EA046459B1 - Способы получения устекинумаба - Google Patents
Способы получения устекинумаба Download PDFInfo
- Publication number
- EA046459B1 EA046459B1 EA202191840 EA046459B1 EA 046459 B1 EA046459 B1 EA 046459B1 EA 202191840 EA202191840 EA 202191840 EA 046459 B1 EA046459 B1 EA 046459B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- glycan
- ustekinumab
- level
- culture
- target
- Prior art date
Links
- MJZJYWCQPMNPRM-UHFFFAOYSA-N 6,6-dimethyl-1-[3-(2,4,5-trichlorophenoxy)propoxy]-1,6-dihydro-1,3,5-triazine-2,4-diamine Chemical compound CC1(C)N=C(N)N=C(N)N1OCCCOC1=CC(Cl)=C(Cl)C=C1Cl MJZJYWCQPMNPRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 187
- 229960003824 ustekinumab Drugs 0.000 title claims description 187
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 88
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 115
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 claims description 48
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 43
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 38
- DWCNMHMZSYJSGO-IMJCQESISA-N beta-D-GlcpNAc-(1->2)-alpha-D-Manp-(1->3)-[beta-D-GlcpNAc-(1->2)-alpha-D-Manp-(1->6)]-beta-D-Manp-(1->4)-beta-GlcpNAc-(1->4)-[alpha-L-Fucp-(1->6)]-beta-D-GlcpNAc Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@H]3[C@H]([C@@H](O[C@@H]4[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)NC(C)=O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]4[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)NC(C)=O)O3)O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@H](O)[C@@H](NC(C)=O)[C@H](O)O1 DWCNMHMZSYJSGO-IMJCQESISA-N 0.000 claims description 36
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 26
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 26
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 25
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 17
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 16
- 238000013459 approach Methods 0.000 claims description 13
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 13
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 claims description 12
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 9
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 5
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims description 4
- 230000009450 sialylation Effects 0.000 claims description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 80
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 26
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 21
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 18
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 14
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 14
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 14
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 12
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 11
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 11
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 9
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 9
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 8
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 7
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- WWOGFSBVRNWZBV-KVMLNOKXSA-N beta-D-Galp-(1->4)-beta-D-GlcpNAc-(1->2)-alpha-D-Manp-(1->3)-[beta-D-Galp-(1->4)-beta-D-GlcpNAc-(1->2)-alpha-D-Manp-(1->6)]-beta-D-Man-(1->4)-beta-D-GlcpNAc-(1->4)-[alpha-L-Fucp-(1->6)]-beta-D-GlcpNAc Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@H]3[C@H]([C@@H](O[C@@H]4[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@@H](CO)O4)NC(C)=O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]4[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@@H](CO)O4)NC(C)=O)O3)O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@H](O)[C@@H](NC(C)=O)[C@H](O)O1 WWOGFSBVRNWZBV-KVMLNOKXSA-N 0.000 description 6
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 201000008808 Fibrosarcoma Diseases 0.000 description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 4
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 4
- -1 '-fluororibose Chemical class 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- 210000000692 cap cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005084 2D-nuclear magnetic resonance Methods 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 238000004252 FT/ICR mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 2
- 102100038551 Peptide-N(4)-(N-acetyl-beta-glucosaminyl)asparagine amidase Human genes 0.000 description 2
- 102100024952 Protein CBFA2T1 Human genes 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 2
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000013583 drug formulation Substances 0.000 description 2
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 2
- 238000005016 nuclear Overhauser enhanced spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 108040002068 peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl)asparagine amidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 101150029662 E1 gene Proteins 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N N-acetyl-beta-neuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 1
- 102000000447 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Human genes 0.000 description 1
- 108010055817 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 201000001263 Psoriatic Arthritis Diseases 0.000 description 1
- 208000036824 Psoriatic arthropathy Diseases 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- GBXZONVFWYCRPT-KVTDHHQDSA-N [(2s,3s,4r,5r)-3,4,5,6-tetrahydroxy-1-oxohexan-2-yl] dihydrogen phosphate Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C=O)OP(O)(O)=O GBXZONVFWYCRPT-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 210000001776 amniocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000000738 capillary electrophoresis-mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000005100 correlation spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001077 electron transfer detection Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 238000005570 heteronuclear single quantum coherence Methods 0.000 description 1
- 229920000140 heteropolymer Polymers 0.000 description 1
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012007 large scale cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001896 rotating frame Overhauser effect spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Description
Перекрестные ссылки на смежные заявки
Данная заявка испрашивает преимущество по предварительной заявке на патент США № 62/786821, поданной 31 декабря 2018 г., которая полностью включена в настоящий документ путем ссылки.
Перечень последовательностей
Рассматриваемая заявка содержит перечень последовательностей, поданный в электронном виде в формате ASCII и полностью включенный в настоящий документ путем ссылки. Копия указанного перечня в формате ASCII, созданная 20 декабря 2019 г., называется M0168PCT_SL.txt и имеет размер 6036 байт.
Предпосылки создания изобретения
Терапевтические антитела являются важным классом терапевтических биологических лекарственных средств. Гликозилирование антитела и состав гликанов могут влиять на активность антитела и эффекторные функции. Сохраняется актуальная потребность в усовершенствованных способах контроля профиля гликанов в продуктах антител.
Изложение сущности изобретения
В настоящем изобретении предложены технологические подходы для получения (например, изготовления) устекинумаба с целевым уровнем одного или более гликанов. Настоящее изобретение дает представление о том, что взаимосвязь между концентрацией галактозы в культуральной среде и временем культивирования можно использовать как технологический подход для контроля целевого уровня одного или более гликанов (например, галактозилирование) в устекинумабе в культуре. В настоящем изобретении продемонстрирована обратная зависимость между временем культивирования и концентрацией галактозы в культуральной среде для контроля целевого уровня одного или более гликанов (например, галактозилирование).
В определенных аспектах в изобретении предложены способы изготовления устекинумаба с целевым уровнем одного или более гликанов. Такие способы могут включать в себя обеспечение (например, продукцию, экспрессию (например, в мелкомасштабной или крупномасштабной клеточной культуре) и/или изготовление) или получение (например, поступление и/или приобретение у третьей стороны (в том числе у привлекаемой по контракту третьей стороны или не связанной контрактом (например, независимой) третьей стороны)) исследуемого белка устекинумаба (например, лекарственное вещество устекинумаба, например препарат лекарственного вещества устекинумаба, например партия исследуемого лекарственного вещества устекинумаба).
В некоторых случаях в изобретении предложены способы изготовления фармацевтической композиции, содержащей устекинумаб, имеющий целевой уровень одного или более гликанов, причем способ включает в себя выбор уровня галактозы и времени культивирования клеток, при этом уровень галактозы и время обратно пропорциональны друг другу;
культивирование популяции клеток, полученных методами генной инженерии, для экспрессии устекинумаба в условиях, включающих выбранный уровень галактозы и время;
сбор устекинумаба, экспрессированного популяцией клеток, с получением таким образом препарата устекинумаба; и очистку, концентрирование и/или определение состава препарата устекинумаба для получения фармацевтической композиции, содержащей устекинумаб, если препарат соответствует целевому уровню одного или более гликанов.
В некоторых вариантах осуществления целевой уровень одного или более гликанов представляет собой целевой уровень гликана, выбранного из группы, состоящей из G0F, сиалилированного гликана и G2F. В некоторых вариантах осуществления целевой уровень одного или более гликанов представляет собой целевой уровень G0F.
В некоторых случаях в изобретении предложены способы изготовления фармацевтической композиции, содержащей устекинумаб, имеющий целевой уровень гликана G0F, причем способ включает в себя выбор целевого уровня гликана G0F;
выбор уровня галактозы и времени для культивирования клеток с обеспечением выбранного целевого уровня G0F, при этом уровень галактозы и время обратно пропорциональны друг другу;
культивирование популяции клеток, полученных методами генной инженерии, для экспрессии устекинумаба в условиях, включающих выбранный уровень галактозы и время;
сбор устекинумаба, экспрессированного популяцией клеток, с получением таким образом препарата устекинумаба; и очистку, концентрирование и/или определение состава препарата устекинумаба для получения фармацевтической композиции, содержащей устекинумаб, если препарат соответствует целевому уровню гликана G0F.
