CN115521919A - 一种调节pd-1抗体和lag-3抗体酸性电荷异构体的cho细胞培养方法 - Google Patents

一种调节pd-1抗体和lag-3抗体酸性电荷异构体的cho细胞培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种调节PD‑1抗体和LAG‑3抗体酸性电荷异构体的CHO细胞培养方法，采用分批补料培养方式培养，在细胞培养至第4~5天后，培养温度降至30‑34℃，同时按照下述补料策略进行培养：在第3、6、8、10天同时添加第一补料培养基和第二补料培养基进行补料培养，同时在第3天添加复合调节剂进行补料培养。本发明从细胞培养的代谢过程调控出发，通过改变降温时间、改变补料策略、向基础培养基中添加天冬氨酸、复合调节剂等，使得其表达过程中营养充分并且对部分电荷异质性的修饰和降解起到抑制和阻止作用，从而能稳定、有效地改善抗体产品的电荷异质性及保持或增加抗体的表达量，有效地解决抗体生产中电荷异质性和产量的问题，方法具有广泛的适应性。

Description

一种调节PD-1抗体和LAG-3抗体酸性电荷异构体的CHO细胞培 养方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体一种涉及调节PD-1抗体和LAG-3抗体酸性电荷异构体的CHO细胞培养方法。
背景技术
蛋白表面一般都含有大量的带电荷基团，且电荷性质可能因各种修饰而发生变化。根据蛋白所带净电荷的不同，可以简单地根据基于电荷的纯化方法将蛋白分为酸性电荷异质体（Acidic variants/ species）、中性主峰（Mian species）和碱性电荷异质体（Basic variants/ species）。酸性电荷异质体产生的原因主要包括C端赖氨酸清除、CDR区天冬氨酸脱酰胺化等，酸性电荷异质体增加会导致单抗类产品半衰期缩短，血液清除率提高，而抗体抗原结合区（Fab区）的修饰，特别是互补决定区（CDR区）的修饰，极有可能对抗原结合和效力产生实质性的影响。碱性电荷异质体产生的原因主要包括C末端赖氨酸的不完全去除、轻链或重链的N-末端谷氨酰胺(Gln)不完全环化为焦谷氨酸等，抗体N端或C端的修饰一般不会对抗体的结构、稳定性和功能产生实质性的影响。
由于电荷异质体可能会影响药物的疗效和/或导致副作用，故需将其控制在可接受范围内，且保证批次间电荷分布的一致性和稳定性。
目前，对生产过程中影响电荷异质体形成的因素的理解尚未十分透彻，故调控策略很难做到有的放矢。已有研究表明有多种调控措施可以减少酸性电荷变体含量，包括降低温度、调节光照、降低表达阶段的pH、培养基中添加Cu2+、Ca2+离子等物质。如CN107805650A公开了一种抗体生产方法，其适用于GS-CHO细胞系构建的细胞株，通过向流加培养液中添加蛋白水解物，使其在表达过程中营养充分并对部分电荷异质性的修饰和降解起到抑制和阻止作用，但是由于蛋白水解物成份不明确，批次间差异等不利因素，产品稳定性不能得到保障。此外，这些手段对不同抗体表达体系的电荷调节应用有限，对抗体的产量也无明显提高。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种调节PD-1抗体和LAG-3抗体酸性电荷异构体的CHO细胞培养方法，能稳定、有效地改善抗体产品的电荷异质性及保持或增加抗体的表达量，有效地解决抗体生产中电荷异质性不均一和产量较低的问题，方法具有极广的适应性。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种调节PD-1抗体和LAG-3抗体酸性电荷异构体的CHO细胞培养方法，采用批次补料培养方式培养，包括如下步骤：
（1）在细胞培养容器中加入基础培养基，接种表达单克隆抗体的CHO-K1细胞株进行培养；
