CN113474366A - 产生优特克单抗的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明描述了制造具有目标水平的一种或多种聚糖的优特克单抗产物的方法。
Description
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序列表
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背景技术
治疗性抗体是一类重要的治疗性生物产品。抗体糖基化和聚糖组成可以影响抗体活性和效应子功能。仍然持续需要用于控制抗体产物的聚糖谱的改进方法。
发明内容
本公开提供了用于产生(例如制造)具有目标水平的一种或多种聚糖的优特克单抗的过程手段。本公开提供了以下见解：培养基中的半乳糖浓度与培养时间之间的关系可以用作控制培养物中优特克单抗的一种或多种聚糖(例如半乳糖基化)的目标水平的过程手段。本公开鉴定了在控制一种或多种聚糖(例如半乳糖基化)的目标水平中，培养时间与培养基中的半乳糖浓度之间的逆相关。
在特定方面，本公开提供了制造具有目标水平的一种或多种聚糖的优特克单抗的方法。此类方法可包括提供(例如，产生、表达(例如，在小规模或大规模细胞培养中)和/或制造)或获得(例如，从第三方(包括合同相关的第三方或非合同相关的(例如独立的)第三方)接受和/或购买)优特克单抗测试蛋白质(例如优特克单抗药物，例如优特克单抗药物的制剂，例如一批测试优特克单抗药物)。
在某些情况下，本公开提供了制造包含具有目标水平的一种或多种聚糖的优特克单抗的药物组合物的方法，该方法包括：选择半乳糖水平和细胞培养时间，其中半乳糖水平和时间是逆相关的；在包括所选择的半乳糖水平和时间的条件下，培养经遗传工程化以表达优特克单抗的细胞群；收获由细胞群表达的优特克单抗，从而产生优特克单抗的制剂；以及如果制剂满足一种或多种聚糖的目标水平，则纯化、浓缩和/或配制优特克单抗制剂，以产生包含优特克单抗的药物组合物。在一些实施方案中，一种或多种聚糖的目标水平是选自G0F、唾液酸化聚糖和G2F的聚糖的目标水平。在一些实施方案中，一种或多种聚糖的目标水平是G0F的目标水平。
在某些情况下，本公开提供了制造包含具有目标水平的G0F聚糖的优特克单抗的药物组合物的方法，该方法包括：选择G0F聚糖的目标水平；选择半乳糖水平和细胞培养时间以提供所选择的G0F的目标水平，其中半乳糖水平和时间是逆相关的；在包括所选择的半乳糖水平和时间的条件下，培养经遗传工程化以表达优特克单抗的细胞群；收获由细胞群表达的优特克单抗，从而产生优特克单抗的制剂；以及如果制剂满足G0F聚糖的目标水平，则纯化、浓缩和/或配制优特克单抗制剂，以产生包含优特克单抗的药物组合物。
在某些情况下，本公开提供了产生具有目标水平的一种或多种聚糖的优特克单抗药物产品的方法，该方法包括：在一定条件下培养经遗传工程化以表达优特克单抗的细胞群，其中该条件的特征在于包括所选择的半乳糖水平和细胞培养时间在内的参数，并且其中半乳糖水平和时间是逆相关的；收获由细胞表达的优特克单抗，从而产生优特克单抗制剂；以及如果优特克单抗制剂满足一种或多种聚糖的目标水平，则纯化、浓缩和/或配制优特克单抗制剂以产生优特克单抗药物产品。在一些实施方案中，一种或多种聚糖的目标水平是选自G0F、唾液酸化聚糖和G2F的聚糖的目标水平。在一些实施方案中，一种或多种聚糖的目标水平是G0F的目标水平。
在一些实施方案中，所提供的方法包括培养经遗传工程化以表达优特克单抗的哺乳动物细胞群。在一些实施方案中，哺乳动物细胞选自：CHO细胞、HEK 293细胞、纤维肉瘤HT1080细胞、PER.C6细胞、CAP细胞、HKB-11细胞、HuH-7细胞、NS0细胞和SP 2/0细胞。
在一些实施方案中，在所提供的方法中，培养步骤是使用连续培养方法进行的。在一些实施方案中，所提供的方法包括使用灌注培养方法(例如基于交替切向流过滤器(ATF)的灌注培养方法)所进行的培养。在一些特定实施方案中，所提供的方法包括通过灌注培养方法来培养经遗传工程化以表达优特克单抗的哺乳动物细胞(例如表达优特克单抗的SP2/0细胞)。
在一些实施方案中，提供了包括在细胞培养时间的时间范围内两次或更多次收获由细胞表达的优特克单抗的方法。
在一些实施方案中，G0F聚糖的目标水平在相对于总聚糖而言20％至80％G0F的范围内。在一些实施方案中，G0F聚糖的目标水平在相对于总聚糖而言25％至65％G0F的范围内。
在一些实施方案中，所提供的方法涉及制造和/或产生具有在相对于总聚糖而言20％至最高40％G0F范围内的目标水平的G0F聚糖的优特克单抗。在一些实施方案中，用于实现具有在相对于总聚糖而言20％至最高40％G0F范围内的目标水平的G0F聚糖的优特克单抗的方法包括0mM的所选择的半乳糖水平，并且细胞培养时间在7天至15天的范围内。
在一些实施方案中，所提供的方法涉及制造和/或产生具有在相对于总聚糖而言40％至80％G0F范围内的目标水平的G0F聚糖的优特克单抗。在一些实施方案中，用于实现具有在相对于总聚糖而言40％至80％G0F范围内的目标水平的G0F聚糖的优特克单抗的方法包括在15mM至30mM范围内的所选择的半乳糖水平，以及在16天至60天范围内的细胞培养时间。在一些特定实施方案中，细胞培养时间在25天至42天的范围内。
在一些实施方案中，所提供的方法包括选择G0F聚糖的目标水平。在一些实施方案中，G0F聚糖的目标水平在相对于总聚糖而言20％至80％G0F的范围内。在一些特定实施方案中，G0F聚糖的目标水平在相对于总聚糖而言20％至最高40％G0F的范围内，其中该方法包括0mM的所选择的半乳糖水平，以及在7天至15天范围内的细胞培养时间。在一些特定实施方案中，G0F聚糖的目标水平在相对于总聚糖而言40％至80％G0F的范围内，其中该方法包括在15mM至30mM范围内的所选择的半乳糖水平，以及在16天至60天范围内的细胞培养时间。
