CN112980796A - 用于降低cho细胞中表达重组蛋白的氧化的液体培养基 - Google Patents
用于降低cho细胞中表达重组蛋白的氧化的液体培养基 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提出了一种用于降低CHO细胞中表达重组蛋白的氧化的液体培养基，培养方法，及降低CHO细胞中表达重组蛋白的氧化的方法。该液体培养基包括：基础培养基、补料培养基和米诺地尔。该培养基中添加米诺地尔，有效降低了融合蛋白及抗体类药物在CHO细胞中的合成过程所形成的氧化杂质，而且不影响融合蛋白及抗体类药物的合成及其质量属性，成本低，操作简单，适合工业化大生产。
Description
技术领域
本发明属于生物学技术领域，具体地，本发明涉及CHO细胞液体培养基、CHO细胞培养方法，及用于降低CHO细胞中表达重组蛋白的氧化的方法。
背景技术
单克隆抗体和其它生物药已被广泛用于肿瘤、炎症、代谢疾病等的治疗，并取得了很好的疗效。基于生物药结构的复杂性，其通常需要在生物宿主内合成。用于重组mAb或融合蛋白类药物表达的宿主细胞系有CHO、NS0、Sp2/0、HEK293和PER.C6等。因CHO细胞在蛋白合成过程中具有与人类蛋白相似的翻译后修饰，且易适应无血清培养基，可在限定培养基中悬浮生长，促进了生物工艺的改进放大，并且已证明其可作为可靠的安全宿主，因此重组蛋白药物生产过程中最常用CHO作为宿主细胞。
CHO细胞在蛋白合成过程中，蛋白产物的合成情况除与克隆本身有关外，与其培养条件密切相关。蛋白合成过程中的翻译后修饰对其生物活性及稳定性等至关重要。蛋白合成过程中，常见的翻译后修饰有氧化，磷酸化、脱氨、C-端的切除、糖基化等。氨基酸的氧化会改变生物大分子的二级、三级结构，从而可能导致其生物活性的改变，半衰期的缩短，形成聚集体等。蛋白合成过程中由于相关酶的催化作用或细胞代谢所产生的活性氧的作用而将氨基酸残基氧化形成氧化杂质。
Hazeltine L B等人研究发现通过调整培养基中锰离子，铜离子，半胱氨酸及色氨酸浓度可降低色氨酸氧化(Biotechnol Prog,2016)，同时Yun Z等人研究发现添加谷胱甘肽和铁离子螯合剂可降低胞内的活性氧水平(J Biosci Bioeng,2003)。还有文献报道添加硫辛酸、甲硫氨酸、N-乙酰半胱氨酸及半胱氨酸可调整细胞内的活性氧水平，从而减少蛋白的氧化(Exp Toxicol Pathol,2008)。Hou Y等人在2019年的Biotechnol J杂志上发表了其最新研究：通过增加培养基中烟酰胺、半胱氨酸的浓度，可缓解蛋白合成过程中的赖氨酸的羟基化。这些方法或多或少会对产物的表达或其质量属性产生影响，如培养基中加金属离子会降低氧化，但同时也会改变培养基的pH和渗透压进而影响细胞的生长。
发明内容
本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：
现有技术中融合蛋白及抗体类药物在CHO细胞中的合成过程容易形成氧化杂质。基于上述问题的发现，发明人提出一种用于降低CHO细胞中表达重组蛋白的氧化的液体培养基，发现CHO细胞培养过程中在培养基中添加米诺地尔可在不影响细胞生长及产物合成、不影响目的产物的其它质量属性的情况下降低氧化杂质，且在培养基及细胞克隆变化时依然对融合蛋白及抗体类药物的氧化杂质具有降低效果。本发明适于解决融合蛋白及抗体类药物在CHO细胞中的合成过程所形成的氧化杂质问题。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种用于降低CHO细胞中表达重组蛋白的氧化的液体培养基。该培养基包括培养基添加物，所述培养添加物为米诺地尔，所述液体培养基能够降低蛋白合成中氧化杂质的形成。
