KR20210131323A

KR20210131323A - 우스테키누맙 생성 방법

Info

Publication number: KR20210131323A
Application number: KR1020217024320A
Authority: KR
Inventors: 루 장
Original assignee: 모멘타 파머슈티컬스 인코포레이티드
Priority date: 2018-12-31
Filing date: 2019-12-20
Publication date: 2021-11-02
Also published as: IL284374A; EP3906257A1; BR112021012973A2; EA202191840A1; EP3906257A4; US20220033487A1; CN113474366A; MX2021008030A; US20220081479A1; CA3125443A1; WO2020142275A1; JP2022516510A; AU2019419372A1

Abstract

하나 이상의 글리칸의 목표 수준을 갖는 우스테키누맙 생성물을 제조하는 방법이 기재된다.

Description

우스테키누맙 생성 방법

관련 출원의 상호 참조

본 출원은 2018년 12월 31일자로 출원된 미국 가출원 제62/786,821호의 이익을 주장하며, 이 출원은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

서열 목록

본 출원은 ASCII 서식으로 전자적으로 출원된 서열 목록을 포함하며, 이는 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다. 2019년 12월 20일자로 생성된 상기 ASCII 사본은 파일명이 M0168PCT_SL.txt이며, 크기가 6,036 바이트이다.

치료용 항체는 중요한 부류의 치료용 생물학적 생성물이다. 항체 글리코실화 및 글리칸 조성은 항체 활성 및 이펙터 기능에 영향을 줄 수 있다. 항체 생성물의 글리칸 프로파일을 제어하기 위한 개선된 방법에 대한 지속적인 필요성이 남아 있다.

본 발명은 하나 이상의 글리칸의 목표 수준을 갖는 우스테키누맙을 생성하기(예를 들어, 제조하기) 위한 공정 레버(process lever)를 제공한다. 본 발명은 배양 배지 중의 갈락토스 농도와 배양 시간 사이의 관계가 배양물 중의 우스테키누맙의 하나 이상의 글리칸(예를 들어, 갈락토실화)의 목표 수준을 제어하기 위한 공정 레버로서 사용될 수 있다는 통찰력을 제공한다. 본 발명은 하나 이상의 글리칸(예를 들어, 갈락토실화)의 목표 수준을 제어함에 있어서 배양 시간과 배양 배지 중의 갈락토스 농도 사이의 역상관(inverse relationship)을 확인시켜 준다.

소정 태양에서, 본 발명은 하나 이상의 글리칸의 목표 수준을 갖는 우스테키누맙을 제조하는 방법을 제공한다. 그러한 방법은 우스테키누맙 시험 단백질(예를 들어, 우스테키누맙 약물 물질, 예를 들어 우스테키누맙 약물 물질의 제제, 예를 들어 시험 우스테키누맙 약물 물질의 배치(batch))을 제공하는(예를 들어, 생성하는, 발현하는(예를 들어, 소규모 또는 대규모 세포 배양 중에서), 그리고/또는 제조하는), 또는 입수하는(예를 들어, 제3자(계약상 관련된 제3자 또는 계약상 관련되지 않은(예를 들어, 독립적인) 제3자를 포함함)로부터 제공받는 그리고/또는 구매하는) 단계를 포함할 수 있다.

일부 경우에, 본 발명은 하나 이상의 글리칸의 목표 수준을 갖는 우스테키누맙을 포함하는 약제학적 조성물을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 갈락토스의 수준 및 세포 배양 시간을 선택하는 단계로서, 상기 갈락토스의 수준 및 상기 시간은 역상관되는, 상기 단계; 상기 갈락토스의 선택된 수준 및 시간을 포함하는 조건 하에서 우스테키누맙을 발현하도록 유전자 조작된 세포들의 집단을 배양하는 단계; 상기 세포들의 집단에 의해 발현되는 우스테키누맙을 수집함으로써, 우스테키누맙 제제를 생성하는 단계; 및 상기 우스테키누맙 제제가 상기 하나 이상의 글리칸의 목표 수준을 충족한다면, 상기 우스테키누맙 제제를 정제, 농축, 및/또는 제형화하여 우스테키누맙을 포함하는 약제학적 조성물을 생성하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 글리칸의 목표 수준은 G0F, 시알화 글리칸, 및 G2F로 이루어진 군으로부터 선택되는 글리칸의 목표 수준이다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 글리칸의 목표 수준은 G0F의 목표 수준이다.

일부 경우에, 본 발명은 G0F 글리칸의 목표 수준을 갖는 우스테키누맙을 포함하는 약제학적 조성물을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 G0F 글리칸의 목표 수준을 선택하는 단계; 갈락토스의 수준을 선택하고, 상기 G0F의 선택된 목표 수준을 제공하도록 세포 배양 시간을 선택하는 단계로서, 상기 갈락토스의 수준 및 상기 시간은 역상관되는, 상기 단계; 상기 갈락토스의 선택된 수준 및 시간을 포함하는 조건 하에서 우스테키누맙을 발현하도록 유전자 조작된 세포들의 집단을 배양하는 단계; 상기 세포들의 집단에 의해 발현되는 우스테키누맙을 수집함으로써, 우스테키누맙 제제를 생성하는 단계; 및 상기 우스테키누맙 제제가 상기 G0F 글리칸의 목표 수준을 충족한다면, 상기 우스테키누맙 제제를 정제, 농축, 및/또는 제형화하여 우스테키누맙을 포함하는 약제학적 조성물을 생성하는 단계를 포함한다.

일부 경우에, 본 발명은 하나 이상의 글리칸의 목표 수준을 갖는 우스테키누맙 약물 제품을 생성하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 조건 하에서 우스테키누맙을 발현하도록 유전자 조작된 세포들의 집단을 배양하는 단계로서, 상기 조건은 갈락토스의 선택된 수준 및 세포 배양 시간을 포함한 파라미터에 의해 특징지어지고, 상기 갈락토스의 수준 및 상기 시간은 역상관되는, 단계; 상기 세포에 의해 발현되는 우스테키누맙을 수집함으로써, 우스테키누맙 제제를 생성하는 단계; 및 상기 우스테키누맙 제제가 상기 하나 이상의 글리칸의 목표 수준을 충족한다면, 상기 우스테키누맙 제제를 정제, 농축, 및/또는 제형화하여 우스테키누맙 약물 제품을 생성하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 글리칸의 목표 수준은 G0F, 시알화 글리칸, 및 G2F로 이루어진 군으로부터 선택되는 글리칸의 목표 수준이다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 글리칸의 목표 수준은 G0F의 목표 수준이다.

일부 실시 형태에서, 제공된 방법은 우스테키누맙을 발현하도록 유전자 조작된 포유류 세포들의 집단을 배양하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 포유류 세포는 CHO 세포, HEK 293 세포, 섬유육종 HT 1080 세포, PER.C6 세포, CAP 세포, HKB-11 세포, HuH-7 세포, NS0 세포 및 SP 2/0 세포로부터 선택된다.

일부 실시 형태에서, 제공된 방법에서, 배양하는 단계는 연속 배양 공정을 사용하여 수행된다. 일부 실시 형태에서, 제공된 방법은 관류(perfusion) 배양 공정(예를 들어, 교번 접선 유동 필터(alternating tangential flow filter, ATF)-기반 관류 배양 공정)을 사용하여 수행되는 배양을 포함한다. 일부 소정 실시 형태에서, 제공된 방법은 관류 배양 공정에 의해 우스테키누맙을 발현하도록 유전자 조작된 포유류 세포(예를 들어, 우스테키누맙을 발현하는 SP 2/0 세포)를 배양하는 단계를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 제공된 방법은 세포들에 의해 발현되는 우스테키누맙을 세포 배양 시간 범위 이내에서 2회 이상 수집하는 단계를 포함한다.