（2）细胞培养至第4~5天后，培养温度降至30-34℃，同时按照下述补料策略进行培养：在第3、6、8、10天同时添加第一补料培养基和第二补料培养基进行补料培养，同时在第3天添加复合调节剂进行补料培养；
其中，所述基础培养基为添加谷氨酰胺、HT添加剂（次黄嘌呤钠盐/胸苷）和天冬氨酸的EdenB501S或
所述基础培养基为添加谷氨酰胺、HT添加剂和天冬氨酸的EdenB501S；
所述第一补料培养基为EdenF500aS；
所述第二补料培养基为EdenF200bs；
所述复合调节剂为精氨酸、赖氨酸、氯化钙和烟酰胺的水溶液。
优选地，所述基础培养基中，谷氨酰胺的添加比例为4mM，HT添加剂的添加比例为1%v/v，其中，所述HT添加剂为100x HT添加剂，其包含10 mM次黄嘌呤钠和1.6 mM胸苷的混合物，即HT（100x），天冬氨酸的添加量为0.8-1.2g/kg，天冬氨酸属于非必需氨基酸，是大规模培养过程中的关键营养物，能提供氮源，促进蛋白合成。根据生产经验选择天冬氨酸0.8-1.2g/kg范围进行实验。优选地，天冬氨酸的添加量为1.0g/kg。
优选地，复合调节剂中，精氨酸的浓度为0.3-0.7mg/kg，赖氨酸的浓度为0.8-1.2mg/kg，氯化钙的浓度为1.0-2.0mg/kg，烟酰胺的浓度为0.6-1.0mg/kg。优选地，精氨酸的浓度为0.5mg/kg，赖氨酸的浓度为1.0mg/kg，氯化钙的浓度为1.5mg/kg，烟酰胺的浓度为0.8mg/kg。精氨酸和赖氨酸不能由细胞自身合成，只能从培养基中获取，添加后可以有效减少产品的酸性物质；氯化钙可以改变细菌细胞壁的通透性，方便代谢产物的排出从而避免与酶结合阻止代谢进行；烟酰胺又称尼克酰胺、维生素B3或维生素PP，是一种水溶性维生素，在生物氧化中起着递氢作用，能促进细胞呼吸、生物氧化过程和新陈代谢。本申请通过添加4种成分，优化细胞生长代谢状况， 提高目的蛋白合成及分泌水平。
在培养过程中，当葡萄糖浓度低于3g/L时，补加300g/kg葡萄糖母液至葡萄糖浓度为6g/L。
其中，细胞接种密度为0.3-0.7×106cells/mL。
具体地，细胞活率降至60%或培养至第14天时细胞培养结束，收获上清液。
在一些实施方式中，表达单克隆抗体的CHO-K1细胞株所表达的单克隆抗体为抗PD-1抗体或抗LAG-3抗体。
其中，在第3、6、8、10天按照初始培养体积的3~8%补料量添加第一补料培养基，按照培养体积的0.3~0.8%补料量添加第二补料培养基进行补料培养，同时在第3天按照初始培养体积的1-2%添加复合调节剂进行培养。优选地，第一补料培养基的添加比例为培养体积的5%，第二补料培养基的添加比例为培养体积的0.5%。
上述所述培养条件为：在36.5±0.5℃，转速110~120 rpm，CO2浓度为5.0-6.0%的条件下进行培养。
在一种优选的实施方式中，本申请提出了一种调节PD-1抗体和LAG-3抗体酸性电荷异构体的CHO细胞培养方法，采用分批补料培养方式培养，包括如下步骤：
（1）在细胞培养容器中加入基础培养基，接种表达单克隆抗体的CHO-K1细胞株进行培养；
（2）细胞培养至第4~5天，培养温度降至30-34℃；在第3、6、8、10天按照初始培养体积的5%补料量添加第一补料培养基，按照培养体积的0.5%补料量添加第二补料培养基进行补料培养，同时在第3天按照初始培养体积的1-2%添加复合调节剂进行培养；
其中，所述基础培养基为添加谷氨酰胺、HT添加剂和天冬氨酸的EdenB501S，谷氨酰胺的添加比例为4mM，HT添加剂的添加比例为1%v/v，所述HT添加剂为100x HT添加剂，其包含10 mM次黄嘌呤钠和1.6 mM胸苷的混合物，天冬氨酸的添加量为1g/kg，所述第一补料培养基为EdenF500aS，所述第二补料培养基为EdenF200bs，所述复合调节剂为含有0.5mg/kg精氨酸、1.0mg/kg的赖氨酸、1.5mg/kg的氯化钙、0.8mg/kg的烟酰胺的水溶液。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