在一些实施例中，所述液体培养基还包括基础培养基和补料培养基。
在一些实施例中，将米诺地尔配成母液，在细胞接种0-10天内一次性添加或在培养过程中分阶段多次添加。
在一些实施例中，本发明所述米诺地尔的使用浓度为0.1-1mM。
在一些实施例中，本发明所述米诺地尔的使用浓度为0.6mM。
在一些实施例中，本发明所述米诺地尔的使用浓度为0.3mM。
在一些实施例中，本发明所述基础培养基为Dynamis或EXCELL Advanced CHOmedium；所述补料培养基为CellBoost或EXCELL Advanced Feed1。
在一些实施例中，本发明所述基础培养基为Dynamis；所述补料培养基为CellBoost。
在一些实施例中，本发明所述基础培养基为EXCELL Advanced CHO medium；所述补料培养基为EXCELL Advanced Feed1。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种利用本发明所述液体培养基对CHO细胞进行培养的方法。根据本发明实施例的培养方法，培养基中添加米诺地尔可以降低目的蛋白或单抗中氨基酸的氧化，降低氧化杂质的含量，而且不会对目的蛋白或单抗的表达量、糖型、电荷异质性等其他属性造成明显影响。
在一些实施例中，利用所述液体培养基对CHO细胞进行培养，以便获得氧化杂质少的融合蛋白或单抗。所述培养工艺为分批培养、补料分批培养或灌流培养。所述培养是在三角瓶、搅拌式反应器或波浪式反应器中，温度为30-37℃条件下进行。
在一些实施例中，进行所述培养之前，进一步包括将所述CHO细胞接种于所述基础培养基。
在一些具体的实施例中，所述接种量为0.2～1.2*106个/mL。上述接种密度下，更适合CHO细胞的生长和目的产物的合成。
在一些实施例中，所述融合蛋白为Fc融合蛋白。
在一些具体的实施例中，所述融合蛋白为GLP-1的Fc融合蛋白。
在一些具体的实施例中，所述单抗为阿达木单抗。
在本发明的第三方面，本发明提出了所述培养基或培养方法在降低融合蛋白及抗体类药物氧化杂质上的应用。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种用于降低CHO细胞中表达重组蛋白的氧化的方法，所述方法为在细胞培养过程中添加米诺地尔，或者利用本发明所述培养基或培养方法培养CHO细胞。
详细说明
本发明将会把确定的具体化的内容所对应的文献详细列出。本发明有预期地涵盖所有的选择余地、变体和同等物，这些可能如权利要求所定义的那样包含在现有发明领域。所属领域的技术人员将识别许多类似或等同于在此所描述的方法和物质，这些可以应用于本发明的实践中去。本发明绝非限于方法和物质的描述。有很多文献和相似的物质与本发明申请相区别或抵触，其中包括但绝不限于术语的定义，术语的用法，描述的技术，或如本发明申请所控制的范围。
本发明所使用的“LC-MS胰蛋白酶图谱分析”为将液质联用应用于研究蛋白质的技术，其分析原理为在变性条件下向分析样品中加入还原剂，打开融合蛋白内部所有交联的二硫键,再加入烷基化试剂封闭所有的自由巯基，使融合蛋白分子在溶液中以游离伸展肽链的形式存在。加入胰蛋白酶，将充分伸展的肽链酶解成小的肽段后进行LC-MS分析，通过分析实验组与对照组样品各肽段的分子量差异来检测氧化杂质的含量和糖型。
本发明所使用的“Protein A”是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，分子量42KD，天然的Protein A有5个IgG结合结构域和未知功能的非Fc结合域。结合域能够特异性地结合多种免疫球蛋白的Fc区段而与Fab区或轻链结合很弱。非Fc结合域能结合部分杂蛋白，导致洗脱下来的IgG纯度不够。因此，现实中，多使用的是重组型Protein A，其非特异性结合明显降低。