일부 실시 형태에서, G0F 글리칸의 목표 수준은 총 글리칸에 대해 20% 내지 80% G0F의 범위 이내이다. 일부 실시 형태에서, G0F 글리칸의 목표 수준은 총 글리칸에 대해 25% 내지 65% G0F의 범위 이내이다.

일부 실시 형태에서, 제공된 방법은 G0F 글리칸의 목표 수준이 총 글리칸에 대해 20% 내지 최대 40% G0F의 범위 이내인 우스테키누맙을 제조 및/또는 생성하는 것에 관한 것이다. 일부 실시 형태에서, G0F 글리칸의 목표 수준이 총 글리칸에 대해 20% 내지 최대 40% G0F의 범위 이내인 우스테키누맙을 달성하기 위한 방법은 갈락토스의 선택된 수준이 0 mM이고, 세포 배양 시간이 7일 내지 15일 범위 이내인 것을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 제공된 방법은 G0F 글리칸의 목표 수준이 총 글리칸에 대해 40% 내지 80% G0F의 범위 이내인 우스테키누맙을 제조 및/또는 생성하는 것에 관한 것이다. 일부 실시 형태에서, G0F 글리칸의 목표 수준이 총 글리칸에 대해 40% 내지 80% G0F의 범위 이내인 우스테키누맙을 달성하기 위한 방법은 갈락토스의 선택된 수준이 15 mM 내지 30 mM 범위 이내이고, 세포 배양 시간이 16일 내지 60일 범위 이내인 것을 포함한다. 일부 소정 실시 형태에서, 세포 배양 시간이 25일 내지 42일 범위 이내이다.

일부 실시 형태에서, 제공된 방법은 G0F 글리칸의 목표 수준을 선택하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, G0F 글리칸의 목표 수준은 총 글리칸에 대해 20% 내지 80% G0F의 범위 이내이다. 일부 소정 실시 형태에서, G0F 글리칸의 목표 수준이 총 글리칸에 대해 20% 내지 최대 40% G0F의 범위 이내인 경우, 상기 방법은 갈락토스의 선택된 수준이 0 mM이고, 세포 배양 시간이 7일 내지 15일 범위 이내인 것을 포함한다. 일부 소정 실시 형태에서, G0F 글리칸의 목표 수준이 총 글리칸에 대해 40% 내지 80% G0F의 범위 이내인 경우, 상기 방법은 갈락토스의 선택된 수준이 15 mM 내지 30 mM 범위 이내이고, 세포 배양 시간이 16일 내지 60일 범위 이내인 것을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 제공된 방법에서, 갈락토스의 선택된 수준은 배양 단계 전체에 걸쳐 제어된다(예를 들어, t = 0부터 수집될 때까지 배양 동안 제어된다).

일부 실시 형태에서, 제공된 방법은 G0F 글리칸의 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, G0F 글리칸의 측정된 수준이 총 글리칸에 대해 20% 내지 80% G0F 범위 이내(예를 들어, 총 글리칸에 대해 20% 내지 최대 40% G0F 범위 이내, 예를 들어 총 글리칸에 대한 40% 내지 80% G0F 범위 이내)라면, 우스테키누맙 제제를 정제, 농축, 및/또는 제형화하는 단계가 수행된다.

본 발명의 이들 및 다른 태양이 하기에 그리고 청구범위에 더 상세히 기재되어 있다.

