EA046459B1 - METHODS FOR OBTAINING USTEKINUMAB - Google Patents
METHODS FOR OBTAINING USTEKINUMAB Download PDFInfo
- Publication number
- EA046459B1 EA046459B1 EA202191840 EA046459B1 EA 046459 B1 EA046459 B1 EA 046459B1 EA 202191840 EA202191840 EA 202191840 EA 046459 B1 EA046459 B1 EA 046459B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- glycan
- ustekinumab
- level
- culture
- target
- Prior art date
Links
- MJZJYWCQPMNPRM-UHFFFAOYSA-N 6,6-dimethyl-1-[3-(2,4,5-trichlorophenoxy)propoxy]-1,6-dihydro-1,3,5-triazine-2,4-diamine Chemical compound CC1(C)N=C(N)N=C(N)N1OCCCOC1=CC(Cl)=C(Cl)C=C1Cl MJZJYWCQPMNPRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 187
- 229960003824 ustekinumab Drugs 0.000 title claims description 187
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 88
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 115
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 claims description 48
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 43
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 38
- DWCNMHMZSYJSGO-IMJCQESISA-N beta-D-GlcpNAc-(1->2)-alpha-D-Manp-(1->3)-[beta-D-GlcpNAc-(1->2)-alpha-D-Manp-(1->6)]-beta-D-Manp-(1->4)-beta-GlcpNAc-(1->4)-[alpha-L-Fucp-(1->6)]-beta-D-GlcpNAc Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@H]3[C@H]([C@@H](O[C@@H]4[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)NC(C)=O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]4[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)NC(C)=O)O3)O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@H](O)[C@@H](NC(C)=O)[C@H](O)O1 DWCNMHMZSYJSGO-IMJCQESISA-N 0.000 claims description 36
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 26
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 26
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 25
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 17
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 16
- 238000013459 approach Methods 0.000 claims description 13
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 13
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 claims description 12
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 9
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 5
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims description 4
- 230000009450 sialylation Effects 0.000 claims description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 80
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 26
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 21
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 18
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 14
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 14
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 14
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 12
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 11
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 11
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 9
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 9
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 8
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 7
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- WWOGFSBVRNWZBV-KVMLNOKXSA-N beta-D-Galp-(1->4)-beta-D-GlcpNAc-(1->2)-alpha-D-Manp-(1->3)-[beta-D-Galp-(1->4)-beta-D-GlcpNAc-(1->2)-alpha-D-Manp-(1->6)]-beta-D-Man-(1->4)-beta-D-GlcpNAc-(1->4)-[alpha-L-Fucp-(1->6)]-beta-D-GlcpNAc Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@H]3[C@H]([C@@H](O[C@@H]4[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@@H](CO)O4)NC(C)=O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]4[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@@H](CO)O4)NC(C)=O)O3)O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@H](O)[C@@H](NC(C)=O)[C@H](O)O1 WWOGFSBVRNWZBV-KVMLNOKXSA-N 0.000 description 6
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 201000008808 Fibrosarcoma Diseases 0.000 description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 4
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 4
- -1 '-fluororibose Chemical class 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- 210000000692 cap cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005084 2D-nuclear magnetic resonance Methods 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 238000004252 FT/ICR mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 2
- 102100038551 Peptide-N(4)-(N-acetyl-beta-glucosaminyl)asparagine amidase Human genes 0.000 description 2
- 102100024952 Protein CBFA2T1 Human genes 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 2
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000013583 drug formulation Substances 0.000 description 2
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 2
- 238000005016 nuclear Overhauser enhanced spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 108040002068 peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl)asparagine amidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 101150029662 E1 gene Proteins 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N N-acetyl-beta-neuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 1
- 102000000447 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Human genes 0.000 description 1
- 108010055817 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 201000001263 Psoriatic Arthritis Diseases 0.000 description 1
- 208000036824 Psoriatic arthropathy Diseases 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- GBXZONVFWYCRPT-KVTDHHQDSA-N [(2s,3s,4r,5r)-3,4,5,6-tetrahydroxy-1-oxohexan-2-yl] dihydrogen phosphate Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C=O)OP(O)(O)=O GBXZONVFWYCRPT-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 210000001776 amniocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000000738 capillary electrophoresis-mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000005100 correlation spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001077 electron transfer detection Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 238000005570 heteronuclear single quantum coherence Methods 0.000 description 1
- 229920000140 heteropolymer Polymers 0.000 description 1
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012007 large scale cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001896 rotating frame Overhauser effect spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Description
Перекрестные ссылки на смежные заявкиCross-references to related applications
Данная заявка испрашивает преимущество по предварительной заявке на патент США № 62/786821, поданной 31 декабря 2018 г., которая полностью включена в настоящий документ путем ссылки.This application claims the benefit of U.S. Provisional Patent Application No. 62/786821, filed December 31, 2018, which is incorporated herein by reference in its entirety.
Перечень последовательностейList of sequences
Рассматриваемая заявка содержит перечень последовательностей, поданный в электронном виде в формате ASCII и полностью включенный в настоящий документ путем ссылки. Копия указанного перечня в формате ASCII, созданная 20 декабря 2019 г., называется M0168PCT_SL.txt и имеет размер 6036 байт.The pending application contains a sequence listing filed electronically in ASCII format and is incorporated herein by reference in its entirety. The ASCII copy of this listing, created on December 20, 2019, is called M0168PCT_SL.txt and is 6036 bytes in size.