В некоторых случаях в изобретении предложены способы получения лекарственного препарата устекинумаба, имеющего целевой уровень одного или более гликанов, причем способ включает в себя культивирование популяции клеток, полученных методами генной инженерии, для экспрессии устекинумаба в определенных условиях, при этом условия характеризуются параметрами, включающими в себя выбранный уровень галактозы и время культивирования клеток, и при этом уровень галактозы и
- 1 046459 время обратно пропорциональны друг другу;
сбор устекинумаба, экспрессированного клеткой, с получением таким образом препарата устекинумаба; и очистку, концентрирование и/или определение состава препарата устекинумаба для получения лекарственного препарата устекинумаба, если препарат устекинумаба соответствует целевому уровню одного или более гликанов.
В некоторых вариантах осуществления целевой уровень одного или более гликанов представляет собой целевой уровень гликана, выбранного из группы, состоящей из G0F, сиалилированного гликана и G2F. В некоторых вариантах осуществления целевой уровень одного или более гликанов представляет собой целевой уровень G0F.
В некоторых вариантах осуществления предложенные способы включают в себя культивирование популяции клеток млекопитающих, полученных методами генной инженерии, для экспрессии устекинумаба. В некоторых вариантах осуществления клетки млекопитающих выбраны из клеток СНО, клеток HEK 293, клеток фибросаркомы НТ 1080, клеток PER.C6, клеток САР, клеток HKB-11, клеток HuH-7, клеток NS0 и клеток SP 2/0.
В некоторых вариантах осуществления в предложенных способах стадию культивирования выполняют с использованием непрерывного процесса культивирования. В некоторых вариантах осуществления предложенные способы включают в себя культивирование, которое выполняется с использованием процесса перфузионного культивирования (например, процесса перфузионного культивирования с использованием системы фильтрации с переменным тангенциальным потоком (ATF)). В некоторых определенных вариантах осуществления предложенные способы включают в себя культивирование клеток млекопитающих, полученных методами генной инженерии, для экспрессии устекинумаба (например, клетки SP 2/0, которые экспрессируют устекинумаб) с использованием процесса перфузионного культивирования.
В некоторых вариантах осуществления предложены способы, включающие в себя сбор устекинумаба, экспрессированного клетками, дважды или более раз в пределах диапазона времени, соответствующего времени культивирования клеток.
В некоторых вариантах осуществления целевой уровень гликана G0F находится в диапазоне от 20 до 80% G0F относительно общего содержания гликана. В некоторых вариантах осуществления целевой уровень гликана G0F находится в диапазоне от 25 до 65% G0F относительно общего содержания гликана.
В некоторых вариантах осуществления предложенные способы относятся к изготовлению и/или получению устекинумаба, имеющего целевой уровень гликана G0F в диапазоне от 20 до 40% G0F относительно общего содержания гликана. В некоторых вариантах осуществления способ получения устекинумаба, имеющего целевой уровень гликана G0F в диапазоне от 20 до 40% G0F относительно общего содержания гликана, включает в себя выбранный уровень галактозы при концентрации 0 мМ и времени культивирования клеток в диапазоне от 7 до 15 дней.
В некоторых вариантах осуществления предложенные способы относятся к изготовлению и/или получению устекинумаба, имеющего целевой уровень гликана G0F в диапазоне от 40 до 80% G0F относительно общего содержания гликана. В некоторых вариантах осуществления способ получения устекинумаба, имеющего целевой уровень гликана G0F в диапазоне от 40 до 80% G0F относительно общего содержания гликана, включает в себя выбранный уровень галактозы при концентрации в диапазоне от 15 до 30 мМ и времени культивирования клеток в диапазоне от 16 до 60 дней. В некоторых определенных вариантах осуществления время культивирования клеток находится в диапазоне от 25 до 42 дней.
В некоторых вариантах осуществления предложенные способы включают в себя выбор целевого уровня гликана G0F. В некоторых вариантах осуществления целевой уровень гликана G0F находится в диапазоне от 20 до 80% G0F относительно общего содержания гликана. В некоторых определенных вариантах осуществления целевой уровень гликана G0F находится в диапазоне от 20 до 40% G0F относительно общего содержания гликана, при этом способ включает в себя выбранный уровень галактозы при концентрации 0 мМ и времени культивирования клеток в диапазоне от 7 до 15 дней. В некоторых определенных вариантах осуществления целевой уровень гликана G0F находится в диапазоне от 40 до 80% G0F относительно общего содержания гликана, при этом способ включает в себя выбранный уровень галактозы при концентрации в диапазоне от 15 до 30 мМ и времени культивирования клеток в диапазоне от 16 до 60 дней.
В некоторых вариантах осуществления в предложенных способах осуществляется контроль за выбранным уровнем галактозы на протяжении всей стадии культивирования (например, контроль в процессе культивирования с t=0 до сбора).
В некоторых вариантах осуществления предложенные способы дополнительно включают в себя измерение уровня гликана G0F. В некоторых вариантах осуществления, если измеренный уровень гликана G0F находится в диапазоне от 20 до 80% G0F относительно общего содержания гликана (например, в диапазоне от 20 до 40% G0F относительно общего содержания гликана, например в диапазоне от 40 до 80% G0F относительно общего содержания гликана), то проводится стадия очистки, концентрирования и/или определения состава препарата устекинумаба.
Эти и другие аспекты изобретения более подробно описаны ниже и в пунктах формулы изобретения.
- 2 046459
Краткое описание графических материалов
Включенные в настоящий документ чертежи, состоящие из следующих фигур, предназначены только для иллюстрации и не носят ограничительного характера.
На фиг. 1 представлено сравнение профилей гликанов различных препаратов и источников устекинумаба. Содержание гликана G0F приведено на левой верхней панели; содержание гликана G1F-A приведено на правой верхней панели; содержание гликана G1F-B приведено на левой нижней панели; а общий уровень сиалилирования приведен на правой нижней панели. Сплошными кружками обозначены стандартные белковые препараты (RPP) из США (черные сплошные кружки) и Европы (заштрихованные сплошные кружки). Символы в крайней правой части каждой панели относятся к исследуемым препаратам устекинумаба, которые были культивированы в разных объемах. Сплошными заштрихованными квадратами обозначены образцы, культивированные в 3 л, белыми квадратами обозначены образцы из сателлитной культуры, сплошными треугольниками обозначены образцы, культивированные в 100 л, и сплошными ромбами обозначены образцы, культивированные в 250 л. Относительное содержание каждого гликана отражено на соответствующей панели, при этом образцы на каждой панели подразделяли на четыре группы, приведенные по оси х слева направо: группа 1 RPP из стандартных образцов 90 мг/мл (крайняя слева), группа 2 RPP из стандартных образцов 90 мг/мл (вторая слева), 5 мг/мл RPP (третья слева) и исследуемые препараты устекинумаба (крайняя справа).
На фиг. 2 представлено изменение профиля гликана G0F в зависимости от продолжительности сбора. Крайний слева столбец (белый) отражает содержание RPP G0F группы 1, второй столбец слева (черный) обозначает численность RPP G0F группы 2, третий столбец слева обозначает среднее содержание G0F в образцах, культивированных за период от 7 до 42 дней. Заштрихованные столбцы (начиная с четвертого столбца слева и далее до крайнего справа столбца) отражают содержание G0F в образцах, культивированных в течение указанного числа дней в диапазоне от 7 дней (D7) до 42 дней (D42, крайний справа столбец).
На фиг. 3 представлено сравнение профилей основных гликанов и их заряженных вариантов в различных условиях культивирования. Вдоль оси х каждой панели слева направо приведены группа 1 RPP (крайняя слева), группа 2 RPP, устекинумаб, культивированный в 3 л DS, устекинумаб, культивированный в 100 л DS, устекинумаб, культивированный в 250 л DS, препарат устекинумаба NCM-2 и препарат устекинумаба NCM-1 (крайний справа).
Некоторые определения
Если прямо не указано иное, используемая в настоящем изобретении терминология в целом соответствует ее общепринятым в данной области значениям. Ниже приведены определения некоторых терминов в явной форме; значения этих и других терминов в конкретных случаях в данном изобретении будут очевидны специалистам в данной области из контекста.
Чтобы настоящее изобретение было более понятным, ниже сначала приведены некоторые определения терминов. Дополнительные определения представленных ниже терминов и других терминов приведены в тексте описания.