하기 도면들로 구성된 본 명세서에 포함된 도면은 단지 예시 목적을 위한 것이며 제한하기 위한 것이 아니다.
도 1은 우스테키누맙의 다양한 제제 및 공급원의 글리칸 프로파일들의 비교를 나타낸다. 상부 좌측 패널에 G0F 글리칸의 풍부도가 제공되어 있고; 상부 우측 패널에 G1F-A 글리칸의 풍부도가 제공되어 있고; 하부 좌측 패널에 G1F-B 글리칸의 풍부도가 제공되어 있고; 전체 시알화가 하부 우측 패널에 제공되어 있다. 채워진 원은 미국(검정색으로 채워진 원) 및 유럽(음영처리된 채워진 원)으로부터의 참조 단백질 생성물("RPP")을 나타낸다. 각각의 패널의 최우측 부분에 있는 기호는 상이한 부피로 배양된 우스테키누맙 시험 제제를 나타낸다. 음영처리된 채워진 정사각형은 3 L로 배양된 샘플을 나타내고, 빈 정사각형은 위성 배양으로부터의 샘플을 나타내고, 채워진 삼각형은 100 L로 배양된 샘플을 나타내고, 채워진 다이아몬드는 250 L로 배양된 샘플을 나타낸다. 각각의 글리칸의 상대 풍부도가 그의 각각의 패널에 나타나 있으며, 이때 각각의 패널에 나타낸 샘플들은 좌측에서 우측으로 x-축을 따라 놓여 있는 다음 4개의 군으로 분류되어 있다: 90 mg/ml의 참조 샘플로부터의 군 1 RPP(최좌측), 90 mg/ml의 참조 샘플로부터의 군 2 RPP(좌측으로부터 두 번째), 5 mg/mL RPP(좌측으로부터 세 번째), 및 우스테키누맙 시험 생성물(최우측).
도 2는 수집 지속시간에 따른 G0F 글리칸 프로파일 변동을 나타낸다. 최좌측 컬럼(백색)은 군 1 RPP G0F 풍부도를 나타내고, 좌측으로부터 두 번째 컬럼(흑색)은 군 2 RPP G0F 풍부도를 나타내고, 좌측으로부터 세 번째 컬럼은 7일 내지 42일 사이에 배양된 샘플로부터의 G0F의 평균 풍부도를 나타낸다. 음영처리된 컬럼(좌측으로부터 네 번째 컬럼에서 시작하여 최우측 컬럼까지 계속됨)은 각각 7일(D7) 내지 최대 42일(D42, 최우측 컬럼)의 범위 이내에서 지시된 일수 동안 배양된 샘플로부터의 G0F 풍부도를 나타낸다.
도 3은 다양한 배양 조건들 사이의 주 글리칸 프로파일 및 전하 변이체의 비교를 나타낸다. 좌측으로부터 우측으로 각각의 패널의 x-축을 따라 다음과 같이 놓여 있다: 군 1 RPP(최좌측), 군 2 RPP, 3 L DS로 배양된 우스테키누맙, 100 L DS로 배양된 우스테키누맙, 250 L DS로 배양된 우스테키누맙, NCM-2 우스테키누맙 제제, 및 NCM-1 우스테키누맙 제제(최우측).
소정 정의
일반적으로, 본 명세서에 사용되는 용어는 명백히 달리 지시되지 않는 한 당업계에서 이해되는 그의 의미에 따른다. 소정의 용어의 명시적인 정의가 하기에 제공되며; 본 명세서 전체에 걸쳐 특정 경우에 이들 및 다른 용어의 의미가 문맥으로부터 당업자에게 명백할 것이다.
본 발명이 더 용이하게 이해될 수 있도록 하기 위하여, 소정의 용어가 하기에 먼저 정의된다. 하기의 용어 및 다른 용어에 대한 추가적인 정의가 본 명세서 전체에 걸쳐 기재된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 하나 이상의 관심 값에 적용될 때, 용어 "약" 또는 "대략"은 언급된 참조값과 유사한 값을 지칭한다. 소정 실시 형태에서, 용어 "약" 또는 "대략"은 언급된 참조값의 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 그보다 작은 값 이내에 있는 값들의 범위를 지칭한다.
우스테키누맙의 하나 이상의 글리칸(예를 들어, 갈락토스, 예를 들어 G0F)의 목표 수준을 제어하는 것과 관련하여 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "제어, 제어되는, 제어하는"은 우스테키누맙의 생성을 위한 하나 이상의 배양 조건을 선택, 유지 및/또는 조정하는 것을 의미한다. 조정은 우스테키누맙의 생성을 위한 하나 이상의 배양 조건을 증가 또는 감소시키는 것을 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 하나 이상의 글리칸의 제어된 목표 수준은 최소한의 제품 변동을 갖는 하나 이상의 글리칸의 원하는 수준을 갖는 우스테키누맙의 생성에 관한 것이다. 일부 실시 형태에서, G0F의 제어된 목표 수준은 동일한 생성 실시 및/또는 배치에서 샘플들 사이에서 20%, 15%, 10%, 또는 5% 이하로 변동될 것이다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 글리칸의 목표 수준을 제어하는 것은 우스테키누맙의 생성에 있어서 일관성(예를 들어, 임의의 특정 생성 공정으로부터의 샘플들 전체에 걸친 일관성, 배치별 일관성)을 보장한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "글리칸"은 적어도 하나의 당 잔기(예를 들어, 단당)를 포함하는 화합물을 지칭한다. 글리칸은 당 잔기의 단량체 또는 중합체일 수 있으며, 선형 또는 분지형일 수 있다. 글리칸은 천연 당 잔기(예를 들어, 글루코스, N-아세틸글루코사민, N-아세틸 뉴라민산, 갈락토스, 만노스, 푸코스, 헥소스, 아라비노스, 리보스, 자일로스 등) 및/또는 변형된 당(예를 들어, 2'-플루오로리보스, 2'-데옥시리보스, 포스포만노스, 6'-설포 N-아세틸글루코사민 등)을 포함할 수 있다. 용어 글리칸은 당 잔기의 동종중합체 및 이종중합체를 포함한다. 용어 "글리칸"은 또한 당접합체(예를 들어, 당단백질, 당지질, 프로테오글리칸 등)의 글리칸 성분을 포함한다. 이 용어는 또한 유리 글리칸을 포함하는데, 이에는 당접합체로부터 절단되었거나 달리 방출된 글리칸이 포함된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "갈락토실화 글리칸"은 적어도 하나의 갈락토스 당 잔기를 포함하는 글리칸을 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 갈락토실화 글리칸은 G1, G2, G1F, G2F, A1, 및/또는 A2 글리칸이다. 비-갈락토실화 글리칸은 G0F 또는 G0을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 갈락토실화 글리칸의 목표 수준은 갈락토실화 글리칸(예를 들어, G2F)의 존재 및/또는 비-갈락토실화 글리칸(예를 들어, G0F)의 목표 수준을 지칭할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "단리된"은 (1) (자연에서든 그리고/또는 실험 환경에서든 어느 곳이든 간에) 초기에 생성되었을 때 그것이 회합되었던 성분들 중 적어도 일부로부터 분리되었고/되었거나, (2) 사람의 손에 의해 설계, 생성, 조제, 및/또는 제조된 물질 및/또는 실체(entity)를 지칭한다. 단리된 물질 및/또는 실체는 이들이 초기에 회합되었던 다른 성분들과 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 99% 초과로 분리될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 단리된 작용제(isolated agent)는 순도가 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 99% 초과이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 물질은 그것에 다른 성분들이 실질적으로 없는 경우 "순수"하다. 일부 실시 형태에서, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 물질은, 예를 들어 하나 이상의 담체 또는 부형제(예를 들어, 완충제, 용매, 물 등)와 같은 소정의 다른 성분들과 배합된 후에도, 여전히 "단리된" 또는 심지어 "순수한" 것으로 간주될 수 있으며; 그러한 실시 형태에서, 물질의 % 단리 또는 순도는 그러한 담체 또는 부형제를 포함하지 않고서 계산된다. 그러나 하나의 예를 제공하기 위하여, 일부 실시 형태에서, 자연에서 발생하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 같은 생물학적 중합체는, a) 그의 기원 또는 유래의 공급원에 의해, 자연에서 그의 천연 상태에서 그와 동반되는 성분들 중 일부 또는 전부와 회합되지 않을 때, b) 그것에 자연에서 그것을 생성하는 종으로부터의 동일한 종의 다른 폴리펩티드 또는 핵산이 실질적으로 없을 때, c) 자연에서 그것을 생성하는 종을 갖지 않는 세포 또는 다른 발현 시스템으로부터의 성분들에 의해 발현되거나 또는 달리 그와 관련될 때, "단리된" 것으로 간주된다. 따라서, 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 화학적으로 합성되거나, 자연에서 그것을 생성하는 것과 상이한 세포 시스템 내에서 합성되는 폴리펩티드는 "단리된" 폴리펩티드인 것으로 간주된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 정제 기법을 거친 폴리펩티드는 a) 그것이 자연에서 회합되는, 그리고/또는 b) 그것이 초기에 생성되었을 때 회합되었던 다른 성분들과 분리된 것이라는 한에 있어서 "단리된" 폴리펩티드인 것으로 간주될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "공정 레버"는 항체 생성물 상의 하나 이상의 글리칸의 풍부도를 증가 또는 감소시키기 위하여 제어될 수 있는 배양 공정의 요소(예를 들어, 하나 이상의 배양 조건)를 지칭한다. 본 발명은 배양 배지 중의 갈락토스 농도와 배양 시간 사이의 지정된 관계인 신규한 공정 레버를 제공한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 배양 배지 중의 갈락토스 농도와 배양 배지 중에서의 배양 시간 사이의 역상관이 하나 이상의 글리칸(예를 들어, 갈락토실화)의 목표 수준을 갖는 우스테키누맙을 생성하기 위한 공정 레버로서 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 공정 레버는 우스테키누맙의 하나 이상의 글리칸(예를 들어, 갈락토실화, 예를 들어 G0F)의 수준(예를 들어, 우스테키누맙 배양물 또는 제제 중의 하나 이상의 글리칸의 수준)을 제어하기 위하여 갈락토스의 선택된 수준 및 세포 배양 시간을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "Fc 영역의 N-글리코실화 부위"는 글리칸이 N-연결된 Fc 영역 내의 아미노산 잔기를 지칭한다. 일부 소정 실시 형태에서, 우스테키누맙의 N-글리코실화 부위는 중쇄 내의 위치 Asn299에 위치한다.
일반적으로, 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "단백질"은 폴리펩티드(즉, 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 적어도 2개의 아미노산의 스트링)이다. 단백질은 아미노산 이외의 모이어티(moiety)를 포함할 수 있고/있거나(예를 들어, 당단백질일 수 있음), 달리 가공되거나 변형될 수 있다. 당업자는 "단백질"이 (신호 서열을 갖거나 갖지 않는) 세포에 의해 생성된 바와 같은 완전한 폴리펩티드 사슬일 수 있거나, 또는 그의 기능적 부분일 수 있음을 이해할 것이다. 당업자는 단백질이 때때로, 예를 들어 하나 이상의 이황화물 결합에 의해 연결되거나 다른 수단에 의해 회합된 하나 초과의 폴리펩티드 사슬을 포함할 수 있음을 추가로 이해할 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "회수"는, 예를 들어, 이를 테면 당업계에 알려진 정제 기법을 사용하여 단리함으로써, 작용제 또는 실체에 다른 이전에 회합된 성분들이 실질적으로 없게 하는 공정을 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 작용제 또는 실체는 천연 공급원 및/또는 세포를 포함하는 공급원으로부터 회수된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "샘플(들)"은 개별적으로 입수된 샘플을 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 개별적인 샘플들의 평가는 동일한 배양 실시로부터(예를 들어, 제조 동안 상이한 시점에서) 또는 상이한 배양 실시(예를 들어, 상이한 배양 라운드)로부터의 샘플의 평가를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "목표값 또는 목표 수준"은 갈락토실화 글리칸 및/또는 시알화 글리칸과 같은 하나 이상의 특정 글리칸의 미리 결정된 수준을 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 목표값은 참조 우스테키누맙 생성물 내에 존재하거나 또는 의약품에 대한 사양서 또는 마스터 배치 기록서(master batch record)에 기재된, 갈락토실화 글리칸(예를 들어, G0, G1, G2, G0F, G1F, G2F 또는 조합) 및/또는 시알화 글리칸(예를 들어, 모노시알화, 다이시알화, 또는 조합)과 같은 하나 이상의 특정 글리칸의 수준이다. 일부 소정 실시 형태에서, 목표값은 우스테키누맙 생성물 내의 G0F 글리칸의 수준이다.
일부 실시 형태에서, 목표값은 우스테키누맙 제제 내의 하나 이상의 글리칸(예를 들어, 갈락토실화 글리칸(예를 들어, 갈락토실화 글리칸의 하나 이상의 종) 및/또는 시알화 글리칸(예를 들어, 시알화 글리칸의 하나 이상의 종))의 절대 수준(예를 들어, 몰수)을 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 목표값은 우스테키누맙 제제 내의 글리칸의 총 수준에 대한 우스테키누맙 제제 내의 하나 이상의 글리칸(예를 들어, 갈락토실화 글리칸(예를 들어, 갈락토실화 글리칸의 하나 이상의 종) 및/또는 시알화 글리칸(예를 들어, 시알화 글리칸의 하나 이상의 종))의 수준을 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 목표값은 "%"로서 표현되며, 이는 우스테키누맙 제제 내의 글리칸(예를 들어, Fc 글리칸)의 총 몰수에 대한 하나 이상의 글리칸(예를 들어, Fc 글리칸)의 몰수를 지칭한다. 일부 실시 형태에서, "%"는 검출된 PNGase F-방출된 Fc 글리칸의 총 몰수에 대한 하나 이상의 PNGase F-방출된 Fc 글리칸의 몰수를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "우스테키누맙 제제"는 특정 생성 방법에 따라 얻어진 우스테키누맙 단백질들의 혼합물을 지칭한다. 우스테키누맙 제제 내의 우스테키누맙 단백질들은 다수의 우스테키누맙 카피(즉, 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가짐)를 포함하지만, 그러한 단백질과 관련된 글리칸들의 혼합물을 갖는다. 일부 경우에, 우스테키누맙 제제는 본 명세서에 제공된 바와 같은 방법 및/또는 시스템을 사용하여 제조된다. 생성 방법은 우스테키누맙을 발현하도록(또는 관련 수준으로 또는 관련 조건 하에서 우스테키누맙을 발현하도록) 조작된 배양된 세포들을 사용하는 재조합 제조 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 생성 방법은 우스테키누맙을 조작된 세포의 소정의 성분들로부터 (예를 들어, 세포를 용해시키고 원심분리에 의해 단백질 성분을 펠릿화함으로써) 단리하는 단리 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 생성 방법은 또한, 우스테키누맙을 다른 세포 성분들, 예를 들어 이전 단계에서 사용되었던 다른 단백질들 또는 유기 성분들로부터 (예를 들어, 크로마토그래피에 의해) 분리하는 정제 단계를 포함할 수 있다. 이들 단계는 비제한적이며, 임의의 수의 추가의 생성 단계가 포함될 수 있음이 이해될 것이다. 상이한 우스테키누맙 제제들이 동일한 생성 방법에 의해, 그러나 상이한 경우(예를 들어, 상이한 실시 또는 제조)에 제조될 수 있다. 대안적으로, 상이한 우스테키누맙 제제들이 상이한 생성 방법에 의해 제조될 수 있다. 2가지의 생성 방법은 임의의 방식(예를 들어, 발현 벡터, 조작된 세포 유형, 배양 조건, 단리 절차, 정제 조건 등)으로 상이할 수 있다.
특허, 특허 출원, 물품, 책, 논문, 및 웹페이지를 포함하지만 이들로 제한되지 않는, 본 출원에 인용된 모든 문헌 및 유사한 재료는, 그러한 문헌 및 유사한 재료들의 형식과는 관계 없이, 그들 전체가 명백히 참고로 포함된다. 포함된 문헌 및 유사한 재료들 중 하나 이상이, 정의된 용어들, 용어 사용, 기재된 기법들 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는 본 출원과 상이하거나 그에 모순되는 경우에, 본 출원이 우선한다. 본 명세서에 사용되는 섹션 제목은 단지 체계적인 목적을 위한 것이며, 설명된 발명 요지를 어떠한 방식으로든 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

