CN108823267B - 调节cho-k1表达系统所分泌抗体的酸性峰含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种调节CHO‑K1表达系统所分泌抗体的酸性峰含量的方法，将CHO‑K1细胞接种到培养基中进行细胞培养，在细胞培养过程中添加调节剂，继续培养以使CHO‑K1细胞分泌具有合适酸性峰含量的目的抗体，其中，调节剂选自酪氨酸和半胱氨酸中的至少一种。这种方法在细胞培养工艺流程即能够根据需要，调节酪氨酸或半胱氨酸的添加量即可提高或降低抗体酸性峰含量，且调节剂不影响细胞的生长，抗体表达量高。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养方法领域，特别是涉及一种调节CHO-K1表达系统所分泌抗体的酸性峰含量的方法。
背景技术
单克隆抗体具有高特异性、低副作用、效果优异的特点，在治疗和诊断中应用越来越广泛。其中，CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞，Chinese Hamster Overy)是生产单克隆抗体蛋白药物应用最为广泛的宿主细胞，有近70％已经上市的治疗性蛋白是由CHO细胞表达生产的。相对于其他细胞表达系统，CHO细胞具有与人相似的翻译后修饰、历史背景清晰、细胞稳健、生长迅速等优势。
然而由于单克隆抗体具有复杂的大分子结构，在生产和储存过程中会产生大量修饰。比如糖基化、氧化、脱酰胺等，使得抗体产生大量的异质性，也被称为电荷异构体。采用CEX-HPLC或CIEF方法进行分析会得到一系列的峰，主要分为三类酸性峰、主峰、碱性峰。电荷异构体对单抗稳定性及生物学功能的发挥具有重要的影响，因而其成为单抗生产工艺中需要控制的非常重要的质量属性，也是生产工艺稳定性的重要反应指标。电荷异构体产生酸碱峰，碱性峰主要来源于C末端赖氨酸去除不完全、N末端焦谷氨酰胺环化胺等。酸性峰一般来源于N-糖末的唾液酸化修饰、氨基酸残基的脱酰胺等。但此酸性峰和碱性峰对应的电荷异构体具有相似的化学性质，通过后期纯化分离控制电荷异质性具有一定的难度，而通过控制细胞培养工艺流程来控制抗体电荷异质性的方法也具有一定的挑战性，成为本领域一直难于解决的问题。
一种方法是在培养基中添加谷氨酰胺降低酸性峰的含量，然而谷氨酰胺对后期的工艺的稳定性带来非常不利的影响，在培养过程中加入谷氨酰胺后，谷氨酰胺易降解，产生大量NH4+，对细胞生长表达带来不利的影响。此外，对于CHO表达系统，加入谷氨酰胺仅能降低所分泌抗体的酸性峰的含量，无法根据需要提高抗体酸性峰的含量。对于一些抗体类的生物类似药，常存在与原药相比酸性峰含量降低的情况，但在临床使用中，出于安全性的考虑，保持类似药和原药相似的酸性峰是非常有必要的，因此如何提高抗体酸性峰含量是一个非常棘手的问题。
发明内容
基于此，有必要提供一种能够根据需要调节CHO-K1表达系统所分泌抗体的酸性峰含量并能够提高抗体表达量的方法。
一种调节CHO-K1表达系统所分泌抗体的酸性峰含量的方法，包括如下步骤：
将CHO-K1细胞接种到培养基中进行细胞培养，及
在所述细胞培养过程中添加调节剂，继续培养以使所述CHO-k1细胞分泌具有合适酸性峰含量的目的抗体，其中，所述调节剂选自酪氨酸和半胱氨酸中的至少一种。
在一个实施方式中，其中所述培养基为：CD optiCHOTM AGTTM培养基、CellventoTMCD-220培养基、Dynamis培养基或Advance培养基中的一种或多种的混合。
在一个实施方式中，还包括在所述细胞培养过程中添加补料培养基，所述补料培养基为：Effendent FeedTM A+、Effendent FeedTM B+或Cell boost 7a补料培养基中的一种或多种的混合。
在一个实施方式中，所述补料培养基的加入方式为1天/次～3天/次，每次加入的所述补料培养基占所述培养基总体积的1％～5％。
在一个实施方式中，所述在所述细胞培养过程中添加调节剂的操作具体为：