В настоящем изобретении термины около или приблизительно, применяемые к одной или более интересующим величинам, означает величину, аналогичную указанной стандартной величине. В определенных вариантах осуществления термин приблизительно или около обозначает диапазон величин, которые находятся в пределах 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% или меньше от указанной стандартной величины.
Термины контрольный, контролируемый, контролирующий, используемые в настоящем изобретении в отношении контроля целевого уровня одного или более гликанов (например, галактозы, например, G0F) устекинумаба, означают выбор, сохранение и/или корректировку одного или более условий культивирования для получения устекинумаба. Коррекция может включать в себя увеличение или уменьшение для одного или более условий культивирования при получении устекинумаба. В настоящем изобретении контролируемый целевой уровень одного или более гликанов относится к получению устекинумаба с желаемым уровнем одного или более гликанов с минимальным отклонением продукта. В некоторых вариантах осуществления контролируемый целевой уровень G0F меняется в зависимости от образца для одного и того же производственного цикла и/или партии не более чем на 20, 15, 10 или 5%. В некоторых вариантах осуществления контроль целевого уровня одного или более гликанов обеспечивает однородность характеристик получения устекинумаба (например, однородность характеристик от партии к партии, однородность характеристик образцов, полученных от какого-либо конкретного процесса производства).
В настоящем изобретении термин гликан относится к соединению, содержащему по меньшей мере один остаток сахара (например, моносахарид). Гликаны могут представлять собой мономеры или полимеры из остатков сахаров и могут быть линейными или разветвленными. Гликан может включать в себя природные остатки сахаров (например, глюкозу, N-ацетилглюкозамин, N-ацетилнейраминовую кислоту, галактозу, маннозу, фукозу, гексозу, арабинозу, рибозу, ксилозу и т.д.) и/или модифицированные сахара (например, 2'-фторрибозу, 2'-дезоксирибозу, фосфоманнозу, 6'-сульфо-Ы-ацетилглюкозамин и т.д.). Термин гликан включает в себя гомополимеры и гетерополимеры остатков сахаров. Термин гликан также охва
- 3 046459 тывает гликановый компонент гликоконъюгата (например, гликопротеин, гликолипид, протеогликан и т.д.). Термин также охватывает свободные гликаны, включая гликаны, которые были отщеплены или иным образом высвобождены из гликоконъюгата.
В настоящем изобретении термин галактозилированный гликан относится к гликану, который включает в себя по меньшей мере один остаток сахара галактозы. В некоторых вариантах осуществления галактозилированный гликан представляет собой гликан G1, G2, G1F, G2F, А1 и/или А2. К негалактозилированным гликанам относятся G0F или G0. В некоторых вариантах осуществления целевой уровень галактозилированного гликана может относиться к наличию галактозилированного гликана (например, G2F) и/или к целевому уровню негалактозилированного гликана (например, G0F).
В настоящем изобретении термин выделенный обозначает вещество и/или объект, который был (1) отделен от по меньшей мере некоторых из компонентов, с которыми он был связан при первоначальном получении (в природе и/или в экспериментальных условиях); и/или (2) создан, произведен, приготовлен и/или изготовлен человеком.
Выделенные вещества и/или объекты могут быть отделены от приблизительно 10%, приблизительно 20%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90%, приблизительно 91%, приблизительно 92%, приблизительно 93%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99% или более чем приблизительно 99% других компонентов, с которыми они были первоначально связаны. В некоторых вариантах осуществления выделенные агенты имеют степень чистоты, равную приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 91%, приблизительно 92%, приблизительно 93%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99% или более чем приблизительно 99%. В настоящем изобретении вещество является чистым, если оно по существу не содержит других компонентов. В некоторых вариантах осуществления, как будет понятно специалистам в данной области, вещество может по-прежнему рассматриваться как выделенное или даже чистое после объединения с определенными другими компонентами, такими как, например, один или более носителей или эксципиентов (например, буфером, растворителем, водой и т.д.); в таких вариантах осуществления процент выделения или чистоты вещества рассчитывается без включения таких носителей или эксципиентов. В качестве лишь одного примера в некоторых вариантах осуществления биологический полимер, например полипептид или полинуклеотид, встречающийся в природе, считается выделенным, когда
а) по природе своего происхождения или источника получения он не связан с некоторыми или со всеми компонентами, сопровождающими его интактное состояние в природе;
b) он является по существу свободным от других полипептидов или нуклеиновых кислот того же биологического вида из числа видов, которые его продуцируют в природе;
с) он экспрессируется или иным способом связан с компонентами клетки или иной экспрессионной системы, которая не относится к тем биологическим видам, которые его продуцируют в природе.
Таким образом, например, в некоторых вариантах осуществления полипептид, полученный путем химического синтеза или синтеза в клеточной системе, отличной от продуцирующей его в природе, считается выделенным полипептидом. Альтернативно или дополнительно в некоторых вариантах осуществления полипептид, который был подвергнут очистке с использованием одного или более способов, может рассматриваться как выделенный полипептид в соответствии со степенью его отделения от других компонентов,
а) с которыми он связан в природе; и/или
b) с которыми он был связан при первоначальном получении.
В настоящем изобретении термин технологический подход относится к элементу процесса культивирования (например, к одному или более условиям культивирования), который можно контролировать для увеличения или уменьшения содержания одного или более гликанов в продукте антитела. В настоящем изобретении предложен новый технологический подход, который опирается на использование установленного соотношения между концентрацией галактозы в культуральной среде и временем культивирования. Как описано в настоящем изобретении, обратно пропорциональное соотношение между концентрацией галактозы в культуральной среде и временем культивирования в культуральной среде можно использовать как технологический подход для получения устекинумаба с целевым уровнем одного или более гликанов (например, галактозилирование). В некоторых вариантах осуществления технологический подход включает в себя выбранный уровень галактозы и время культивирования клеток для контроля уровня одного или более гликанов (например, галактозилирование, например, G0F) устекинумаба (например, уровень одного или более гликанов в культуре или препарате устекинумаба).
В настоящем изобретении термин сайт N-гликозилирования Fc-области относится к аминокислотному остатку в Fc-области, с которым N-связан гликан. В некоторых определенных вариантах осуществления сайт N-гликозилирования устекинумаба находится в тяжелой цепи в положении Asn299.
Как правило, в настоящем изобретении термин белок означает полипептид (т.е. цепь из по меньшей мере двух аминокислот, связанных друг с другом пептидными связями). Белки могут включать в
- 4 046459 себя фрагменты помимо аминокислот (например, могут представлять собой гликопротеины) и/или могут быть обработаны или модифицированы иным образом. Специалистам в данной области будет очевидно, что белок может представлять собой полную полипептидную цепь, продуцируемую клеткой (с сигнальной последовательностью или без нее), или может представлять собой ее функциональный участок. Специалистам в данной области дополнительно будет очевидно, что иногда белок может включать в себя более одной полипептидной цепи, например связанной одной или более дисульфидными связями или связанной другими способами.
В настоящем изобретении термин извлечение обозначает процесс перевода агента или объекта в состояние, по существу свободное от других ранее связанных компонентов, например, посредством выделения, например, с использованием методик очистки, известных в данной области. В некоторых вариантах осуществления агент или объект извлекают из природного источника и/или источника, содержащего клетки.
В настоящем изобретении термин образец (образцы) относится к отдельно полученным образцам. В некоторых вариантах осуществления оценка отдельных образцов включает в себя оценку образцов из одного и того же цикла культивирования (например, в разные моменты времени в процессе приготовления) или из разных циклов культивирования (например, в разные циклы культивирования).
В настоящем изобретении термин целевое значение или целевой уровень обозначает предварительно заданный уровень одного или более конкретных гликанов, таких как галактозилированные гликаны и/или сиалилированные гликаны. В некоторых вариантах осуществления целевое значение представляет собой уровень одного или более конкретных гликанов, таких как галактозилированные гликаны (например, G0, G1, G2, G0F, G1F, G2F или комбинации) и/или сиалилированные гликаны (например, моносиалилированные, дисиалилированные или комбинации), в стандартном продукте устекинумаба или значение приведено в описании или в сводном протоколе сопровождения партии фармацевтического продукта. В некоторых определенных вариантах осуществления целевое значение представляет собой уровень гликанов G0F в продукте устекинумаба.