소정 실시 형태의 상세한 설명

본 발명은 하나 이상의 글리칸(예를 들어, 갈락토실화, 예를 들어 G0F 글리칸)의 목표 수준을 갖는 우스테키누맙을 생성하기 위한 공정 레버의 발견을 적어도 부분적으로 기술한다. 항체 생성 동안 글리칸 조성 및 수준을 제어하는 것은 끊임없는 난제이다. 치료용 항체의 글리코실화는 그의 안전성 및/또는 효능에 영향을 줄 수 있다. (문헌[Zhang et al. (2016) Drug Discovery Today 21(5): 740-765]). 따라서, 우스테키누맙의 생성에 있어서 글리칸 조성의 일관성(예를 들어, 임의의 특정 생성 공정으로부터의 샘플들 전체에 걸친 일관성, 배치별 일관성)을 보장할 수 있는 것이 중요하다. 우스테키누맙 참조 단백질 생성물("RPP")의 특성화 동안, 우스테키누맙 RPP의 2개의 별개의 글리칸 집단이 관찰되었다.

본 발명은 우스테키누맙의 제조 동안 글리칸 조성을 제어하기 위한 레버의 개발을 기술한다. 확인된 RPP 글리칸 프로파일 각각을 포함하는, 특정 글리칸들의 목표 수준을 갖는 우스테키누맙을 생성하기 위한 공정 레버가 본 명세서에 기술되어 있다. 기재된 바와 같은 레버를 개발하는 과정에서, 본 발명은 배양 배지 중의 갈락토스 농도 및 배양 시간 사이의 관계를 확인하였다. 본 발명은 배양 배지 중의 갈락토스 농도와 배양(예를 들어, 연속 배양) 시간 사이의 관계가 배양물 중의 우스테키누맙의 하나 이상의 글리칸(예를 들어, 갈락토실화)의 목표 수준을 제어하기 위한 공정 레버로서 사용될 수 있다는 통찰력을 제공한다.

본 발명은, 글리칸 수준(예를 들어, 갈락토실화)의 제어를 위하여, 갈락토스의 수준과 시간(즉, 배양 지속시간) 사이의 관계가 역상관된다는 통찰력을 추가로 제공한다. 글리칸 조성을 제어하기 위한 본 발명의 배양 방법은 연속 배양 방법(예를 들어, 관류 배양)을 포함한다.

우스테키누맙

본 발명은 특정 글리칸 프로파일을 갖는 우스테키누맙을 제조, 조제, 제어 또는 달리 생성하기 위한 방법 및 공정을 부분적으로 제공한다.