本发明所使用的“Protein A亲和色谱柱”广泛用于各种抗体的柱层析分离纯化，其原理是将Protein A与琼脂糖凝胶以一定的方式结合，制备用于抗体纯化的亲和填料，经过亲和层析，即可从腹水、血清和培养液等样品中纯化得到高纯度的抗体。检测波长为280nm，柱温25℃。
本发明所使用的“毛细管区带电泳”用于电荷异构体检测。分析过程为：经ProteinA捕获收集样品，取样品150μg至10KDa超滤管浓缩后，加入碘乙酰胺溶液，混匀后于70℃水浴15min后离心取样上清采用毛细管仪进行检测。
本发明所使用的“台盼蓝染色法”用于细胞密度检测，分析过程为：取1mL细胞悬液于EP管中，混匀后取20μL与0.2％的台盼蓝溶液混合均匀，取20μL于测样板中，采用细胞活力分析仪检测活细胞密度。
本发明所使用的“Dynamis”为商业培养基，用于CHO细胞的培养，购于Thermofisher。
本发明所使用的“EXCELL Advanced CHO medium”为商业培养基，用于CHO细胞的培养，购于Merck。
本发明所使用的“CellBoost 7a”为商业培养基，用于CHO细胞的培养，购于GE。
本发明所使用的“EXCELL Advanced Feed1”为商业培养基，用于CHO细胞的培养，购于Merck。
本发明所使用的“CHO细胞”为中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell)的缩写。
本发明所使用的“单抗”或“mAb”为单克隆抗体的缩写
本发明所使用的“mM”为浓度单位mmol/L的缩写。
本发明所使用的“M”为浓度单位mol/L的缩写。
附图说明
图1为实施例1中添加米诺地尔对氧化杂质含量的影响。
图2为实施例1中添加米诺地尔对其它方面的影响，A：细胞生长；B：表达量；C：糖型；D：电荷异质性。
图3为实施例2中添加米诺地尔对氧化杂质含量的影响。
图4为实施例2中添加米诺地尔对其它方面的影响，A：细胞生长；B：表达量；C：糖型；D：电荷异质性。
图5为实施例3中添加米诺地尔对氧化杂质含量的影响。
图6为实施例3中添加米诺地尔对其它方面的影响，A：细胞生长；B：表达量；C：糖型；D：电荷异质性。
图7为实施例4中添加米诺地尔对氧化杂质含量的影响。
图8为实施例4中添加米诺地尔对其它方面的影响，A：细胞生长；B：表达量；C：糖型；D：电荷异质性。
图9为实施例5中添加米诺地尔对氧化杂质含量的影响。
图10为实施例5中添加米诺地尔对其它方面的影响，A：细胞生长；B：表达量；C：糖型；D：电荷异质性。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1
1.将基础培养基Dynamis装入1L三角瓶中，装液量为300mL，灭菌冷却后，将培养好的CHO细胞种子按6*105个/mL接入三角瓶中。
2.加入终浓度为0.3mM的米诺地尔，37℃，8％CO2，140rpm条件下培养，并以未添加米诺地尔为对照。
3.培养3天后开始每天补料，补料培养基为CellBoost7a，培养至13天，停止培养，发酵液1000g离心20min，取上清，经ProteinA柱捕获产物(GLP-1与Fc融合蛋白)。ProteinA捕获参数：洗脱液为pH4.4～4.6 0.1M HAc-NaAc，洗脱流速为0.1CV/min，洗脱时间为15min，收集含目的蛋白的洗脱液，并检测目的蛋白的表达量。
4.LC-MS胰蛋白酶图谱分析产物的氧化杂质，如图1所示，可以看出添加米诺地尔后，最终产物氧化杂质含量明显降低。利用LC-MS胰蛋白酶图谱继续分析产物的糖型，台盼蓝染色法检测细胞密度，得到添加米诺地尔对细胞数量、产物表达量、产物电荷异质性、产物糖型的影响，结果分别如图2中A、B、C、D所示。结合图1和图2可以看出，添加米诺地尔后，最终产物氧化杂质含量明显降低，且对细胞生长及其它产物质量属性无明显影响。