В некоторых вариантах осуществления целевое значение относится к абсолютному уровню (например, числу молей) одного или более гликанов (например, галактозилированных гликанов (например, одного или более видов галактозилированных гликанов) и/или сиалилированных гликанов (например, одного или более видов сиалилированных гликанов)) в препарате устекинумаба. В некоторых вариантах осуществления целевое значение относится к уровню одного или более гликанов (например, галактозилированных гликанов (например, одного или более видов галактозилированных гликанов) и/или сиалилированных гликанов (например, одного или более видов сиалилированных гликанов)) в препарате устекинумаба по отношению к общему уровню гликана в препарате устекинумаба. В некоторых вариантах осуществления целевое значение выражено как процент, который относится к числу молей одного или более гликанов (например, гликанов Fc) по отношению к общему числу молей гликанов (например, гликанов Fc) в препарате устекинумаба. В некоторых вариантах осуществления процент относится к числу молей одного или более PNGаза F-высвобожденных гликанов Fc по отношению к общему числу молей обнаруженных PNGαза F-высвобожденных гликанов Fc.
В настоящем изобретении термин препарат устекинумаба относится к смеси белков устекинумаба, полученных в соответствии с конкретным способом получения. Белки устекинумаба в препарате устекинумаба включают в себя множество копий устекинумаба (т.е. имеющих одинаковую или по существу одинаковую аминокислотную последовательность), но со смесью гликанов, связанных с белком. В некоторых случаях препарат устекинумаба готовят с использованием способа и/или системы, описанной в настоящем изобретении. Способы получения могут включать в себя стадию приготовления с помощью рекомбинантных технологий с использованием культивированных клеток, сконструированных таким образом, чтобы они экспрессировали устекинумаб (или экспрессировали устекинумаб на соответствующем уровне или в соответствующих условиях). В некоторых вариантах осуществления способ получения может включать в себя стадию выделения, в ходе которой устекинумаб отделяют от определенных компонентов сконструированных клеток (например, посредством лизиса клеток и осаждения белкового компонента центрифугированием). В некоторых вариантах осуществления способ получения также может включать в себя стадию очистки, в ходе которой устекинумаб отделяют (например, хроматографией) от других клеточных компонентов, например от других белков или органических компонентов, которые использовали на предшествующих стадиях. Следует понимать, что эти стадии не имеют ограничительного характера и что может быть включено любое число дополнительных стадий получения. Разные препараты устекинумаба могут быть приготовлены одним и тем же способом производства, но в разное время (например, в разных циклах или препаратах). Альтернативно разные препараты устекинумаба могут быть приготовлены разными способами производства. Двум способам получения могут быть присущи любые отличия (например, экспрессионный вектор, тип сконструированных клеток, условия культивирования, процедура выделения, условия очистки и т.д.).
Вся литература и аналогичные материалы, цитируемые в настоящей заявке, включая без ограничений патенты, заявки на патенты, статьи, книги, научные трактаты и веб-страницы, независимо от формата такой литературы и аналогичных материалов, полностью включены в настоящий документ путем
- 5 046459 ссылки. В случае если один или более из включенной в настоящий документ литературы и аналогичных материалов отличаются от настоящей заявки или противоречит ей, включая без ограничений определенные термины, использование терминов, описанные методики и т.п., данная заявка имеет преобладающую силу. В настоящем изобретении заголовки разделов служат исключительно для целей структурирования документа и никоим образом не должны рассматриваться как ограничивающие объект изобретения.
Подробное описание определенных вариантов осуществления
В настоящем изобретении по меньшей мере частично приведено открытие технологических подходов для получения устекинумаба, имеющего целевые уровни одного или более гликанов (например, галактозилирование, например, гликаны G0F). Контроль состава и уровней гликанов в процессе получения антител по-прежнему является проблемой. Гликозилирование терапевтических антител может влиять на их безопасность и/или эффективность (Zhang et al. (2016), Drug Discovery Today, 21(5):740-765). Соответственно важно иметь возможность обеспечить однородность состава гликанов при получении устекинумаба (например, однородность характеристик в разных партиях, однородность характеристик образцов, полученных в каком-либо конкретном производственном процессе). В ходе исследования характеристик стандартного белка продукта устекинумаба (RPP) были обнаружены две отдельные популяции гликанов RPP устекинумаба.
В настоящем изобретении приведена разработка подходов для контроля состава гликанов в процессе изготовления устекинумаба. В настоящем изобретении описаны технологические подходы для получения устекинумаба с целевыми уровнями конкретных гликанов, при этом идентифицирован профиль гликанов в каждом из RPP. В процессе разработки представленных подходов в настоящем изобретении определяется взаимосвязь между концентрацией галактозы в культуральной среде и временем культивирования. Настоящее изобретение дает представление о том, что взаимосвязь между концентрацией галактозы в культуральной среде и временем культивирования (например, непрерывного культивирования) можно использовать как технологический подход для контроля целевого уровня одного или более гликанов (например, галактозилирование) в устекинумабе в культуре.
Настоящее изобретение дополнительно дает представление от том, что для контроля уровня гликанов (например, галактозилирование) может использоваться обратно пропорциональная зависимость между уровнем галактозы и временем (т.е. продолжительностью культивирования). Способы культивирования по настоящему изобретению для контроля состава гликанов включают в себя способы непрерывного культивирования (например, перфузионное культивирование).
Устекинумаб.
В настоящем изобретении частично предложены способы и процессы изготовления, приготовления, контроля или иного получения устекинумаба с конкретными профилями гликанов.
Устекинумаб представляет собой антитело, которое специфически связывается с субъединицей р-40 как IL-12, так и IL-23. Исследовали применение устекинумаба при ряде заболеваний человека, включая псориаз, псориатический артрит, болезнь Крона и рассеянный склероз.
В некоторых вариантах осуществления устекинумаб включает в себя последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3, которые отличаются не более чем на 3 аминокислотных остатка от последовательностей HCDR, как указано в SEQ ID NO: 1, и последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3, которые отличаются не более чем на 3 аминокислотных остатка от последовательностей LCDR, как указано в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления устекинумаб включает в себя последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3, которые отличаются не более чем на 2 аминокислотных остатка или не более чем на 1 аминокислотный остаток от последовательностей HCDR, как указано в SEQ ID NO: 1, и последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3, которые отличаются не более чем на 2 аминокислотных остатка или не более чем на 1 аминокислотный остаток от последовательностей LCDR, как указано в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления устекинумаб включает в себя вариабельный домен тяжелой цепи, который отличается не более чем на 3 аминокислотных остатка от последовательности, как указано в SEQ ID NO: 1, и вариабельный домен легкой цепи, который отличается не более чем на 3 аминокислотных остатка от последовательности, как указано в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления устекинумаб включает в себя вариабельный домен тяжелой цепи, включающий в себя последовательность, которая отличается не более чем на 5 аминокислотных остатков от последовательности, как указано в SEQ ID NO: 1, и вариабельный домен легкой цепи, включающий в себя последовательность, которая отличается не более чем на 5 аминокислотных остатков от последовательности SEQ ID NO: 2.
В некоторых вариантах осуществления устекинумаб включает в себя последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3, как указано в SEQ ID NO: 1, и последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3, как указано в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления устекинумаб включает в себя вариабельный домен тяжелой цепи, как указано в SEQ ID NO: 1, и вариабельный домен легкой цепи, как указано в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления устекинумаб включает в себя тяжелую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 1, и/или легкую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 2.
SEQ ID NO: 1, последовательность тяжелой цепи устекинумаба (жирным шрифтом выделена по
- 6 046459 следовательность вариабельного домена с подчеркнутыми последовательностями CDR):
EVOLVOSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTTYWLGWVROMPGKGLDWIGI MSPVDSDIRYSPSFQGOVTMSVDKSITTAYLOWNSLKASDTAMYYCARRRPGOGY FDFWGQGTLVTVSSSSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDK THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 2, последовательность легкой цепи устекинумаба (жирным шрифтом выделена последовательность вариабельного домена с подчеркнутыми последовательностями CDR):
DIOMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASOGISSWLAWYOOKPEKAPKSLIYAASS LOSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATYYCOQYNIYPYTFGOGTKLEIKRTVA APSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKD STYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Способы культивирования.