우스테키누맙은 IL-12 및 IL-23 둘 모두의 p-40 하위단위에 특이적으로 결합하는 항체이다. 우스테키누맙은 건선, 건선성 관절염, 크론병 및 다발성 경화증을 포함한 다수의 인간 질병에서 연구되어 왔다.

일부 실시 형태에서, 우스테키누맙은 서열 번호 1에 제시된 바와 같은 HCDR 서열과 3개 이하의 아미노산 잔기만큼 상이한 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 서열 번호 2에 제시된 바와 같은 LCDR 서열과 3개 이하의 아미노산 잔기만큼 상이한 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 우스테키누맙은 서열 번호 1에 제시된 바와 같은 HCDR 서열과 2개 이하의 아미노산 잔기만큼 또는 1개 이하의 아미노산 잔기만큼 상이한 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 서열 번호 2에 제시된 바와 같은 LCDR 서열과 2개 이하의 아미노산 잔기만큼 또는 1개 이하의 아미노산 잔기만큼 상이한 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 우스테키누맙은 서열 번호 1에 제시된 바와 같은 서열과 3개 이하의 아미노산 잔기만큼 상이한 중쇄 가변 도메인, 및 서열 번호 2에 제시된 바와 같은 서열과 3개 이하의 아미노산 잔기만큼 상이한 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 우스테키누맙은 서열 번호 1에 제시된 바와 같은 서열과 5개 이하의 아미노산만큼 상이한 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열 번호 2의 서열과 5개 이하의 아미노산 잔기만큼 상이한 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 우스테키누맙은 서열 번호 1에 제시된 바와 같은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 서열 번호 2에 제시된 바와 같은 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 우스테키누맙은 서열 번호 1에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 도메인, 및 서열 번호 2에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 우스테키누맙은 서열 번호 1의 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 서열 번호 2의 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.

서열 번호 1 - 우스테키누맙 중쇄 서열(볼드체는 밑줄친 CDR 서열을 갖는 가변 도메인 서열을 나타냄)

서열 번호 2 - 우스테키누맙 경쇄 서열(볼드체는 밑줄친 CDR 서열을 갖는 가변 도메인 서열을 나타냄)

배양 방법

일부 실시 형태에서, 제공된 방법은 G0F 글리칸의 목표 수준을 선택하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, G0F 글리칸의 목표 수준은 총 글리칸에 대해 20% 내지 80% G0F의 범위 이내이다. 일부 소정 실시 형태에서, G0F 글리칸의 목표 수준이 총 글리칸에 대해 20% 내지 최대 40% G0F의 범위 이내인 경우, 상기 방법은 갈락토스의 선택된 수준이 0 mM이고, 세포 배양 시간이 7일 내지 15일 범위 이내인 것을 포함한다. 일부 소정 실시 형태에서, G0F 글리칸의 목표 수준이 총 글리칸에 대해 40% 내지 80% G0F의 범위 이내인 경우, 상기 방법은 갈락토스의 선택된 수준이 15 mM 내지 30 mM 범위 이내이고, 세포 배양 시간이 16일 내지 60일 범위 이내인 것을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 목표 글리칸 수준을 갖는 우스테키누맙을 제조 및/또는 생성하기 위한 제공된 방법은 시알화 글리칸 및/또는 G2F 글리칸의 목표 수준을 포함한다. 시알화 글리칸 및/또는 G2F 글리칸의 목표 수준을 갖는 우스테키누맙에 대한 조건이 하기 표 1에 제공되어 있다.

[표 1]

일부 실시 형태에서, 제공된 방법은 시알화 글리칸의 목표 수준이 총 글리칸에 대해 15% 내지 30% 시알화 글리칸의 범위 이내인 우스테키누맙을 제조 및/또는 생성하는 것에 관한 것이다. 일부 실시 형태에서, 시알화 글리칸의 목표 수준이 총 글리칸에 대해 15% 내지 30% 시알화 글리칸의 범위 이내인 우스테키누맙을 달성하기 위한 방법은 갈락토스의 선택된 수준이 0 mM이고, 세포 배양 시간이 7일 내지 15일 범위 이내인 것을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 제공된 방법은 시알화 글리칸의 목표 수준이 총 글리칸에 대해 5% 내지 최대 15% 시알화 글리칸의 범위 이내인 우스테키누맙을 제조 및/또는 생성하는 것에 관한 것이다. 일부 실시 형태에서, G0F 글리칸의 목표 수준이 총 글리칸에 대해 5% 내지 최대 15% 시알화 글리칸의 범위 이내인 우스테키누맙을 달성하기 위한 방법은 갈락토스의 선택된 수준이 15 mM 내지 30 mM 범위 이내이고, 세포 배양 시간이 16일 내지 60일 범위 이내인 것을 포함한다. 일부 소정 실시 형태에서, 세포 배양 시간이 25일 내지 42일 범위 이내이다.

일부 실시 형태에서, 제공된 방법은 G2F 글리칸의 목표 수준이 총 글리칸에 대해 5% 내지 10% G2F의 범위 이내인 우스테키누맙을 제조 및/또는 생성하는 것에 관한 것이다. 일부 실시 형태에서, G2F 글리칸의 목표 수준이 총 글리칸에 대해 5% 내지 10% G2F의 범위 이내인 우스테키누맙을 달성하기 위한 방법은 갈락토스의 선택된 수준이 0 mM이고, 세포 배양 시간이 7일 내지 15일 범위 이내인 것을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 제공된 방법은 G2F 글리칸의 목표 수준이 총 글리칸에 대해 1% 내지 최대 5% G0F의 범위 이내인 우스테키누맙을 제조 및/또는 생성하는 것에 관한 것이다. 일부 실시 형태에서, G2F 글리칸의 목표 수준이 총 글리칸에 대해 1% 내지 최대 5% G2F의 범위 이내인 우스테키누맙을 달성하기 위한 방법은 갈락토스의 선택된 수준이 15 mM 내지 30 mM 범위 이내이고, 세포 배양 시간이 16일 내지 60일 범위 이내인 것을 포함한다. 일부 소정 실시 형태에서, 세포 배양 시간이 25일 내지 42일 범위 이내이다.

일부 실시 형태에서, 제공된 방법에서, 배양하는 단계는 연속 배양 공정을 사용하여 수행된다. 일부 실시 형태에서, 제공된 방법은 관류 배양 공정(예를 들어, 교번 접선 유동 필터(ATF)-기반 관류 배양 공정)을 사용하여 수행되는 배양을 포함한다. 일부 소정 실시 형태에서, 제공된 방법은 관류 배양 공정에 의해 우스테키누맙을 발현하도록 유전자 조작된 포유류 세포(예를 들어, 우스테키누맙을 발현하는 SP 2/0 세포)를 배양하는 단계를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 목표값은 미리 결정된 의약품 사양서 또는 약제학적 제제에 대한 품질 제어 기준, 예를 들어 분석 증명서(Certificate of Analysis, CofA), 시험 증명서(Certificate of Testing, CofT), 또는 마스터 배치 기록서이다. 일부 실시 형태에서, 제품 사양서는 FDA 라벨, 의사 인서트, USP 모노그래프, 또는 EP 모노그래프에서의 제품 설명이다.

일반적으로, 본 발명의 세포 배양 방법은 25℃ 내지 40℃의 범위 이내의 온도에서 그리고 지구상에서 접하게 되는 바와 같은 중력을 이용하여 배양하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 세포 집단을 배양하는 제공된 방법은 우스테키누맙 생성물의 발현에 충분하다. 세포 배양 배지는 일반적으로 적절한 에너지원 및 세포 주기를 조절하는 화합물을 포함한다. 일반적으로, 배양 배지는, 예를 들어 아미노산, 비타민, 무기 염, 및 글루코스를 포함하며, 이는 당업자에게 알려져 있다. 일부 실시 형태에서, 세포 배양 배지는 pH가 6 내지 8이다. 동물 세포 배양을 위한 배지는 당업계에 잘 확립되어 있으며, 특정 목적 및/또는 세포 유형에 대해 당업자에 의해 일상적으로 최적화된다.

