CN105779394A - 一种降低抗体酸性峰含量和改良抗体糖型的细胞培养方法 - Google Patents

一种降低抗体酸性峰含量和改良抗体糖型的细胞培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种降低抗体酸性峰含量和改良抗体糖型的细胞培养方法，该方法以GS‑CHO细胞为表达系统，在基础培养基中添加谷氨酰胺来进行抗体表达的细胞株培养。本发明在基础培养基中添加谷氨酰胺后能有效的降低抗体酸性峰含量和改良糖基化水平，从而改进抗体药物的活性和药效，提高抗体质量使之与标准品接近，该方法适于抗体新药物的开发研究和后期的规模化生产，具有很好的应用前景和经济效益。

Description

一种降低抗体酸性峰含量和改良抗体糖型的细胞培养方法
技术领域
本发明涉及一种细胞培养方法，具体涉及一种降低抗体酸性峰含量和改良抗体糖型的细胞培养方法。
背景技术
CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞，ChineseHamsterOvery)是生产蛋白药物应用最为广泛的宿主细胞之一，相对于其他细胞表达系统，CHO细胞表达系统能够与外源基因稳定地整合并经过复杂的翻译后修饰表达出与天然蛋白结构、免疫原性、糖基化类型和方式等几乎相同的蛋白，从而能够保证重组蛋白的药性和药效。此外，CHO细胞很少分泌自身的内源蛋白，也有利于外源蛋白的后期分离纯化。
单克隆抗体具有复杂的分子结构和较大的分子量，在再生产及其后期的储存过程中可产生大量的修饰，比如糖基化、C末端赖氨酸的截除、氧化脱酰胺等，使得抗体分子可以产生多种异构体，这些异构体的组合就产生了单克隆抗体的电荷异质性、糖基化修饰异质性、分子量大小异构性等。
糖基化作为抗体最重要的翻译后修饰对抗体的生物活性具有重要的作用，各种糖基的类型和含量对单抗药物的药化药代特性及药效的发挥有着重要的作用，因此糖基化水平和糖基化修饰类型是单抗药物的重要参数。现有的改变糖基化的方法主要是通过基因水平来改造宿主细胞相关的糖基化酶进而改变抗体的糖型或糖基化水平，但该方法周期长，并且由于其安全性、复杂性和稳定性需要较长时间的验证和确定，不利于生物制品的审批。而中国专利CN103320388A通过优化表达抗体的细胞株的基础培养基和补料批次方法，来改善抗体的糖基化水平，但该方法流程较为复杂，受培养基限制较大，很难广泛的应用到实际生产中去。
由于单抗类制品在翻译后修饰过程中产生的电荷异质性对单抗稳定性及生物学功能的发挥具有重要的影响，因而其成为单抗生产工艺中需要控制的非常重要的质量属性，也是生产工艺稳定性的重要反应指标。电荷异质性产生酸碱峰，其中碱性峰主要来源于C末端赖氨酸的不均一性、甲硫氨酸氧化或天冬氨酸转变为丁二酰亚胺等，而酸性峰一般来源于N-糖末端的唾液酸化修饰、氨基酸残基的脱酰胺等。但此两种峰具有相似的化学性质，通过后期纯化分离控制电荷异质性具有一定的难度，而通过控制细胞培养工艺流程来控制抗体电荷异质性的方法也具有一定的挑战性，成为本领域一直难于解决的问题。
发明内容
本发明为了克服上述现有技术中存在的缺陷和不足提供了一种表达系统为GS-CHO的细胞培养方法。该方法通过在现有的商业化哺乳动物细胞培养基中添加谷氨酰胺，采用GS-CHO表达系统的细胞培养工艺来表达抗体，能在降低抗体酸性峰的同时改良抗体的糖基化水平，使得抗体质量与原药标准品一致，保证了抗体的药效。
为了实现上述目的，本发明的技术方案提供了一种降低抗体酸性峰含量和改良抗体糖型的细胞培养方法，其特征在于，以GS-CHO细胞为表达系统，在基础培养基中添加谷氨酰胺。
在本发明的一些实施方式中，基础培养基选自CDM4PERMAb、HycellCHOMedium、CDM4MAb、CDFortiCHOAGT、TFS-RDMP-1或TFS-RDMP-9。
在本发明的一些实施方式中，谷氨酰胺的浓度为2～20mM；在一些实施方式中谷氨酰胺的浓度为2.5mM、3mM、4mM、5mM、8mM、10mM、13mM、15mM、17Mm或19mM。
在本发明的一些实施方式中，谷氨酰胺的浓度为2～6mM。
在本发明的一些实施方式中，细胞培养方法包括以下步骤：
a)将含谷氨酰胺的基础培养基加入培养皿中，接种细胞后，在37℃下培养；
b)当葡萄糖的浓度低于3～15g/L或谷氨酸单钠盐浓度低于3～12mM时，在培养皿中补加流加培养基；
c)培养6天后将培养温度调到32～34℃，继续培养7～9天。
在本发明的一些实施方式中，流加培养基选自浓缩补料培养基CHOCDEfficientFeedTMA、EfficientFeedTMA+AGT_Supplement、EfficientFeedTMB、EfficientFeedTMB+AGT_Supplement、EfficientFeedTMC、EfficientFeedTMC+AGT_Supplement、CellventoTMFeed200或ActiCHOFeedA。
在本发明的一些实施方式中，GS-CHO表达系统为携带GS基因的并且GS基因下游插入了外源基因的表达载体转染至CHO细胞。
有益效果：
本发明使用表达系统为GS-CHO的细胞培养方法，在基础培养基中添加谷氨酰胺来进行抗体表达的细胞株的培养，该方法能够在降低酸性峰的同时达到优化抗体糖基化水平的目的，使得抗体的酸性峰和糖基化水平与原药标准品一致，保证了抗体的药效。
附图说明
图1是实施例1中的细胞株A补料批次实验的细胞活率；
图2是实施例1中的细胞株A补料批次实验的活细胞密度；
图3是实施例1中的细胞株A补料批次实验的抗体相对表达量图；
图4是实施例1中的细胞株A补料批次实验抗体的酸性峰比例图；
图5是实施例1中的细胞株A补料批次实验抗体的糖基化含量图；
图6是实施例中抗体的糖基结构图。
图7是实施例2中的细胞株B补料批次实验的细胞活率；
图8是实施例2中的细胞株B补料批次实验的活细胞密度；
图9是实施例2中的细胞株B补料批次实验的抗体相对表达量图；
图10是实施例2中的细胞株B补料批次实验抗体的酸性峰比例图；
图11是实施例2中的细胞株B补料批次实验抗体的糖基化含量图；
具体实施方式