（1）本申请的抗体生产方法改善了抗体电荷异质性，降低了抗体的酸性峰含量；
（2）本发明的抗体生产方法减少了聚体含量，提高了单体含量；
（3）本发明的抗体生产方法增加了抗体产量；
（4）本发明的抗体生产方法采用了多种调控措施，并使用化学成分明确的培养基及添加物，能维持生产工艺和抗体质量的稳定性。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1显示了细胞株1实施例和比较例的活细胞密度随培养时间的变化图；
图2显示了细胞株1实施例和比较例的细胞活率随培养时间的变化图；
图3显示了细胞株1实施例和比较例的乳酸浓度随培养时间的变化图；
图4显示了细胞株1实施例和比较例的葡萄糖浓度随培养时间的变化图；
图5显示了细胞株1实施例和比较例的抗体表达量比对图；
图6显示了细胞株1实施例和比较例的体积排阻色谱法（SEC）聚体检测结果图；
图7显示了细胞株1实施例和比较例的体积排阻色谱法（SEC）单体检测结果图；
图8显示了细胞株1实施例和比较例的阳离子色谱法（CEX）酸性峰检测结果图；
图9显示了细胞株1实施例和比较例的阳离子色谱法（CEX）主峰检测结果图；
图10显示了细胞株2实施例和比较例的抗体表达量图；
图11显示了细胞株2实施例和比较例的体积排阻色谱法（SEC）聚体检测结果图；
图12显示了细胞株2实施例和比较例的体积排阻色谱法（SEC）单体检测结果图；
图13显示了细胞株2实施例和比较例的阳离子色谱法（CEX）酸性峰检测结果图；
图14显示了细胞株2实施例和比较例的阳离子色谱法（CEX）主峰检测结果图。
具体实施方式
本发明从细胞培养的代谢过程调控出发，通过四种方式，分别为改变降温时间、改变补料策略、向基础培养基（EdenB501S+4mM谷氨酰胺+1% HT）中添加天冬氨酸、添加一种复合调节剂（精氨酸、赖氨酸、氯化钙和烟酰胺混合物），使得其表达过程中营养充分并且对部分电荷异质性的修饰和降解起到抑制和阻止作用，从而能稳定、有效地改善抗体产品的电荷异质性及保持或增加抗体的表达量，有效地解决抗体生产中电荷异质性和产量的问题，方法具有广泛的适应性。
本发明所用细胞株1为自主构建表达单克隆抗体的CHO细胞株，宿主细胞是CHO-K1（ATCC，NO.CCL61），所用抗PD-1抗体基因编码序列见CN106432494A文献所附序列表中的SEQID NO:62及SEQ ID NO:64，构建携带抗体轻、重链基因的表达载体pcDNA3.1-LC-G418和pcDNA3.1-HC-zeocin转染CHO-K1细胞。将转染24h后的细胞用选择性培养基（500ug/mLG418+400ug/mL Zeocin）筛选以获得迷你细胞群。迷你细胞群恢复后利用流式分选技术进行克隆筛选，通过摇管分批补料实验进行克隆评估后挑选表达量最高、抗体质量最佳的克隆用于上游细胞培养工艺，将该克隆命名为CHO细胞株1。
本发明所用细胞株2为自主构建表达单克隆抗体的CHO细胞株，宿主细胞是CHO-K1（ATCC，NO.CCL61），所用抗LAG-3抗体基因编码序列见CN110204614A文献所附序列表中的SEQ ID NO:17及SEQ ID NO:18，所用真核表达载体是pcDNA3.1。构建携带抗体轻、重链基因的表达载体pcDNA3.1-LC-G418和pcDNA3.1-HC-zeocin转染CHO-K1细胞。将转染24h后的细胞用选择性培养基（500ug/mL G418+400ug/mL Zeocin）筛选以获得迷你细胞群。迷你细胞群恢复后利用流式分选技术进行克隆筛选，通过摇管分批补料实验进行克隆评估后挑选表达量最高、抗体质量最佳的克隆用于上游细胞培养工艺，将该克隆命名为CHO细胞株2。