在所述细胞培养过程中添加酪氨酸，所述酪氨酸的添加量为0.01mmol/(L·天)～1.2mmol/(L·天)；或者，
在所述细胞培养过程中添加半胱氨酸，所述半胱氨酸的添加量为0.01mmol/(L·天)～1.2mmol/(L·天)；或者，
在所述细胞培养过程中添加酪氨酸和半胱氨酸，所述酪氨酸和所述半胱氨酸总的添加量为0.01mmol/(L·天)～1.2mmol/(L·天)。
在一个实施方式中，在所述细胞培养过程中，维持细胞培养液中的糖浓度为2g/L～6g/L。
在一个实施方式中，所述CHO-K1细胞为携带GS基因且在所述GS基因的下游插入了外源性基因表达载体的细胞。
在一个实施方式中，所述外源性基因表达载体选自纳武单抗表达载体、贝伐珠单抗表达载体和阿达木单抗表达载体中的至少一种。
一种降低CHO-K1表达系统所分泌抗体的酸性峰含量的方法，包括如下步骤：
将CHO-K1细胞接种到培养基中进行细胞培养，所述培养基中含有Dynamis培养基和Advance培养基，所述Dynamis培养基与所述Advance培养基的体积比为1～2:1～2；及
在所述培养基中培养1天～3天后，在所述培养基中添加酪氨酸和Cell boost7a补料培养基，并维持细胞培养液中的糖浓度为2g/L～6g/L，继续培养10天～15天以使所述CHO-k1细胞分泌的所述目的抗体的酸性峰含量降低，其中，所述酪氨酸的添加量为0.01mmol/(L·天)～1.2mmol/(L·天)，所述Cell boost 7a补料培养基的加入方式为1天/次～3天/次，每次加入的所述Cell boost 7a补料培养基占所述培养基总体积的1％～5％。
一种提高CHO-K1表达系统所分泌抗体的酸性峰含量的方法，包括如下步骤：
将CHO-K1细胞接种到培养基中进行细胞培养，所述培养基中含有Dynamis培养基和Advance培养基，所述Dynamis培养基与所述Advance培养基的体积比为1～2:1～2；及
在所述培养基中培养1天～3天后，在所述培养基中添加半胱氨酸和Cell boost7a补料培养基，并维持细胞培养液中的糖浓度为2g/L～6g/L，继续培养10天～15天以使所述CHO-k1细胞分泌的所述目的抗体的酸性峰含量提高，其中，所述半胱氨酸的添加量为0.01mmol/(L·天)～1.2mmol/(L·天)，所述Cell boost 7a补料培养基的加入方式为1天/次～3天/次，每次加入的所述Cell boost 7a补料培养基占所述培养基总体积的1％～5％。
在之前很长的一段时间内，细胞培养研究的目的主要是为了提高目的蛋白的表达量。随着表达量越来越高，最近研究者开始关注细胞培养对抗体质量的影响。但细胞培养较为复杂，研究起来难度较大，特别是细胞培养基，其营养成分非常复杂，目前的研究没有彻底摸索清楚培养基成分对抗体质量的影响。细胞培养的氨基酸种类较多，研究较多的是谷氨酰胺，因为它作为细胞培养常用的氮源，对其他氨基酸的作用研究的很少。但目前稳定CHO细胞株筛选系统为谷氨酰胺合成酶系统(GS)，细胞培养时已不需要添加谷氨酰胺，因此目前常见的做法是不再调节额外的氨基酸作为调节剂。本发明在调节剂的选择等方面进行了大量的探索研究，打破之前的技术偏见，预料不到地发现，将CHO-K1细胞接种到培养基中培养，并在细胞培养过程中添加酪氨酸或半胱氨酸能够调节CHO-K1表达系统所分泌抗体的酸性峰含量。这种方法在细胞培养工艺流程即能够根据需要，调节酪氨酸或半胱氨酸的添加量即可提高或降低抗体酸性峰含量，且调节剂不影响细胞的生长，抗体表达量高。
附图说明
图1为实施例1～实施例15的各组细胞分泌的抗体表达量结果统计图；
图2为实施例1～实施例5的各组活细胞密度结果统计图；
图3为实施例6～实施例10的各组活细胞密度结果统计图；
图4为实施例11～实施例15的各组活细胞密度结果统计图；
图5为实施例11～实施例15的各组细胞分泌的抗体酸性峰含量结果统计图；