在一些实施方案中，所提供的方法在整个培养步骤中控制(例如在从t＝0直至收获的培养期间控制)所选择的半乳糖水平。
在一些实施方案中，所提供的方法还包括测量G0F聚糖的水平。在一些实施方案中，如果测量的G0F聚糖水平在相对于总聚糖而言20％至80％G0F的范围内(例如，在相对于总聚糖而言20％至最高40％G0F的范围内，例如在相对于总聚糖而言40％至80％G0F的范围内)，则进行纯化、浓缩、和/或配制优特克单抗制剂的步骤。
本发明的这些和其他方面在以下和权利要求书中有更详细的描述。
附图说明
由以下附图构成的本文所包括的附图仅用于说明目的而非为了限制。
图1示出了各种制剂和优特克单抗源的聚糖谱的比较。左上图提供了G0F聚糖的丰度；右上图提供了G1F-A聚糖的丰度；左下图提供了G1F-B聚糖的丰度；并且右下图提供了总唾液酸化。实心圆代表来自美国(黑色实心圆)和欧洲(阴影实心圆)的参考蛋白产品(“RPP”)。各图最右侧部分的符号代表在不同体积下培养的优特克单抗测试制剂。实心阴影方块表示在3L下培养的样品，空心方块表示来自卫星培养的样品，实心三角形表示在100L下培养的样品，并且实心菱形表示在250L下培养的样品。各聚糖的相对丰度在其相应的图中示出，其中各图所示的样品分为四组，沿x轴从左到右走：来自90mg/ml参考样品的第1组RPP(最左边)，来自90mg/ml参考样品的第2组RPP(从左起第二个)、5mg/mL RPP(从左起第三个)和优特克单抗测试产物(最右边)。
图2示出了G0F聚糖谱随收获持续时间的变化。最左列(白色)表示第1组RPP G0F丰度，从左起第二列(黑色)表示第2组RPP G0F丰度，从左起第三列表示在7天至42天培养的样品的G0F的平均丰度。阴影列(从左起第四列开始并继续到最右列)各自代表培养7天(D7)至最多42天(D42，最右列)范围内的指定天数的样品的G0F丰度。
图3示出了各种培养条件之间的主要聚糖谱和掌控变型的比较。示出了沿各图的x轴从左到右走：第1组RPP(最左边)，第2组RPP，在3LDS下培养的优特克单抗，在100L DS下培养的优特克单抗，在250L DS下培养的优特克单抗，NCM-2优特克单抗制剂，以及NCM-1优特克单抗制剂(最右边)。
某些定义
一般来讲，除非另外明确指明，本文使用的术语根据其在本领域中理解的含义。下面提供了某些术语的明确定义；在贯穿本说明书的特定情况下，这些和其他术语的含义对于本领域的技术人员而言将从上下文显而易见。
为了可以更容易地理解本发明，以下首先定义某些术语。贯穿本说明书阐述了以下术语和其他术语的附加定义。
如本文所用，术语“约”或“大约”在应用于一个或多个所关注的值时是指类似于所陈述参考值的值。在某些实施方案中，术语“约”或“大约”是指落入所陈述的参考值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小之内的值范围。
如本文所用，提及到控制优特克单抗的一种或多种聚糖(例如半乳糖，例如G0F)的目标水平时的术语“控制”、“受控”、“处于控制”意指选择、维持和/或调节产生优特克单抗的一种或多种培养条件。调节可以包括增加或减少用于产生优特克单抗的一种或多种培养条件。如本文所用，一种或多种聚糖的受控目标水平涉及具有期望水平的具有最小产物漂移的一种或多种聚糖的优特克单抗的产生。在一些实施方案中，G0F的受控目标水平在相同生产运行和/或批次中的样品之间的变化将不超过20％、15％、10％或5％。在一些实施方案中，控制一种或多种聚糖的目标水平确保了优特克单抗生产的一致性(例如，批次间一致性、来自任何特定生产过程的整个样品的一致性)。
如本文所用，“聚糖”是指包含至少一个糖残基(例如单糖)的化合物。聚糖可为糖残基的单体或聚合物，并且可为直链或支链的。“聚糖”可包括天然糖残基(例如，葡萄糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰神经氨酸、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、己糖、阿拉伯糖、核糖、木糖等)和/或改性糖(例如，2′-氟核糖、2′-脱氧核糖、磷酸甘露糖、6′-磺基N-乙酰葡糖胺等)。术语“聚糖”包括糖残基的均聚物和杂聚物。术语“聚糖”还涵盖糖缀合物(例如糖蛋白、糖脂、蛋白聚糖等)的聚糖组分。该术语还涵盖游离聚糖，包括已从糖缀合物裂解或以其他方式释放的聚糖。
如本文所用，“半乳糖基化聚糖”是指包含至少一个半乳糖残基的聚糖。在一些实施方案中，半乳糖基化聚糖是G1、G2、G1F、G2F、A1和/或A2聚糖。非半乳糖基化聚糖包括G0F或G0。在一些实施方案中，半乳糖基化聚糖的目标水平可指半乳糖基化聚糖(例如G2F)的存在和/或非半乳糖基化聚糖(例如G0F)的目标水平。
