된 RSV-감염 MDDC 세포 뱃치로부터 유래된 펩타이드 시료를 이용하여 분석되었다.
결과 I: MHC 클래스 I 리간돔
스탠다드 LCMS 기술은 제한적인 수의 HLA-A2 바인딩된 MV 에피토프의 식별을 이끈다.
MHC 클래스 I 리간드는 스탠다드 LCMS 기술에 의해 MV 관련 MHC 클래스 I 에피토프를 식별하기 위해 MV 감염 후 휴먼 WH 세포로부터 기재된 바와 같이 획득되었다. 두 HLA-A2 리간돔 시료를 조사하였다. 하나는 어프로치 A에 따라 획득된 것이며(서브트랙티브 분석), 다른 하나는 어프로치 B에 따른 HLA-A2 리간돔 시료(동위원소 표지)이다. 각 어프로치에서, 3 후보 바이러스-관련 MHC 클래스 I 에피토프가 MS/MS 시퀀싱 후 MV 에피토프로서 확인된 것으로 검출될 수 있었다(표 1). 공개된 바와 같이, 스탠다드 LCMS 기술은 수퍼도미넌트 MV-C84-92 에피토프를 함유하는 총 4가지 다른 에피토프의 식별을 가능케 하였으며, 이는 세포당 >100,000에서 발현되는 것으로 발견되었다.
비교예: 플랫폼 LCMS 기술은 10-15배 이상의 MV 에피토프의 식별을 이끈다.
스탠다드 LCMS 기술이 복합 MHC 클래스 I 리간돔 시료에서 수천개의 화학적으로 유사한 셀프 에피토프 중에서 서브펨토몰 범위로 여러, 가능한 대부분의 풍부한 바이러스 에피토프의 식별 및 특성화를 뒷받침할 수 있었지만, 이러한 당 기술분야의 상황에서 중요한 부가적인 서브도미넌트 바이러스 에피토프에 대한 지식 격차가 계속 유지되고 있었음은 분명하였다.
본 발명자들은 이러한 기술의 LC 부분에 있어 엄격한 변형이 서브도미넌트 MHC 클래스 I 리간드의 검출 및 식별을 가능케 하는 플랫폼 LCMS 기술을 생성할 수 있을지 조사하였다. 도 9는 스탠다드 LCMS 기술(상위 패널) 또는 방법(Methods)에서 기재된 바와 같은 여러 조합된 독립적 변형을 함유하는 플랫폼 LCMS 기술(하위 패널)을 이용한 경우 (어프로치 A에서 제조된)하나의 단일 MV 감염-관련 MHC 클래스 I 시료의 분획상에서 전형적인 LCMS 피크 수행을 나타낸 것이다. 보다 낮은 LCMS 런의 온라인 데이타 의존적 LCMS/MS 시퀀싱(플랫폼 기술)은 31개의 다른 에피토프를 나타내는 39 MV-유래 HLA-A2 리간드의 식별을 이끌었다(표 2). 이러한 자연적으로 표출되는 에피토프 중 26개 에피토프는 새로운 MV 에피토프이었으며, 3개는 스탠다드 LCMS 기술을 이용하여 이미 식별된 것이었으며(표 1), 그리고 2개는 새로이 정량화된 천연 HLA-A2 리간드이지만 마우스 및 휴먼 MV CD8+ T 세포 에피토프로서 문헌적으로 기재된 것이었다(Neumeister et al. 1998, Nanan et al. 1995). 따라서, 적어도 팩터 10이상의 에피토프가 스탠다드 LCMS 방법의 플랫폼 변형에 의해 확인되었다.
플랫폼 LCMS 기술에 의한 다른 바이러스로부터 MHC 클래스 I 리간돔의 에피토프를 발굴하는 부가적인 실시예
이의 우수헝을 보다 분석하기 위해, 플랫폼 LCMS 기술은 어프로치 A' 및 C'에 기재된 바와 같은 다른 바이러스 감염 세포 뱃치로부터 제조된 MHC 클래스 I 리간돔을 분석하는데 사용되었다. 6개의 바이러스 MHC 클래스 I 에피토프가 식별되었으며, 이들은 스탠다드 LCMS 기술에 의해서는 검출될 수 없었던 것이다: 4 에피토프는 인플루엔자 바이러스 감염에 관련된 것이며, 2 에피토프는 RSV 감염에 관련된 것이었다(표 2).
플랫폼 LCMS 기술에 의한 MHC 클래스 I 리간돔의 에피토프 발굴은 LC 방법의 여러 독립적 향상에 기인한다.
피크 수행 및 펩타이드 발굴에 대한 본 방법에서 단일 변형의 기여를 알아보기 위해, 긴 컬럼과 함께 구배 기울기의 역할 및 컬럼 ID와 함께 C18 파티클 크기의 영향을 별도의 서포티브 실험으로 조사하였다. 복합 트립신 처리 단백질 분해를 이용하여 도 10에 나타낸 바와 같이, 90cm 길이 컬럼을 이용한 보다 완만하고 연장된 구배 슬로프의 적용은 피크 성능을 증가시켰으며, 크로마토그램에서 펩타이드의 피크 폭을 확장시켰다. 이는 MS 공급원내에 화합물의 연장된 존재를 가능케 하며, 저 존재비 펩타이드의 포괄적인 데이타 의존적 다단계 MS/MS 분석을 촉진하였다(펩타이드 발굴). 예상대로, 50μm ID 컬럼에 패킹된 3μm C18 파티클을 이용한 경우에 비해 보다 작은 ID(25μm)의 컬럼에 패킹된 3μm C18 파티클을 이용한 경우 4배 이상의 LCMS 시스템의 감도가 획득되었다(도 11, 상위 패널). 예기치 않게, 분리 효율 또한 보다 작은 ID 컬럼에 의해 향상되었다(도 11, 하위 패널).
플랫폼 LCMS 분석은 MV 에피토프의 특정 특징의 식별을 가능케 한다.
서열 정보 및 다양성 이외에 MHC 클래스 I 리간드의 중요한 특징은 길이 변화, 존재비 및 에피토프의 가능한 PTM이다. 표 2는 5개의 다른 길이의 펩타이드가 MV-유래 HLA-A2 리간드로부터 발견되었음을 나타낸다: 8-mers(n=2), 9-mers(n=21), 10-mers(n=9), 11-mers(n=5) 및 12-mers(n=2). 따라서, 9-mers는 가장 흔한 것이었으며, 준정량화에 따라 각각 MV-유래 HLA-A2 리간돔의 26% 및 18%를 나타내는 두개의 가장 풍부한 펩타이드 종이 9-mers이었다. 앞선 연구에서 수프라도미넌트 에피토프로 알려진 KLWESPQEI 에피토프(표 1)는 이러한 분석에서 불충분하게 표시되었다. 이는 이러한 특정 에피토프만을 함유하는 소 HPLC 분획이 다른 연구 목적을 위해 시료에서 선택적으로 공제되었기 때문인 것으로 예상되었다. 7 에피토프로부터, 동일한 에피토프를 공유하는 2 또는 3 길이 변이체가 식별되었다(표 2).
또한, 대 구조 단백질의 에피토프 RAN*VSLEEL, 융합 글리코단백질 F0 전구체의 KLMPN*ITLL, 및 혈구응집 글리코단배질의 LSVDLSpPTV(표 2)는 번역된 게놈에서 추론될 수 없는 번역후 변형된 에피토프이었다. 이러한 변형은 바이러스 MHC 클래스 I 에피토프에 대해 문헌적으로 기재된 바 없었다.
바이러스 감염-관련 상향조절된 MHC 클래스 I 셀프 에피토프의 식별
도 8에 나타낸 바와 같이, 바이러스-특이 에피토프 뿐만 아니라, 데 노보-유도 또는 상향조절된 셀프-에피토프가 동위원소 표지의 사용과 MHC 클래스 I 분리 및 LCMS 기술을 조합함으로써 검출될 수 있다. 인플루엔자 바이러스 감염-관련 HLA-A2 리간돔은 아프로치 C에 기재된 바와 같이 휴먼 MDDC로부터 분리되었으며, 스탠다드 LCMS 기술에 적용되었다. 3개의 표지 아미노산을 적용한 상향조절 펩타이드의 시뮬레이션 동위원소 패턴에 부합하는 동위원소 클러스터를 조사하였다. 도 12는 3 동위원소-표지 아미노산이 순응된 동위원소 클러스터의 예를 나타낸다. 상기 에피토프는 휴먼 인터페론-유도 GTP-바인딩 단백질 Mx1(accession nr P20591)으로부터 유래된 VVSEVDIAKAD로 식별되었다. 6개의 다른 상향조절된 셀프-에피토프는 인플루엔자 감염 후 식별되었다(표 3). 다른 셀프-에피토프는 바이러스 감염 후 상향조절된 자연적으로 표출되는 MHC 클래스 I 리간드로서 보고되지 않았지만, 본 발명에서 식별된 에피토프는 신규하고, 인플루엔자 바이러스 감염에 특이적으로 관련될 수 있다.