图6为抗体酸性峰主效应图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
一实施方式的调节CHO-K1表达系统所分泌抗体的酸性峰含量的方法包括如下步骤是S110～S120。
S110、将CHO-K1细胞接种到培养基中进行细胞培养。
具体地，CHO-K1细胞为携带GS基因且在GS基因的下游插入了外源基因表达载体的细胞。CHO-K1细胞能够表达外源性蛋白，例如单克隆抗体等。
具体地，CHO-K1细胞为携带GS基因且在GS基因的下游插入了外源性基因表达载体的细胞。
进一步地，外源性基因表达载体选自纳武单抗表达载体、贝伐珠单抗表达载体和阿达木单抗表达载体中的至少一种。
具体地，培养基可以是CD optiCHOTM AGTTM培养基、CellventoTM CD-220培养基、Dynamis培养基或Advance培养基中的一种或多种的混合。
优选地，培养基中含有Dynamis培养基和Advance培养基，Dynamis培养基与Advance培养基的体积比为1～2:1～2。Dynamis和Advance培养基中主要含有脂质、无机盐、维生素等成分。Dynamis培养基和Advances培养基为细胞生长提供必要的营养成分，为细胞生长提供保障。培养基为Dynamis培养基、Advance培养基与调剂配合，能够更好的调节抗体酸性峰含量。
本实施方式中，Dynamis培养基具体为Dynamis TM AGTTM Medium，购自赛默飞世尔公司，货号为A2617504。CD optiCHOTM AGTTM也购自赛默飞世尔公司，货号为A14285EF。Advance培养基具体为
Advanced CHO Fed-batch Medium，购自默克公司，货号为24366C。CellventoTM CD-220培养基也购自默克公司，货号为1.01885.0010。
S120、在细胞培养过程中添加调节剂，继续培养以使CHO-k1细胞分泌具有合适酸性峰含量的目的抗体，其中，调节剂选自酪氨酸和半胱氨酸中的至少一种。
在细胞培养的过程中额外添加调节剂，在细胞培养阶段实现对抗体酸性峰的调节，从源头制备合适酸性峰含量的目的抗体，简化后期的纯化分离工艺。
具体地，调节剂选自酪氨酸和半胱氨酸中的至少一种。经过大量的研究实验发现，添加酪氨酸到特定的培养基中，继续培养CHO-k1细胞能够降低目的抗体的酸性峰。添加半胱氨酸到特定的培养基中，继续培养CHO-k1细胞能够提高目的抗体的酸性峰。并且，添加酪氨酸和半胱氨酸基本不影响细胞生长，使得抗体的表达量增加。
在一个实施方式中，在细胞培养过程中添加酪氨酸，酪氨酸的添加量为0.01mmol/(L·天)～1.2mmol/(L·天)。进一步地，酪氨酸的添加量为0.06mmol/(L·天)～1.2mmol/(L·天)。
在另一个实施方式中，在细胞培养过程中添加半胱氨酸，半胱氨酸的添加量为0.01mmol/(L·天)～1.2mmol/(L·天)。进一步地，半胱氨酸的添加量为0.06mmol/(L·天)～1.2mmol/(L·天)。
在另一个实施方式中，在细胞培养过程中添加酪氨酸和半胱氨酸，酪氨酸和半胱氨酸总的添加量为0.01mmol/(L·天)～1.2mmol/(L·天)。进一步地，混合添加时，酪氨酸和半胱氨酸的摩尔比为1～2:1～2。
在一个实施方式中，还包括在细胞培养过程中添加补料培养基，补料培养基的加入方式为1天/次～3天/次，每次加入的补料培养基占培养基总体积的1％～5％。在培养过程中，加入的补料培养基配合，以提高抗体的表达量和工艺的稳定性。
具体地，补料培养基可以为Effendent FeedTM A+、Effendent FeedTM B+和Cellboost 7a补料中的一种或多种。
本实施方式中，补料培养基为Cell boost 7a，购自Hyclone公司，货号为ABA212153A。Effendent FeedTM A+、Effendent FeedTM B+均购买自赛默飞世尔公司，货号分别为：A25023-04和A25030-04。