如本文所用，术语“分离的”是指这样的物质和/或实体：(1)与其在初始产生(无论是在自然和/或实验环境中)时相关联的至少一些组分分离，和/或(2)由人手工设计、产生、制备和/或制造。分离的物质和/或实体可以与它们初始相关的其他组分的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、或大于约99％分离。在一些实施方案中，分离的试剂的纯度为约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、或大于约99％。如本文所用，如果物质基本上不含其他组分，则其是“纯的”。在一些实施方案中，如本领域的技术人员所理解，物质在与例如某些其他组分诸如一种或多种载体或赋形剂(例如缓冲液、溶剂、水等)组合之后仍可被视为是“分离的”或甚至“纯的”；在此类实施方案中，在不包含此类载体或赋形剂的情况下计算物质的分离百分比或纯度。仅给出一个示例，在一些实施方案中，当处于以下情况时认为自然界中存在的生物聚合物诸如多肽或多核苷酸是“分离的”：a)由于其起源或衍生源，与以自然界中的天然状态伴随其的部分或全部组分没有关联；b)其基本上不含与自然界中产生其的物类相同的物类的其他多肽或核酸；c)由不是自然界中产生其的物类的细胞或其他表达系统表达，或以其他方式与来自不是自然界中产生其的物类的细胞或其他表达系统的组分相关联。因此，例如，在一些实施方案中，化学合成或在不同于自然界中产生其的细胞系统中合成的多肽被视为“分离的”多肽。另选地或除此之外，在一些实施方案中，已经经受了一种或多种纯化技术的多肽可被视为“分离的”多肽，所达到的程度在于其已经与a)其在自然界中相关联；和/或b)其在初始产生时相关联的其他组分相分离。
如本文所用，“过程手段”是指可被控制以便增加或减小抗体产物上的一种或多种聚糖的丰度的培养过程的要素(例如一种或多种培养条件)。本公开提供了一种新型过程手段，即培养基中半乳糖浓度与培养时间之间的特定关系。如本文所述，培养基中的半乳糖浓度与培养基中的培养时间之间的逆相关可以用作产生具有目标水平的一种或多种聚糖(例如半乳糖基化)的优特克单抗的过程手段。在一些实施方案中，过程手段包括所选择的半乳糖水平和细胞培养时间以控制优特克单抗的一种或多种聚糖(例如半乳糖基化，例如G0F)的水平(例如优特克单抗培养物或制剂中的一种或多种聚糖的水平)。
如本文所用，“Fc区的N-糖基化位点”是指聚糖与之N-连接的Fc区内的氨基酸残基。在一些特定实施方案中，优特克单抗的N-糖基化位点位于重链中的Asn299位置处。
一般来讲，如本文所用，“蛋白质”是多肽(即通过肽键彼此连接的至少两个氨基酸的链)。蛋白质可包括除氨基酸之外的部分(例如可为糖蛋白)和/或能够以其他方式加工或修饰。本领域的普通技术人员将理解，“蛋白质”可为如由细胞产生的完整多肽链(具有或不具有信号序列)，或者可为其功能部分。普通技术人员还将理解，蛋白质有时可包含多于一个多肽链，例如通过一个或多个二硫键连接或通过其他方式缔合。
如本文所用，“回收”是指通过例如使用本领域已知的纯化技术分离而使得试剂或实体基本上不含其他先前相关联的组分的过程。在一些实施方案中，从天然来源和/或包含细胞的来源回收试剂或实体。
如本文所用，“样品”是指单独产生的样品。在一些实施方案中，单独样品的评价包括来自相同培养运行(例如在制备期间的不同时间点)或来自不同培养运行(例如不同轮的培养)的样品的评价。
如本文所用，“目标值或目标水平”是指一种或多种特定聚糖，诸如半乳糖基化聚糖和/或唾液酸化聚糖的预定水平。在一些实施方案中，目标值是在提及到优特克单抗产物时或药物产品的说明书或母料记录中描述的一种或多种特定聚糖，诸如半乳糖基化聚糖(例如G0、G1、G2、G0F、G1F、G2F或组合)和/或唾液酸化聚糖(例如单唾液酸化、二唾液酸化或组合)的水平。在一些特定实施方案中，目标值是优特克单抗产物中G0F聚糖的水平。
在一些实施方案中，目标值是指优特克单抗制剂中的一种或多种聚糖(例如半乳糖基化聚糖(例如半乳糖基化聚糖的一种或多种物类)和/或唾液酸化聚糖(例如唾液酸化聚糖的一种或多种物类))的绝对水平(例如摩尔数)。在一些实施方案中，目标值是指相对于优特克单抗制剂中聚糖的总水平，优特克单抗制剂中的一种或多种聚糖(例如半乳糖基化聚糖(例如半乳糖基化聚糖的一种或多种物类)和/或唾液酸化聚糖(例如唾液酸化聚糖的一种或多种物类))的水平。在一些实施方案中，目标值表达为“百分比”，其是指一种或多种聚糖(例如Fc聚糖)相对于优特克单抗制剂中的聚糖(例如Fc聚糖)的总摩尔数而言的摩尔数。在一些实施方案中，“百分比”是指一种或多种PNGase F释放的Fc聚糖相对于检测到的PNGase F释放的Fc聚糖的总摩尔数而言的摩尔数。
如本文所用，术语“优特克单抗制剂”是指根据特定生产方法获得的优特克单抗蛋白质的混合物。优特克单抗制剂中的优特克单抗蛋白质包括优特克单抗的多个拷贝(即具有相同或基本上相同的氨基酸序列)，但是具有与蛋白质相关的聚糖的混合物。在某些情况下，优特克单抗制剂使用如本文所提供的方法和/或系统进行制备。生产方法可以包括使用经工程化以表达优特克单抗(或以相关水平或在相关条件下表达优特克单抗)的培养细胞的重组制备步骤。在一些实施方案中，生产方法可以包括其中将优特克单抗与工程化细胞的某些组分进行分离(例如，通过使细胞裂解并通过离心使蛋白质组分沉淀)的分离步骤。在一些实施方案中，生产方法还可以包括其中将优特克单抗与其他细胞组分(例如，先前步骤中使用的其他蛋白质或有机组分)进行分离(例如通过色谱法)的纯化步骤。应当理解，这些步骤是非限制性的，并且可以包括任何数量的附加生产步骤。可以通过相同的生产方法但在不同的情况下(例如不同的运行或制剂)制备不同的优特克单抗制剂。另选地，可以通过不同的生产方法制备不同的优特克单抗制剂。两种生产方法可能在任何方面(例如表达载体、工程化细胞类型、培养条件、分离过程、纯化条件等)均有所不同。
本专利申请中引用的所有文献和类似材料，包括但不限于专利、专利申请、文章、书、论文和网页均明确地全文以引用方式并入，而无论此类文献和类似材料的形式如何。在所引入的文献和类似材料中的一者或多者与本专利申请不同或抵触的事件中，包括但不限于所定义的术语、术语使用、所描述的技术等，都以本专利申请为准。本文所用的章节标题仅用于组织目的，而不应被解释为以任何方式限制所描述的主题。
具体实施方式
