CN110540958A - 脐带间充质干细胞分泌因子的制备及其在生发中的应用 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了脐带间充质干细胞分泌因子在促进毛囊修复和/或毛发再生中的应用，所述脐带间充质干细胞分泌因子通过包括以下步骤的方法制备：1)在诱导培养前，对脐带间充质干细胞进行传代培养；2)移除传代培养基，使用干细胞诱导培养基进行诱导培养；3)收集上清，得到脐带间充质干细胞分泌因子。本申请的脐带间充质干细胞分泌因子对于促进毛囊修复和/或毛发再生具有显著的作用。

Description

脐带间充质干细胞分泌因子的制备及其在生发中的应用
技术领域
本申请涉及一种脐带间充质干细胞分泌因子的制备方法和应用，属于生物技术领域。
背景技术
内在的遗传和内分泌因素导致了毛囊调控的失调是所有毛发问题的根源。常见的雄性脱发，核心的原因是雄激素分泌过盛以及脱发部位的相关激素受体遗传性的敏感，从而通过复杂的细胞调控抑制了毛囊组织的活性，所以在表象上就形成了脱发。
国内生防脱生发行业的产业规模达85亿元左右，行业的发展速度很快，近几年平均增长率达到15％，预示着其未来增长的潜力仍然很大。但是目前国内防脱生发市场上大多数产品的功效不明显，整个市场表现出“需求强烈而供给不足”。
在防脱生发技术变革方面，中药方面的革新主要是配方的改变，但疗效上并没有突破性进展。西药方面，目前公认的脱发治疗性药物主要是处方药米诺地尔和非那司提。这些药物有疗效但副作用明显。
毛囊中的核心细胞是毛乳头细胞，它实际上就是一种间充质干细胞，它的活性维持主要靠自分泌或旁分泌的细胞因子。所以补充多肽因子，可以有效的激活已经被抑制了活性的毛乳头细胞，从而起到育发生发的潜在作用。
近年来前沿科研报告发现，多肽分析因子对毛囊细胞有激活再生的显著功效，所以多肽因子为核心的生发护发产品开始具有良好的研发意义和市场前景。
发明内容
本发明的一个方面提供了脐带间充质干细胞分泌因子的制备方法，所述方法包括以下步骤：
1)在诱导培养前，对脐带间充质干细胞进行传代培养；
2)移除传代培养基，使用干细胞诱导培养基进行诱导培养；
3)收集上清，得到脐带间充质干细胞分泌因子。
优选地，所述干细胞诱导培养基包括干细胞基础培养基、20.0-40.0μg/mL维生素C、2.0-6.0μg/mL胰岛素、1.0-5.0μg/mL转铁蛋白和1.0-5.0ng/mL亚硒酸钠。
优选地，所述干细胞诱导培养基还包括20.0-60.0μM米诺地尔或0.5-1.5ng/mL成纤维细胞生长因子。
优选地，所述步骤1)的传代后，间充质干细胞的汇合度为50％～70％。
优选地，所述步骤2)的具体过程为，移除传代培养基，使用缓冲液冲洗后，加入诱导培养基培养36小时至60小时。
优选地，在所述步骤2)中的诱导培养前，使用UVB处理细胞。
优选地，所述UVB处理的辐照量为20-30mJ/cm2。
本发明的另一个方面提供了由所述的脐带间充质干细胞分泌因子的制备方法得到的脐带间充质干细胞分泌因子。
本发明的另一个方面提供了脐带间充质干细胞分泌因子在促进毛囊修复和/或毛发再生中的应用，其中所述脐带间充质干细胞分泌因子根据本发明所述的制备方法进行制备而得到。
本发明的另一个方面提供了脐带间充质干细胞分泌因子在制备用于促进毛囊修复和/或毛发再生的药品或保健品中的应用，其中所述脐带间充质干细胞分泌因子根据本发明所述的制备方法进行制备而得到。
本申请能产生的有益效果包括：
1)本申请所提供的脐带间充质干细胞分泌因子制备方法步骤简单，对仪器设备的要求较低，能够以低成本进行；
2)本申请所提供的脐带间充质干细胞分泌因子，对于促进毛囊修复和/或毛发再生具有显著的作用。
附图简要说明
图1示出了还原酶抑制剂的抑制率实验结果。
图2示出了毛发长度促进率的实验结果。
图3示出了VEGF相对分泌量的实验结果。
图4示出了VEGF的mRNA分泌检测结果。
图5示出了VEGF的蛋白水平分泌检测结果。
图6示出了IGF的mRNA分泌检测结果。
图7示出了IGF的蛋白水平分泌检测结果。
具体实施方案