在一个实施方式中，还包括在细胞培养过程中，维持细胞培养液中的糖浓度为2g/L～6g/L。糖具体为葡萄糖。在培养过程中维持细胞培养液中的糖浓度，提高抗体的表达量和工艺的稳定性。
具体地，在添加调节剂后，每天取样进行细胞计数并检测糖含量，如果培养基中糖浓度不够，则补充糖分，保证细胞正常生长。
在一个实施方式中，提供一种降低CHO-K1表达系统所分泌抗体的酸性峰含量的方法，具体包括如下步骤：将CHO-K1细胞接种到培养基中进行细胞培养，培养基中含有Dynamis培养基和Advance培养基，Dynamis培养基与Advance培养基的体积比为1～2:1～2。在培养基中培养1天～3天后，在培养基中添加酪氨酸和Cell boost 7a补料培养基，并维持细胞培养液中的糖浓度为2g/L～6g/L，继续培养10天～15天以使CHO-K1细胞分泌的目的抗体的酸性峰含量降低，其中，酪氨酸的添加量为0.01mmol/(L·天)～1.2mmol/(L·天)，Cell boost 7a补料培养基的加入方式为1天/次～3天/次，每次加入的Cell boost 7a补料培养基占培养基总体积的1％～5％，该细胞培养工艺，培养基、酪氨酸、补料培养基以及细胞培养液中糖浓度各个参数配合，有效降低CHO-K1表达系统所分泌抗体的酸性峰的含量，且不影响细胞的生长，抗体表达量高。
此外，本申请还提供一实施方式的提高CHO-K1表达系统所分泌抗体的酸性峰含量的方法，具体包括如下步骤：将CHO-K1细胞接种到培养基中进行细胞培养，培养基中含有Dynamis培养基和Advance培养基，Dynamis培养基与Advance培养基的体积比为1～2:1～2。在培养基中培养1天～3天后，在培养基中添加半胱氨酸和Cell boost 7a补料培养基，并维持细胞培养液中的糖浓度为2g/L～6g/L，继续培养10天～15天以使CHO-K1细胞分泌的目的抗体的酸性峰含量提高，其中，半胱氨酸的添加量为0.01mmol/(L·天)～1.2mmol/(L·天)，Cell boost7a补料培养基的加入方式为1天/次～3天/次，每次加入的Cell boost 7a补料培养基占培养基总体积的1％～5％，该细胞培养工艺，培养基、半胱氨酸、补料培养基以及细胞培养液中糖浓度各个参数配合，有效提高CHO-K1表达系统所分泌抗体的酸性峰的含量，且不影响细胞的生长，抗体表达量高，有效解决抗体类的仿制药生产过程中无法提高抗体酸性峰含量的问题。
上述调节CHO-K1表达系统所分泌抗体的酸性峰含量的方法，至少具有如下有益效果：在细胞培养工艺流程中通过额外添加调节剂，根据需要调节酪氨酸或半胱氨酸的添加量即可实现提高或降低抗体酸性峰含量，调节剂与培养基配合培养CHO-K1细胞，调节CHO-K1细胞所分泌的抗体的酸性峰含量，从源头制备合适酸性峰含量的目的抗体，简化后期的纯化分离工艺。并且酪氨酸和半胱氨酸不影响细胞的生长，抗体表达量高。在保证产量的基础上，调节抗体中酸性峰的比例，使得酸性峰的比例达到预期要求，保证了抗体的质量。
进一步地，在细胞培养过程中添加一定含量的Cell boost 7a补料培养基，加入的调节剂与Cell boost 7a补料培养基配合，以提高抗体的表达量和工艺稳定性。
进一步地，在细胞培养过程中维持细胞培养液中的糖浓度，提高抗体的表达量和工艺的稳定性。
以下为具体实施例部分。
实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。单位mM表示mmol/L，M表示mol/L。
实验所用材料：
CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)为菲鹏生物股份有限公司通过商业渠道购买，并自行构建的细胞株(CHO-K1)，所表达抗体为纳武单抗(Opdivo)的生物类似药，作用靶点为PD-1。
培养基和补料培养基是从多种商业化化学限定培养基单独使用或两两按一定比例混合方案中筛选到比较适合该细胞株表达的培养基。