本公开至少部分地描述了产生具有目标水平的一种或多种聚糖(例如半乳糖基化，例如G0F聚糖)的优特克单抗的过程手段的发现。在抗体产生期间控制聚糖组成和水平是一项持续的挑战。治疗性抗体的糖基化可以影响其安全性和/或功效(Zhang等人(2016)Drug Discovery Today 21(5):740-765)。因此，重要的是能够确保优特克单抗产生中聚糖组成的一致性(例如，批次间一致性、来自任何特定生产过程的整个样品的一致性)。在优特克单抗参考蛋白产品(“RPP”)的表征期间，观察到优特克单抗RPP的两种不同的聚糖群。
本公开描述了用于在优特克单抗的制造期间控制聚糖组成的手段的开发。本文描述了产生具有目标水平的特定聚糖(包括所鉴定的各RPP聚糖谱)的优特克单抗的过程手段。在开发如所述的手段的过程中，本公开鉴定了培养基中半乳糖浓度与培养时间之间的关系。本公开提供了以下见解，培养基中的半乳糖浓度与培养(例如连续培养)时间之间的关系可以用作控制培养物中优特克单抗的一种或多种聚糖(例如半乳糖基化)的目标水平的过程手段。
本公开还提供了以下见解，对于控制聚糖水平(例如半乳糖基化)，半乳糖水平与时间(即培养持续时间)之间的关系是逆相关的。用于控制聚糖组成的本公开的培养方法包括连续培养方法(例如灌注培养)。
优特克单抗
本公开部分地提供了用于制造、制备、控制或以其他方式生成具有特定聚糖谱的优特克单抗的方法和过程。
优特克单抗是特异性地结合至IL-12和IL-23两者的p-40亚基的抗体。优特克单抗已经在许多人类疾病中进行了研究，包括银屑病、银屑病性关节炎、克罗恩氏病和多发性硬化症。
在一些实施方案中，优特克单抗包含与如SEQ ID NO.:1所示的HCDR序列相差不超过3个氨基酸残基的HCDR1、HCDR2和HCDR序列，以及与如SEQ ID NO.:2所示的LCDR序列相差不超过3个氨基酸残基的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。在一些实施方案中，优特克单抗包含与如SEQ ID NO.:1所示的HCDR序列相差不超过2个氨基酸残基或不超过1个氨基酸残基的HCDR1、HCDR2和HCDR序列，以及与如SEQ ID NO.:2所示的LCDR序列相差不超过2个氨基酸残基或不超过1个氨基酸残基的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。在一些实施方案中，优特克单抗包含与如SEQ ID NO.:1所示的序列相差不超过3个氨基酸残基的重链可变结构域，以及与如SEQ ID NO.:2所示的序列相差不超过3个氨基酸残基的轻链可变结构域。在一些实施方案中，优特克单抗包含含有与如SEQ ID NO.:1所示的序列相差不超过5个氨基酸的序列的重链，以及含有与SEQ ID NO.:2的序列相差不超过5个氨基酸残基的序列的轻链。
在一些实施方案中，优特克单抗包含如SEQ ID NO.:1所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，以及如SEQ ID NO.:2所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。在一些实施方案中，优特克单抗包含如SEQ ID NO.:1所示的重链可变结构域以及如SEQ ID NO.:2所示的轻链可变结构域。在一些实施方案中，优特克单抗包含含有SEQ ID NO.:1的序列的重链和/或含有SEQ IDNO.:2的序列的轻链。
SEQ ID NO.:1—优特克单抗重链序列(粗体表示具有加下划线的CDR序列的可变
结构域序列)
SEQ ID NO.:2—优特克单抗轻链序列(粗体表示具有加下划线的CDR序列的可变
结构域序列)
培养方法
在某些情况下，本公开提供了制造包含具有目标水平的一种或多种聚糖的优特克单抗的药物组合物的方法，该方法包括：选择半乳糖水平和细胞培养时间，其中半乳糖水平和时间是逆相关的；在包括所选择的半乳糖水平和时间的条件下，培养经遗传工程化以表达优特克单抗的细胞群；收获由细胞群表达的优特克单抗，从而产生优特克单抗的制剂；以及如果制剂满足一种或多种聚糖的目标水平，则纯化、浓缩和/或配制优特克单抗制剂，以产生包含优特克单抗的药物组合物。在一些实施方案中，一种或多种聚糖的目标水平是选自G0F、唾液酸化聚糖和G2F的聚糖的目标水平。在一些实施方案中，一种或多种聚糖的目标水平是G0F的目标水平。
在某些情况下，本公开提供了产生具有目标水平的一种或多种聚糖的优特克单抗药物产品的方法，该方法包括：在一定条件下培养经遗传工程化以表达优特克单抗的细胞群，其中该条件的特征在于包括所选择的半乳糖水平和细胞培养时间在内的参数，并且其中半乳糖水平和时间是逆相关的；收获由细胞表达的优特克单抗，从而产生优特克单抗制剂；以及如果优特克单抗制剂满足一种或多种聚糖的目标水平，则纯化、浓缩和/或配制优特克单抗制剂以产生优特克单抗药物产品。在一些实施方案中，一种或多种聚糖的目标水平是选自G0F、唾液酸化聚糖和G2F的聚糖的目标水平。在一些实施方案中，一种或多种聚糖的目标水平是G0F的目标水平。
在一些实施方案中，G0F聚糖的目标水平在相对于总聚糖而言20％至80％G0F的范围内。在一些实施方案中，G0F聚糖的目标水平在相对于总聚糖而言25％至65％G0F的范围内。
在一些实施方案中，所提供的方法涉及制造和/或产生具有在相对于总聚糖而言20％至最高40％G0F范围内的目标水平的G0F聚糖的优特克单抗。在一些实施方案中，用于实现具有在相对于总聚糖而言20％至最高40％G0F范围内的目标水平的G0F聚糖的优特克单抗的方法包括0mM的所选择半乳糖水平，以及在7天至15天的范围内的细胞培养时间。