除非另有说明，本文所使用的所有技术和科学术语都具有如本领域普通技术人员所通常理解的含义。一般来说，本文所使用的术语是公知的并且常规使用于本领域。
本发明所使用的主要术语定义如下：
当在本文中使用时，术语“干细胞”是指一类具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，干细胞可以分化成多种功能细胞。术语“间充质干细胞”是指干细胞家族中的一项重要成员，其来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞，最初在骨髓中发现，具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点。术语“脐带间充质干细胞”是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞。
当在本文中使用时，术语“干细胞分泌培养液”是指将干细胞在培养基中进行培养后，收集上清得到的培养溶液，其中含有生长因子。在一些实施方案中，收集上清以后还包括经过包括但不限于过滤、离心等手段除去其中所包含的固体成分，所述固体成分包括但不限于干细胞碎片、培养基中的固体杂质等。
当在本文中使用时，“干细胞基础培养基”是指本领域中常见的用于干细胞培养的常规培养基，例如本领域中常见的无血清培养基，诸如可以商购获得的StemProTMMSC SFMXenoFree培养基。
当在本文中使用时，“干细胞诱导培养基”是指在在上述干细胞基础培养基的基础上，加入一种或更多种成分，从而诱导干细胞特异性地分泌生长因子，这样的成分例如包括但不限于维生素C、胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠。
在一些实施方案中，本发明的干细胞诱导培养基还可以包含其他成分，例如但不限于米诺地尔、成纤维细胞生长因子。
当在本文中使用时，术语“细胞因子”、“生长因子”具有相同的含义，可互换使用。
当在本发明的干细胞诱导培养基中使用时，维生素C的含量范围为20.0-40.0μg/mL，例如20.0、25.0、30.0、35.0和40.0μg/mL，以及上述含量值中任意两个值为端点构成的含量范围。在一些实施方案中，维生素C的含量范围为20.0-40.0μg/mL，优选为22.0-38.0μg/mL，更优选为24.0-36.0μg/mL，再更优选为26.0-34.0μg/mL，最优选为28.0-32.0μg/mL，例如28.0、29.0、30.0、31.0和32.0μg/mL，以及上述含量范围内的任意数值。
当在本发明的干细胞诱导培养基中使用时，胰岛素的含量范围为2.0-6.0μg/mL，例如2.0、3.0、4.0、5.0和6.0μg/mL，以及上述含量值中任意两个值为端点构成的含量范围。在一些实施方案中，胰岛素的含量范围为2.0-6.0μg/mL，优选为2.5-5.5μg/mL，更优选为3.0-5.0μg/mL，最优选为3.5-4.5μg/mL。
当在本发明的干细胞诱导培养基中使用时，转铁蛋白的含量范围为1.0-5.0μg/mL，例如1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5和5.0μg/mL，以及上述含量值中任意两个值为端点构成的含量范围。在一些实施方案中，转铁蛋白的含量范围为1.0-5.0μg/mL，优选为1.5-4.5μg/mL，更优选为2.0-4.0μg/mL，最优选为2.5-3.5μg/mL。
当在本发明的干细胞诱导培养基中使用时，亚硒酸钠的含量范围为1.0-5.0ng/mL，例如1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5和5.0ng/mL，以及上述含量值中任意两个值为端点构成的含量范围。在一些实施方案中，亚硒酸钠的含量范围为1.0-5.0ng/mL，优选为1.5-4.5ng/mL，更优选为2.0-4.0ng/mL，最优选为2.5-3.5ng/mL。