具体地，培养基含有Dynamis培养基和Advance培养基，由Dynamis培养基与Advance培养基按体积比为1:1的比例混合配制。Dynamis培养基具体为Dynamis TM AGTTMMedium，购自赛默飞世尔公司。Advance培养基具体为
Advanced CHO Fed-batch Medium，购自默克公司。
Cell boost 7a补料培养基购自购自Hyclone公司。
酪氨酸、半胱氨酸和色氨酸购买自Sigma-aldrich。将酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸分别配制成300mM、280mM、100mM，每种氨基酸都按照碱溶和酸溶两种方式溶解，碱溶具体为：先加入80％的超纯水，在搅拌的情况下加入对应的氨基酸，然后在搅拌的情况下慢慢加入1～5mol/L的NaOH溶液溶解，最终pH为11.5。酸溶具体为：先加入80％的超纯水，在搅拌的情况下加入对应的氨基酸，然后在搅拌的情况下慢慢加入1～12mol/L的HCl溶液溶解，最终pH为1.0。总共配成6种氨基酸溶液。
实施例1～15
运用Minitab软件进行DOE实验设计、分析和预测。
细胞培养方法包括以下步骤：
(A)准备15组细胞，各组按照相同的接种密度将CHO-K1细胞接种到含30mL培养基的125mL培养皿中，在37℃、8％CO2的培养箱中培养3天，摇床转速120rpm～130rpm。
(B)从第3天开始添加补料培养基cellboost7a，每次加入的Cell boost 7a补料培养基占培养基总体积的3％，并按照表1的方案添加初始培养基体积百分比的氨基酸。补料培养基以及氨基酸每两天补充一次。每天取样计数和测糖，始终维持糖浓度在4g/L。
(C)继续培养11天后收样，收集蛋白抗体。
表1实验设计
注：角点表示边界值，中心点表示中间的值。
对照组(15)除了不添加调节剂外，其余与实验组的培养条件相同。
对各组细胞培养过程中涉及细胞活率和活细胞密度、电荷异质性、还原纯度进行统计，具体测试方法如下：
细胞活率和密度测定：通过台盼蓝染色法用自动细胞计数仪测定。
电荷异质性的测定：通过HPLC法测定：样品加缓冲液稀释至2mg/ml，上样50μL，流速1mL/min；检测波长为280nm，样品盘温度8℃，柱温40℃，运行时间22min。
抗体表达量的测定：通过HPLC法测定：用0.1M磷酸缓冲液以2mL/min流速平衡HPLC系统15min至基线平稳。进样50μL,以2mL/min流速洗脱。
实验结果：
各组抗体表达量统计结果如图1所示。
各组活细胞密度统计结果如图2～图4所示。
抗体电荷异质性数据如图5所示。
抗体酸性峰的影响分析如表2～表3以及图6所示。
表2抗体电荷异构体含量
表3 DOE设计方差分析表
从表3的结果可以看出，方差分析的失拟项p值为0.314＞0.05，说明模型没有失拟。从结果可以清晰的看出酪氨酸和半胱氨酸对抗体的酸性峰含量影响显著。提高酪氨酸可以降低酸性峰的含量，而提高半胱氨酸可以提高酸性的含量。采用酸溶或碱溶解氨基酸不影响酸性峰的含量，但显著影响细胞生长和抗体表达。同时氨基酸的添加量也显著影响细胞的生长和抗体表达。
实验结论
1、酪氨酸(Tyr)添加比例与酸性峰比例呈负相关，半胱氨酸(Cys)添加比例与酸性峰呈正相关。而加入色氨酸(Trp)添加比例以及氨基酸溶解方式与酸性峰比例不存在统计学显著性。说明加入何种调节剂才能够调节抗体的酸碱性峰并不能简单的通过理论分析获知，具体的细胞培养过程中影响因素复杂。
2、调节剂不影响细胞的生长，在达到调节抗体酸性峰的同时，抗体表达量高。
3、当需要降低抗体酸性峰比例的时候，提高酪氨酸的添加量，同时降低半胱氨酸的添加量。在不考虑细胞生长表达的情况下，酪氨酸(Tyr)最佳添加方案是每升培养体积每2天添加0.4％的300mm的Tyr，即0.6mmol/(L·天)。