在一些实施方案中，所提供的方法涉及制造和/或产生具有在相对于总聚糖而言40％至80％G0F范围内的目标水平的G0F聚糖的优特克单抗。在一些实施方案中，用于实现具有在相对于总聚糖而言40％至80％G0F范围内的目标水平的G0F聚糖的优特克单抗的方法包括在15mM至30mM范围内的所选择的半乳糖水平，以及在16天至60天范围内的细胞培养时间。在一些特定实施方案中，细胞培养时间在25天至42天的范围内。
在一些实施方案中，所提供的方法还包括选择G0F聚糖的目标水平。在一些实施方案中，G0F聚糖的目标水平在相对于总聚糖而言20％至80％G0F的范围内。在一些特定实施方案中，G0F聚糖的目标水平在相对于总聚糖而言20％至最高40％G0F的范围内，其中该方法包括0mM的所选择的半乳糖水平，以及在7天至15天范围内的细胞培养时间。在一些特定实施方案中，G0F聚糖的目标水平在相对于总聚糖而言40％至80％G0F的范围内，其中该方法包括在15mM至30mM范围内的所选择的半乳糖水平，以及在16天至60天范围内的细胞培养时间。
在一些实施方案中，所提供的方法还包括测量G0F聚糖的水平。在一些实施方案中，如果测量的G0F聚糖水平在相对于总聚糖而言20％至80％G0F的范围内(例如，在相对于总聚糖而言20％至最高40％G0F的范围内，例如在相对于总聚糖而言40％至80％G0F的范围内)，则进行纯化、浓缩、和/或配制优特克单抗制剂的步骤。
在一些实施方案中，所提供的用于制造和/或产生具有目标聚糖水平的优特克单抗的方法包括唾液酸化聚糖和/或G2F聚糖的目标水平。下表1提供了用于具有目标水平的唾液酸化聚糖和/或G2F聚糖的优特克单抗的条件。
表1——用于产生具有目标G2F和唾液酸化聚糖水平的优特克单抗制剂的示例性
条件
| 聚糖范围 | G2F | 总唾液酸化 |
| NCM-1(0mM半乳糖，培养时间7-15天) | >5％-10％ | >15％-30％ |
| NCM-2(15-30mM半乳糖，培养时间25-60天) | 1％-5％ | 5％-15％ |
在一些实施方案中，所提供的方法涉及制造和/或产生具有在相对于总聚糖而言15％至30％唾液酸化聚糖范围内的目标水平的唾液酸化聚糖的优特克单抗。在一些实施方案中，用于实现具有在相对于总聚糖而言15％至30％唾液酸化聚糖范围内的目标水平的唾液酸化聚糖的优特克单抗的方法包括0mM的所选择的半乳糖水平，并且细胞培养时间在7天至15天的范围内。
在一些实施方案中，所提供的方法涉及制造和/或产生具有在相对于总聚糖而言5％至最高15％唾液酸化聚糖范围内的目标水平的唾液酸化聚糖的优特克单抗。在一些实施方案中，用于实现具有在相对于总聚糖而言5％至最高15％唾液酸化聚糖范围内的目标水平的G0F聚糖的优特克单抗的方法包括在15mM至30mM范围内的所选择的半乳糖水平，以及在16天至60天范围内的细胞培养时间。在一些特定实施方案中，细胞培养时间在25天至42天的范围内。
在一些实施方案中，所提供的方法涉及制造和/或产生具有在相对于总聚糖而言5％至10％G2F范围内的目标水平的G2F聚糖的优特克单抗。在一些实施方案中，用于实现具有在相对于总聚糖而言5％至10％G2F范围内的目标水平的G2F聚糖的优特克单抗的方法包括0mM的所选择的半乳糖水平，以及在7天至15天的范围内的细胞培养时间。
在一些实施方案中，所提供的方法涉及制造和/或产生具有在相对于总聚糖而言1％至最高5％G0F范围内的目标水平的G2F聚糖的优特克单抗。在一些实施方案中，用于实现具有在相对于总聚糖而言1％至最高5％G2F范围内的目标水平的G2F聚糖的优特克单抗的方法包括在15mM至30mM范围内的所选择的半乳糖水平，以及在16天至60天范围内的细胞培养时间。在一些特定实施方案中，细胞培养时间在25天至42天的范围内。
在一些实施方案中，所提供的方法在整个培养步骤中控制(例如在从t＝0直至收获的培养期间控制)所选择的半乳糖水平。
在一些实施方案中，所提供的方法包括培养经遗传工程化以表达优特克单抗的哺乳动物细胞群。在一些实施方案中，哺乳动物细胞选自：CHO细胞、HEK 293细胞、纤维肉瘤HT1080细胞、PER.C6细胞、CAP细胞、HKB-11细胞、HuH-7细胞、NS0细胞和SP 2/0细胞。
在一些实施方案中，在所提供的方法中，培养步骤是使用连续培养方法进行的。在一些实施方案中，所提供的方法包括使用灌注培养方法(例如基于交替切向流过滤器(ATF)的灌注培养方法)所进行的培养。在一些特定实施方案中，所提供的方法包括通过灌注培养方法来培养经遗传工程化以表达优特克单抗的哺乳动物细胞(例如表达优特克单抗的SP2/0细胞)。
在一些实施方案中，提供了包括在细胞培养时间的时间范围内两次或更多次收获由细胞表达的优特克单抗的方法。
在一些实施方案中，目标值是预定药学产品规格或用于药物制剂的质量控制标准，例如分析证书(CofA)、检验证书(CofT)或母料记录。在一些实施方案中，产品规格是FDA标签、医师插页、USP专著或EP专著中的产品描述。
一般来讲，本公开的细胞培养方法包括在25℃至40℃范围内的温度下以及在地球上遇到的重力下培养。在一些实施方案中，所提供的培养细胞群的方法足以表达优特克单抗产物。细胞培养基通常包含适当的能量来源和调节细胞周期的化合物。一般来讲，培养基包含例如本领域的技术人员已知的氨基酸、维生素、无机盐和葡萄糖。在一些实施方案中，细胞培养基具有6至8的pH。用于动物细胞培养的培养基是本领域熟知的，并且技术人员针对特定目的和/或细胞类型常规地优化。
在一些实施方案中，本公开的方法包括经由连续细胞培养系统(例如，灌注细胞培养系统)培养细胞群。在一些实施方案中，连续细胞培养系统包括生物反应器罐和细胞保留装置。在一些实施方案中，连续细胞培养系统包括生物反应器罐、细胞保留装置、培养基供应和排放废物收集。在一些实施方案中，连续细胞培养系统包括细胞群(例如经工程化以表达优特克单抗的细胞群，例如由经工程化以表达优特克单抗的细胞组成的细胞群)和细胞培养基。