실험 방법 II: MHC 클래스 II 리간돔
보르데텔라 퍼투시스(
Bordetella pertussis
)의 배양 및 전 세포 제조물의 생성
보르데텔라 퍼투시스(Bordetella parapertussis) 스트레인 509를 모두 여과된 0.15% 락틱산(Fluka, Switzerland) 및 18.6mM NaOH를 함유하는 고유의 14N-함유 미니멀 Bioexpress 세포 성장 배지, 또는 98% 풍부 15N-안정 동위원소-표지 미미멀 Bioexpress 세포 성장 배지(Cambridge Isotope Laboratories, USA)에서 정지기까지 성장시켰다. 성장 후, 두 14N- 및 15N-표지 박테리아 클러스터를 56℃에서 30분간 배양함으로써 열 불활성화하고, 2,000g로 20분간 원심분리하고 1/5부피의 PBS에 펠렛을 녹여 PBS에 5배 농축하였다. 14N- 및 15N-표지 전 세포 제조물의 흡광도를 590nm에서 측정하고, 항원 표출 세포의 항원 펄스를 위해 이러한 제조물의 1:1 혼합물을 이러한 OD590 값에 기초하여 제조하였다.
보르데텔라 퍼투시스(
Bordetella parapertussis
)로부터 재조합 P.69 퍼탁틴의 제조
B. pertussis P.69 Pertactin 와일드 타입 변이체 P.69 Prn1(accession nr AJ011091)(Hijnen et al. 2005)의 세포외 도메인을 암호하는 플라스미드 pPRN1을 함유하는 이. 콜라이(E. Coli) 스트레인 BL21-Codonplus(DE3)-RP(Stratagene, la Jolla, CA)를 고유의 14N-표지 미니멀 Bioexpress 세포 성장 배지 또는 98% 풍부 15N-표지 미니멀 Bioexpress 세포 성장 배지(Cambridge Isotope Laboratories, USA)에서 37℃에서 250rpm으로 OD590이 0.6-0.8에 이를 때 까지 성장시켰다. 후속적으로, 배양물은 1mM IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)로 유도되고, 4시간동안 더 배양되었다. 유도된 14N- 및 15N-표지 박테리아는 5,000g에서 10분간 4℃에서 원심분리에 의해 수거되고, 후속적으로 Bug Buster 시약(Novagen, Darmstadt, Germany)을 이용하여 용해되었다. 세포 용해물은 습윤 셀 페이스트의 그람당 5,000U 리소자임 및 125U 벤조나제 뉴클레아제로 처리되었다. 봉입체는 원심분리에 의해 수집되고, 1:10 희석 Bug Buster 시약으로 3회 세정되었다. 정제된 14N- 및 15N-표지 봉입체는 6M 구아니딘 하이드로클로라이드(GuHcl), 10mM 벤즈아미딘, 1mM EDTA, 100mM NaCl, 및 50mM Tris·HCl pH=8.8에 가용화되었다. 14N- 및 15N-표지 rP.69 Prn1 단백질의 디폴딩은 GuHCl이 함유되지 않은 동일한 버퍼에 신속히 50배 희석하여 개시되었다. 단백질은 1mM EDTA, 100mM NaCl, 및 50mM Tris·HCl pH=8에 대해 4℃에서 밤새 투석하여 완전히 리폴딩되도록 하였다. 후속적으로, 리폴딩된 단백질은 50kDa의 분자량 컷-오프를 갖는 투석막(Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA)을 이용하여 50mM Tris·HCl pH=8.8에 대해 2회 투석되었다. 단백질은 50-kDa 컷오프를 갖는 Amicon Ultra-15 농축기(Millipore, Billerica, MA)상에서 농축되었다. 마지막으로, 2μg 프로테아제 인히비터(Roche, Penzberg, Germany)를 1mg/ml로 농축 단백질에 첨가하였다. 휴먼 MDDC의 항원 펄스를 위해, Bicinchoninic Acid(이하 BCA라 칭함) 단백질 어세이(Pierce Protein Research Products, Rockford, USA)로 측정된 단백질 함량에 기초하여 14N- 및 15N-표지 rP.69 Prn1 단백질의 1:1 단백질/단백질 혼합물을 제조하였다.
최소 배지 및 OMV 제조물에서 나이세리아 메닝지티디스(
Neisseria meningitidis
) 동질유전자 스트레인의 성장
다양한 주 외막 단백질 Porin A(이하 PorA라 칭함)(Peeter et al. 1996)의 혈청형 P1.5-2,10 또는 P1.7-2,4를 각각 발현하는 나이세리아 메닝지티디스 H44/76의 두 클래스 3-, 클래스 4- 동질유전자 스트레인을 고유의 14N-함유 미니멀 Bioexpress 세포 성장 배지 또는 98% 풍부 15N-표지 미니멀 Bioexpress 세포 성장 배지(Cambridge Isotope Laboratories, USA)에서 정지시가지 성장시켰다. 이러한 배양물로부터, Claassen(Claassen et al. 1996)에 따라 14N- 및 15N-표지 외막 소포(이하 OMV라 칭함)의 뱃치를 제조하고 특성화하였다. 휴먼 MDDC의 항원 펄스를 위해, BCA 단백질 어세이(Pierce Protein Research Products, Rockford, USA)로 측정된 단백질 함량에 기초하여 14N- 및 15N-표지 OMV 뱃치의 1:1 단백질/단백질 혼합물을 제조하였다.
최소 배지에서 병원체-유래 단백질의 발현 및 표지
전 세포 B. pertussis 제조물의 단배질 분석을 위해, 막 복합체를 14N- 및 15N-표지 전 세포 B. pertussis 제조물의 소 분액으로부터 제조하였다. 박테리아 세포 뱃치를 7,000g에서 원심분리하고(15분, 10℃), 펠렛을 10mM Tris·HCl pH=8.0에 재부유하였다. 이러한 서스펜션을 얼음상에서 초음파분해하여 세포 막을 부수고, 6,500g에서 원심분리하고(10분, 10℃), 상층물을 수집하였다. 막 프레그먼트를 스핀다운하고(40,000g, 1시간), 10mM Tris·HCl pH=8.0에 용해된 1% 사크로실에 취하였다. 막 복합체를 SDS-PAGE에 적용하고, 단백질을 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인으로 이송하였다. 멤브레인을 공지된 비룰런스 팩터 필라멘토스 혈구응집소(1:500, 클론 31E5), P.69 Pertactin(1:50, 클론 Pem4), Pertussis Toxin Subunit 1(1:1,000, 클론 151C1), Pertussis Toxin Subunit 4(1:100, 클론 1-227), 및 fimbriae 2(1:1,000, 클론 21E7)(모두 네널란드 백신 연구소로부터 구입)에 대해 모노클로날 항체을 이용하여 탐침되었다(웨스턴 블롯). 그 후, 멤브레인을 알칼린 포스파타아제-표지 항-마우스 IgG(1:5,000; SBA, UK)로 배양하고, 신호를 레디 투 유즈 AP 접합 기질 키트(Biorad, USA)를 이용하여 검출하였다.
동위원소 표지의 효율은 대표적인 단백질 예로서 P.69 Pertactin을 이용하여 조사되었다. 단백질을 SDS-PAGE상으로 분리한 후, 14N- 및 15N-표지 69-kDa 밴드를 겔로부터 잘라내었다. 14N- 및 15N-표지 P.69 Pertactin 및 이의 트립신 터리 분해물을 LCMS(P.69 Pertactin) 및 LCMS/MS(분해물)에 각각 적용하였다.
14N- 및 15N-표지 rP.69 Pertactin 제조물에서 단백질 및 4N- 및 15N-OMV 제조물에서 PorA의 강도 뿐만 아니라, 단백질 및 트립신처리 분해물의 동위원소 표지 효율을 B. pertussis의 막 복합체에 대해 상기한 바와 같이, 특히, 각각 P.69 Pertactin 및 PorA를 표적함으로써 유사한 기술(SDS-PAGE, 웨스턴 블롯, LCMS 및 LCMS/MS)에 의해 평가하였다. PorA, 혈청형 특이 모노클로날 항체가 웨스턴 블롯에 사용되었다.
병원체-관련 MHC 클래스 II 리간돔을 발현하는 휴먼 MDDC 뱃치를 이끄는 실험 어프로치 D, E 및 F
어프로치 D에서, 휴먼 MDDC는 조금 변형하여 실험 방법 I에 기재된 방법에 따라 배양되었다. 여기서, 1x109 PBMC를 HLA-DR2 동형 접합성 혈액 도너로부터 고지에 입각한 동의를 받아 얻어진 백혈구분리반출법 버피 코트를 이용하여 분리되었다. 6일에, 여전히 미성숙한 MDDC를 OD590=0.028의 최종 농도로 14N- 및 15N-표지 전 세포 B. pertussis 제조물의 1:1 혼합물로 펄싱하였다. 8일에, 전 세포 B. pertussis-펄싱된 MDDC를 수거하고, PBS에 세정하고 카운팅하였다. 20x106 MDDC를 펠렛화하고, 동결하고, 펩타이드 분리 및 분석시까지 -80℃에 보관하였다. 전 세포 B. pertussis-펄스 전후의 소 분액(1%)의 MDDC를 플로우 사이토메트리로 특성화하여 MDDC의 순도 및 성숙도를 확인하였다(데이타로 나타내지 않음).