可以使用本领域技术人员所熟知并实践的方法来构建含有编码抗体的序列以及适当转录和翻译控制元件的表达载体。
下面通过具体实施例详细说明本发明，文中使用的试剂除非另有指明均为市售可得试剂。
下述实施例中，基础培养基1为添加谷氨酰胺、HT添加剂的EdenB501S；基础培养基2为添加谷氨酰胺、HT添加剂和天冬氨酸的EdenB501S，即相较于基础培养基1额外添加了天冬氨酸。其中，HT添加剂即为100x HT补充液（Life Technologies Corporation）。
比较例1
比较例1的抗体生产过程如下：
（a）细胞复苏阶段：将细胞株1复苏，37℃水浴，120~150秒内快速解冻；将细胞悬液移至含有40 ml预热好的完全培养基，组分为：CD CHO+4mM Glutamine+1%HT（含义为含有1%v/v HT（100X，即为10 mM次黄嘌呤钠和1.6 mM胸苷的混合物）和4 mM 谷氨酰胺，下文中相关培养基具有类似的含义）中，调节细胞接种密度至0.4×106 cells/mL；将培养摇瓶（250mL）转移至二氧化碳摇床中（振幅50 mm），摇床参数设定为：转速110 rpm，CO2浓度6.0%，温度36.5℃；
（b）种子扩增阶段：按照扩增计划，细胞培养2～4天后，取样检测活细胞密度及细胞活率，观察细胞形态。当活细胞密度及细胞活率满足下一级扩增要求后，在生物安全柜内用预热的完全培养基将细胞按种子扩增计划要求接种至相应规格一次性无菌锥形瓶中；
（c）细胞培养阶段：待种子液活细胞密度达到2～5×106cells/mL，将细胞悬液接种于1L摇瓶中，加入基础培养基1：EdenB501S+4mM Glutamine+1%HT，细胞接种密度为0.30～0.70×106cells/mL，接种后在36.5±0.5℃，转速110 rpm，CO2浓度6.0%条件下进行培养，初始培养体积约300mL；
（d）细胞培养至第5天，培养温度降至31.0±0.5℃；同时在第3、5、7、9、11天以如下的策略进行补料培养，直至培养结束；培养策略为：每两天补料一次，第一补料培养基EdenF500aS的添加的比例为初始培养体积的5%；第二补料培养基EdenF200bs的添加的比例为初始培养体积的0.5%；
（e）当葡萄糖浓度低于3g/L时，补加浓度为300g/kg的葡萄糖母液至6g/L；
（f）待细胞活率降至60%或培养至第14天时结束细胞培养，收获上清液；
（g）本比较例对培养产物进行测试，得到如下结果：抗体表达量为2.39 g/L，聚体和单体含量分别是4.1%、95.8%；酸性峰含量为34.5%，主峰含量为47.8%。
实施例1
本实施例采用与比较例1相同的方法进行培养，不同的是：本实施例细胞培养的降温时间为培养至第四天，温度降至31.0±0.5℃。
本实施例以比较例1作为对照组，对培养产物进行测试，得到如下结果：
请参见图1-图9，其中，相对于对照组，实施例1培养细胞密度整体偏低，培养后期细胞衰亡趋势减缓，收获时细胞活率在80%以上，乳酸堆积，葡萄糖水平维持在1-6g/L之间。实施例1聚体含量从4.1%降至3.7%，单体含量从95.8%提升至96.1%，碎片含量基本一致。实施例1抗体表达量提高至3.12g/L；酸性峰含量由34.5%降至31.7%，主峰含量由47.8%提升至49.1%。
从本实施例的以上结果可知，优化降温时间能减少聚体含量，提高单体含量，并有效降低了酸性峰含量，提高主峰含量，此外抗体产量也明显提高。
实施例2
本实施例采用与比较例1相同的方法进行培养，不同的是：本实施例的第一和第二补料培养基采用在第3、6、8、10天进行补料的策略；
本实施例以比较例1作为对照组，对培养产物进行测试，得到如下结果：