在一些实施方案中，细胞保留装置为或包括连续离心机、交替切向流过滤器(ATF)、切向流膜过滤器(TFF)、动态过滤器、旋转过滤器、超声和介电泳分离器、或重力沉降槽。在一些特定实施方案中，细胞保留装置为或包括ATF。
在一些实施方案中，生物反应器系统包括搅拌罐生物反应器、细胞保留装置、培养基供应和排放废物收集。
在一些实施方案中，生物反应器系统(例如灌注生物反应器系统)包括喷洒器。在一些实施方案中，生物反应器系统包括钻孔喷洒器。在一些实施方案中，生物反应器系统包括开口管喷洒器。在一些实施方案中，生物反应器系统包括烧结喷洒器。
在一些实施方案中，本公开的方法包括在1L至3000L范围内的体积下培养细胞群(例如经工程化以表达优特克单抗的细胞群，例如由经工程化以表达优特克单抗的细胞组成的细胞群)。在一些实施方案中，所提供的方法包括培养经遗传工程化以在至少25L、50L、100L、200L、250L、400L、500L、600L、800L、1000L或2000L的体积下表达优特克单抗的哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所提供的方法包括培养经遗传工程化以在约25L至约250L的体积下表达优特克单抗的哺乳动物细胞。
聚糖评估
在一些实施方案中，优特克单抗的聚糖通过任何可用的合适方法进行分析(例如测量)。在一些情况下，如本文所述的聚糖结构和组合物例如通过酶促、色谱、质谱(MS)、色谱后接MS、电泳方法、电泳方法后接MS、核磁共振(NMR)方法以及它们的组合中的一种或多种进行分析。示例性酶促方法包括使优特克单抗制剂与一种或多种酶在足以释放一种或多种聚糖(例如，一种或多种暴露的聚糖)的条件和时间下接触。在一些情况下，所述一种或多种酶包括PNGase F。示例性色谱方法包括但不限于使用脉冲安培检测的高效阴离子交换色谱(SAX-PAD)、液相色谱(LC)、高效液相色谱(HPLC)、超高效液相色谱(UPLC)、薄层色谱(TLC)、酰胺柱色谱以及它们的组合。示例性质谱(MS)包括但不限于串联MS、LC-MS、LC-MS/MS、基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI-MS)、傅里叶变换质谱(FTMS)、离子迁移分离-质谱(IMS-MS)、电子转移解离(ETD-MS)以及它们的组合。示例性电泳方法包括但不限于毛细管电泳(CE)、CE-MS、凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳、丙烯酰胺凝胶电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后接使用识别特定聚糖结构的抗体进行Western印迹、以及它们的组合。示例性核磁共振(NMR)包括但不限于一维NMR(1D-NMR)、二维NMR(2D-NMR)、相关光谱学磁角旋转NMR(COSY-NMR)、总相关光谱学NMR(TOCSY-NMR)、异核单量子相干NMR(HSQC-NMR)、异核多量子相干(HMQC-NMR)、旋转核欧佛豪瑟效应频谱NMR(ROESY-NMR)、核欧佛豪瑟效应频谱(NOESY-NMR)以及它们的组合。
细胞
可在本文所述的方法中使用可用于表达优特克单抗的任何宿主细胞。在一些实施方案中，经工程化以表达优特克单抗的细胞包括编码优特克单抗产物的一种或多种核酸，该优特克单抗产物包含如SEQ ID NO.:1所示的重链可变结构域和/或如SEQ ID NO.:2所示的轻链可变结构域。在一些实施方案中，经工程化以表达优特克单抗的细胞包括编码优特克单抗产物的一种或多种核酸，该优特克单抗产物包含含有SEQ ID NO.:1的序列的重链和/或含有SEQ ID NO.:2的序列的轻链。在一些实施方案中，经工程化以表达优特克单抗的细胞包括编码优特克单抗产物的一种或多种核酸，该优特克单抗产物包含如SEQ ID NO.:1所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列以及如SEQ ID NO.:2所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
在一些实施方案中，经工程化以表达优特克单抗的细胞包括编码优特克单抗产物的一种或多种核酸，该优特克单抗产物具有与例如在二级审批流程下被批准用于人或动物的治疗或诊断用途的蛋白质相同的一级氨基酸序列。在一些实施方案中，经工程化以表达优特克单抗的细胞包括编码与经批准的治疗或诊断蛋白质相差不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个残基的优特克单抗产物的一种或多种核酸。在一些实施方案中，经工程化以表达优特克单抗的细胞包括编码与经批准的治疗或诊断蛋白质具有至少90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的蛋白质的一种或多种核酸。术语“相同的一级氨基酸序列”、“相差不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个残基的一级氨基酸序列”、“具有至少98％或更高的序列同一性的序列”或类似术语涉及一级氨基酸序列之间的同一性水平。在一些实施方案中，蛋白质制剂或产物包括氨基酸变体，例如在末端残基处(例如在一个或两个末端残基处)不同的物类。在此类情况的一些实施方案中，所比较的序列同一性是被比较的每种产物中丰度最高(例如丰度最高的活性)物类的一级氨基酸序列之间的同一性。在一些实施方案中，序列同一性是指由可用于制备优特克单抗产物的核酸编码的氨基酸序列。
在一些实施方案中，经工程化以表达优特克单抗的细胞是哺乳动物细胞。