어프로치 E에서, 상기한 바와 같이 휴먼 MDDC는 조금 변형하여 실험 방법 I에 기재된 방법에 따라 제조되었다. 여기서, HLA-DR 혈액형의 동형 접합성 집단을 나타내는 9개의 다른 혈액 뱅크 도너로부터 고지에 입각한 동의를 받아 얻어진 PBMC는 개별적으로 배양되어(3x108 PBMC/도너) MDDC를 성장시켰다. 6일에, 여전히 미성숙한 MDDC를 S. abortis equi의 20ng/ml LPS의 존재하에 10μg/ml의 최종 농도로 14N- 및 15N-표지 rP.69 Pertactin 제조물의 1:1 혼합물로 펄싱하였다. 8일에, rP.69 Pertactin-펄싱된 MDDC를 수거하고(n=9), PBS에 세정하고, 모으고, 카운팅하였다. 모아진 70x106 MDDC를 펠렛화하고, 동결하고, 펩타이드 분리 및 분석시까지 -80℃에 보관하였다. 전 세포 B. pertussis rP.69 Pertactin 펄스 전후의 소 분액(1%)의 MDDC를 플로우 사이토메트리로 특성화하여 MDDC의 순도 및 성숙도를 확인하였다(데이타로 나타내지 않음).
어프로치 F에서, 상기한 바와 같이 휴먼 MDDC는 조금 변형하여 실험 방법 I에 기재된 방법에 따라 제조되었다. 여기서, HLA-DR1 동형 접합성 도너 및 HLA-DR2 동형 접합성 도너로부터 고지에 입각한 동의를 받아 얻어진 PBMC는 개별적으로 배양되어(2x109 PBMC/도너) MDDC를 성장시켰다. 6일에, 각 MDDC 뱃치를 두 분액에서 분할하고, S. abortis equi의 20ng/ml LPS의 존재하에 25μg/ml의 최종 농도로 14N- 및 15N-표지 P1.7-2,4 OMV 또는 14N- 및 15N-표지 P1.5-2,10 OMV의 1:1 혼합물로 펄싱하였다. 8일에, OMV-펄싱된 MDDC를 수거하고(n=9), PBS에 세정하고, 카운팅하고, 펠렛화하고, 동결하고, 펩타이드 분리 및 분석시까지 -80℃에 보관하였다. OMV 펄스 전후의 소 분액(1%)의 각 MDDC 뱃치를 플로우 사이토메트리로 특성화하여 MDDC의 순도 및 성숙도를 확인하였다(데이타로 나타내지 않음).
펩타이드 합성
합성 펩타이드 스탠다드는 SYRO II 동시 다중 펩타이드 합성기(MultiSyntech GmbH, Witten, Germany)를 이용하여 고상 FMOC 화학에 의해 제조되었다. 합성된 펩타이드의 순도 및 정체는 역상 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 평가되었다.
MHC 클래스 II 리간돔의 분리
다음과 같이 조금 변형한 것을 제외하고, 실험 방법 I에 기재된 바와 같은 MHC 클래스 I 리간돔의 분리에 따른 면역화학에 의해 MHC 클래스 II 분자의 가용화 및 병원체-관련 MHC 클래스 II 리간돔의 후속적인 분리를 위해 어프로치 D, E 및 F에 따라 제조된 MDDC 뱃치를 해동하고 용해하였다. 클리어 단계에서, 휴먼 HLA-DR 분자에 특이적인 마우스 항체(클론 B8.11.2)를 사용하였으며, 10% 아세트산을 이용하여 클리어 컬럼으로부터 용출한 후, HLA-DR 분자 및 관련 펩타이드를 10-kDa 분자량 컷-오프 멤브레인 필터를 통해 통과시키고, 그 여과물을 70℃로 15분간 가열하였다. MHC 클래스 II 리간돔의 농축, 재구성, 스파이킹 및 보관은 실험 방법 I에서 MHC 클래스 I 리간돔에 대해 기재된 방법과 같다.
플랫폼 LCMS 분석
펩타이드 시료는 본 명세서에서 앞서 기술한 바와 같이 전기 스프레이 이온화-질량 분광계에 결합된 최적화 나노플로우 액체 크로마토그래피(플랫폼 LCMS)에 의해 분석되었다. 1-2x107 MDDC를 나타내는 펩타이드 시료의 분액들을, 3-μm C18 파티클로 패킹된 25μm ID을 갖는 25cm 길이 분석 컬럼에 변형된 MicroTee 배관 요소를 통해 연속적으로 연결된 C18 프리컬럼상에 로딩하였다. 사용된 이동상은 아세토니트릴 30μl/min의 흐름속도에서 45분내에 100% A(물 + 0.1-M 아세트산) 내지 A에 용해된 60%의 아세토니트릴 + 0.1-M 아세트산의 얕은 선형 구배이었다. 컬럼 팁은 금- 및 탄소-코팅되었으며, 컬럼 헤드 압력은 >250bar이었다. 질량 스펙트럼은 적어도 10,000FWHM의 질량 분해도에서 300-1,500 Da의 범위로 1sec/scan의 스캔 속도로 기록되었다(MS 분석).
주로 에피토프 시료의 2차 분액을 사용하여 후보 병원체-관련 MHC 클래스 II 에피토프의 MS 시퀀싱(MS/MS 분석)을 위해, MS1 분석 사이클은 미리선택된 질량상에서 또는 질량 스펙트로미터내로 용출되는 시점에 가장 풍부하게 되는 질량상에서 충돌 유도된 프레그먼트화의 사이클로 변환되었다. MS/MS 스펙트럼은 50-2,000 Da의 질량 범위 및 5,000FWHM의 질량 분해도에서 1sec/scan의 스캔 속도로 습득되었다. 최적 충돌 에너지는 에피토프의 특성 및 사용된 스펙트로미터의 타입에 따라 크게 달라졌으며, 이러한 실험에서 최적화되었다. MS/MS 스펙트럼의 해석은 수동적으로 또는 Mascot(Perkins et al., 1999 at www.matrixscience.com, Matrix Science Ltd., London UK), ProteinProspector(www.prospector.ucsf.edu, University of California, San Francisco, CA, USA), BioWorksTM(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) 및/또는 ProtenLynxTM(Waters Corp., Milford, MA, USA)와 같은 소프트웨어 도구를 이용하여 이루어진다.
식별된 에피토프의 정량화를 위해, 관련 반응 인자들을 식별된 에피토프의 합성 유사체의 강도량을 표준 펩타이드 Angitensin-III 및 Oxytocin의 강도량의 평균으로 나누어 계산하였다. 이러한 인자들은 후속적으로 세포 뱃치에 존재하는 천연 에피토프의 수를 정량화하는데 사용되었다.
온라인 2-차원 플랫폼 LCMS 분석
펩타이드는 전기 스프레이 이온화-질량 분광계에 결합된 온라인 2-차원 나노스케일 액체 크로마토그래피(2D-LCMS)에 의해 분석되었다. 1-2x107 MDDC를 나타내는 펩타이드 시료의 분액들을, 건조 파티클 중량으로 2-3비율로 혼합된 약음이온 교환 파티클(예, PolyWAX LPTM, PolyLC, Columbia, MD, USA로부터 구입가능)과 강 양이온 교환 파티클(예, PolySULFOETHYL AspartamideTM, PolyLC, Columbia, MD, USA로부터 구입가능)의 혼합물을 포함하는 프리컬럼상에 로딩하였다. 이 혼합 음이온-양이온 교환(ACE) 정지기를 융합 실리카 배관에 슬러리-패킹하고, 두 베드 길이의 C18 파티클(예, Reprosil-Pur® C18-AQ, 5μm 파티클 크기, 120Å 공극 크기, Dr. Maisch, Germany로부터 구입가능) 사이에 샌드위치하였다. 프리컬럼 베드의 각 부분의 길이는 20mm이었으며, 프리컬럼의 내부직경은 50μm이었다. C18-ACE-C18 샌드위치 프리컬럼은 3-μm C18 파티클로 조밀하게 패킹된 25μm ID을 갖는 25cm 길이 분석 컬럼(예, Reprosil-Pur® C18-AQ, 3μm 파티클 크기, 120Å 공극 크기, Dr. Maisch, Germany로부터 구입가능)에 변형된 MicroTee 배관 요소를 통해 연속적으로 연결되었다. 사용된 이동상은 아세토니트릴 30nl/min의 흐름속도에서 45분내에 100% A(물 + 0.1-M 아세트산) 내지 A에 용해된 60%의 아세토니트릴 + 0.1-M 아세트산의 얕은 선형 구배이었다. 컬럼 팁은 금- 및 탄소-코팅되었으며, 컬럼 헤드 압력은 >250bar이었다. 질량 스펙트럼은 적어도 10,000FWHM의 질량 분해도에서 300-1,500 Da의 범위로 1sec/scan의 스캔 속도로 기록되었다(MS 분석). 각각 1nM, 1μM, 10mM, 1M 및 2M의 농도로 증가량의 포름산 및 디메틸설폭시드(DMSO)를 함유하는 물을 포함하는, 무염 용출 용매의 분액을 주입하고, 상기 언급한 아세토니트릴 + 0.1M 아세트산의 완만한 선형 구배 및 질량 스펙트럼 조건을 사용하여 펩타이드를 분리 및 MS 분석함으로써, 5회 후속 주입, 분석 분리 및 MS 분석-사이클을 수행하였다.