请参见图1-图9，其中，相对于对照组，实施例2培养后期细胞衰亡趋势减缓，收获时细胞活率在85%以上，乳酸水平先上升后下降，上下波动明显，葡萄糖水平维持在1-6g/L之间。 实施例2聚体含量从4.1%降至2.7%，单体含量从95.8%提升至97.1%，碎片含量基本一致。实施例2抗体表达量提高至3.25g/L；酸性峰含量由34.5%降至31.2%，主峰含量由47.8%提升49.8%。
从本实施例的以上结果可知，优化补料策略能有效减少聚集体含量，提高单体含量，降低酸性峰含量，提高主峰含量，同时抗体产量提高。
实施例3
本实施例采用与比较例1相同的方法进行培养，不同的是：本实施例采用含1g/ kg天冬氨酸的基础培养基2（EdenB501S+4mM Glutamine+1%HT+1g/ kg天冬氨酸）。
本实施例以比较例1作为对照组，对培养产物进行测试，得到如下结果：
请参见图1-图9，其中，相对于对照组，实施例3培养后期细胞衰亡趋势减缓，收获时细胞活率在90%以上，乳酸水平先上升后下降，上下波动明显，葡萄糖水平均维持在1-6g/L之间。实施例3聚体含量从4.1%降至2.5%，单体含量从95.8%提升至97.4%，碎片含量基本一致。实施例3抗体表达量提高至3.32g/L；酸性峰含量由34.5%降至29.4%，主峰含量由47.8%提升至50.2%。
从本实施例的以上结果可知，基础培养基中添加天冬氨酸能有效减少聚集体含量，提高单体含量，并有效降低酸性峰含量，提高主峰含量，同时抗体产量提高。
实施例4
本实施例采用与比较例1相同的方法进行培养，不同的是：本实施例在培养第3天将含有0.5mg/kg精氨酸、1.0mg/kg赖氨酸、1.5mg/kg氯化钙、0.8mg/kg烟酰胺的复合调节剂按照初始培养体积的2%一次性添加至摇瓶中。
本实施例以比较例1作为对照组，对培养产物进行测试，得到如下结果：
请参见图1-图9，其中，相对于对照组，实施例4培养后期细胞衰亡趋势减缓，收获时细胞活率在90%以上，乳酸水平先上升后下降，上下波动明显，葡萄糖水平均维持在1-6g/L之间。实施例4聚体含量从4.1%降至2.6%，单体含量从95.8%提升至97.3%，碎片含量基本一致。实施例4抗体表达量提高至3.79g/L；酸性峰含量由34.5%降至28.6%，主峰含量由47.8%提升至50.5%，
从本实施例的以上结果可知，增加一定浓度的精氨酸、赖氨酸、氯化钙、烟酰胺混合物作为调节剂能有效减少聚集体含量，提高单体含量，并能有效降低酸性峰含量，提高主峰含量，抗体产量明显提高。
实施例5
本实施例采用与实施例4相同的方法进行培养，不同的是：本实施例复合调节剂中精氨酸添加量调整为0.3mg/kg、赖氨酸添加量调整为0.8mg/kg、氯化钙添加量调整为1.0mg/kg、烟酰胺添加量调整为0.6mg/kg。
本实施例以实施例4作为对照组，对培养产物进行测试，得到如下结果：
请参见图1-图9，其中，相对于对照组，实施例5培养后期细胞衰亡趋势减缓，收获时细胞活率在85%以上，乳酸水平均先上升后下降，上下波动明显，葡萄糖水平均维持在1-6g/L之间。实施例5聚体含量从2.6%升至3.6%，单体含量从97.3%降至96.2%，碎片含量基本一致。实施例5抗体表达量由3.79 g/L降低至3.05g/L；酸性峰含量由28.6%升至33.5%，主峰含量由50.5%降至47.5%。
从本实施例的以上结果可知，在实施例4的基础上，复合调节剂各组分添加浓度降低，聚体含量增加，酸性峰含量增高，抗体产量也明显降低。
实施例6
本实施例采用与实施例4相同的方法进行培养，不同的是：本实施例复合调节剂中精氨酸添加量调整为0.7mg/kg、赖氨酸添加量调整为1.2mg/kg、氯化钙添加量调整为2.0mg/kg、烟酰胺添加量调整为1.0mg/kg。
本实施例以实施例4作为对照组，对培养产物进行测试，得到如下结果：