本发明实施例中的CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)细胞株A和细胞株B购自invitrogen公司；肿瘤坏死因子-α(TNFα)抗体和重组人肿瘤坏死因子受体-Fc重组蛋白(rhTNFR-Fc)抗体的细胞株为自主构建。下面结合附图与具体实施方式对本发明做进一步详细的阐述。
本发明中所用的基础培养基CDM4PERMAb、HycellCHOMedium、CDM4MAb、TFS-RDMP-1和TFS-RDMP-9购自Hyclone，CDFortiCHOAGT购自(Gibco)；流加培养基CHOCDEfficientFeedTMA、EfficientFeedTMA+AGT_Supplement、EfficientFeedTMB、EfficientFeedTMB+AGT_Supplement、EfficientFeedTMC和EfficientFeedTMC+AGT_Supplement购自Gibco，CellventoTMFeed200购自Milipore、ActiCHOFeedA购自Hyclone；标准品为英国雅培制药公司旗下的产品修美乐(阿达木单抗)。
实施例1
一种表达抗肿瘤坏死因子-α(TNFα)抗体的细胞株A的培养。
在细胞培养实验中，第0天将终浓度分别为0mM(对照组)、2mM、4mM、6mM的谷氨酰胺的基础培养基CDM4PERMAb分别全部加入到500ml摇瓶中，细胞以1×106cells/mL进行接种，在37℃下培养，从第3天开始每天测定细胞活力和密度及培养中各种生化参数，并进行流加培养，流加培养基为CHOCDEfficientFeedTMA，根据生化分析仪检测的结果控制葡萄糖浓度在5g/L，谷氨酸单钠盐浓度在4mM，第6天开始将温度控制在33℃，在细胞培养的第15天进行收获。
细胞培养过程中涉及细胞活率和密度、抗TNFα抗体浓度、抗TNFα抗体电荷异质性、抗TNFα抗体纯度和抗TNFα抗体糖基化的检测，具体测试方法如下：
细胞活率和密度的测定：
通过台盼蓝染色法用细胞活力分析仪测定。
抗TNFα抗体浓度的测定：
通过HPLC法测定，用0.1M磷酸缓冲液以2ml/min流速平衡HPLC系统15min至基线平稳，于系统程序中设置标准曲线法程序。进样50μl，以2ml/min流速洗脱，记录有关数据，并进行处理。
抗TNFα抗体电荷异质性的测定：
通过HPLC法测定：进样体积为100μl，流速1ml/min，检测波长280nm，样品盘温度8℃，柱温40℃，运行时间22min。
抗TNFα单抗纯度的测定：
用毛细管电泳检测，毛细管电泳系统分别用1MNaOH洗5min、水洗5min及分离缓冲液洗10min。每次进样前，分别用0.1MNaOH及分离缓冲液洗1min后进样。毛细管长30.2cm，有效长度20cm，检测波长220nm，柱温25℃，样品盘15℃。
HPLC-MS检测抗TNFα抗体糖基化：
色谱条件(色谱柱：Agilent-C8，75×2.1mm，5μm，300埃)：进样体积2μl，检测波长280nm，流速0.5ml/min，柱温75℃，样品盘温度8℃；
质谱条件：仪器模式AutoMS/MS，离子模式DualAJSESI源，阳离子，干燥气体N2，12L/min，325℃；碰撞电压260V；工作电压65V；毛细管电压4000V；夹套气体温度(流速)：350℃，12L/min；气体温度325℃；VCap：3500V；喷头电压1000V；分离器电压65V；OCT1RFVpp电压750V；质量范围500-3200m/z。
细胞株A流加培养实验的细胞活率、活细胞密度、抗体表达量、酸性峰及糖基化(G0F，G1F，G2F)水平的检测结果分别依次见附图1-5，图6为糖基结构图。
细胞株A在不同补料批次实验中的细胞活率和活细胞密度如图1-2所示，根据以上培养条件在培养的第15天细胞活率都能维持94％以上，在培养的第8天左右，细胞密度都能达到最大值2.8×107cells/mL以上；如图3所示，抗体最终表达量与基础培养基中谷氨酰胺的浓度成反比，但相对于对照组，实验组抗体表达量都在95％以上。此外，随着基础培养基中谷氨酰胺终浓度的增大，酸性峰比例逐渐由30.21％降到23.64％(图4)。从图5中的糖基化(G0F，G1F，G2F)含量图可以看出，随着基础培养基中谷氨酰胺浓度的增大，G2F和G1F逐渐减小，G0F逐渐增大，三者的变化都逐渐趋于标准品的糖基化水平。
由上可知，该方法可有效的降低酸性峰和改善糖基化水平，使得抗体表达质量和标准品趋于一致。
实施例2
细胞株B进行重组人肿瘤坏死因子受体-Fc重组蛋白(rhTNFR-Fc)抗体的表达培养。
在细胞培养实验中，第0天将终浓度分别为0mM(对照组)、2mM、4mM、6mM的谷氨酰胺的基础培养基CDFortiCHOAGT分别全部加入到500ml摇瓶中，细胞以1×106cells/mL进行接种，在37℃下培养，从第三天开始每天测定细胞活力和密度及培养中各种生化参数，并进行流加培养，流加培养基为EfficientFeedTMB+，根据生化分析仪检测的结果控制葡萄糖浓度在10g/L，谷氨酸单钠盐浓度在8mM，第六天开始将温度控制在34℃，到细胞培养的第13天进行收获。抗体质量检测方法同实施例1，细胞株B流加培养实验过程中的细胞活率、活细胞密度、抗体表达量、酸性峰及糖基化(G0F，G1F，G2F)测试结果分别依次见附图7-11。
细胞株B在不同基础培养基补料方法中的细胞活率和活细胞密度如表7和8所示，细胞活率都能维持90％以上，从第7天开始，细胞密度都能保持在1×107cells/mL以上。抗体表达量随基础培养基中谷氨酰胺终浓度的增加逐渐降低(图9)，但相对于对照组，实验组抗体表达量基本保持在98％以上，说明抗体表达量变化不大。图10显示增大谷氨酰胺浓度可以降低酸性峰，使得酸性峰含量由40.35％逐渐降低到37.5％。图11显示通过增加谷氨酰胺浓度，抗体糖基化(G0F，G1F，G2F)水平逐渐接近标准品糖基化水平，通过增大谷氨酰胺浓度逐渐降低了G2F和G1F，增加了G0F的含量，三者的变化都逐渐趋于标准品的糖基化水平。
由上可知，该方法可有效的降低酸性峰和改善糖基化水平，使得抗体表达质量和标准品趋于一致。