후보 병원체-관련 MHC 클래스 II 리간드의 식별
셀프-유래 리간드로부터 병원체-관련 MHC 클래스 II 리간드를 구별하기 위해, 필수적인 질량 스펙트럼 정보("질량 값" 및 "강도 값"으로 정의됨)를 MS 스펙트럼으로부터 추출하고, 질량 스펙트럼 더블릿에 대한 MHC 클래스 II 질량 스펙트럼 해석 알고리즘 조사에 사용되었다. 후보 병원체-관련 MHC 클래스 II 리간드로서 질량 스펙트럼 더블릿을 파지티브로 판별하기 위해 다음과 같은 5가지 기준을 만족해야 한다:
(i) '라이트' 및 '헤비' 에피토프의 모노이소토픽 질량간의 질량 차이(Δm)는 '라이트' 에피토프의 질량의 약 1.2%이어야 한다. 이러한 상대적 질량 차이는 단백질 및 펩타이드에서 질소 원자의 평균 자연 빈도에 기초한다. 각 질소 원자의 질량에서 1Da 증가는 본래의 펩타이드/단백질에 대해 1.2%의 상대적 질량 증가를 일으킨다.
(ii) '라이트' 및 '헤비' 에피토프의 전하 상태는 동등해야 한다.
(iii) '라이트' 및 '헤비' 에피토프의 강도비는 약 1이어야 한다.
(iv) '헤비' 에피토프의 질량 스펙트럼 패턴은 [M*-1] 및 [M*-2] 동위원소 피크로서 가시화되는 98-원자%-풍부 15N-동위원소의 편입을 나타내야 한다(M*은 15N-동위원소의 균일한 편입을 함유하는 '헤비' 에피토프의 모노이소토픽 질량을 나타냄).
(v) 후보 에피토프에 존재하는 질소 원자의 산출된 수는 정수이어야 한다. 이 수는 '라이트' 및 '헤비' 에피토프의 모노이소토픽 질량의 절대 질량 차이(Δm)를 이러한 에피토프의 전항 상태(z)로 곱하여 산출될 수 있다.
도 8(하위 패널, 우측 스펙트럼)은 안정한 동위원소 및 상기 언급된 바를 만족하는 기준을 이용한 경우에 항원 펄싱된 MDCC로부터 추출된 병원체-관련 클래스 II 리간드의 시뮬레이션 동위원소 패턴을 나타낸 것이다. 후보 병원체-관련 MHC 클래스 II 리간드는 펩타이드 용출물의 MS 스펙트럼의 질량 축을 따라 수학적으로 시뮬레이션된 동위원소 패턴을 이동시킴으로써 조사되었다. 부합하는 동위원소 클러스터를 추가 LCMS/MS 분석을 위해 선택하였다.
면역 림포사이트
Sanquin(Amsterdam)으로부터 건강한 혈액 뱅크 도너의 말초혈액을 도너로부터 고지에 입각한 동의를 받아 얻었다(S03.0015-X). 말초혈액 분자 세포(PBMC)를 fycoll-hypaque(Pharmacia Biotech, Uppsala Sweden)상에서 버피 코트 세포의 원심분리에 의해 분리하여 새로이 사용되거나, 실험에 사용되기 전까지 냉동보존되었다. PBMC를 2% 휴먼 AB 혈청(Harlan, USA)이 보충된 완전 배지, 즉, AIM-V 배지(GibcoBRL, USA)에서 배양하였다. 암컷 spf Balb/c 마우스 및 C57black/6 마우스를 Harlan으로부터 구입하고, 통상적인 조건하에서 하우스에 보관하였다. 모든 실험은 The Animal Ethics Committee of the NVI에 의해 승인되었다. 4마리 마우스로 이루어진 그룹을 0일 및 28일에 피하로 실험 방법 II에서 기재된 바와 같이 제조된 PBS에 LpxL1 보조 리포좀을 함유하는 rP1.7-2,4 또는 rP1.5-2,10(1.5μg) 또는 P1.7-2,4 또는 P1.5-2,10 OMV(도즈당 1.5μg PorA)으로 면역되었다. 42일 후, 단일 스플레노사이트 및 림프 노드 서스펜션을 70-μm 공극 크기 나일론 필터를 통해 기관의 기계적 분리에 의해 획득하였다. 스플레노사이트 서스펜션내의 적혈구 세포를 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA로 4℃에서 2분간 용해하였다. 스플레노사이트를 10% FCS(HyClone, USA) 및 pen/strep/glu((GibcoBRL, USA)이 보충된 완전 IMDM-10 배지, 즉, Iscove's Modified Dubelcco's Medium(GibcoBRL, USA)에 취하였다. 림프 노드 세포를 5% 노말 마우스 혈청(Harlan, USA) 및 pen/strep/glu이 보충된 완전 IMDM-배지에 취하였다.
PorA 펩타이드 및 단백질
각각 상기 제조된 12 아미노산 오버랩과 중복되는 전체 P1.7-2,4 및 P1.5-2,10 단백질에 걸친 합성 18-mer 펩타이드를 스마트 풀링에 의해 즉, 각 합성 펩타이드는 두 다른 풀의 8펩타이드로 나타내도록 16 풀(A-H 및 1-8)로 풀링하였다. 재조합 P1.7-2,4 및 P1.5-2,10 단백질(이하 rP1,7-2,4 및 rP1.5-2,10)은 나이세리아 메닝지티디스(Neisseria meningitidis) H44/76의 상기 언급된 동질유전자 스트레인의 PorA 유전자를 이용하여 당 기술분야에 알려진 재조합 단백질 발현 기술에 의해 획득되었다.
증식 어세이
P.69 Pertactin 특이 휴먼 증식 어세이를 위해, 105 PBMC를 1 또는 10μM로 관련 펩타이드의 존재 또는 부재하에서 150μl/well로 완전 배지에서 37℃, 5% 이산화탄소 분위기에서 배양하였다. PorA 특이 휴먼 증식 어세이를 위해, 105 PBMC 또는 2x104 MB71.5 T 세포를 표시된 농도로 관련 펩타이드, 펩타이드 풀 또는 PorAs rP1.7-2,4, P1.5-2,10, P1.7,16, P1.19,15 또는 P1.22,14의 존재 또는 부재하에서 150μl/well로 완전 배지에서 37℃, 5% 이산화탄소 분위기에서 배양하였다. 4일에, 100-μl 부피를 사이토카인 검출을 위해 제거하였다. 그 다음, 0.5μCi(18.5kBq) 3H-티미딘(Amersham, USA)을 세포 수거 18시간 전에 배양물에 첨가하였다. CPM의 검출 및 그 결과의 산출은 면역 스플레노사이트의 증식 어세이에 대한 것과 같이 수행되었다. 결과는 적어도 3중 웰로부터 SI±SD로 표현된다. T 세포주 MB71.5에 특이적인 리전 4가 완전배지에서 0.5μg/ml rP1.5-2,1을 이용한 MB71 PBMC의 반복적인 시험관내 재자극에 의해 생성되었다.
뮤린 증식 어세이를 위해, P1.7-2,4 또는 P.15-2,10 면역화 Balb/c 또는 C57Black/6 마우스로부터 얻은 스플레노사이트를 IMDM-10에서 rPorA 또는 18-mer 올리고펩타이드의 존재하에서 또는 배지만을 이용하여 96-웰 둥근바닥 플래이트(Greiner)에서 1.5x105 cells/150μl로 배양하였다. 4일에, 4, 0.5μCi(18.5kBq) 3H-티미딘(Amersham, USA)을 웰에 첨가하고, 세포를 추가 18시간동안 배양하였다. 세포를 수거하고, 3H-티미딘 편입을 Wallac 1205 β-플래이트 액체 신틸레이션 카운터를 이용하여 측정하였다. 결과는 삼중 웰로부터 항원이 존재하는 경우의 배양물의 CPM의 몫을 배지만 존재하는 경우의 배양물의 CPM으로 나누어 계산된 자극 지수(SI)±SD로 표현된다.
결과 II: MHC 클래스 II 리간돔
최소 배지에서
14
N 및
15
N 동위원소 표지의 단백질 발현 및 효율
실험 방법 II의 어프로치 D에 기재된 바와 같이 생성된 14N- 및 15N- 표지 전 세포 보르데텔라 퍼투시스(Bordetellar pertussis) 제조물의 멤브레인 복합체내의 박테리아 단백질은 SDS-PAGE에 의해 분리되고, 웨스턴 블롯에 의해 분석되었다. 피라멘트성 혈구응집소 P.69 Pertactin, Pertussis Toxin Subunits 1 및 4, 및 Fimbriae 2는 유사한 속도로 14N- 및 15N- 표지 제조물에서 발현되었으며, 이는 헤비 동위원소 표지 배지에서 정상적인 단백질 발현을 나타낸다. 14N- 및 15N-P.69 Pertactin 밴드로부터 추출된 LCMS 분석은 이의 라이트 형태에 비해 P.69 Pertactin 단백질의 헤비 형태에 대해 1.2%의 질량 증가를 확인하였다. 또한, 14N- 및 15N-P.69 Pertactin의 트립신처리 분해 산물로부터 얻어진 MS/MS 스펙트럼은 헤비 및 라이트 아미노산으로의 전형적인 프레그먼트화를 나타내었으며, 이는 P.69 Pertactin 단백질의 전체 서열에 걸친 성공적인 안정한 표지를 확인시켜주는 것이다.