4、当需要提高抗体酸性峰比例的时候，降低酪氨酸的添加量，同时提高半胱氨酸的添加量。在不考虑细胞生长表达的情况下，若要提高酸性峰比例，半胱氨酸(Cys)最佳添加方案是每升培养体积每2天添加0.4％的280mm的Cys，即0.56mmol/(L·天)。根据实验结果预测，添加更多的Cys提高酸性峰的作用会跟明显。
实施例16
某生物制药公司表达的阿达木单抗的酸性峰含量为18％～20％。
本实施例通过细胞株(CHO-K1)表达抗体为阿达木单抗的生物类似药，在常规培养基中培养抗体酸性峰比例为25％。
改变培养条件，细胞培养方法包括以下步骤：
(A)将CHO-K1细胞接种到含30mL培养基的125mL培养皿中，培养基中含有Dynamis培养基和Advance培养基，Dynamis培养基与Advance培养基的体积比为1:1，在37℃、8％CO2的培养箱中培养3天，摇床转速120rpm～130rpm。
(B)从第3天开始添加补料培养基cellboost7a和酪氨酸，补料培养基以及酪氨酸氨基酸每两天补充一次。每次加入的Cell boost 7a补料培养基占培养基总体积的3％，酪氨酸添加量为0.6mmol/(L·天)，补每天取样计数和测糖，始终维持糖浓度在6g/L。
(C)继续培养15天后收样，收集蛋白抗体。
在改进的培养条件下收集的阿达木单抗的生物类似药的酸性峰比例为19％，相比原始的酸性峰含量(25％)，有明显降低的效果，即有效降低了抗体酸性峰含量。本实施例表达的阿达木单抗的生物类似药具有与阿达木单抗相似的酸性峰含量。
实施例17
本实施例与实施例16大致相同，不同的是：
改变培养条件，细胞培养方法包括以下步骤：
(A)将CHO-K1细胞接种到含30mL培养基的125mL培养皿中，培养基为CD optiCHOTMAGTTM培养基，在37℃、8％CO2的培养箱中培养3天，摇床转速120rpm～130rpm。
(B)从第3天开始添加补料培养基cellboost7a和酪氨酸，补料培养基以及酪氨酸氨基酸每两天补充一次。每次加入的Cell boost 7a补料培养基占培养基总体积的3％，酪氨酸添加量为0.6mmol/(L·天)，补每天取样计数和测糖，始终维持糖浓度在6g/L。
(C)继续培养15天后收样，收集蛋白抗体。
在改进的培养条件下收集的抗体酸性峰比例为21％，相比原始的酸性峰含量(25％)，有降低的效果。
实施例18
某生物制药公司表达的贝伐珠单抗的酸性峰含量为24％～26％。
本实施例通过细胞株(CHO-K1)，表达抗体为贝伐珠单抗的生物类似药，在常规培养基中培养抗体酸性峰比例为20％。
改变培养条件，细胞培养方法包括以下步骤：
(A)将CHO-K1细胞接种到含30mL培养基的125mL培养皿中，培养基中含有Dynamis培养基和Advance培养基，Dynamis培养基与Advance培养基的体积比为2:1，在37℃、8％CO2的培养箱中培养3天，摇床转速120rpm～130rpm。
(B)从第3天开始添加补料培养基cellboost7a和半胱氨酸，补料培养基以及酪氨酸氨基酸每两天补充一次。每次加入的Cell boost 7a补料培养基占培养基总体积的3％，半胱氨酸添加量为0.56mmol/(L·天)，补每天取样计数和测糖，始终维持糖浓度在4g/L。
(C)继续培养10天后收样，收集蛋白抗体。
在改进的培养条件下收集的抗体酸性峰比例为25％，相比原始的酸性峰含量(20％)，有明显提高的效果，即有效提高了抗体酸性峰含量。本实施例表达的贝伐珠单抗的生物类似药具有与贝伐珠单抗相似的酸性峰含量。
实施例19
本实施例与实施例16大致相同，不同的是：
改变培养条件，细胞培养方法包括以下步骤：
(A)将CHO-K1细胞接种到含30mL培养基的125mL培养皿中，培养基中为CellventoTMCD-220培养基，在37℃、8％CO2的培养箱中培养3天，摇床转速120rpm～130rpm。