请参见图1-图9，其中，相对于对照组，实施例6培养后期细胞衰亡趋势减缓，收获时细胞活率在85%以上，乳酸水平均先上升后下降，上下波动明显，葡萄糖水平均维持在1-6g/L之间。实施例6聚体含量从2.6%升至3.1%，单体含量从97.3%降至96.8%，碎片含量基本一致。实施例6抗体表达量由3.79 g/L降低至3.02g/L；酸性峰含量由28.6%升至32.4%，主峰含量由50.5%降至49.7%。
从本实施例的以上结果可知，在实施例4的基础上，复合调节剂各组分添加浓度升高，聚体含量增加，酸性峰含量增加，同时抗体产量也降低。
实施例7
本实施例采用与实施例4相同的方法进行培养，其中，不同的是：本实施例复合调节剂中氯化钙添加量调整为2.3mg/kg。
本实施例以实施例4作为对照组。对培养产物进行测试，得到如下结果：
请参见图1-图9，其中，相对于对照组，实施例7培养后期细胞衰亡趋势减缓，收获时细胞活率在80%以上，乳酸水平均先上升后下降，上下波动明显，葡萄糖水平均维持在1-6g/L之间。实施例7聚体含量从2.6%升至3.4%，单体含量从97.3%降至96.5%，碎片含量基本一致。实施例7抗体表达量由3.79 g/L提高至3.98g/L；酸性峰含量由28.6%降至27.8%，主峰含量基本一致。
从本实施例的以上结果可知，在实施例4的基础上，复合调节剂中氯化钙浓度提高，酸性峰含量降低，产量提高。
实施例8
本实施例采用与实施例4相同的方法进行培养，本实施例在培养第3天将含有0.5mg/kg精氨酸、1.0mg/kg赖氨酸、1.5mg/kg氯化钙、0.8mg/kg烟酰胺的复合调节剂按照初始培养体积的2%一次性添加至摇瓶中；不同的是：培养至第四天，温度降至31.0±0.5℃。
本实施例以实施例4作为对照组。对培养产物进行测试，得到如下结果：
请参见图1-图9，其中，相对于对照组，实施例8培养后期细胞衰亡趋势减缓，收获时细胞活率在90%以上，乳酸水平均先上升后下降，上下波动明显，葡萄糖水平均维持在1-6g/L之间。实施例8聚体含量从2.6%降至2.5%，单体含量维持在97.3%，碎片含量基本一致。实施例8抗体表达量由3.79 g/L提高至4.11g/L；酸性峰含量由28.6%降至26.3%，主峰含量由50.5%提升至51.1%。
实施例9
本实施例采用与实施例4相同的方法进行培养，不同的是：本实施例第一和第二补料培养基采用在第3、6、8、10天进行补料的策略。
本实施例以实施例4作为对照组。对培养产物进行测试，得到如下结果：
请参见图1-图9，其中，相对于对照组，实施例9培养后期细胞衰亡趋势减缓，收获时细胞活率在90%以上，乳酸水平均先上升后下降，上下波动明显，葡萄糖水平均维持在1-6g/L之间。实施例9抗体表达量由3.79 g/L提高至4.14g/L；酸性峰含量由28.6%降至26.8%，主峰含量由50.5%升至51.3%。
实施例10
本实施例采用与实施例4相同的方法进行培养，不同的是：本实施例采用含1g/kg天冬氨酸的基础培养基2。
本实施例以实施例4作为对照组。对培养产物进行测试，得到如下结果：
请参见图1-图9，其中，相对于对照组，实施例10培养后期细胞衰亡趋势减缓，收获时细胞活率在90%以上，乳酸水平均先上升后下降，上下波动明显，葡萄糖水平均维持在1-6g/L之间。实施例10聚体含量从2.6%降至2.3%，单体含量从97.3%提升至97.5%，碎片含量基本一致。实施例10抗体表达量由3.79 g/L提高至4.07g/L；酸性峰含量由28.6%降至27.2%，主峰含量由50.5%提升至51.5%，
实施例11
本实施例采用与实施例4相同的方法进行培养，不同的是：本实施例第一和第二补料培养基采用在第3、6、8、10天进行补料的策略；同时，培养至第四天，温度降至31.0±0.5℃。
本实施例以实施例4作为对照组。对培养产物进行测试，得到如下结果：