마찬가지로, 14N- 및 15N-표지의 단백질 발현 및 효율은 rP.69 Pertactin에 대해 어프로치 E에 기재된 바와 같이 평가되었고, 나이세리아 메닝지티디스(Neisseria meningitidis)로부터 유래된 OMV 제조물에 대해 실험 방법 II의 어프로치 F에 기재도니 바와 같이 평가되었다. 전체 단백질에 걸친 단백질 강도 및 성공적인 표지가 각각 rP.69 Pertactin 및 PorA 제조물에 대해 관찰되었다.
실험 어프로치 D에서 HLA-DR2-바인딩된 보르데텔라 퍼투시스(
Bordetellar pertussis
)의 식별
병원체-관련 HLA-DR 리간드는 실험 방법 II에 기재된 바와 같이 14N- 및 15N-표지 전 세포 보르데텔라 퍼투시스(Bordetellar pertussis) 제조물의 1:1(OD/OD) 혼합물로 펄싱된 HLA-DR2 동형접합 MDDC로부터 추출되었다. 후보 보르데텔라 퍼투시스(Bordetellar pertussis) MHC 클래스 II 리간드를 나타내는 질량 스펙트럼 더블릿은 수학적 조사 알고리즘을 이용하여 LCMS 스펙트럼에서 조사되었다. 도 13(상위 패널)은 17 질소원자를 함유하는 후보 에피토프(도 13, 삽도)를 나타내는 m/z 788.94Da 및 797.42Da에서 검출된 동위원소 클러스터의 예를 나타낸다. 상기 에피토프의 MS/MS 스펙트럼(도 13, 하위 패널)은 보르데텔라 퍼투시스(Bordetellar pertussis)로부터 추정되는 주변세포질 단백질로부터 유래된 에피토프(accession number CAE43606)을 나타내는 부분 서열을 보여주었다. 6개의 다른 스펙트럼 더블릿을 시퀀싱하였으며, 보르데텔라 퍼투시스(Bordetellar pertussis)의 4가지 다른 단백질로부터 유래된 4 에피토프의 길이 변이체를 나타내었다(표 4). 상기 에피토프들은 내부 스탠다드를 이용하여 준정량화되었다.
실험 어프로치 E에서 HLA-DR-바인딩된 보르데텔라 퍼투시스(
Bordetellar pertussis
) rP.69 Pertactin 에피토프의 식별
병원체-관련 HLA-DR 리간드는 실험 방법 II에 기재된 바와 같이 14N- 및 15N-표지 rP.69 Pertactin의 1:1(OD/OD) 혼합물로 펄싱된 MDDC의 HLA-DR 동형접합 풀 뱃치로부터 추출되었다. 후보 P.69 Pertactin MHC 클래스 II 리간드를 나타내는 질량 스펙트럼 더블릿은 수학적 조사 알고리즘을 이용하여 LCMS 스펙트럼에서 조사되었다. 도 14(상위 패널)은 20 질소원자를 함유하는 후보 에피토프(도 14, 삽도)를 나타내는 m/z 770.43Da 및 780.39Da에서 검출된 스펙트럼 더블릿과 부합하는 동위원소 클러스터의 예를 나타낸다. 상기 에피토프의 MS/MS 스펙트럼(도 14, 하위 패널)은 P.69 Prn1의 부합하는 펩타이드 서열 LRDTNVTAVPASGAPA의 b-타입 이온 시리즈(accession number AJ011091)을 보여주었다. 총, 5 스펙트럼 더블릿을 시퀀싱하였으며, 이들은 보르데텔라 퍼투시스(Bordetellar pertussis) P.69 Pertactin의 두 에피토프 리전의 길이 변이체를 나타내었다(표 5). 상기 에피토프들은 내부 스탠다드를 이용하여 준정량화되었다.
본 발명자들은 상기 에피토프를 나타내는 합성 스탠다드와 함께 건강한 성인 도너로부터 PBMC의 시험관내 재자극화에 의해 인간에서 두 보르데텔라 퍼투시스(Bordetellar pertussis) P.69 Pertactin 에피토프의 면역원성을 조사하였다. ASTLWYAESNALSKRLG 서열을 포함하는 제 2 에피토프 리전에 대해, 면역 인식은 적어도 2 도너에서 관찰되었으며(표 5), 이는 상기 에피토프가 기능적 휴먼 이페토프임을 보여주는 것이다.
실험 어프로치 F에서 HLA-DR1 및 2 바인딩된 나이세리아 메닝지티디스(Neisseria meningitidis) 에피토프의 식별
병원체-관련 HLA-DR 리간드는 다음과 같은 조합의 HLA-DR 정렬 및 PorA 혈청형이 나타나도록 표지된 OMV 제조물로 펄싱된 4 MDDC 뱃치로부터 추출되었다: 실험 방법 II에 기재된 바와 같이, 각각, HLA-DR1/P1.7-2,4, HLA-DR2/P1.7-2,4, HLA-DR1/P1.5-2,10, 및 HLA-DR2/P1.5-2,10. P1.7-2,4 또는 P1.5-2,10으로부터 유래된 후보 MHC 클래스 II 리간드를 나타내는 질량 스펙트럼 더블릿은 수학적 탐색 알고리즘을 이용하여 LCMS 스펙트럼에서 탐색되었다. 도 15는 각각, HLA-DR1/P1.7-2,4 리간돔에서 m/z 1065.01Da 및 1076.47Da에서 검출된 한쌍의 [MH2]2+ 이온(패널 A), 및 HLA-DR2/P1.5-2,10 리간돔에서 m/z 701.01Da 및 708.67Da에서 검출된 한쌍의 [MH3]3+ 이온(패널 B)의 두 스펙트럼 더블릿 예를 나타낸다. 두 가지 모두의 질량 스펙트럼 더블릿에서 질량 증가는 각 후보 에피토프에서 24 질소원자의 존재를 나타낸다. m/z 1065.01Da에서 [MH2]2+ 이온 및 m/z 701.01Da에서 [MH3]3+ 이온의 MS/MS 시퀀싱은 각각 PorA 동족 에피토프 SPDFSGFSGSVQFVPIQNSK(P1.7-2,4, 패널 C) 및 SPEFSGFSGSVQFVPAQNSK(P1.5-2,10, 패널 D)에 부합하는 스펙트럼을 나타내었다. 어프로치 F하에 실험 방법 II에 기재된 바와 같이 제조된 4 리간돔에서 집합적으로 38 스펙트럼 더블릿은 나이세리아 메닝지티디스(Neisseria meningitidis) PorA의 8 에피토프 리전으로부터 길이 변이체, 혈청형 변이체 및/또는 HLA-DR 대립형질 특이 리간드인 것으로 특성화되었다(표 6). 상기 에피토프들은 내부 스탠다드를 이용하여 반
실험 방법 II에 기재된 바와 같이 14N- 및 15N-표지 rP.69 Pertactin의 1:1(OD/OD) 혼합물로 펄싱된 MDDC의 HLA-DR 동형접합 풀 뱃치로부터 추출되었다. 후보 P.69 Pertactin MHC 클래스 II 리간드를 나타내는 질량 스펙트럼 더블릿은 수학적 조사 알고리즘을 이용하여 LCMS 스펙트럼에서 조사되었다. 도 14(상위 패널)은 20 질소원자를 함유하는 후보 에피토프(도 14, 삽도)를 나타내는 m/z 770.43Da 및 780.39Da에서 검출된 스펙트럼 더블릿과 부합하는 동위원소 클러스터의 예를 나타낸다. 상기 에피토프의 MS/MS 스펙트럼(도 14, 하위 패널)은 P.69 Prn1의 부합하는 펩타이드 서열 LRDTNVTAVPASGAPA의 b-타입 이온 시리즈(accession number AJ011091)을 보여주었다. 총, 5 스펙트럼 더블릿을 시퀀싱하였으며, 이들은 보르데텔라 퍼투시스(Bordetellar pertussis) P.69 Pertactin의 두 에피토프 리전의 길이 변이체를 나타내었다(표 5). 상기 에피토프들은 내부 스탠다드를 이용하여 준정량화되었다. 자연적으로 표출된 에피토프들 중 28개는 신규한 PorA HLA-DR 리간드이었으며, 10개는 4개의 공지된 에피토프 리전(리전 1,3, 7 및 8)에 국한된 앞서 기재된 것들이었다. 이런 이유로, 4개의 신규한 자연적으로 표출된 PorA 에피토프 리건이 개시되었으며(리전 2, 4, 5 및 6), 이 중에서 리전 2는 휴먼 CD4+ T 세포를 자극하는 것으로 보고되었다(Wiertz et al. 1992). 조사된 모든 4개의 리간돔에서, 리전 8 에피토프가 풍부하게 발현되었다. HLA-DR1/P1.7-2,4 리간돔에서 질량 스펙트럼 더블릿의 MS 시퀀싱은 총 리전 8 리간돔의 1%를 나타내는 이러한 에피토프 리전의 2 변이체를 드러내었으며, 이는 IGNYTQINAASVG 코어 서열을 함유하지만 C-말단에 +114Da 또는 +270Da으로 연장되며, PorA내의 이러한 고보존 리전에서 상기 에피토프의 자연 C-말단 플랭킹 잔기와 부합하지 않는 것이었다(도 16). 이러한 변이체 및 이러한 목적으로 제조된 합성 스탠다드의 14N- 및 15N-표지 카운터파트의 LCMS 특징은 상기 연장이 분자내 스플라이싱 이벤트로부터 발생되어야만 하는 각각 아미노산 GG(또는 N), 또는 GGR(또는 NR)을 갖는 코어 서열의 비통상적인 연장과 부합하였음을 보여주었다. MHC 클래스 II 리간드의 스플라이싱은 개시된 바 없다. MHC 클래스 II 리간드의 PTM으로서 스플라이싱의 첫번째 입증은 전용 면역학적 실험 디자인 및 LCMS와 결합된 안정한 동위원소의 사용으로 인한 직접적인 결과이다. 이런 이유로, MHC 클래스 I 리간드와 관련하여 MHC 클래스 II 리간드의 현상 PTM의 무지는 T 세포 에피토프에 대한 우리의 지식에 대하여 현실적으로 위협적인 것이며, 이를 해결하기 위해서 상기 접근법을 필요로 한다.