在一些实施方案中，本发明的干细胞诱导培养基包括干细胞基础培养基、20.0-40.0μg/mL维生素C、2.0-6.0μg/mL胰岛素、1.0-5.0μg/mL转铁蛋白和1.0-5.0ng/mL亚硒酸钠，其中，维生素C的含量范围优选为优选为22.0-38.0μg/mL，更优选为24.0-36.0μg/mL，再更优选为26.0-34.0μg/mL，最优选为28.0-32.0μg/mL；胰岛素的含量范围优选为2.5-5.5μg/mL，更优选为3.0-5.0μg/mL，最优选为3.5-4.5μg/mL；转铁蛋白的含量范围优选为1.5-4.5μg/mL，更优选为2.0-4.0μg/mL，最优选为2.5-3.5μg/mL；亚硒酸钠的含量范围优选为1.5-4.5ng/mL，更优选为2.0-4.0ng/mL，最优选为2.5-3.5ng/mL。
在优选实施方案中，本发明的干细胞诱导培养基包括干细胞基础培养基、30.0μg/mL维生素C、4.0μg/mL胰岛素、3.0μg/mL转铁蛋白和3.0ng/mL亚硒酸钠。
当在本发明的干细胞诱导培养基中使用时，米诺地尔的含量范围为20.0-60.0μM，例如20.0、25.0、30.0、35.0、40.0、45.0、50.0、55.0和60.0μM，以及上述含量值中任意两个值为端点构成的含量范围。在一些实施方案中，米诺地尔的含量范围为20.0-60.0μM，优选为25.0-55.0μM、更优选为30.0-50.0μM，最优选为35.0-45.0μM。
当在本发明的干细胞诱导培养基中使用时，成纤维细胞生长因子的含量范围为0.5-1.5ng/mL，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4和1.5ng/mL，以及上述含量值中任意两个值为端点构成的含量范围。在一些实施方案中，成纤维细胞生长因子的含量范围为0.5-1.5ng/mL，优选为0.6-1.4ng/mL，更优选为0.7-1.3ng/mL，再更优选为0.8-1.2ng/mL，最优选为0.9-1.1ng/mL。
对干细胞进行传代培养的方法步骤可以采用本领域技术人员所熟知的常规方法，以及常规培养条件，例如37℃和5％CO2。可以用于本发明的传代培养基包括本领域中常规使用的传代培养基，例如StemProTMMSC SFM XenoFree培养基。在传代培养过程中，细胞达到50％-70％的汇合度，例如50％、55％、60％、65％和70％的汇合度时进行传代。
在一些实施方案中，移除传代培养基之后，可以用缓冲液进行冲洗。可用于本发明的缓冲液例如可以是PBS，但不限于此，冲洗次数没有特别限制，可以是1次、2次、3次或更多次。
采用本领域技术人员所熟知的技术步骤收集诱导培养后的上清，即得到含有脐带间充质干细胞分泌因子的溶液。在一些实施方案中，收集上清以后还包括除去其中的固体成分，所述固体成分包括但不限于干细胞碎片、培养基中的固体杂质等。固体成分的去除方法包括但不限于本领域中常见的过滤、离心等，对此本发明没有特别限制，只要能充分地除去上清中的固体成分。
本发明的脐带间充质干细胞分泌因子是由脐带间充质干细胞所分泌的多肽因子，其中包括至少一种，例如两种、三种、四种、五种或者更多种的天然多肽、寡肽以及氨基酸。
本发明的脐带间充质干细胞分泌因子可以直接以获得的上清液，即含有脐带间充质干细胞分泌因子的溶液进行使用，以用于促进毛囊修复、毛发再生等。此时，所使用的术语“脐带间充质干细胞”可以表示“含有脐带间充质干细胞分泌因子的溶液”。在一些实施方案中，可以进一步处理获得的上清液，即含有脐带间充质干细胞分泌因子的溶液，例如但不限于冷冻干燥等获得其他形态的脐带间充质干细胞分泌因子，所述其他形态的脐带间充质干细胞分泌因子包括但不限于固定粉末形式。
本发明的脐带间充质干细胞分泌因子可以制备为包括溶液剂、喷雾剂、膏剂、糊剂等等剂型，并以包括但不限于涂抹、喷洒、敷贴等形式进行施用。
下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。
如无特别说明，本申请的实施例中的原料和催化剂均通过商业途径购买。