请参见图1-图9，其中，相对于对照组，实施例11培养后期细胞衰亡趋势减缓，收获时细胞活率在90%以上，乳酸水平均先上升后下降，上下波动明显，葡萄糖水平均维持在1-6g/L之间。实施例11聚体含量从2.6%降至2.4%，单体含量从97.3%提升至97.4%，碎片含量基本一致。实施例11抗体表达量由3.79g/L提高至4.27g/L；酸性峰含量由28.6%降至25.4%，主峰含量由50.5%提升至51.8%。
从本实施例结果可知，添加优选比例的复合调节剂，同时优化补料策略和降温时间能减少聚体含量，提高单体含量，并能降低酸性峰含量、提高主峰含量，同时抗体产量明显提高。
实施例12
本实施例采用与实施例4相同的方法进行培养，不同的是：本实施例采用含1g/kg天冬氨酸的基础培养基2；第一和第二补料培养基采用在第3、6、8、10天进行补料的策略；培养至第四天，温度降至31.0±0.5℃。
本实施例以实施例4作为对照组。对培养产物进行测试，得到如下结果：
请参见图1-图9，其中，相对于对照组，实施例12培养后期细胞衰亡不明显，收获时细胞活率在90%以上，乳酸水平均先上升后下降，上下波动明显，葡萄糖水平均维持在1-6g/L之间。实施例12聚体含量从2.6%降至2.1%，单体含量从97.3%提升至97.7%，碎片含量基本一致。实施例12抗体表达量由3.79 g/L提高至4.61g/L；酸性峰含量由28.6%降至24.3%，主峰含量由50.5%提升至51.5%。
实施例13
本实施例采用与实施例12相同的方法进行培养，不同的是：本实施例复合调节剂含有0.5mg/kg精氨酸、1.0mg/kg赖氨酸、1.5mg/kg氯化钙，未添加烟酰胺。
本实施例以实施例12作为对照组。对培养产物进行测试，得到如下结果：
请参见图5-图9，其中，相对于对照组，实施例13抗体表达量由4.61 g/L降低至4.36g/L，酸性峰含量由24.3%升高至25.9%。由此可知，复合调节剂中不添加烟酰胺，酸性峰含量增加，抗体产量降低。
比较例2
本比较例采用与比较例1相同的方法进行培养，不同的是：本比较例采用细胞株2进行细胞培养。
本比较例对培养产物进行测试，得到如下结果：
请参见图10-图14，比较例2抗体表达量为3.51 g/L，聚体含量和单体含量分别是1.4%、98.6%；酸性峰含量为38.6%，主峰含量45.3%。
实施例14
本实施例采用与比较例2相同的方法进行培养，不同的是：本实施例采用含1g/ kg天冬氨酸的基础培养基2（EdenB501S+4mM Glutamine+1%HT+1g/ kg天冬氨酸）；第一和第二补料培养基采用在第3、6、8、10天进行补料的策略；培养第3天将含有0.5mg/kg精氨酸、1.0mg/kg赖氨酸、1.5mg/kg氯化钙、0.8mg/kg烟酰胺的复合调节剂按照初始培养体积的2%一次性添加至摇瓶中；培养至第四天，温度降至31.0±0.5℃。
本实施例以比较例2作为对照组。对培养产物进行测试，得到如下结果：
请参见图10-图14，其中，相对于比较例2，实施例14聚体含量从1.4%降至0.9%，单体含量从98.6%提升至99.1%，碎片含量基本一致。实施例14抗体表达量由3.51 g/L提高至5.84 g/L；酸性峰含量由38.6%降至31.9%，主峰含量由45.3%提升至50.1%。
实施例15
本实施例采用与实施例14相同的方法进行培养，不同的是：本实施例复合调节剂含有0.5mg/kg精氨酸、1.0mg/kg赖氨酸、1.5mg/kg氯化钙，未添加烟酰胺。
本实施例以实施例14作为对照组。对培养产物进行测试，得到如下结果：
请参见图10-图14，其中，相对于对照组，实施例15聚体含量基本一致，表达量由5.84g/L降至5.17 g/L，酸性峰含量由31.9%升至33.7%，主峰含量由50.1%降至49.1%。