Claims (7)

1.一种降低抗体酸性峰含量和改良抗体糖型的细胞培养方法，其特征在于，以GS-CHO细胞为表达系统，在基础培养基中添加谷氨酰胺。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述谷氨酰胺的浓度为2～20mM。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述谷氨酰胺的浓度为2～6mM。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的基础培养基选自CDM4PERMAb、HycellCHOMedium、CDM4MAb、CDFortiCHOAGT、TFS-RDMP-1或TFS-RDMP-9。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞培养方法包括以下步骤：
a)将含谷氨酰胺的基础培养基加入培养皿中，接种细胞后，在37℃下培养；
b)当葡萄糖的浓度低于3～15g/L或谷氨酸单钠盐浓度低于3～12mM时，在培养皿中补加流加培养基；
c)培养6天后将培养温度调到32～34℃，继续培养7～9天。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述流加培养基选自浓缩补料培养基CHOCDEfficientFeedTMA、EfficientFeedTMA+AGT_Supplement、EfficientFeedTMB、EfficientFeedTMB+AGT_Supplement、EfficientFeedTMC、EfficientFeedTMC+AGT_Supplement、CellventoTMFeed200或ActiCHOFeedA。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述GS-CHO表达系统为携带GS基因的并且GS基因下游插入了外源基因的表达载体转染至CHO细胞。
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