일부 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 연속 세포 배양 시스템(예를 들어, 관류 세포 배양 시스템)을 통해 세포 집단을 배양하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 연속 세포 배양 시스템은 생물반응기 탱크 및 세포 체류 장치를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 연속 세포 배양 시스템은 생물반응기 탱크, 세포 체류 장치, 배지 공급장치 및 방출(bleed) 폐기물 수집장치를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 연속 세포 배양 시스템은 세포 집단(예를 들어, 우스테키누맙을 발현하도록 조작된 세포 집단, 예를 들어 우스테키누맙을 발현하도록 조작된 세포들로 이루어진 세포 집단) 및 세포 배양 배지를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 세포 체류 장치는 연속 원심분리기, 교번 접선 유동 필터(ATF), 접선 유동 막 필터(TFF), 동적 필터, 스핀-필터, 초음파 및 이중 전기영동 분리기, 또는 중력 침강기이거나 이를 포함한다. 일부 소정 실시 형태에서, 세포 체류 장치는 ATF이거나 이를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 생물반응기 시스템은 교반-탱크형 생물반응기, 세포 체류 장치, 배지 공급장치 및 방출 폐기물 수집장치를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 생물반응기 시스템(예를 들어, 관류 생물반응기 시스템)은 스파저(sparger)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 생물반응기 시스템은 드릴 구멍(drilled hole) 스파저를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 생물반응기 시스템은 개방 파이프 스파저를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 생물반응기 시스템은 소결된 스파저를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 세포 집단(예를 들어, 우스테키누맙을 발현하도록 조작된 세포 집단, 예를 들어 우스테키누맙을 발현하도록 조작된 세포들로 이루어진 세포 집단)을 1 L 내지 3000 L 범위 이내의 부피로 배양하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제공된 방법은 우스테키누맙을 발현하도록 유전자 조작된 포유류 세포를 적어도 25 L, 50 L, 100 L, 200 L, 250 L, 400 L, 500 L, 600 L, 800 L, 1000 L, 또는 2000 L의 부피로 배양하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제공된 방법은 우스테키누맙을 발현하도록 유전자 조작된 포유류 세포를 약 25 L 내지 약 250 L의 부피로 배양하는 단계를 포함한다.

글리칸 평가

일부 실시 형태에서, 우스테키누맙의 글리칸은 임의의 이용가능한 적합한 방법에 의해 분석된다(예를 들어, 측정된다). 일부 경우에, 본 명세서에 기재된 바와 같은 글리칸 구조 및 조성물은, 예를 들어, 하나 이상의 효소적 방법, 크로마토그래피 방법, 질량 분석(MS) 방법, 크로마토그래피 방법과 이에 후속되는 MS 방법, 전기영동 방법, 전기영동 방법과 이에 후속되는 MS, 핵자기 공명(NMR) 방법, 및 이들의 조합에 의해 분석된다. 예시적인 효소적 방법은 하나 이상의 글리칸(들)(예를 들어, 하나 이상의 노출된 글리칸(들))을 방출하기에 충분한 시간 동안 그리고 조건 하에서 우스테키누맙 제제를 하나 이상의 효소와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 하나 이상의 효소는 PNGase F를 포함한다. 예시적인 크로마토그래피 방법에는 펄스형 전류측정 검출을 사용하는 강한 음이온 교환 크로마토그래피(Strong Anion Exchange chromatography using Pulsed Amperometric Detection, SAX-PAD), 액체 크로마토그래피(LC), 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC), 박층 크로마토그래피(TLC), 아미드 컬럼 크로마토그래피, 및 이들의 조합이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 예시적인 질량 분석(MS)은 탠덤 MS, LC-MS, LC-MS/MS, 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 질량 분석(MALDI-MS), 푸리에 변환 질량 분석(FTMS), 질량 분석에 의한 이온 이동도 분리(IMS-MS), 전자 전달 해리(ETD-MS), 및 이들의 조합을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 예시적인 전기영동 방법은 모세관 전기영동(CE), CE-MS, 겔 전기영동, 아가로스 겔 전기영동, 아크릴아미드 겔 전기영동, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)과 이에 후속되는, 특정 글리칸 구조를 인식하는 항체를 사용하는 웨스턴 블롯팅(Western blotting), 및 이들의 조합을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 예시적인 핵자기 공명(NMR)은 1차원 NMR(1D-NMR), 2차원 NMR(2D-NMR), 상관 분광법 자기-각 회전 NMR(COSY-NMR), 총 상관 분광법 NMR(TOCSY-NMR), 이종핵 단일-양자 간섭 NMR(HSQC-NMR), 이종핵 다중 양자 간섭(HMQC-NMR), 회전 핵 오버하우저 효과 분광법 NMR(ROESY-NMR), 핵 오버하우저 효과 분광법(NOESY-NMR), 및 이들의 조합을 포함하지만 이로 한정되지 않는다.

세포

우스테키누맙을 발현하기 위해 사용될 수 있는 임의의 숙주 세포가 본 명세서에 기재된 방법에 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 우스테키누맙을 발현하도록 조작된 세포는 서열 번호 1에 제시된 바와 같은 중쇄 가변 도메인, 및/또는 서열 번호 2에 제시된 바와 같은 경쇄 가변 도메인을 포함하는 우스테키누맙 생성물을 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 우스테키누맙을 발현하도록 조작된 세포는 서열 번호 1의 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 서열 번호 2의 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 우스테키누맙 생성물을 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 우스테키누맙을 발현하도록 조작된 세포는 서열 번호 1에 제시된 바와 같은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열, 및 서열 번호 2에 제시된 바와 같은 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 우스테키누맙 생성물을 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 우스테키누맙을 발현하도록 조작된 세포는 인간 또는 동물에서의 치료용 또는 진단용 용도에 대해, 예를 들어 2차 승인 프로세스 하에서 승인된 단백질과 동일한 1차 아미노산 서열을 갖는 우스테키누맙 생성물을 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 우스테키누맙을 발현하도록 조작된 세포는 승인된 치료용 또는 진단용 단백질과 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 또는 20개 이하의 잔기만큼 상이한 우스테키누맙 생성물을 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 우스테키누맙을 발현하도록 조작된 세포는 승인된 치료용 또는 진단용 단백질과 적어도 90, 95, 98, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함한다. 용어 "동일한 1차 아미노산 서열", "1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 또는 20개 이하의 잔기만큼 상이한 1차 아미노산 서열", "적어도 98% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 서열", 또는 유사한 용어는 1차 아미노산 서열들 사이의 동일성 수준과 관련된다. 일부 실시 형태에서, 단백질 제제 또는 생성물은 아미노산 변이체, 예를 들어 말단 잔기에서, 예를 들어 1개 또는 2개의 말단 잔기에서 상이한 종을 포함한다. 그러한 경우의 일부 실시 형태에서, 비교되는 서열 동일성은 비교되는 각각의 생성물 내의 가장 풍부한(예를 들어, 가장 풍부한 활성) 종의 1차 아미노산 서열들 사이의 동일성이다. 일부 실시 형태에서, 서열 동일성은 우스테키누맙 생성물을 제조하는 데 사용될 수 있는 핵산에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 지칭한다.

일부 실시 형태에서, 우스테키누맙을 발현하도록 조작된 세포는 포유류 세포이다.