实施例
实施例1.含多种多肽因子培养基的制备
使用StemProTMMSC SFM XenoFree培养基培养脐带间充质干细胞，当细胞长满培养瓶后，进行传代，使其24小时候的汇合度为50％-70％。24小时以后，使用具体配方如下的诱导培养基进行诱导培养。
具体操作为：移除传代培养基，PBS冲洗1次，加入不同配方、不同条件的诱导培养基进行诱导培养。培养48小时，使脐带间充质干细胞充分分泌多肽因子至培养基中，收集培养上清。
采用4种条件进行诱导培养，具体不同配方和条件的诱导培养基组分如下：
1#：干细胞基础培养基(StemProTMMSC SFM XenoFree，ThermoFisher)，30μg/mL维生素C；4μg/mL胰岛素；3μg/ml转铁蛋白；3ng/mL亚硒酸钠；
2#：干细胞基础培养基(StemProTMMSC SFM XenoFree，ThermoFisher)，30μg/mL维生素C；4μg/mL胰岛素；3μg/ml转铁蛋白；3ng/mL亚硒酸钠，30-50μM米诺地尔；
3#：干细胞基础培养基(StemProTMMSC SFM XenoFree，ThermoFisher)，30μg/mL维生素C；4μg/mL胰岛素；3μg/ml转铁蛋白；3ng/mL亚硒酸钠，1ng/mL FGF2；
4#：干细胞基础培养基(StemProTMMSC SFM XenoFree，ThermoFisher)，30μg/mL维生素C；4μg/mL胰岛素；3μg/ml转铁蛋白；3ng/mL亚硒酸钠，在进行诱导培养前使用UVB处理细胞，辐照量25mJ/cm2；
阴性对照：不进行细胞培养，仅使用干细胞基础培养基(StemProTMMSC SFMXenoFree，ThermoFisher)，30μg/mL维生素C；4μg/mL胰岛素；3μg/ml转铁蛋白；3ng/mL亚硒酸钠过滤得到上清液。
以下实验检测用本发明的培养方法所得到的脐带间充质干细胞分泌因子的活性，以及阴性对照组所得到的分泌因子组合物的活性，并进行对比。
实施例2.5a-还原酶抑制实验
雄激素性秃发(AGA)，是由于睾酮(T)在5a-还原酶的作用下转化为活性更强的双氢睾酮(DHT)，毛囊对DHT敏感，大量的DHT影响毛囊发育，导致脱发。因此，判断某种物质是否有育发功能，可通过其是否能抑制5a-还原酶作为判断依据之一。本实施例的阳性对照药物为脱发治疗性药物非那司提，它是5a-还原酶公认的药物抑制剂。5a-还原酶的含量通过其mRNA的表达量来衡量，检测过程如下:
人真皮乳头细胞，分别在加入前述4种在不同条件下所得的脐带间充质干细胞分泌因子的培养基，加入非那司提的培养基(阳性对照组)和阴性对照组培养基中培养48小时，然后进行5a-还原酶的mRNA表达水平检测。
检测步骤如下：
1.总RNA提取
使用miRcute miRNA提取分离试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，货号DP501)进行总RNA提取。按照说明书的步骤进行操作。提取RNA后，通过NanoDrop对样本的浓度进行测定。所有RNA样本保存在-80℃冰箱。
2.cDNA反转录
实验均采用FastQuant cDNA第一链合成试剂盒进行(天根生化科技(北京)有限公司，货号KR106)进行。按照说明书的步骤进行操作。所有cDNA样本保存在-20℃冰箱。
3.cDNA的荧光定量
对所有cDNA的荧光定量PCR检测均使用SuperReal荧光定量预混试剂增强版试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，货号FP205)进行。在96孔板中进行反应，具体配制体系如下：
cDNA的荧光定量PCR反应体系
反应体系配制完成后在7500Fast荧光定量PCR仪上进行扩增反应和荧光量读取。具体反应程序如下表：
7500 Fast荧光定量PCR仪两步法反应程序
反应后，对结果以GAPDH为内参，通过“相对表达量＝2^(-ΔΔCt)”的方法计算目的基因的相对表达量。
5a-还原酶qPCR检测引物为:
Forward Primer:TCAGACGAACTCAGTGTACG(SEQ ID NO.1)；
Reverse Primer:CGTAGTGGACGAGGAACATGG(SEQ ID NO.2)
实验结果如图1所示，图中所示“对照”为阴性对照，从结果中可以看出，条件1-4得到的脐带间充质干细胞分泌因子在不同浓度下均可以有效抑制5a-还原酶，且抑制效果随浓度的升高后减少。在被测条件下10％浓度效果为优选浓度，条件4效果较好。
实施例3.促进毛囊离体培养的实验
幼年小鼠触须毛囊在离体状态下，在特定培养基中能存活一定时间。毛囊存活期间，毛发可继续生长。不同配方培养基因所含组分不同，可保持毛囊存活时间亦有不同，可依据毛发不同的生长长度，判断不同配方的培养基对毛囊的影响情况。
从小鼠的上唇部分离获取毛囊组织后，将毛囊置于24孔板的不同孔中。毛囊在37℃、5％二氧化碳条件下孵育14天。移除普通培养液，向孔中分别加入实施例1中得到的4种多肽因子组合物或对照组培养组合物，测定下列指标，每三天换液。
VEGF因子的含量测定：培养15天后的小鼠毛囊组织收集后，每个孔的毛囊转至2mL的冻存管中，加入PBS，在-80℃冰箱中保存样本。标本融化后保持2-8℃，加入PBS，手工研磨将毛囊离心，仔细收集上清液，采用ELISA法检测标本中VEGF因子的含量(Mouse VEGFELISA Kit(Boster Biological Technology,Wuhan,China.Catalog#EK0541)。
毛囊生长长度的分析：每7天拍摄一次毛囊组织长度，通过形态学观察测量毛囊长度。
实验结果如图2和3所示，图中所示“对照”为阴性对照，从结果可以看出，通过体外毛发生长效果量化统计、外植体VEGF分泌量检测，可得所有条件均可以有效促进毛囊生长。效果整体随浓度的上升而上升，条件2、条件3效果较好。
实施例4.促进真皮乳头细胞中与毛发生长相关活性基因(VEGF、IGF-1)表达的实验
顶部及枕部毛囊:消毒后分离真皮和皮下组织，获得皮下组织部分。使用分离酶胶原酶消化皮下组织，获得游离的毛乳头。收集游离的毛乳头，离心5min，用15％DMEM条件培养基悬浮，按每25cm2细胞培养瓶接种30～40个毛乳头，静置5％CO2细胞培养箱5～7d。待真皮乳头细胞贴壁扩增，传代后，在加入前述的4种不同条件所得的脐带间充质干细胞分泌因子所得的4组培养基，及阴性对照培养基中培养24小时后，进行如下指标的检测：
Realtime-qPCR和ELISA检测相关信号分子的表达，包括VEGF(qPCR引物：ForwardPrimer AGGGCAGAATCATCACGAAGT(SEQ ID NO.3)；Reverse Primer AGGGTCTCGATTGGATGGCA(SEQ ID NO.4)/ELISA试剂盒:Mouse VEGF ELISA Kit(Boster Biological Technology,Wuhan,China.Catalog#EK0541)，IGF-1(qPCR引物：Forward PrimerGCTCTTCAGTTCGTGTGTGGA(SEQ ID NO.5)；Reverse Primer GCCTCCTTAGATCACAGCTCC/ELISA(SEQ ID NO.6)试剂盒：Mouse IGF-1 ELISA Kit(Boster Biological Technology，Wuhan，China.Catalog#EK0378)。
实验结果如图4-7所示，图中所示“对照”为阴性对照，从结果可以看出，通过真皮乳细胞的活性分泌因子指标的检测，可见所有条件均可有效促进该类毛囊核心功能细胞的功能化，基于VEGF与IGF的mRNA和蛋白水平的分泌检测指标，条件3的效果较好。
实施例5.人群育发功效测试
测试人群要求：
a)中国男女；
b)年龄20岁～45岁(试验开始时刻)岁(试验开始时刻)岁(试验开始时刻)岁(试验开始时刻)；
c)自我评价头部表现出易脱发、毛稀疏等问题
d)一周可坚持使用产品3次以上；
e)半年内没有进行过针对脱发问题进行过治疗；