在一些实施方案中，经工程化以表达优特克单抗的细胞是小鼠细胞。在一些实施方案中，经工程化以表达优特克单抗的细胞来自鼠细胞系。小鼠(例如鼠)细胞系包括例如鼠骨髓瘤细胞系，例如NS0细胞和SP 2/0细胞。
在一些实施方案中，经工程化以表达优特克单抗的细胞是人细胞。在一些实施方案中，经工程化以表达优特克单抗的细胞来自人细胞系。人细胞系包括例如HEK 293：人胚肾293；HT-1080：来自具有上皮样表型的纤维肉瘤；PER.C6：来自经由用腺病毒E1基因转染永生化的人胚胎视网膜细胞；CAP：来自通过腺病毒类型5E1基因永生化的人羊水细胞；HKB-11：通过HEK293-S与人B细胞系的聚乙二醇融合创建；以及HuH-7：来自人肝细胞癌。在一些特定实施方案中，剪切敏感性细胞选自：HEK 293细胞、纤维肉瘤HT 1080细胞、PER.C6细胞、CAP细胞、HKB-11细胞和HuH-7细胞。
在一些实施方案中，表达如本文所述的优特克单抗产物的细胞群使用重组方法来产生。基因(诸如，编码多肽诸如本文所述的抗体试剂的基因)的重组表达可包括构建含有编码多肽的多核苷酸的表达载体。一旦获得了多核苷酸，可以使用本领域已知的技术通过重组DNA技术来产生用于产生多肽的载体。已知的方法可用于构建含有多肽编码序列以及适当的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。
一旦通过重组表达产生了本文所述的优特克单抗产物，其可以通过本领域已知的用于纯化的任何方法，例如通过色谱法(例如离子交换、亲和以及分级柱色谱法)、离心、差别性溶解度，或通过用于纯化蛋白质的任何其他标准技术进行纯化。例如，可通过适当地选择和组合亲和柱诸如A蛋白柱与色谱柱、过滤、超滤、盐析和透析过程来分离和纯化优特克单抗(参见Antibodies:A Laboratory Manual,Ed Harlow,David Lane,Cold SpringHarbor Laboratory,1988)。此外，如本文所述，可使优特克单抗产物与异源多肽序列融合以促进纯化。
药物组合物
可以将使用本文所述的任何方法、系统和/或过程产生或制造的优特克单抗产物引入药物组合物中。此类药物组合物可用于预防和/或治疗疾病。包含优特克单抗的药物组合物可以通过本领域的技术人员已知的方法进行配制(参见例如Remington’sPharmaceutical Sciences,第20版,Lippincott Williams&Wilkins,2000)。药物组合物能够以可注射制剂的形式(包括在水或另一种药学上可接受的液体中的无菌溶液或悬浮液)肠胃外施用。例如，可通过将细胞产物(例如重组蛋白，例如糖蛋白，例如抗体试剂)与药学上可接受的载体或介质(诸如无菌水和生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、调味赋形剂、稀释剂、媒介物、防腐剂、粘结剂)适当地组合，然后以公认的药学实践所需的单位剂型进行混合来配制药物组合物。药物制剂中包含的活性成分的量使得提供指定范围内的合适剂量。
在一些实施方案中，优特克单抗的制剂包含蔗糖作为稳定剂/张力调节剂。在一些实施方案中，优特克单抗的制剂包含组氨酸(例如L-组氨酸)作为缓冲剂。在一些实施方案中，优特克单抗的制剂包含聚山梨酸酯80作为表面活性剂。在一些特定实施方案中，优特克单抗的制剂包含组氨酸(例如L-组氨酸)、蔗糖和聚山梨酸酯80。
在一些实施方案中，优特克单抗的制剂被配制用于肠胃外施用，例如静脉内注射、肌内注射、腹膜内注射、皮下注射。在一些实施方案中，优特克单抗的制剂被配制用于皮下施用。
本公开通过以下实施例进一步举例说明。这些实施例仅被提供为了进行示意性的说明。它们不应理解为以任何方式限制本公开的范围或内容。
实施例
实施例1：优特克单抗产物的聚糖组成变化的鉴定
该实施例鉴定了市售优特克单抗参考蛋白产品(“RPP”)批量中聚糖组成的显著变化。具体地，本实施例展示了在分成两种不同聚糖谱的市售优特克单抗批量中聚糖组成的变化性。这两组聚糖变体在本文中被称为“第1组”，其以相对高水平的G0F聚糖为特征；以及“第2组”，其以相对低水平的G0F聚糖为特征。
分析了三十(30)批优特克单抗RPP。在这30批中，28批来自90mg/mL制剂，并且2批为5mg/mL制剂。在28批90mg/mL优特克单抗RPP中，这些批中的八(8)批被鉴定为具有第1组聚糖谱，并且二十(20)批被鉴定为具有第2组聚糖谱。参见图1。
第1组和第2组样品的主要聚糖物类各自的平均丰度的总结汇总于下表2中。
表2：第1组和第2组优特克单抗样品中主要聚糖的丰度
| 聚糖(％) | 第1组 | 第2组 |
| 4,3,1,0,0(G0F) | 27.7 | 62.1 |
| 4,4,1,0,0A(G1F-A) | 28.1 | 14.1 |
| 4，4，1，0，0 B(G1F-B) | 6.6 | 3.5 |
| 4，4，1，0，1 A | 5.4 | 4.1 |
| 4，4，1，0，1 B | 3.2 | 2.9 |
| 4，5，1，0，0(G2F) | 8.4 | 2.3 |
| 4,6,1,0,0 | 1.4 | 0.2 |
| 4,5,1,0,1 | 6.7 | 2.1 |
| 4,5,1,0,2 | 2.0 | 0.9 |
| 4,6,1,0,1 B | 3.4 | 0.7 |
| 以上的总和 | 92.9 | 92.9 |
还分析了通过在3L至250L范围内的不同体积下用5mM半乳糖培养(例如通过基于ATF的灌注培养方法)42天的持续时间所生成的优特克单抗测试产物。这些优特克单抗测试产物的聚糖丰度描绘于图1的各图的最右侧分组中。优特克单抗测试产物的聚糖谱在第1组和第2组RPP的那些的范围内。因此，本实施例鉴定了市售优特克单抗RPP的两组不同聚糖谱，并且展示了同期培养条件产生具有这两组范围内的中间聚糖丰度的优特克单抗测试产物。