실험 방법에서 어프로치 F에 대해 기재된 바와 같이 획득된 4 리간돔에서 질량 스펙트럼 더블릿의 포괄적인 LCMS 분석의 다른 결과로서, PorA 단백질로부터 유래되지 않은 24개의 부가적인 에피토프들이 식별되었다. 집합적으로, 상기 에피토프들은 나이세리아 메닝지티디스(Neisseria meningitidis) OMV 제조물과 관련된 13개의 다른 단백질의 18 에피토프(길이 변이체)를 나타내었다(표 7). 이러한 발견은 잠재적 T 세포 표적으로서 에피토프 리전 및 이들의 각 전구체 단백질을 나타낸다.
온라인 2-차원 플랫폼 LCMS 기술을 이용한 MHC 리간돔의 고 처리율 분석
MHC 리간돔의 고 처리율 분석을 증진시키기 위해, 어프로치 F에 기재된 OMV 펄스드 MDDC 뱃치로부터 유래된 동일한 MHC 클래스 II 펩타이드 시료의 반을 상기 온라인 2-차원 플랫폼 LCMS 기술에 적용하였다. 어프로치 F 시료의 오프-라인 제조된 SCX 분획의 플랫폼 LCMS 분석을 이용하여 앞서 확인된 에피토프에 부가적으로, 온라인 2-D 적용은 PorA로부터 기원하였지만 이전에는 확인되지 않은 19개의 부가적인 펩타이드 에피토프 및 나이세리아 메닝지티디스(Neisseria meningitidis)의 하나의 논-PorA 단백질을 신속하고 시료 절감 방식으로 수득하였다(표 8).
MHC 리간돔은 면역원성 및 보호와 상관관계에 있다
따라서, 이러한 타입의 분석은 항원으로부터 잠재적 CD4 T 세포 에피토프 리전의 다양성을 보여줄 뿐만 아니라, T 세포 반응의 면역원성 및 퀄러티와 그리고 최종적인 PTM을 조절하는 이들의 상대적 존재비에 대한 통찰을 제공한다. 중요하게, 본 실시예로 나타낸 바와 같이, 동위원소 표지 및 전용 LCMS 기술과 함께 사용된 실험 셋업은 T 세포 면역성에서 병원체성 항원 변화 및 휴먼 HLA-DR 다형성의 역할 조사를 촉진한다. 다수 공지된 나이세리아 메닝지티디스(Neisseria meningitidis) PorA 혈청형의 서열 정렬은 마이크로다형성이 표 6에 나타낸 자연적으로 존재하는 리전 중 3곳에서 일어났음을 보여주었다(리전 1, 4 및 5). 본 발명자들은 건강한 성인 도너의 PBMC 및 면역화된 Balb/c 마우스와 C57black/6 마우스의 스플레노사이트를 이용하여 상기 신규 마이크로다형성 리전 4의 기능적 역할을 조사하였다. 우선, 본 발명자들은 다양한 도너로부터 얻은 PBMC를 각각, P1.7-2,4 또는 P1.5-2,10으로 반복적인 시험관내 재자극화에 의해 각각, SPDFSGFSGSVQFVPIQNSK(P1.7-2,4 변이체, 이하 D/I라 칭함) 및 SPEFSGFSGSVQFVPAQNSK(P1.5-2,10 변이체, 이하 E/A라 칭함)에 특이적인 T 세포주가 생성될 수 있는지 알아보았다. 한 도너로부터, P1.7-2,4 에피토프 변이체를 나타내는 중복 합성 18-mer 펩타이드 PDFSGFSGSVQFVPIQNS(코드 S004-29) 및 SGSVQFVPIQNSKSAYTP(코드 S004-30)으로 펄싱된 것이 아니라, P1.5-2,10 에피토프 변이체를 나타내는 중복 합성 18-mer 펩타이드 PEFSGFSGSVQFVPAQNS(코드 S011-24) 및 SGSVQFVPAQNSKAYTP(코드 S011-25)로 펄싱된 자기유래 항원 표출 세포를 인식하는 특이적인 T 세포주(MB-71.5)가 생성되었다. P1.5-2,10 단배질로 펄싱된 자기유래 항원 표출 세포로 자극될 경우 MB-71.5 T 세포는 또한 증식되거나(도 17B) 사이토카인을 생성하였다(나타내지 않음). 다른 5 PorA 변이체로부터, 단지 P1.5-1,2-2(E/A) 및 P1.22,14(D/A) 변이체만이 MB-71.5 T 세포를 재자극하였으며, P1.7-2,4(D/I), P1.7,16(E/I) 또는 P1.19,15(D/I)는 그렇지 않았으며, 이는 자연적으로 프로세싱된 '리전 4' 에피토프의 C-말단 반에서 알라닌(A) 잔기가 T 세포 인식에 필수적이었으을 나타낸다. 또한, D/I 또는 A/I 특이적 T 세포는 시험된 어느 개체에서(n=5) 검출될 수 없었다. 전임상 동물 시험에서, 본 발명자들은 유사한 관찰을 발견하였다: P1.5-1,2-2(P1.5-2,10과 같이 E/A '리전 4')로 면역화된 Balb/c 마우스의 스플레노사이트는 P1.5-2,10 '리전 4' 펩타이드 S011-24 및 S011-25에 반응하였지만, P1.7-2,4 특이 리전 4 변이체 S004-29 및 S004-30에는 반응하지 않았다(데이타로 나타내진 않았음). P1.7-2,4로 면역화된 마우스는 리전 4에 대한 (측정가능한) T 세포 반응을 증가시키지 않았다(표 9). 또한, P1.5-2,10로 면역화된 Balb/c 마우스로부터 유래된 T 세포 하이브리도마는 와일드-타입 PorA 변이체의 존재하에서 휴먼 MB-71.5 T 세포와 동일한 반응 패턴을 가졌다(데이타로 나타내진 않았음). 또한, C57black/6 마우스에서, P1.7-2,4는 '리전 4'에 대해 (측정가능한) T 세포 반응을 유도하지 못하였으나, P1.5-1,2-2 '리전 4'는 면역성이었다. 두 모든 PorA 변이체는 전용 LCMS 기술에 의해 식별된 다른 에피토프 리전, '리전 6'에 대해 T 세포 반응을 동등하게 유발할 수 있었으며, 이는 P1.7-2,4가 T 세포 항원으로서 완전히 작용할 수 없는 것이 아니었음을 나타낸다(표 9). 인간 뿐만 아니라 마우스에서 박테리아 항체를 유도하는 P1.7-2,4의 저조한 능력(refs 15 및 16)은 백신 개발에 있어 문제가 된다. Balb/c 마우스에서, 항-'리전 4' 스플레노사이트 증식의 정도는 각 마우스에서 P1.5-1,2-2에 대한 박테리아 타이터의 수준과 상관적이었다(R=0,78). 집합적으로, 이러한 면역원성 데이타는 PorA의 중요한 기능성 T 세포 에피토프로서 '리전 4'를 지정한다.
디스커션: MHC 클래스 I 및 II 리간돔
최초로, 향상된 LCMS 장치를 이끄는, 플랫폼 LCMS 기술로 표현된 새로운 조합의 방법은 종래에는 스탠다드 LCMS 기술을 이용하여 제한적인 수의 에피토프를 수득하였던 MHC 클래스 I 및 II 펩타이드 시료의 에피토프 발굴에 중요한 작용을 하였다. 또한, 길이 및 길이 변화, 존재비 및 PTM과 같은 특정 에피토프 특징들이 상기 플랫폼 기술에 의해 검출되었다.
관련 면역학적 실험 디자인 및 동위원소 표지의 사용과 함께, 상기 플랫폼 LCMS 기술은 전례가 없는 고수준의 정확성 및 감도로 병원체-관련 MHC 클래스 I 및 II 리간돔을 명료하게 식별할 수 있다.