일부 실시 형태에서, 우스테키누맙을 발현하도록 조작된 세포는 뮤린 세포이다. 일부 실시 형태에서, 우스테키누맙을 발현하도록 조작된 세포는 마우스 세포주로부터의 것이다. 뮤린(예를 들어, 마우스) 세포주는, 예를 들어 마우스 골수종 세포주, 예를 들어 NS0 세포 및 SP 2/0 세포를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 우스테키누맙을 발현하도록 조작된 세포는 인간 세포이다. 일부 실시 형태에서, 우스테키누맙을 발현하도록 조작된 세포는 인간 세포주로부터의 것이다. 인간 세포주는, 예를 들어, HEK 293: 인간 배아 신장 293; HT-1080: 상피-유사 표현형을 갖는 섬유육종으로부터의 것; PER.C6: 아데노바이러스 E1 유전자에 의한 형질감염을 통해 불멸화된 인간 배아 망막 세포로부터의 것; CAP: 아데노바이러스 5형 E1 유전자를 통해 불멸화된 인간 양수세포로부터의 것; HKB-11: HEK293-S와 인간 B-세포주의 폴리에틸렌 글리콜 융합을 통해 생성됨; 및 HuH-7: 인간 간세포 암종으로부터의 것을 포함한다. 일부 소정 실시 형태에서, 전단-민감 세포는 HEK 293 세포, 섬유육종 HT 1080 세포, PER.C6 세포, CAP 세포, HKB-11 세포 및 HuH-7 세포로부터 선택된다.

일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 우스테키누맙 생성물을 발현하는 세포 집단은 재조합 방법을 사용하여 생성된다. 유전자, 예컨대 본 명세서에 기재된 항체 작용제와 같은 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자의 재조합 발현은 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터의 작제를 포함할 수 있다. 일단 폴리뉴클레오티드가 얻어졌으면, 폴리펩티드의 생성을 위한 벡터가 당업계에 알려진 기법을 사용하여 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 수 있다. 알려진 방법을 사용하여 폴리펩티드 코딩 서열 및 적절한 전사 및 번역 제어 신호를 함유하는 발현 벡터를 작제할 수 있다. 이들 방법은, 예를 들어 시험관내(in vitro) 재조합 DNA 기법, 합성 기법, 및 생체내(in vivo) 유전자 재조합을 포함한다.

일단 본 명세서에 기재된 우스테키누맙 생성물이 재조합 발현에 의해 생성되었으면, 이는 정제에 대해 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해, 예를 들어 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 및 크기결정 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차등 용해도에 의해, 또는 단백질의 정제에 대한 임의의 다른 표준 기법에 의해 정제될 수 있다. 예를 들어, 우스테키누맙은 단백질 A 컬럼과 같은 친화성 컬럼을 적절하게 선택하고 크로마토그래피 컬럼, 여과, 한외여과, 염석(salting-out) 및 투석 절차와 조합함으로써 단리되고 정제될 수 있다(문헌[Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988] 참조). 또한, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 우스테키누맙 생성물은 정제를 용이하게 하기 위해 이종성 폴리펩티드 서열에 융합될 수 있다.

약제학적 조성물

본 명세서에 기재된 방법, 시스템 및/또는 공정 중 임의의 것을 사용하여 생성되거나 제조된 우스테키누맙 생성물이 약제학적 조성물 내로 도입될 수 있다. 그러한 약제학적 조성물은 질병의 예방 및/또는 치료에 유용할 수 있다. 우스테키누맙을 포함하는 약제학적 조성물은 당업자에게 알려진 방법에 의해 제형화될 수 있다(예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2000] 참조). 약제학적 조성물은 물 또는 다른 약제학적으로 허용되는 액체 중 멸균 용액 또는 현탁액을 포함하는 주사가능한 제형의 형태로 비경구 투여될 수 있다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 세포 생성물(예를 들어, 재조합 단백질, 예를 들어 당단백질, 예를 들어 항체 작용제)을 약제학적으로 허용되는 비히클 또는 매질, 예컨대 멸균수 및 생리 식염수, 식물성 오일, 유화제, 현탁화제, 계면활성제, 안정제, 향미부여 부형제, 희석제, 비히클, 보존제, 결합제와 적합하게 배합한 후, 일반적으로 허용되는 약제학적 실무에서 필요로 하는 단위 용량 형태로 혼합함으로써 제형화될 수 있다. 약제학적 제제 내에 포함되는 활성 성분의 양은 지정된 범위 내의 적합한 용량이 제공되도록 하는 양이다.

일부 실시 형태에서, 우스테키누맙 제제는 안정제/등장화제로서의 수크로스를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 우스테키누맙 제제는 완충제로서 히스티딘(예를 들어, L-히스티딘)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 우스테키누맙 제제는 계면활성제로서 폴리소르베이트 80을 포함한다. 일부 소정 실시 형태에서, 우스테키누맙 제제는 히스티딘(예를 들어, L-히스티딘), 수크로스, 및 폴리소르베이트 80을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 우스테키누맙 제제는 비경구 투여, 예를 들어 정맥내 주사, 근육내 주사, 복막내 주사, 피하 주사를 위해 제형화된다. 일부 실시 형태에서, 우스테키누맙 제제는 피하 투여를 위해 제형화된다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시된다. 실시예는 단지 예시적인 목적을 위해 제공된다. 이들은 어떠한 방식으로든 본 발명의 범주 또는 내용을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

실시예

실시예 1: 우스테키누맙 생성물의 글리칸 조성에 있어서의 시프트의 확인

이 실시예는 구매가능한 우스테키누맙 참조 단백질 생성물("RPP")의 로트(lot)들 중에서 글리칸 조성에 있어서의 유의한 시프트를 확인한다. 구체적으로는, 본 실시예는 2개의 별개의 글리칸 프로파일로 분리되는 구매가능한 우스테키누맙의 로트들 중에서 글리칸 조성의 변동성을 보여준다. 이들 2개의 군의 글리칸 변이체는, 본 명세서에서, 상대적으로 높은 수준의 G0F 글리칸을 특징으로 하는 것을 "군 1"로, 그리고 상대적으로 낮은 수준의 G0F 글리칸을 특징으로 하는 것을 "군 2"로 지칭한다.

우스테키누맙 RPP의 30개의 로트를 분석하였다. 이들 30개의 로트 중에서, 28개의 로트는 90 mg/mL 제제였고 2개의 로트는 5 mg/mL 제제였다. 90 mg/mL의 우스테키누맙 RPP의 28개의 로트 중에서, 이들 로트 중 8개는 군 1 글리칸 프로파일을 갖는 것으로 확인되었고, 20개의 로트는 군 2 글리칸 프로파일을 갖는 것으로 확인되었다. 도 1을 참조한다.

군 1 및 군 2 샘플에 대한 각각의 주 글리칸 종의 평균 풍부도에 대한 개요가 하기 표 2에 요약되어 있다.

[표 2]

3 L 내지 250 L 범위 이내의 상이한 부피로 42일의 지속시간 동안 5 mM 갈락토스와 함께 (예를 들어, ATF-기반 관류 배양 공정에 의해) 배양함으로써 생성된 우스테키누맙 시험 생성물을 또한 분석하였다. 이들 우스테키누맙 시험 생성물의 글리칸 풍부도가 도 1의 각각의 패널의 최우측에 집단화되어 도시되어 있다. 우스테키누맙 시험 생성물의 글리칸 프로파일은 군 1 및 군 2 RPP의 것들의 범위 이내였다. 따라서, 본 실시예는 구매가능한 우스테키누맙 RPP에 대한 글리칸 프로파일의 2개의 별개의 군을 확인시켜 주었으며, 동시적 배양 조건이 이들 2개의 군의 범위 이내에서 중간 글리칸 풍부도를 갖는 우스테키누맙 시험 생성물을 산출한다는 것을 보여주었다.