本发明提供了一种调节PD-1抗体和LAG-3抗体酸性电荷异构体的CHO细胞培养的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims (10)

1.一种调节PD-1抗体和LAG-3抗体酸性电荷异构体的CHO细胞培养方法，其特征在于，采用分批补料培养方式培养，包括如下步骤：
（1）在细胞培养容器中加入基础培养基，接种表达单克隆抗体的CHO-K1细胞株进行培养；
（2）细胞培养至第4~5天后，培养温度降至30-34℃，同时按照下述补料策略进行培养：在第3、6、8、10天同时添加第一补料培养基和第二补料培养基进行补料培养，同时在第3天添加复合调节剂进行补料培养；
其中，所述基础培养基为添加谷氨酰胺、HT添加剂的EdenB501S或添加谷氨酰胺、HT添加剂和天冬氨酸的EdenB501S；
所述第一补料培养基为EdenF500aS；
所述第二补料培养基为EdenF200bs；
所述复合调节剂为精氨酸、赖氨酸、氯化钙和烟酰胺的水溶液。
2.根据权利要求1所述的CHO细胞培养方法，其特征在于，所述基础培养基中，谷氨酰胺的添加比例为4mM，HT添加剂的添加比例为1%v/v，天冬氨酸的添加量为0.8-1.2g/kg，所述HT添加剂为100x HT添加剂。
3.根据权利要求1所述的CHO细胞培养方法，其特征在于，复合调节剂中，精氨酸的浓度为0.3-0.7mg/kg，赖氨酸的浓度为0.8-1.2mg/kg，氯化钙的浓度为1.0-2.0mg/kg，烟酰胺的浓度为0.6-1.0mg/kg。
4.根据权利要求1所述的CHO细胞培养方法，其特征在于，在培养过程中，当葡萄糖浓度低于3g/L时，补加300g/kg葡萄糖母液至葡萄糖浓度为6g/L。
5.根据权利要求1所述的CHO细胞培养方法，其特征在于，细胞接种密度为0.3-0.7×106cells/mL。
6.根据权利要求1所述的CHO细胞培养方法，其特征在于，细胞活率降至60%或培养至第14天时细胞培养结束，收获上清液。
7.根据权利要求1所述的CHO细胞培养方法，其特征在于，表达单克隆抗体的CHO-K1细胞株所表达的单克隆抗体为抗PD-1抗体或抗LAG-3抗体。
8.根据权利要求1所述的CHO细胞培养方法，其特征在于，在第3、6、8、10天按照初始培养体积的3~8%补料量添加第一补料培养基，按照初始培养体积的0.3~0.8%补料量添加第二补料培养基进行补料培养，同时在第3天按照初始培养体积的1-2%添加复合调节剂进行培养。
9.根据权利要求1所述的CHO细胞培养方法，其特征在于，第0天至第3天的培养条件为：在36.5±0.5℃，转速110~120 rpm，CO2浓度为5.0-6.0%的条件下进行培养。
10.一种调节单抗酸性电荷异构体的CHO细胞培养方法，其特征在于，采用分批补料培养方式培养，包括如下步骤：
（1）在细胞培养容器中加入基础培养基，接种表达单克隆抗体的CHO-K1细胞株进行培养；
（2）细胞培养至第4~5天后，培养温度降至30-34℃；在第3、6、8、10天按照初始培养体积的5%补料量添加第一补料培养基，按照初始培养体积的0.5%补料量添加第二补料培养基进行补料培养，同时在第3天按照初始培养体积的1-2%添加复合调节剂进行培养；
其中，所述基础培养基为添加谷氨酰胺、HT添加剂的EdenB501S或添加谷氨酰胺、HT添加剂和天冬氨酸的EdenB501S，谷氨酰胺的添加比例为4mM，HT添加剂的添加比例为1%v/v，所述HT添加剂为100x HT添加剂，天冬氨酸的添加量为1g/kg，所述第一补料培养基为EdenF500aS，所述第二补料培养基为EdenF200bs，所述复合调节剂为含有0.5mg/kg精氨酸、1.0mg/kg的赖氨酸、1.5mg/kg的氯化钙、0.8mg/kg的烟酰胺的水溶液。
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