В некоторых случаях в изобретении предложены способы изготовления фармацевтической композиции, содержащей устекинумаб, имеющий целевой уровень одного или более гликанов, причем способ включает в себя выбор уровня галактозы и времени культивирования клеток, при этом уровень галактозы и время обратно пропорциональны друг другу;
культивирование популяции клеток, полученных методами генной инженерии, для экспрессии устекинумаба в условиях, включающих выбранный уровень галактозы и время;
сбор устекинумаба, экспрессированного популяцией клеток, с получением таким образом препарата устекинумаба; и очистку, концентрирование и/или определение состава препарата устекинумаба для получения фармацевтической композиции, содержащей устекинумаб, если препарат соответствует целевому уровню одного или более гликанов.
В некоторых вариантах осуществления целевой уровень одного или более гликанов представляет собой целевой уровень гликана, выбранного из группы, состоящей из G0F, сиалилированного гликана и G2F. В некоторых вариантах осуществления целевой уровень одного или более гликанов представляет собой целевой уровень G0F.
В некоторых случаях в изобретении предложены способы получения лекарственного препарата устекинумаба, имеющего целевой уровень одного или более гликанов, причем способ включает в себя культивирование популяции клеток, полученных методами генной инженерии, для экспрессии устекинумаба в определенных условиях, при этом условия характеризуются параметрами, включающими в себя выбранный уровень галактозы и время культивирования клеток, и при этом уровень галактозы и время обратно пропорциональны друг другу;
сбор устекинумаба, экспрессированного клеткой, с получением таким образом препарата устекинумаба; и очистку, концентрирование и/или определение состава препарата устекинумаба для получения лекарственного препарата устекинумаба, если препарат устекинумаба соответствует целевому уровню одного или более гликанов.
В некоторых вариантах осуществления целевой уровень одного или более гликанов представляет собой целевой уровень гликана, выбранного из группы, состоящей из G0F, сиалилированного гликана и G2F. В некоторых вариантах осуществления целевой уровень одного или более гликанов представляет собой целевой уровень G0F.
В некоторых вариантах осуществления целевой уровень гликана G0F находится в диапазоне от 20 до 80% G0F относительно общего содержания гликана. В некоторых вариантах осуществления целевой уровень гликана G0F находится в диапазоне от 25 до 65% G0F относительно общего содержания гликана.
В некоторых вариантах осуществления предложенные способы относятся к изготовлению и/или получению устекинумаба, имеющего целевой уровень гликана G0F в диапазоне от 20 до 40% G0F относительно общего содержания гликана. В некоторых вариантах осуществления способ получения устекинумаба, имеющего целевой уровень гликана G0F в диапазоне от 20 до 40% G0F относительно общего содержания гликана, включает в себя выбранный уровень галактозы при 0 мМ и времени культивирования клеток в диапазоне от 7 до 15 дней.
В некоторых вариантах осуществления предложенные способы относятся к изготовлению и/или получению устекинумаба, имеющего целевой уровень гликана G0F в диапазоне от 40 до 80% G0F относительно общего содержания гликана. В некоторых вариантах осуществления способ получения устекинумаба, имеющего целевой уровень гликана G0F в диапазоне от 40 до 80% G0F относительно общего со
- 7 046459 держания гликана, включает в себя выбранный уровень галактозы при концентрации в диапазоне от 15 до 30 мМ и времени культивирования клеток в диапазоне от 16 до 60 дней. В некоторых определенных вариантах осуществления время культивирования клеток находится в диапазоне от 25 до 42 дней.
В некоторых вариантах осуществления предложенные способы дополнительно включают в себя выбор целевого уровня гликана G0F. В некоторых вариантах осуществления целевой уровень гликана G0F находится в диапазоне от 20 до 80% G0F относительно общего содержания гликана. В некоторых определенных вариантах осуществления целевой уровень гликана G0F находится в диапазоне от 20 до 40% G0F относительно общего содержания гликана, при этом способ включает в себя выбранный уровень галактозы при концентрации 0 мМ и времени культивирования клеток в диапазоне от 7 до 15 дней. В некоторых определенных вариантах осуществления целевой уровень гликана G0F находится в диапазоне от 40 до 80% G0F относительно общего содержания гликана, при этом способ включает в себя выбранный уровень галактозы при концентрации в диапазоне от 15 до 30 мМ и времени культивирования клеток в диапазоне от 16 до 60 дней.
В некоторых вариантах осуществления предложенные способы дополнительно включают в себя измерение уровня гликана G0F. В некоторых вариантах осуществления, если измеренный уровень гликана G0F находится в диапазоне от 20 до 80% G0F относительно общего содержания гликана (например, в диапазоне от 20 до 40% G0F относительно общего содержания гликана, например в диапазоне от 40 до 80% G0F относительно общего содержания гликана), то проводится стадия очистки, концентрирования и/или определения состава препарата устекинумаба.
В некоторых вариантах осуществления предложены способы изготовления и/или получения устекинумаба, имеющего целевой уровень гликана, в том числе целевой уровень сиалилированного гликана и/или гликана G2F. В табл. 1 ниже предложены условия для устекинумаба с целевыми уровнями сиалилированного гликана и/или гликана G2F.
Таблица 1
Примеры условий получения препаратов устекинумаба с целевыми уровнями G2F и сиалилированных гликанов
| Набор гликанов | G2F | Общее сиалилирование |
| NCM-1 (0 мМ галактозы, время культивирования 7-15 дней) | > 5%-10% | > 15%-30% |
| NCM-2 (15-30 мМ галактозы, время культивирования 25-60 дней) | 1%-5% | 5%-15% |
В некоторых вариантах осуществления предложенные способы относятся к изготовлению и/или получению устекинумаба, имеющего целевой уровень сиалилированного гликана в диапазоне от 15 до 30% сиалилированного гликана относительно общего содержания гликана. В некоторых вариантах осуществления способ получения устекинумаба, имеющего целевой уровень сиалилированного гликана в диапазоне от 15 до 30% сиалилированного гликана относительно общего содержания гликана, включает в себя выбранный уровень галактозы при концентрации 0 мМ и времени культивирования клеток в диапазоне от 7 до 15 дней.
В некоторых вариантах осуществления предложенные способы относятся к изготовлению и/или получению устекинумаба, имеющего целевой уровень сиалилированного гликана в диапазоне от 5 до 15% сиалилированного гликана относительно общего содержания гликана. В некоторых вариантах осуществления способ получения устекинумаба, имеющего целевой уровень гликана G0F в диапазоне от 5 до 15% сиалилированного гликана относительно общего содержания гликана, включает в себя выбранный уровень галактозы при концентрации в диапазоне от 15 до 30 мМ и времени культивирования клеток в диапазоне от 16 до 60 дней. В некоторых определенных вариантах осуществления время культивирования клеток находится в диапазоне от 25 до 42 дней.
В некоторых вариантах осуществления предложенные способы относятся к изготовлению и/или получению устекинумаба, имеющего целевой уровень гликана G2F в диапазоне от 5 до 10% G2F относительно общего содержания гликана. В некоторых вариантах осуществления способ получения устекинумаба, имеющего целевой уровень гликана G2F в диапазоне от 5 до 10% G2F относительно общего содержания гликана, включает в себя выбранный уровень галактозы при концентрации 0 мМ и времени культивирования клеток в диапазоне от 7 до 15 дней.
В некоторых вариантах осуществления предложенные способы относятся к изготовлению и/или получению устекинумаба, имеющего целевой уровень гликана G2F в диапазоне от 1 до 5% G0F относительно общего содержания гликана. В некоторых вариантах осуществления способ получения устекинумаба, имеющего целевой уровень гликана G2F в диапазоне от 1 до 5% G2F относительно общего содержания гликана, включает в себя выбранный уровень галактозы при концентрации в диапазоне от 15 до 30 мМ и времени культивирования клеток в диапазоне от 16 до 60 дней. В некоторых определенных вариантах осуществления время культивирования клеток находится в диапазоне от 25 до 42 дней.
В некоторых вариантах осуществления в предложенных способах осуществляется контроль за вы
- 8 046459 бранным уровнем галактозы на протяжении всей стадии культивирования (например, контроль в процессе культивирования с t=0 до сбора).