实施例2：培养时间影响优特克单抗聚糖组成
本实施例展示了收获收集时间选择是用于控制优特克单抗聚糖组成的要素。如图2所描绘，G0F聚糖相对于总聚糖的丰度通常随培养持续时间而减小。例如，在培养13天时收获的优特克单抗制剂具有几乎50％丰度的G0F聚糖，而在培养34天或更多天后收获的样品具有相对于总聚糖组合物而言小于30％的G0F聚糖。
令人感兴趣地，本公开提供了如下认识：培养持续时间(即直到收获的时间)的减少伴随着G0F水平的增加；而培养持续时间(即直到收获的时间)的增加与G0F水平的下降相结合。
因此，该实施例展示了增加培养时间可以降低G0F聚糖相对于总聚糖组合物的丰度，并且还描述了可以改变培养时间以控制优特克单抗聚糖组成。
实施例3：具有第1组和第2组聚糖谱的优特克单抗产物的生成
本实施例鉴定了培养时间与培养基中半乳糖浓度之间的逆相关，该逆相关可以充当控制优特克单抗聚糖水平(例如半乳糖基化)的过程手段。本实施例展示了具有工程化聚糖谱的非一致性材料(即非一致性优特克单抗制剂)的产生。具体地，本实施例展示了两种非一致性优特克单抗制剂的产生，它们在本文中称为NCM-1和NCM-2，且已经被工程化成使聚糖谱分别匹配第1组RPP和第2组RPP(如以上实施例1中所述)。
具体地，通过用15mM半乳糖培养(例如通过基于ATF的灌注培养方法)并在培养的第16天之前收获优特克单抗(例如，在7天至15天范围内的时间点收获)来生成NCM-1制剂。相比之下，通过在缺乏半乳糖(0mM半乳糖)的培养基中培养(例如通过基于ATF的灌注培养方法)并在培养的第25天之后收获优特克单抗(例如，在34天至45天范围内的时间点收获)来生成NCM-2制剂。如图3所描述，对于所分析的每种聚糖物类(包括G0F、G1FA、G1FB、G2F、总唾液酸化、主要、酸性和碱性聚糖)，NCM-1聚糖谱与第1组RPP的那些良好地相关，并且NCM-2聚糖谱与第2组RPP的那些良好地相关。表3提供了通过控制半乳糖浓度和培养时间的过程手段而工程化的每种聚糖的示例性目标范围。
表3—NCM-1和NCM-2优特克单抗制剂的示例性目标聚糖范围
因此，本实施例展示，半乳糖浓度与培养时间的逆相关要素可以用作控制聚糖组成的过程手段，并且可以用于产生具有目标聚糖水平的非一致性优特克单抗制剂。
等同方案
应当理解，虽然已结合本公开的具体实施方式描述了本公开，但是前述描述旨在说明而非限制由随附权利要求书所限定的本发明的范围。其他方面、优点和修改均在以下权利要求书的范围内。
Claims (12)
1.一种制造包含具有目标水平的G0F聚糖的优特克单抗的药物组合物的方法，所述方法包括：
(a)选择G0F聚糖的目标水平，
(b)选择半乳糖水平和细胞培养时间以提供所选择的G0F聚糖水平，其中所述半乳糖水平和所述时间是逆相关的；
(c)在包括所选择的半乳糖水平和时间的条件下，培养经遗传工程化以表达优特克单抗的细胞群；
(d)收获由所述细胞群表达的优特克单抗，从而产生优特克单抗的制剂；以及
(e)如果所述制剂满足所述G0F聚糖的目标水平，则纯化、浓缩和/或配制优特克单抗制剂，以产生包含优特克单抗的药物组合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养是使用灌注培养方法进行的。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述G0F聚糖的目标水平在相对于总聚糖而言20％至80％G0F的范围内。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述G0F聚糖的目标水平在相对于总聚糖而言25％至65％G0F的范围内。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述G0F聚糖的目标水平在相对于总聚糖而言20％至最高40％G0F的范围内，其中所选择的半乳糖水平为0mM，并且其中所述细胞培养时间在7天至15天的范围内。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述G0F聚糖的目标水平在相对于总聚糖而言40％至80％G0F的范围内，其中所选择的半乳糖水平在15mM至30mM的范围内，并且其中所述细胞培养时间在16天至60天的范围内。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述细胞培养时间在25天至42天的范围内。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，还包括测量G0F聚糖的水平。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中经遗传工程化以表达优特克单抗的所述细胞群是哺乳动物细胞。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述哺乳动物细胞选自CHO细胞、HEK 293细胞、纤维肉瘤HT 1080细胞、PER.C6细胞、CAP细胞、HKB-11细胞、HuH-7细胞、NS0细胞和SP 2/0细胞。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所选择的半乳糖水平在从t＝0直至收获的培养期间控制。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中在所述细胞培养时间的时间范围内两次或更多次收获由所述细胞表达的优特克单抗。
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