实施例2
1.将基础培养基Dynamis装入1L三角瓶中，装液量为300mL，灭菌冷却后，将培养好的CHO细胞种子按8*105个/mL接入三角瓶中。
2.加入终浓度为0.3mM的米诺地尔，30℃，8％CO2，140rpm条件下培养，并以未添加米诺地尔为对照。
3.培养3天后开始每天补料，补料培养基为CellBoost 7a，培养至15天，停止培养，发酵液1000g离心20min，取上清，经ProteinA柱捕获产物(阿达木单抗)。ProteinA捕获参数：洗脱液为pH4.4～4.3 0.1M HAc-NaAc，洗脱流速为0.1CV/min，洗脱时间为10min，收集含目的抗体的洗脱液，并检测目的抗体的表达量。
4.LC-MS胰蛋白酶图谱分析产物的氧化杂质，如图3所示，可以看出添加米诺地尔后，最终产物氧化杂质含量明显降低。利用LC-MS胰蛋白酶图谱继续分析产物的糖型，台盼蓝染色法检测细胞密度，得到添加米诺地尔对细胞数量、产物表达量、产物电荷异质性、产物糖型的影响，结果分别如图4中A、B、C、D所示。结合图3和图4可以看出，添加米诺地尔后，最终产物氧化杂质含量明显降低，且对细胞生长及其它产物质量属性无明显影响。说明其降氧化作用也适用于单克隆抗体的生产。
实施例3
1.将基础培养基Dynamis装入50L反应器中，装液量为30L，将培养好的CHO细胞种子按8*105个/mL接入反应器中，控制溶解氧(DO)30～50％，pH6.8～7.4,温度37℃。
2.加入终浓度为0.6mM的米诺地尔，并以未添加米诺地尔为对照。
3.培养3天后开始每天补料，补料培养基为CellBoost 7a，培养至第12天，停止培养，收集发酵液离心，离心参数为1000g，4℃，20min。取上清，经ProteinA柱捕获产物(GLP-1与Fc的融合蛋白)。ProteinA捕获参数：洗脱液为pH4.4～4.6 0.1M HAc-NaAc，洗脱流速为0.1CV/min，洗脱时间为15min，收集含目的蛋白的洗脱液，并检测目的蛋白的表达量。
4.LC-MS胰蛋白酶图谱分析产物的氧化杂质，如图5所示，可以看出添加米诺地尔后，最终产物氧化杂质含量明显降低。利用LC-MS胰蛋白酶图谱继续分析产物的糖型，台盼蓝染色法检测细胞密度，得到添加米诺地尔对细胞数量、产物表达量、产物电荷异质性、产物糖型的影响，结果分别如图6中A、B、C、D所示。结合图5和图6可以看出，在培养工艺放大至50L反应器时添加米诺地尔仍有降低氧化杂质的效果。
实施例4
1.将基础培养基EXCELL Advanced CHO medium装入50L反应器中，装液量为35L，将培养好的CHO细胞种子按8*105个/mL接入反应器中，控制溶解氧(DO)30～50％，pH6.8～7.4,温度37℃。
2.加入终浓度为0.3mM的米诺地尔，并以未添加米诺地尔为对照。
3.培养3天后开始每天补料，补料培养基为EXCELL Advanced Feed1。溶解氧(DO)30～50％，pH 6.8～7.4，37℃条件下培养至第6天，加入终浓度为0.3mM的米诺地尔，继续培养至14天，收集发酵液离心，离心参数为1000g，4℃，20min。取上清，经ProteinA层析柱捕获产物(GLP-1与Fc融合蛋白)。ProteinA捕获参数：洗脱液为pH4.4～4.6 0.1M HAc-NaAc，洗脱流速为0.1CV/min，洗脱时间为15min，收集含目的蛋白的洗脱液，并检测目的蛋白的表达量。
4.LC-MS胰蛋白酶图谱分析产物的氧化杂质，如图7所示，可以看出添加米诺地尔后，最终产物氧化杂质含量明显降低。利用LC-MS胰蛋白酶图谱继续分析产物的糖型，台盼蓝染色法检测细胞密度，得到添加米诺地尔对细胞数量、产物表达量、产物电荷异质性、产物糖型的影响，结果分别如图8中A、B、C、D所示。结合图7和图8可以看出，采用不同培养基进行培养时添加米诺地尔仍有降低氧化杂质的效果。