실시예 2: 배양 시간은 우스테키누맙 글리칸 조성에 영향을 준다

본 실시예는 수확물 수집 시기가 우스테키누맙 글리칸 조성을 제어하기 위한 요소임을 보여준다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 총 글리칸에 대한 G0F 글리칸의 풍부도는 일반적으로 배양 지속시간에 따라 감소된다. 예를 들어, 배양 13일째에 수집된 우스테키누맙 제제는 거의 50% 풍부도의 G0F 글리칸을 가진 반면, 34일 이상의 배양 후에 수집된 샘플은 총 글리칸 조성에 대해 30% 미만의 G0F 글리칸을 가졌다.

흥미롭게도, 본 발명은 배양 지속시간(즉, 수집될 때까지의 시간)의 감소가 G0F 수준의 증가와 결부되는 반면, 배양 지속시간(즉, 수집될 때까지의 시간)의 증가는 G0F 수준의 감소와 결부된다는 것을 인식한다.

따라서, 이 실시예는 증가하는 배양 시간이 총 글리칸 조성에 대한 G0F 글리칸의 풍부도를 감소시킬 수 있음을 보여주며, 우스테키누맙 글리칸 조성을 제어하기 위해 배양 시간이 변동될 수 있음을 추가로 기술한다.

실시예 3: 군 1 및 군 2 글리칸 프로파일을 갖는 우스테키누맙 생성물의 생성

본 실시예는 우스테키누맙 글리칸 수준(예를 들어, 갈락토실화)을 제어하기 위한 공정 레버로서의 역할을 할 수 있는 배양 시간과 배양 배지 중의 갈락토스 농도 사이의 역상관을 확인시켜 준다. 본 실시예는 조작된 글리칸 프로파일을 갖는 부적합(non-conforming) 물질(즉, 부적합 우스테키누맙 제제)의 생성을 보여준다. 구체적으로는, 본 실시예는 실시예 1에서 전술된 바와 같이, 군 1 RPP 및 군 2 RPP에 각각 매칭되는 글리칸 프로파일을 갖도록 조작된, 본 명세서에서 NCM-1 및 NCM-2로 지칭되는 2개의 부적합 우스테키누맙 제제의 생성을 보여준다.

구체적으로는, NCM-1 제제는 15 mM 갈락토스와 함께 (예를 들어, ATF-기반 관류 배양 공정에 의해) 배양하고, 우스테키누맙을 배양 일수 16 전에 수집함으로써(예를 들어, 일수 7 내지 일수 15의 범위 이내의 시점에서 수집함으로써) 생성하였다. 대조적으로, NCM-2 제제는 갈락토스가 결여된 배지(0 mM 갈락토스) 중에서 (예를 들어, ATF-기반 관류 배양 공정에 의해) 배양하고, 우스테키누맙을 배양 일수 25 후에 수집함으로써(예를 들어, 일수 34 내지 일수 45의 범위 이내의 시점에서 수집함으로써) 생성하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, G0F, G1FA, G1FB, G2F, 전체 시알화, 주(main), 산성, 및 염기성 글리칸을 포함한, 분석된 각각의 글리칸 종에 대해, NCM-1 글리칸 프로파일은 군 1 RPP의 것과 잘 상관되었고, NCM-2 글리칸 프로파일은 군 2 RPP의 것과 잘 상관되었다. 표 3은 갈락토스 농도 및 배양 시간의 공정 레버를 제어함으로써 조작된 바와 같은 각각의 글리칸에 대한 예시적인 목표 범위를 제공한다.

[표 3]

따라서, 본 실시예는 갈락토스 농도 및 배양 시간의 역상관 요소가 글리칸 조성을 제어하기 위한 공정 레버로서 사용될 수 있고, 목표 글리칸 수준을 갖는 부적합 우스테키누맙 제제를 생성하는 데 사용될 수 있음을 보여주었다.

등가물

본 발명이 이의 상세한 설명과 함께 기재되었지만, 전술한 설명은 예시하고자 하는 것이고, 첨부된 청구범위의 범주에 의해 규정되는 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것이 아님이 이해되어야 한다. 다른 태양, 이점, 및 변형이 하기 청구범위의 범주 내에 있다.

<110> Momenta Pharmaceuticals, Inc. <120> METHODS OF PRODUCING USTEKINUMAB <130> 2010403-0534 (M0168PCT) <150> 62/786821 <151> 2018-12-31 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 449 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Ile 35 40 45 Gly Ile Met Ser Pro Val Asp Ser Asp Ile Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Met Ser Val Asp Lys Ser Ile Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Asn Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Arg Pro Gly Gln Gly Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ser Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 2 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ile Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210

Claims

G0F 글리칸의 목표 수준을 갖는 우스테키누맙을 포함하는 약제학적 조성물을 제조하는 방법으로서,
(a) G0F 글리칸의 목표 수준을 선택하는 단계,
(b) 갈락토스의 수준을 선택하고, 상기 G0F 글리칸의 선택된 수준을 제공하도록 세포 배양 시간을 선택하는 단계로서, 상기 갈락토스의 수준 및 상기 시간은 역상관되는, 상기 단계;
(c) 상기 갈락토스의 선택된 수준 및 시간을 포함하는 조건 하에서 우스테키누맙을 발현하도록 유전자 조작된 세포들의 집단을 배양하는 단계;
(d) 상기 세포들의 집단에 의해 발현되는 우스테키누맙을 수집함으로써, 우스테키누맙 제제를 생성하는 단계; 및
(e) 상기 우스테키누맙 제제가 상기 G0F 글리칸의 목표 수준을 충족한다면, 상기 우스테키누맙 제제를 정제, 농축, 및/또는 제형화하여 우스테키누맙을 포함하는 약제학적 조성물을 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 배양하는 단계는 관류(perfusion) 배양 공정을 사용하여 수행되는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 G0F 글리칸의 목표 수준은 총 글리칸에 대해 20% 내지 80% G0F의 범위 이내인, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 G0F 글리칸의 목표 수준은 총 글리칸에 대해 25% 내지 65% G0F의 범위 이내인, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 G0F 글리칸의 목표 수준은 총 글리칸에 대해 20% 내지 최대 40% G0F의 범위 이내이며, 상기 갈락토스의 선택된 수준은 0 mM이고, 상기 세포 배양 시간은 7일 내지 15일 범위 이내인, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 G0F 글리칸의 목표 수준은 총 글리칸에 대해 40% 내지 80% G0F의 범위 이내이며, 상기 갈락토스의 선택된 수준은 15 mM 내지 30 mM의 범위 이내이고, 상기 세포 배양 시간은 16일 내지 60일 범위 이내인, 방법.
제6항에 있어서, 상기 세포 배양 시간은 25일 내지 42일 범위 이내인, 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, G0F 글리칸의 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 우스테키누맙을 발현하도록 유전자 조작된 세포들의 집단은 포유류 세포인, 방법.
제9항에 있어서, 상기 포유류 세포는 CHO 세포, HEK 293 세포, 섬유육종 HT 1080 세포, PER.C6 세포, CAP 세포, HKB-11 세포, HuH-7 세포, NS0 세포 및 SP 2/0 세포로부터 선택되는, 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 갈락토스의 선택된 수준은 t = 0부터 수집될 때까지 배양 동안 제어되는, 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포들에 의해 발현되는 우스테키누맙은 상기 세포 배양 시간 범위 이내에서 2회 이상 수집되는, 방법.