В некоторых вариантах осуществления предложенные способы включают в себя культивирование популяции клеток млекопитающих, полученных методами генной инженерии, для экспрессии устекинумаба. В некоторых вариантах осуществления клетки млекопитающих выбраны из клеток СНО, клеток HEK 293, клеток фибросаркомы НТ 1080, клеток PER.C6, клеток САР, клеток HKB-11, клеток HuH-7, клеток NS0 и клеток SP 2/0.
В некоторых вариантах осуществления в предложенных способах стадию культивирования выполняют с использованием непрерывного процесса культивирования. В некоторых вариантах осуществления предложенные способы включают в себя культивирование, которое выполняется с использованием процесса перфузионного культивирования (например, процесса перфузионного культивирования с использованием системы фильтрации с переменным тангенциальным потоком (ATF)). В некоторых определенных вариантах осуществления предложенные способы включают в себя культивирование клеток млекопитающих, полученных методами генной инженерии, для экспрессии устекинумаба (например, клетки SP 2/0, которые экспрессируют устекинумаб) с использованием процесса перфузионного культивирования.
В некоторых вариантах осуществления предложены способы, включающие в себя сбор устекинумаба, экспрессированного клетками, дважды или более раз в пределах диапазона времени, соответствующего времени культивирования клеток.
В некоторых вариантах осуществления целевое значение представляет собой предварительно заданную спецификацию фармацевтического продукта или критерий контроля качества для фармацевтического препарата, например сертификат анализа (CofA), сертификат испытаний (CofT) или сводный протокол сопровождения партии. В некоторых вариантах осуществления спецификация продукта представляет собой описание продукта на листке-вкладыше Управления по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными средствами США, листке-вкладыше для врача, в статье Фармакопеи США или статье Европейской фармакопеи.
По существу способы культивирования клеток настоящего изобретения включают в себя культивирование при температуре в диапазоне от 25 до 40°С и при силе тяжести, действующей на поверхности земли. В некоторых вариантах осуществления предложенные способы культивирования популяции клеток достаточны для экспрессии продукта устекинумаба. Среда для культивирования клеток по существу содержит соответствующий источник энергии и соединения, регулирующие клеточный цикл. По существу культуральная среда включает в себя, например, аминокислоты, витамины, неорганические соли и глюкозу, известные специалистам в данной области. В некоторых вариантах осуществления рН клеточной культуральной среды составляет от 6 до 8. Среды для культивирования животных клеток хорошо известны в данной области и постоянно оптимизируются специалистами в данной области для конкретной цели и/или типа клеток.
В некоторых вариантах осуществления способы настоящего изобретения включают в себя культивирование популяции клеток посредством системы непрерывного культивирования клеток (например, системы перфузионного культивирования клеток). В некоторых вариантах осуществления система непрерывного культивирования клеток включает в себя резервуар биореактора и устройство для удержания клеток. В некоторых вариантах осуществления система непрерывного культивирования клеток включает в себя резервуар биореактора, устройство для удержания клеток, источник среды и сток для сбора отходов. В некоторых вариантах осуществления система непрерывного культивирования клеток включает в себя популяцию клеток (например, популяцию клеток, сконструированную для экспрессии устекинумаба, например, популяцию клеток, состоящую из клеток, сконструированных для экспрессии устекинумаба) и клеточные культуральные среды.
В некоторых вариантах осуществления устройство для удержания клеток представляет собой или включает в себя непрерывную центрифугу, фильтр переменного тангенциального потока (ATF), мембранный фильтр тангенциального потока (TFF), динамический фильтр, центробежный фильтр, ультразвуковой и диэлектрофоретический сепаратор или гравитационный отстойник. В некоторых конкретных вариантах осуществления устройство удержания клеток представляет собой или включает в себя ATF.
В некоторых вариантах осуществления система биореактора включает в себя резервуар биореактора с мешалкой, устройство для удержания клеток, источник среды и сток для сбора отходов.
В некоторых вариантах осуществления система биореактора (например, система перфузионного биореактора) включает в себя барботер. В некоторых вариантах осуществления система биореактора включает в себя барботер с просверленными отверстиями. В некоторых вариантах осуществления система биореактора включает в себя барботер с открытой трубкой. В некоторых вариантах осуществления система биореактора включает в себя шоттовский барботер.
В некоторых вариантах осуществления способы настоящего изобретения включают в себя культивирование популяции клеток (например, популяции клеток, сконструированных для экспрессии устекинумаба, например, популяции клеток, состоящей из клеток, сконструированных для экспрессии устекинумаба) в объеме в диапазоне от 1 до 3000 л. В некоторых вариантах осуществления предложенные способы включают в себя культивирование клеток млекопитающих, полученных методами генной инжене
- 9 046459 рии для экспрессии устекинумаба в объеме по меньшей мере 25, 50, 100, 200, 250, 400, 500, 600, 800, 1000 или 2000 л. В некоторых вариантах осуществления предложенные способы включают в себя культивирование клеток млекопитающих, полученных методами генной инженерии для экспрессии устекинумаба в объеме от приблизительно 25 л до приблизительно 250 л.
Оценка гликанов.
В некоторых вариантах осуществления гликаны устекинумаба анализируют (например, измеряют) любым доступным подходящим способом. В некоторых случаях структуру и композицию гликанов, описанных в настоящем изобретении, анализируют, например, с помощью одного или более из ферментных, хроматографических, масс-спектрометрических (МС), хроматографических с последующей МС, электрофоретических методов, электрофоретических методов с последующей МС, методов ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и их комбинаций. Примеры ферментативных способов включают в себя взаимодействие препарата устекинумаба с одним или более ферментами в условиях и в течение времени, достаточных для высвобождения одного или более гликана(ов) (например, одного или более доступного (-ых) гликана(ов)). В некоторых случаях один или более ферментов включают в себя PNGазу F. Примеры хроматографических способов включают в себя, без ограничений, активную анионообменную хроматографию с импульсным амперометрическим датчиком (SAX-PAD), жидкостную хроматографию (ЖХ), высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), сверхэффективную жидкостную хроматографию (СВЭЖХ), тонкослойную хроматографию (ТСХ), колоночную амидную хроматографию и их комбинации. Примеры масс-спектрометрии (МС) включают в себя, без ограничений, тандемную МС, ЖХ-МС, ЖХ-МС/МС, масс-спектрометрию с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-MS), масс-спектрометрию с преобразованием Фурье (FTMS), разделение по ионной подвижности с масс-спектрометрией (IMS-MS), диссоциацию с переносом электронов (ETD-MS) и их комбинации. Примеры электрофоретических способов включают в себя, без ограничений, капиллярный электрофорез (КЭ), КЭ-МС, гель-электрофорез, электрофорез в агарозном геле, электрофорез в акриламидном геле, электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ) с последующим вестерн-блоттингом с использованием антител, которые распознают конкретные структуры гликанов, и их комбинации. Примеры ядерного магнитного резонанса (ЯМР) включают в себя, без ограничений, одномерный ЯМР (Id-ЯМР), двухмерный ЯМР (2D-ЯМР), ЯМР с вращением образца под магическим углом с корреляционной спектроскопией (COSY-NMR), ЯМР с полной корреляционной спектроскопией (TOCSY-NMR), ЯМР с гетероядерной одноквантовой когерентностью (HSQC-NMR), ЯМР с гетероядерной многоквантовой когерентностью (HMQC-NMR), ротационный ЯМР со спектроскопией ядерного эффекта Оверхаузера (ROESY-NMR), спектроскопию ядерного эффекта Оверхаузера (NOESYNMR) и их комбинации.
Клетки.
В способах, описанных в настоящем изобретении, может использоваться любая клетка-хозяин, которая может использоваться для экспрессии устекинумаба. В некоторых вариантах осуществления клетка, сконструированная для экспрессии устекинумаба, содержит одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих продукт устекинумаба, который включает в себя вариабельный домен тяжелой цепи, как указано в SEQ ID NO: 1, и/или вариабельный домен легкой цепи, как указано в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления клетка, сконструированная для экспрессии устекинумаба, содержит одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих продукт устекинумаба, который включает в себя тяжелую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 1, и/или легкую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления клетка, сконструированная для экспрессии устекинумаба, содержит одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих продукт устекинумаба, который включает в себя последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3, как указано в SEQ ID NO: 1, и последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3, как указано в SEQ ID NO: 2.