상기 플랫폼 LCMS 기술은 필요한 보다 긴 그리고 보다 신뢰성있는 액체 분무 프로세스와 함께 보다 낮은 흐름 속도, 보다 높은 컬럼 헤드 압력을 이룸으로써 MHC 클래스 I 및 II 리간돔 분석에 있어서 종래에 사용된(스탠다드) LCMS 방법과 구별된다. 대체로, 이는 MS/MS 사이클 시간에 이온의 강도 및 체류 시간을 증가시켜, 이에 따라 지배적인 펩타이드종 및 하위지배적인 펩타이드종이 신뢰성있게 특성화될 수 있는 수준으로 LCMS/MS의 식별 성능을 증진시킨다.
a값은 세포당 각 펩타이드의 카피수를 나타낸다.
[표 2a]
[표 2b]
[표 2c]
a MV 에피토프에 대해, 식별된 에피토프에 인접한 잔기들은 괄호안에 주어진다. 따라서, 이러한 잔기들은 식별된 에피토프의 일부가 아니다.
b 값은 100%의 총 상대 존재비에 대한 상대 존재비를 나타낸다.
c 에피토프의 세포 공급원.
d SEQ ID NRs 7-49는 HLA-A*0201 관련 리간드이며, SEQ ID NRs 50-51은 HLA-B*0701 관련 리간드이다.
# MV 에피토프는 또한 스탠다드 LCMS를 이용하여 검출가능하다.
## 마우스 CTL 에피토프로서 이전에 알려진 에피토프(Neumeister et al. 1998).
### PTM을 갖는 에피토프: 별표(*)는 특정 아미노산 잔기의 디아미드화를 나타내며, 인산화 사이트는 'p'로 표시된다.
#### 휴먼 CTL 에피토프로 이전에 알려진 에피토프(Neumeister et al. 1998).
| 에피토프 | 휴먼 소스 단백질 |
| VVSEVDIAKAD SEQ ID NO: 52 |
인터페론-유도 GTP-바인딩 단백질 Mx1(P20591) |
| RLSDAQIYV SEQ ID NO: 53 |
테트라트리코펩타이드 리피트 3를 함유한 인터페론-유도 단백질(O14879) |
| HLANIVERV SEQ ID NO: 54 |
트리파타이트 모티프-함유 단백질 22(Q8IYM9) |
| SLAEGLRRTV SEQ ID NO: 55 |
휴먼 2'-5'-올리고아데닐레이트 합성효소 3(Q9Y6K5) |
| AIHHFIEGV SEQ ID NO: 56 |
테트라트리코펩타이드 리피트 2를 함유한 휴먼 인터페론-유도 단백질(P09913) |
| KPKNPEFTSGL SEQ ID NO: 57 |
테트라트리코펩타이드 리피트 2를 함유한 휴먼 인터페론-유도 단백질(P09913) |
| KIRNFVVVF SEQ ID NO: 58 |
인터페론-유도 헬리케이즈 C 도메인-함유 단백질 1(Q9BYX4) |
| B. 퍼투시스(B. pertussis) 단백질 및 에피토프a | 존재비(copies/cell) |
| 추정 주변세포질 단백질(CAE43606)c (L)AAFIALYPNSQLAPT(A) SEQ ID NO: 59 (F)IALYPNSQLAPT(A) SEQ ID NO: 60 |
175 25 |
| 아데닐로숙시네이트 합성효소(CAE42466) (K)LAEVLDYHNFVLTQ(Y) SEQ ID NO: 61 |
10 |
| 추정 펩티도글리칸-관련 리포프로틴(NP_881875) (R)GGAEYNLALGQRRADA(V) SEQ ID N: 62 (R)GGAEYNLALGQRRA(D) SEQ ID NO: 63 |
350 10 |
| 10-kDa 샤페로닌(groES 단백질)(NP_882015) (E)KPDQGEVVAVGPGKKTEDG(K) SEQ ID NO: 64 (E)KPDQGEVVAVGPGKKTED(G) SEQ ID NO: 65 |
80 5 |
a 포괄적으로 나타내기 위해 자연적으로 프로세싱되고 표출된 에피토프에 인접한 잔기들을 괄호안에 주어진다.
b 값은 세포당 각 펩타이드의 카피수를 나타낸다.
c 어세션 번호.
a 포괄적으로 나타내기 위해 자연적으로 프로세싱되고 표출된 에피토프에 인접한 잔기들을 괄호안에 주어진다.
b 값은 세포당 각 펩타이드의 카피수를 나타낸다.
c 에피토프 리전을 나타내는 합성 펩타이드에 대해 특이적 시험관내 증식 활성에 의해 검출된 면역원성.
d 검출되지 않음.
[표 6a]
[표 6b]
[표 6c]
a R: 네스티드 에피토프 셋트의 PorA 리전
b 포괄적으로 나타내기 위해 자연적으로 프로세싱되고 표출된 에피토프에 인접한 잔기들을 괄호안에 주어지며, (-)은 단백질의 N- 또는 C-말단을 나타낸다. 두 스트레인간의 가변 잔기가 (굵은 글자체) 표시된다.
c 값은 세포당 각 펩타이드의 카피수를 나타낸다.
[표 7a]
[표 7b]
[표 7c]
a 포괄적으로 나타내기 위해 자연적으로 프로세싱되고 표출된 에피토프에 인접한 잔기들을 괄호안에 주어지며, (-)은 단백질의 N- 또는 C-말단을 나타낸다. 두 스트레인간의 가변 잔기가 (굵은 글자체) 표시된다.
b 값은 세포당 각 펩타이드의 카피수를 나타낸다.
c 어세션 번호.
[표 8a]
[표 8b]
a OMV 펄싱된 HLA-DR*1501 MDDC로부터 유래된 25%의 펩타이드 용출물에서 온란인-2차원 버전의 플랫폼 LCMS 분석에 의해 식별된 P1.5-2,10 및 FrpB 단백질의 부가적인 에피토프(이는 50%의 동일한 펩타이드 용출물의 오프-라인 제조된 SCX 분획을 사용하여서는 식별되지 않았음).
* 산화 메티오닌
| P1.7-2,41 | P1.5-1,2-21 | |
| Balb/c 마우스 | -없음2 | 리전 4 |
| C57black/6 마우스 | 리전 6 | 리전 4 + 리전 6 |
1 동물그룹은 실험 방법 II에 기재된 바와 같이 리포솜 또는 OMV에 편입된 1.5μg의 상기 나타낸 PorA로 면역화되었다.
2 마우스 스트레인에서 인식된 PorA 에피토프
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<212> PRT
<213> Bordetella pertussis
<400> 63
Gly Gly Ala Glu Tyr Asn Leu Ala Leu Gly Gln Arg Arg Ala
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<211> 16
<212> PRT
<213> Bordetella pertussis
<400> 64
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<211> 16
<212> PRT
<213> Bordetella pertussis
<400> 65
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<211> 16
<212> PRT
<213> Bordetella pertussis
<400> 66
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<213> Bordetella pertussis
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<213> Bordetella pertussis
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<213> Bordetella pertussis
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<213> Bordetella pertussis
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<213> Bordetella pertussis
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Gly
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<213> Bordetella pertussis
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<213> Neisseria meningitidis
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Gly
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<213> Neisseria meningitidis
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<213> Neisseria meningitidis
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20
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Ala
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<213> Neisseria meningitidis
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<213> Neisseria meningitidis
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<213> Neisseria meningitidis
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<213> Neisseria meningitidis
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<213> Neisseria meningitidis
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Thr
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<213> Neisseria meningitidis
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<213> Neisseria meningitidis
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20
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<213> Neisseria meningitidis
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<213> Neisseria meningitidis
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<211> 41
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<213> Neisseria meningitidis
<400> 139
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<213> Neisseria meningitidis
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<213> Neisseria meningitidis
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Gly
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<213> Neisseria meningitidis
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<213> Neisseria meningitidis
<400> 143
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<213> Neisseria meningitidis
<400> 144
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35
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<213> Neisseria meningitidis
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<213> Neisseria meningitidis
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (28)
<223> misc_feature oxidated methionine
<400> 146
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Gly Asp Asp Asp His Arg Ile Val Leu Ser His Met Lys Asp Gln His
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<210> 147
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<213> Neisseria meningitidis
<400> 147
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<213> Neisseria meningitidis
<400> 148
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<210> 149
<211> 32
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<213> Neisseria meningitidis
<400> 149
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Claims (30)
- 펌프 장치, 분석 컬럼, 전기 스프레이 이온화 유니트 및 질량 분광계를 포함하며, 상기 펌프 장치는 분석 컬럼에 나노스케일 흐름을 제공하도록 구성 및 배열되며, 상기 분석 컬럼은 액체 크로마토그래피를 위한 정지상을 포함하며, 그리고 상기 분석 컬럼은 70μm이하의 내부 직경을 가지며, 상기 전기 스프레이 이온화 유니트는 시료의 흐름 경로에서 분석 컬럼의 하향흐름에 위치한 전기 스프레이용 에미터를 포함하며, 상기 에미터는 70μm이하의 내부 직경을 가지며, 상기 질량 분광계는 상기 에미터의 하향흐름에 위치하며, 상기 에미터는 시료를 스프레이하기 위한 테이퍼드 말단(tapered end)을 포함하며, 상기 테이퍼드 말단은 전도성 1차 코팅 및 보호성 2차 코팅을 갖는 것으로 제공되는, 시료 분석용 액체 크로마토그래피-질량 스펙트로미터 장치.