f)受试者应当对常用化妆品不敏感；
g)受试者近6个月来没有参加别的同类临床研究；
目标例数
计划入选合格受试者35人，最终完成33人。
测试仪器
①TrichoScan分析软件(DMS，奥地利)；
②DermaDoc皮肤镜图像分析管理系统(DMS，奥地利)；
测试节点
观察项目\观察日 首日 2天后 4周 4周+2天后 8周 8周+2天后
受试者到访 ○ ○ ○ ○ ○ ○
试验说明和取得同意 ○ - - - - -
皮肤镜图像分析管理系统 ○ ○ ○ ○ ○ ○
剃发 ○ - ○ - ○ -
全头拍照 - ○ - ○ - ○
受试者自我评估 - ○ - ○ - ○
确认试验样品的使用状况 - ○ - ○ - ○
注：“○”表示实施，“-”表示不实施。
评价最终指标
头发密度、休止期比例、生长速率、自我满意度评价。
对于人群育发测试试用10％的使用1#条件制备的多肽因子进行涂抹测试，每次头皮涂抹2-4mL。
●受试者脱发数量显著减少，其中87.87％(29人)受试者脱发数量有减少；
●受试者头发密度显著增加，其中69.69％(23人)受试者头发密度有增加；
●受试者头发休止期比例显著降低，其中84.85％(28人)受试者头发休止期比例有降低；
●受试者头发生长速度增加，其中72.73％(24人)的受试者头发生长速度有增加。
以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

Claims (10)

1.脐带间充质干细胞分泌因子的制备方法，包括以下步骤：
1)在诱导培养前，对脐带间充质干细胞进行传代培养；
2)移除传代培养基，使用干细胞诱导培养基进行诱导培养；
3)收集上清，得到脐带间充质干细胞分泌因子。
2.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞分泌因子的制备方法，其中，所述干细胞诱导培养基包括干细胞基础培养基、20.0-40.0μg/mL维生素C、2.0-6.0μg/mL胰岛素、1.0-5.0μg/mL转铁蛋白和1.0-5.0ng/mL亚硒酸钠。
3.根据权利要求2所述的脐带间充质干细胞分泌因子的制备方法，其中，所述干细胞诱导培养基还包括20.0-60.0μM米诺地尔或0.5-1.5ng/mL成纤维细胞生长因子。
4.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞分泌因子的制备方法，其中，所述步骤1)的传代后，间充质干细胞的汇合度为50％-70％。
5.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞分泌因子的制备方法，其中，所述步骤2)的具体过程为，去除传代培养基，使用缓冲液冲洗后，加入诱导培养基培养36小时-60小时。
6.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞分泌因子的制备方法，其中，在所述步骤2)中的诱导培养前，使用UVB处理细胞。
7.根据权利要求6所述的脐带间充质干细胞分泌因子的制备方法，其中，所述UVB处理的辐照量为20-30mJ/cm2。
8.由权利要求1-7中任一项所述的脐带间充质干细胞分泌因子的制备方法得到的脐带间充质干细胞分泌因子。
9.脐带间充质干细胞分泌因子在促进毛囊修复和/或毛发再生中的应用，其中所述脐带间充质干细胞分泌因子根据权利要求1-7中任一项所述的制备方法进行制备而得到。
10.脐带间充质干细胞分泌因子在制备用于促进毛囊修复和/或毛发再生的药品或保健品中的应用，其中所述脐带间充质干细胞分泌因子根据权利要求1-7中任一项所述的制备方法进行制备而得到。
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Pledgor: Hemei Biotechnology (Zhejiang) Co.,Ltd.

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