В некоторых вариантах осуществления клетка, сконструированная для экспрессии устекинумаба, содержит одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих продукт устекинумаба, который имеет ту же первичную аминокислотную последовательность, что и одобренный белок, например, в рамках процедуры вторичного одобрения, терапевтического или диагностического использования у людей или животных. В некоторых вариантах осуществления клетка, сконструированная для экспрессии устекинумаба, содержит одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих продукт устекинумаба, который отличается не более чем на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 или 20 остатков от одобренного терапевтического или диагностического белка. В некоторых вариантах осуществления клетка, сконструированная для экспрессии устекинумаба, содержит одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих белок, который имеет по меньшей мере 90, 95, 98, 99 или 100%-ную идентичность последовательности с одобренным терапевтическим или диагностическим белком. Термины та же первичная аминокислотная последовательность, первичная аминокислотная последовательность, которая отличается не более чем на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 или 20 остатков, последовательности, которые имеют по меньшей мере 98%-ную или более идентичность последовательности или аналогичные термины относятся к уровню идентичности между первичными аминокислотными последовательностями. В некоторых вариантах осуществления препарат или продукт белка содержит аминокислотные варианты, например молекулы, которые отличаются кон
- 10 046459 цевыми остатками, например одним или двумя концевыми остатками. В некоторых вариантах осуществления таких случаев идентичность сопоставляемой последовательности представляет собой идентичность между первичной аминокислотной последовательностью наиболее распространенных (например, наиболее распространенных активных) молекул в каждом из сравниваемых продуктов. В некоторых вариантах осуществления идентичность последовательности относится к аминокислотной последовательности, кодируемой нуклеиновой кислотой, которая может использоваться для получения продукта устекинумаба.
В некоторых вариантах осуществления клетки, сконструированные для экспрессии устекинумаба, представляют собой клетки млекопитающих.
В некоторых вариантах осуществления клетки, сконструированные для экспрессии устекинумаба, представляют собой мышиные клетки. В некоторых вариантах осуществления клетка, сконструированная для экспрессии устекинумаба, получена из мышиной клеточной линии. К мышиным (например, полученным от мыши) клеточным линиям относятся, например клеточные линии мышиной миеломы, например, клетки NS0 и клетки SP 2/0.
В некоторых вариантах осуществления клетки, сконструированные для экспрессии устекинумаба, представляют собой человеческие клетки. В некоторых вариантах осуществления клетка, сконструированная для экспрессии устекинумаба, получена из человеческой клеточной линии. К человеческим клеточным линиям относятся, например, HEK 293: эмбриональные клетки почки человека 293; НТ-1080: из фибросаркомы с эпителиальным фенотипом; PER.C6: из эмбриональных клеток сетчатки человека, иммортализованных трансфекцией гена аденовируса E1; CAP: из амниоцитов человека, иммортализованных геном аденовируса типа 5 Е1; HKB-11: полученные слиянием HEK293-S и линии В-клеток человека в присутствии полиэтиленгликоля; и HuH-7: из гепатоцеллюлярной карциномы человека. В некоторых определенных вариантах осуществления чувствительные к сдвиговому воздействию клетки млекопитающих выбраны из клеток HEK 293, клеток фибросаркомы НТ 1080, клеток PER.C6, клеток САР, клеток HKB-11 и клеток HuH-7.
В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток, экспрессирующих продукт устекинумаба, как описано в настоящем изобретении, получают с использованием рекомбинантных способов. Рекомбинантная экспрессия гена, такого как ген, кодирующий полипептид, например одиночное антитело, описанный в настоящем изобретении, может включать в себя конструирование экспрессионного вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий полипептид. После получения полинуклеотида вектор продукции полипептида может быть получен с помощью технологии рекомбинантной ДНК с использованием известных в данной области методик. Для конструирования экспрессионных векторов, содержащих последовательности, кодирующие полипептид, и соответствующих сигналов контроля транскрипции и трансляции могут использоваться известные способы. К таким способам относятся, например, методики рекомбинантной ДНК in vitro, синтетические методики и генетическая рекомбинация in vivo.
После получения описанного в настоящем изобретении продукта устекинумаба с помощью рекомбинантной экспрессии его можно очищать любым способом, известным специалистам в данной области, например, с помощью хроматографии (например, ионообменной, аффинной и колоночной хроматографии с распределением по размерам), центрифугирования, дифференциальной растворимости или с помощью любой другой стандартной методики очистки белков. Например, устекинумаб можно выделять и очищать посредством соответствующего отбора и комбинации аффинных колонок, например, колонки с белком А, с хроматографическими колонками, фильтрацией, ультрафильтрацией, с помощью процедур высаливания и диализа (см. Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Дополнительно, как описано в настоящем изобретении, чтобы упростить очистку, продукт устекинумаба может быть слит с гетерологичными полипептидными последовательностями.
Фармацевтические композиции.
Продукт устекинумаба, полученный или изготовленный с использованием любых из способов, систем и/или процессов, описанных в настоящем изобретении, может быть включен в состав фармацевтической композиции. Такую фармацевтическую композицию можно использовать для профилактики и/или лечения заболеваний. Фармацевтические композиции, содержащие устекинумаб, могут быть составлены способами, известными специалистам в данной области (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2000). Фармацевтическую композицию можно вводить парентерально в форме состава для инъекций, содержащего стерильный раствор или суспензию в воде или другую фармацевтически приемлемую жидкость. Например, фармацевтическую композицию можно составить, соответствующим образом комбинируя клеточный продукт (например, рекомбинантный белок, например, гликопротеин, например, отдельное антитело) с фармацевтически приемлемыми носителями или средами, такими как стерильная вода и физиологический солевой раствор, растительное масло, эмульгатор, суспендирующий агент, поверхностно-активное вещество, стабилизатор, ароматизирующий эксципиент, разбавитель, носитель, консервант, связующее вещество, с последующим смешиванием в форме однократной дозы, необходимой для общепринятой фармацевтической практики. Количество активного ингредиента, включенного в фармацевтический препарат, является таким, чтобы обеспечить подходящую дозу в указанном диапазоне.
- 11 046459
В некоторых вариантах осуществления препарат устекинумаба включает в себя сахарозу в качестве стабилизатора/регулятора тоничности. В некоторых вариантах осуществления препарат устекинумаба включает в себя гистидин (например, L-гистидин) в качестве буфера. В некоторых вариантах осуществления препарат устекинумаба включает в себя полисорбат-80 в качестве поверхностно-активного вещества. В некоторых определенных вариантах осуществления препарат устекинумаба включает в себя гистидин (например, L-гистидин), сахарозу и полисорбат-80.
В некоторых вариантах осуществления состав препарата устекинумаба предназначен для парентерального введения, например внутривенной инъекции, внутримышечной инъекции, внутрибрюшинной инъекции, подкожной инъекции. В некоторых вариантах осуществления состав препарат устекинумаба предназначен для подкожного введения.
Изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими примерами. Такие примеры приведены исключительно в целях иллюстрации. Их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем или содержание изобретения.
Примеры
Пример 1. Определение сдвига в составе гликанов в продуктах устекинумаба.
В этом примере выявлен значительный сдвиг в составе гликанов в партиях доступных в продаже стандартных белков продуктов устекинумаба (RPP). В частности, в настоящем примере продемонстрировано, что изменения в составе гликанов среди партий доступного в продаже устекинумаба можно подразделить на два различных профиля гликанов. Эти две группы вариантов гликанов в настоящем изобретении называются группой 1, для которой характерен относительно высокий уровень гликана G0F, и группой 2, для которой характерен относительно низкий уровень гликана G0F.
Анализировали 30 (тридцать) партий устекинумаба RPP. Из этих 30 партий 28 партий были из препаратов с концентрацией 90 мг/мл, а 2 партии были препаратами с концентрацией 5 мг/мл. Было установлено, что из 28 партий с 90 мг/мл устекинумаба RPP в 8 (восьми) из этих партий отмечался профиль гликанов группы 1, а в 20 (двадцати) партий отмечался профиль гликанов группы 2. См. фиг. 1.
Сводная информация о среднем содержании основных соединений гликанов для образцов группы 1 и группы 2 приведена ниже в табл. 2.