- 제 1항에 있어서, 상기 분석 컬럼 및 에미터는 55μm이하의 내부 직경, 바람직하게 최대 55μm이하의 내부 직경을 갖는 것을 특징으로 하는 액체 크로마토그래피-질량 스펙트로미터 장치.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 에미터는 분석 컬럼과 일체적으로(integrally) 형성되는 것을 특징으로 하는 액체 크로마토그래피-질량 스펙트로미터 장치.
- 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 보호성 2차 코팅은 탄소, 바람직하게 탄소 시멘트를 포함하는 것을 특징으로 하는 액체 크로마토그래피-질량 스펙트로미터 장치.
- 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 보호성 2차 코팅은 실리콘 합금 또는 전기 전도성 폴리머인 것을 특징으로 하는 액체 크로마토그래피-질량 스펙트로미터 장치.
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 에미터의 테이퍼드 말단은 20μm이하의 내부 직경, 바람직하게 10μm이하의 내부 직경을 갖는 것을 특징으로 하는 액체 크로마토그래피-질량 스펙트로미터 장치.
- 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1차 코팅은 금과 같은 귀금속인 것을 특징으로 하는 액체 크로마토그래피-질량 스펙트로미터 장치.
- 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 에미터는 상기 1차 및 2차 코팅과 함께 제공된 융합 실리카를 포함하는 것을 특징으로 하는 액체 크로마토그래피-질량 스펙트로미터 장치.
- 예를 들어 액체 크로마토그래피 컬럼으로부터 시료를 받는 상향 말단 및 상기 시료를 전기 스프레이하는 테이퍼드 말단을 포함하며, 에미터는 전기 스프레이 이온화 유니트의 일부이며, 융합 실리카로부터 형성되고 최대 55μm이하의 내부 직경을 가지며, 여기서 에미터의 테이퍼드 말단은 금으로 이루어진 전도성 1차 코팅 및 2차의 전도성 탄소계 코팅을 갖는 것으로 제공되는, 나노스케일 흐름을 위한 에미터.
- 제 9항에 있어서, 상기 테이퍼드 말단 부근의 에미터의 내부 직경은 최대 10μm인 것을 특징으로 하는 에미터.
- 펌프 장치, 분석 컬럼, 전기 스프레이 이온화 유니트 및 질량 분광계를 포함하며, 상기 펌프 장치는 분석 컬럼에 나노스케일 흐름을 제공하도록 구성 및 배열되며, 상기 분석 컬럼은 액체 크로마토그래피를 위한 정지상을 포함하며, 그리고 상기 분석 컬럼은 70μm이하의 내부 직경을 가지며, 상기 전기 스프레이 이온화 유니트는 시료의 흐름 경로에서 분석 컬럼의 하향흐름에 위치한 전기 스프레이용 에미터를 포함하며, 상기 에미터는 70μm이하의 내부 직경을 가지며, 상기 질량 분광계는 상기 에미터의 하향흐름에 위치하며, 액체 크로마토그래피-질량 스펙트로미터 장치는 적어도 2-차원 크로마토그래피를 포함하며, 여기서 1차원은 적어도 강 양이온 교환(SCX)을 포함하며, 2차원은 역상 크로마토그래피를 포함하며, 여기서 용출 용매는 일반적으로 무염 용액인 것을 특징으로 하는 시료 분석용 액체 크로마토그래피-질량 스펙트로미터 장치.
- 제 11항에 있어서, 상기 무염 용액은 아세트산을 포함하는 것을 특징으로 하는 액체 크로마토그래피-질량 스펙트로미터 장치.
- 제 11항 또는 제 12항에 있어서, 상기 무염 용액은 포름산을 포함하는 것을 특징으로 하는 액체 크로마토그래피-질량 스펙트로미터 장치.
- 펌프 장치, 분석 컬럼, 전기 스프레이 이온화 유니트 및 질량 분광계를 포함하며, 상기 펌프 장치는 분석 컬럼에 나노스케일 흐름을 제공하도록 구성 및 배열되며, 상기 분석 컬럼은 70μm이하의 내부 직경을 갖는 캐버티(cavity)를 갖는 배관 요소에 의해 형성되며, 여기서 액체 크로마토그래피를 위한 정지상은 상기 캐버티에서 받아지며, 그리고 여기서 상기 전기 스프레이 이온화 유니트는 시료의 흐름 경로에서 분석 컬럼에 하향흐름에 위치한 전기 스프레이용 에미터를 포함하며, 상기 에미터는 70μm이하의 내부 직경을 가지며, 상기 질량 분광계는 상기 에미터의 하향흐름에 위치하며, 여기서 액체 크로마토그래피-질량 스펙트로미터(LCMS) 장치는 LCMS 장치의 적어도 두 배관 요소를 연결하는 연결 요소를 포함하며, 상기 배관 요소는 외부 직경과 그리고 내부 직경을 갖는 캐버티를 가지며, 여기서 상기 연결 요소는 적어도 2개의 페룰 및 상기 페룰을 받는 적어도 2개의 수신 캐버티를 포함하며, 상기 페룰은 상기 배관부를 받도록 적응된 내부 직경을 갖는 내부 캐버티를 가지며, 그리고 상기 2 페룰은 배관 요소를 일직선으로 수신 공간에 받으며, 여기서 상기 연결 요소는 상기 페룰의 내부 캐버티와 연결되고 일직선으로 맞추어진 내부 체적을 포함하며, 상기 내부 체적은 배관부의 말단을 받도록 맞추어진 내부 직경을 가지며, 배관부의 말단이 내부 체적내 접합부로 배치될 수 있는 연결 상태를 갖는 것을 특징으로 하는, 시료 분석용 액체 크로마토그래피-질량 스펙트로미터(LCMS) 장치.
- 제 14항, 또는 제 7항과 결합하여 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연결 요소는 수신 캐버티내에 페룰을 잠그기 위한 잠금 시스템을 포함하는 것을 특징으로 하는 크로마토그래피-질량 스펙트로미터 장치.
- 제 14항 또는 제 15항 또는, 제 14항과 결합하여 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내부 체적의 내부 직경과 페룰 내부 캐버티는 일반적으로 배관부의 외부 직경과 동등한 것을 특징으로 하는 크로마토그래피-질량 스펙트로미터 장치.
- 제 14항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 또는 제 14항과 결합하여 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연결 요소는 3-웨이 연결 요소인 것을 특징으로 하는 크로마토그래피-질량 스펙트로미터 장치.
- 제 17항에 있어서, 상기 3-웨이 연결 요소의 제 3 연결은 내부 체적의 출구를 형성하는 것을 특징으로 하는 크로마토그래피-질량 스펙트로미터 장치.
- 최대 55μm의 내부 직경을 갖는 내부 캐버티를 갖는 적어도 45cm 길이의 컬럼을 제공하는 단계, 상기 컬럼의 일 말단에 프릿을 제조하는 단계 및 상기 컬럼내에 적절한 액체 크로마토그래피 고상 물질을 패킹하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 컬럼은 패킹 도중에 진동되는 것을 특징으로 하는 액체 크로마토그래피 컬럼 제조 방법.
- 최대 55μm의 내부 직경을 갖는 내부 캐버티를 갖는 적어도 45cm 길이의 컬럼을 제공하는 단계, 상기 컬럼의 일 말단에 프릿을 제조하는 단계 및 상기 컬럼내에 적절한 액체 크로마토그래피 고상 물질을 패킹하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 액체 크로마토그래피 고상 물질은 저 점도 용매에 슬러리로 제공되는 것을 특징으로 하는 액체 크로마토그래피 컬럼 제조 방법.
- 제 20항에 있어서, 상기 저 점도 용매는 아세톤인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 20항 또는 제 21항에 있어서, 상기 저 점도 용매의 점도는 최대 0.35cP인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 19항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내부 직경은 최대 35μm인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 19항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컬럼은 융합 실리카 컬럼인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 8항 또는 제 11항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 정의된 장치를 에피토프의 식별 방법에 사용하는 용도.
- a) MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 에피토프 중 적어도 하나를 포함하며, 상기 에피토프는 항원 표출 세포에 의해 프로세싱 및 표출된, 시료를 제조하는 단계; 및
b) 상기 에피토프의 식별을 위해 제 1항 내지 제 8항 또는 제 11항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 정의된 장치에서 a)에서 획득된 상기 시료를 분석하는 단계
를 포함하는 에피토프 식별 방법.
- 상기 에피토프를 포함하는 분자의 화학적 합성 및 재조합 발현 중 적어도 하나를 포함하는, 제 25항 또는 제 26항에서 식별된 에피토프를 함유하는 조성물을 제조하는 방법.
- 제 25항에 정의된 용도 또는 제 26항에 정의된 방법에 의해 획득가능한 에피토프.
- 제 25항 또는 제 26항에 정의된 에피토프 또는 상기 에피토프를 포함하는 조성물을 이러한 에피토프를 운반하는 병원체에 의해 야기되는 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 백신 제조용으로 사용하는 용도.
- 제 25항 또는 제 26항에 정의된 에피토프 또는 상기 에피토프를 포함하는 조성물을 포유류의 면역 상태를 평가하기 위해 사용하는 용도.
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