实施例5
1.将基础培养基Dynamis装入1L三角瓶中，装液量为300mL，将培养好的CHO细胞种子按10*105个/mL接入反应器中。
2.加入终浓度为0.9mM的米诺地尔，30℃，8％CO2，140rpm条件下培养，并以未添加米诺地尔为对照。
3.培养3天后开始每天补料，补料培养基为CellBoost 7a。培养至第15天，停止培养，收集发酵液离心，离心参数为1000g，4℃，20min。取上清，经ProteinA层析柱捕获产物(阿达木单抗)。ProteinA捕获参数：洗脱液为pH4.0～4.3，0.1M HAc-NaAc，洗脱流速为0.1CV/min，洗脱时间为10min，收集含目的抗体的洗脱液，并检测目的抗体的表达量。
4.LC-MS胰蛋白酶图谱分析产物的氧化杂质，如图9所示，可以看出添加米诺地尔后，最终产物氧化杂质含量明显降低。利用LC-MS胰蛋白酶图谱继续分析产物的糖型，台盼蓝染色法检测细胞密度，得到添加米诺地尔对细胞数量、产物表达量、产物电荷异质性、产物糖型的影响，结果分别如图10中A、B、C、D所示。结合图9和图10可以看出，添加0.9mM米诺地尔后，最终产物氧化杂质明显降低，且对细胞生长无明显影响。
在本说明书的描述中，参考术语“一些实施例”、“一些具体的实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.一种用于降低CHO细胞中表达重组蛋白的氧化的液体培养基，其特征在于，包括培养基添加物，所述培养添加物为米诺地尔，所述液体培养基能够降低蛋白合成中氧化杂质的形成。
2.根据权利要求1所述的液体培养基，其特征在于，还包括基础培养基和补料培养基；所述基础培养基为Dynamis或EXCELL Advanced CHO medium；所述补料培养基为CellBoost或EXCELL Advanced Feed1。
3.根据权利要求1所述的液体培养基，其特征在于，将所述米诺地尔配成母液，在细胞接种0-10天内一次性添加或在培养过程中分阶段多次添加。
4.根据权利要求1或3任一项所述的液体培养基，其特征在于，所述米诺地尔的浓度为0.1-1mM；任选的，所述米诺地尔的浓度为0.6mM；任选的，所述米诺地尔的浓度为0.3mM，任选的，所述米诺地尔的浓度为0.9mM。
5.一种CHO细胞的培养方法，其特征在于，利用权利要求1-4任一项所述的液体培养基对CHO细胞进行培养。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，利用所述培养基对CHO细胞进行培养，以便获得氧化杂质少的融合蛋白或单抗，所述培养的培养工艺为分批培养、补料分批培养或灌流培养；所述培养的培养容器为三角瓶、搅拌式反应器或波浪式反应器；所述培养的培养温度为30-37℃。
7.根据权利要求5-6任一项所述的方法，其特征在于，进行所述培养之前，进一步包括将CHO细胞接种于所述基础培养基；所述接种量为0.2～1.2*106个/mL。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述融合蛋白为Fc融合蛋白；优选的，所述融合蛋白为GLP-1的Fc融合蛋白；所述单抗为阿达木单抗。
9.权利要求1-4任一项所述的培养基或权利要求5-8任一项所述的培养方法在降低融合蛋白及抗体类药物氧化杂质上的应用。
10.一种用于降低CHO细胞中表达重组蛋白的氧化的方法，其特征在于，在细胞培养过程中添加米诺地尔，或者利用权利要求1-4任一项所述的培养基或权利要求5-8任一项所述的培养方法培养CHO细胞。
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