Таблица 2
Содержание основных гликанов в образцах устекинумаба группы 1 и группы 2
| Гликан(%) | Группа 1 | Группа 2 |
| 4,3,1,0,0 (G0F) | 27,7 | 62,1 |
| 4,4,1,0,0 A (G1F-A) | 28,1 | 14,1 |
| 4,4,1,0,0 В (G1F-B) | 6,6 | 3,5 |
| 4,4,1,0,1 А | 5,4 | 4,1 |
| 4,4,1,0,1 В | 3,2 | 2,9 |
| 4,5,1,0,0 (G2F) | 8,4 | 2,3 |
| 4,6,1,0,0 | 1,4 | 0,2 |
| 4,5,1,0,1 | 6,7 | 2,1 |
| 4,5,1,0,2 | 2,0 | 0,9 |
| 4,6,1,0,1 В | 3,4 | 0,7 |
| Сумма вышеперечисленного | 92,9 | 92,9 |
Также анализировали исследуемые продукты устекинумаба, полученные культивированием (например, с помощью процесса перфузионного культивирования с ATF) с 5 мМ галактозы в течение 42 дней при разных объемах в диапазоне от 3 до 250 л. Содержание гликанов в этих исследовательских продуктах устекинумаба показана в крайней справа группе на каждой панели на фиг. 1. Профили гликанов в исследуемых продуктах устекинумаба находились в пределах диапазона для RPP группы 1 и группы 2. Таким образом, в настоящем примере идентифицированы две различные группы профилей гликанов для доступного в продаже устекинумаба RPP и показано, что в современных условиях культивирования получаются исследуемые продукты устекинумаба с промежуточными значениями содержания гликанов в пределах диапазонов, характерных для этих двух групп.
Пример 2. Время культивирования влияет на состав гликанов в устекинумабе.
В настоящем примере продемонстрировано, что момент сбора является одним из элементов контроля состава гликанов в устекинумабе. Как показано на фиг. 2, содержание гликана G0F относительно общего содержания гликанов обычно снижается по мере увеличения времени культивирования. Например, препараты устекинумаба, собранные через 13 дней культивирования, содержали почти 50% гликанов G0F, тогда как образцы, собранные после 34 или более дней культивирования, содержали менее 30%
-
Claims (1)
- гликанов G0F по отношению к общему содержанию гликанов.Интересно, что в настоящем изобретении приведено подтверждение того, что уменьшение продолжительности культивирования (т.е. времени до сбора) сопровождается увеличением уровня G0F, в то время как увеличение продолжительности культивирования (т.е. времени до сбора) сопровождается снижением уровня G0F.Таким образом, настоящий пример демонстрирует, что увеличение времени культивирования может привести к уменьшению содержания гликанов G0F по сравнению с общим содержанием гликанов, и дополнительно описано, что время культивирования может меняться для контроля состава гликанов в устекинумабе.Пример 3. Получение продуктов устекинумаба с профилями гликанов группы 1 и группы 2.В настоящем примере выявлена обратно пропорциональная зависимость между временем культивирования и концентрацией галактозы в культуральной среде, которая может служить технологическим подходом для контроля уровней гликанов в устекинумабе (например, галактозилирование). В настоящем примере продемонстрировано получение не соответствующих требованиям материалов (т.е. не соответствующих требованиям препаратов устекинумаба) со сконструированными профилями гликанов. В частности, в настоящем примере рассматривается получение двух не соответствующих требованиям препаратов устекинумаба, называемых в настоящем изобретении NCM-1 и NCM-2, которые были сконструированы таким образом, чтобы их профили гликанов совпадали с характеристиками группы 1 RPP и группы 2 RPP соответственно, как описано выше в примере 1.В частности, препараты NCM-1 получали культивированием (например, с помощью процесса перфузионного культивирования с ATF) в среде без галактозы (0 мМ галактозы) со сбором устекинумаба до 16-го дня культивирования (сбор в моменты времени в пределах диапазона от 7- до 15-го дня). Напротив, препараты NCM-2 получали культивированием (например, с помощью процесса перфузионного культивирования с ATF) в присутствии галактозы в диапазоне от 15 до 30 мМ со сбором устекинумаба после 25-го дня культивирования (например, сбор в моменты времени в пределах диапазона от 34- до 45-го дня). Как показано на фиг. 3, профили гликанов NCM-1 хорошо коррелируют с профилями гликанов группы 1 RPP, a профили гликанов NCM-2 хорошо коррелируют с профилями гликанов группы 2 RPP для каждой из проанализированных молекул гликанов, включая GOF, G1FA, G1FB, G2F, общее сиалилирование, основные, кислые и щелочные гликаны. В табл. 3 приведены примеры целевых диапазонов для каждого гликана, сконструированных посредством контроля на основе технологических подходов с использованием концентрации галактозы и времени культивирования.Таблица 3Примеры целевых диапазонов гликанов для препаратов устекинумаба NCM-1 и NCM-2Набор гликанов G0F G1F-A G1F-B G2F Общее сиалилирован неNCM-1 (0 мМ галактозы, время культивирования 7-15 дней) 20%-40% > 25%-35% > 5,5%-10% > 5%-10% > 15%-30%NCM-2 (15-30 мМ галактозы, время культивирования 25-60 дней) > 40%-80% 10%-25% 2%-5,5% 1%-5% 5%-15%Таким образом, в настоящем примере продемонстрировано, что связанные обратной пропорциональной зависимостью элементы концентрации галактозы и времени культивирования можно использовать в качестве технологических подходов для контроля состава гликанов, а также их можно использовать для получения не соответствующих требованиям препаратов устекинумаба с целевыми уровнями гликанов.Эквиваленты.Следует понимать, что несмотря на подробное изложение в настоящем изобретении приведенное выше описание предназначено для иллюстрации и не ограничивает объем настоящего изобретения, который определяется объемом прилагаемой формулы изобретения. Другие аспекты, преимущества и модификации входят в объем следующей формулы изобретения.ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Способ получения фармацевтической композиции, содержащей устекинумаб, имеющий целевой уровень гликана G0F, включающий в себя (a) выбор целевого уровня гликана G0F, в котором целевой уровень гликана G0F находится в диапазоне от 20 до 80% G0F относительно общего содержания гликана;-
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US62/786,821 | 2018-12-31 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA046459B1 true EA046459B1 (ru) | 2024-03-15 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2732679T3 (es) | Procedimientos de cultivo celular | |
| EP2975401B1 (en) | Improved method of mapping glycans of glycoproteins in serum samples | |
| RU2558367C2 (ru) | Способ очистки полипептидных растворов | |
| US20220033487A1 (en) | Methods of Producing Ustekinumab | |
| EA008220B1 (ru) | Композиция, включающая эритропоэтинподобные молекулы, и способы ее применения | |
| KR20150138273A (ko) | 단백질의 피로글루타민산 형성을 증가시키기 위한 방법 | |
| EA012162B1 (ru) | Способ рефолдинга рекомбинантных антител | |
| KR20090005410A (ko) | 항-Ａβ 항체 | |
| US20220267413A1 (en) | Methods For The Treatment Of Neurodegeneration | |
| CN107531749A (zh) | 超纯化DsbA和DsbC及其制备和使用方法 | |
| JP2018528218A (ja) | 組換えグリコシル化エクリズマブおよびエクリズマブ変異体 | |
| Skeene et al. | One filter, one sample, and the N-and O-glyco (proteo) me: toward a system to study disorders of protein glycosylation | |
| EA046459B1 (ru) | Способы получения устекинумаба | |
| KR20210056372A (ko) | 연속 세포 배양 방법 | |
| TWI654991B (zh) | 包含長效紅血球生成素之組成物 | |
| KR20210005689A (ko) | 조절된 글리칸 프로파일을 갖는 항체 | |
| US20230357813A1 (en) | Hypersialylated immunoglobulin | |
| US11028184B2 (en) | Long-acting PCSK9-specific binding protein and application thereof | |
| De la Luz-Hernandez et al. | Cancer vaccine characterization: from bench to clinic | |
| JP6761536B2 (ja) | プロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン９型の結合タンパク質及びその使用 | |
| US20240025985A1 (en) | Agent for Preventing or Treating Frontotemporal Lobar Degeneration | |
| Zdebska et al. | Glycophorin A in two patients with congenital dyserythropoietic anemia type I and type II is partly unglycosylated. | |
| WO2018025270A1 (en) | Enriched modified vitamin d binding protein compositions and use thereof | |
| CN115078728A (zh) | 一种融合蛋白的快速分析方法 | |
| KR20180026688A (ko) | 지속형 에리트로포이에틴 함유 조성물 |