(B)从第3天开始添加补料培养基Effendent FeedTM A+和半胱氨酸，补料培养基以及酪氨酸氨基酸每两天补充一次。每次加入的Effendent FeedTM A+补料培养基占培养基总体积的8％，半胱氨酸添加量为0.56mmol/(L·天)，补每天取样计数和测糖，始终维持糖浓度在4g/L。
(C)继续培养10天后收样，收集蛋白抗体。
在改进的培养条件下收集的抗体酸性峰比例为23％，相比原始的酸性峰含量(20％)，有提高的效果。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (9)
1.一种降低CHO-K1表达系统所分泌抗体的酸性峰含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将CHO-K1细胞接种到培养基中进行细胞培养，及
在所述细胞培养过程中添加酪氨酸和补料培养基，继续培养以使所述CHO-K1细胞分泌具有合适酸性峰含量的目的抗体，所述酪氨酸的添加量为0.15mmol/(L·天)～1.2mmol/(L·天)。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述培养基为：CD optiCHOTM AGTTM培养基、CellventoTM CD-220培养基、Dynamis培养基和Advance培养基中的一种或多种的混合。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述补料培养基为：Effendent FeedTM A+、Effendent FeedTM B+或Cell boost 7a补料培养基中的一种或多种的混合。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述补料培养基的加入方式为每天一次～每三天一次，每次加入的所述补料培养基占所述培养基总体积的1％～5％。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酪氨酸的添加量为0.6mmol/(L·天)。
6.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，在所述细胞培养过程中，维持细胞培养液中的糖浓度为2g/L～6g/L。
7.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，所述CHO-K1细胞为携带GS基因且在所述GS基因的下游插入了外源性基因表达载体的细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述外源性基因表达载体选自纳武单抗表达载体、贝伐珠单抗表达载体和阿达木单抗表达载体中的至少一种。
9.一种降低CHO-K1表达系统所分泌抗体的酸性峰含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将CHO-K1细胞接种到培养基中进行细胞培养，所述培养基中含有Dynamis培养基和Advance培养基，所述Dynamis培养基与所述Advance培养基的体积比为1～2:1～2；及
在所述培养基中培养1天～3天后，在所述培养基中添加酪氨酸和Cellboost7a补料培养基，并维持细胞培养液中的糖浓度为2g/L～6g/L，继续培养10天～15天以使所述CHO-K1细胞分泌的目的抗体的酸性峰含量降低，其中，所述酪氨酸的添加量为0.15mmol/(L·天)～1.2mmol/(L·天)，所述Cell boost 7a补料培养基的加入方式为每天一次～每三天一次，每次加入的所述Cell boost 7a补料培养基占所述培养基总体积的1％～5％。
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Non-Patent Citations (2)
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