Предпосылки создания изобретенияPrerequisites for creating the invention
Терапевтические антитела являются важным классом терапевтических биологических лекарственных средств. Гликозилирование антитела и состав гликанов могут влиять на активность антитела и эффекторные функции. Сохраняется актуальная потребность в усовершенствованных способах контроля профиля гликанов в продуктах антител.Therapeutic antibodies are an important class of therapeutic biological drugs. Antibody glycosylation and glycan composition can influence antibody activity and effector functions. There remains a pressing need for improved methods to control the glycan profile of antibody products.
Изложение сущности изобретенияSummary of the invention
В настоящем изобретении предложены технологические подходы для получения (например, изготовления) устекинумаба с целевым уровнем одного или более гликанов. Настоящее изобретение дает представление о том, что взаимосвязь между концентрацией галактозы в культуральной среде и временем культивирования можно использовать как технологический подход для контроля целевого уровня одного или более гликанов (например, галактозилирование) в устекинумабе в культуре. В настоящем изобретении продемонстрирована обратная зависимость между временем культивирования и концентрацией галактозы в культуральной среде для контроля целевого уровня одного или более гликанов (например, галактозилирование).The present invention provides technological approaches for obtaining (eg, manufacturing) ustekinumab with a target level of one or more glycans. The present invention provides insight that the relationship between galactose concentration in the culture medium and culture time can be used as a technology approach to control the target level of one or more glycans (eg, galactosylation) in ustekinumab in culture. The present invention demonstrates an inverse relationship between culture time and galactose concentration in the culture medium to control the target level of one or more glycans (eg, galactosylation).
В определенных аспектах в изобретении предложены способы изготовления устекинумаба с целевым уровнем одного или более гликанов. Такие способы могут включать в себя обеспечение (например, продукцию, экспрессию (например, в мелкомасштабной или крупномасштабной клеточной культуре) и/или изготовление) или получение (например, поступление и/или приобретение у третьей стороны (в том числе у привлекаемой по контракту третьей стороны или не связанной контрактом (например, независимой) третьей стороны)) исследуемого белка устекинумаба (например, лекарственное вещество устекинумаба, например препарат лекарственного вещества устекинумаба, например партия исследуемого лекарственного вещества устекинумаба).In certain aspects, the invention provides methods for making ustekinumab to target levels of one or more glycans. Such methods may include providing (e.g., production, expression (e.g., in small-scale or large-scale cell culture), and/or manufacturing) or obtaining (e.g., supplying and/or purchasing from a third party (including a contracted third party) party or non-contracted (e.g., independent) third party) ustekinumab investigational protein (e.g., ustekinumab drug substance, e.g., ustekinumab drug substance preparation, e.g., a batch of ustekinumab investigational drug substance).
В некоторых случаях в изобретении предложены способы изготовления фармацевтической композиции, содержащей устекинумаб, имеющий целевой уровень одного или более гликанов, причем способ включает в себя выбор уровня галактозы и времени культивирования клеток, при этом уровень галактозы и время обратно пропорциональны друг другу;In some cases, the invention provides methods for making a pharmaceutical composition containing ustekinumab having a target level of one or more glycans, the method including selecting a galactose level and a cell culture time, wherein the galactose level and time are inversely proportional to each other;
культивирование популяции клеток, полученных методами генной инженерии, для экспрессии устекинумаба в условиях, включающих выбранный уровень галактозы и время;culturing a population of genetically engineered cells to express ustekinumab under conditions including a selected level of galactose and time;
сбор устекинумаба, экспрессированного популяцией клеток, с получением таким образом препарата устекинумаба; и очистку, концентрирование и/или определение состава препарата устекинумаба для получения фармацевтической композиции, содержащей устекинумаб, если препарат соответствует целевому уровню одного или более гликанов.collecting ustekinumab expressed by the population of cells, thereby obtaining a ustekinumab preparation; and purifying, concentrating and/or determining the composition of the ustekinumab drug to obtain a pharmaceutical composition containing ustekinumab, if the drug meets the target level of one or more glycans.
В некоторых вариантах осуществления целевой уровень одного или более гликанов представляет собой целевой уровень гликана, выбранного из группы, состоящей из G0F, сиалилированного гликана и G2F. В некоторых вариантах осуществления целевой уровень одного или более гликанов представляет собой целевой уровень G0F.In some embodiments, the target level of one or more glycans is a target level of a glycan selected from the group consisting of G0F, sialylated glycan, and G2F. In some embodiments, the target level of one or more glycans is the target level of G0F.
В некоторых случаях в изобретении предложены способы изготовления фармацевтической композиции, содержащей устекинумаб, имеющий целевой уровень гликана G0F, причем способ включает в себя выбор целевого уровня гликана G0F;In some cases, the invention provides methods for making a pharmaceutical composition containing ustekinumab having a target level of G0F glycan, the method including selecting a target level of G0F glycan;
выбор уровня галактозы и времени для культивирования клеток с обеспечением выбранного целевого уровня G0F, при этом уровень галактозы и время обратно пропорциональны друг другу;selecting the level of galactose and time for culturing cells to ensure the selected target level of G0F, while the level of galactose and time are inversely proportional to each other;
культивирование популяции клеток, полученных методами генной инженерии, для экспрессии устекинумаба в условиях, включающих выбранный уровень галактозы и время;culturing a population of genetically engineered cells to express ustekinumab under conditions including a selected level of galactose and time;
сбор устекинумаба, экспрессированного популяцией клеток, с получением таким образом препарата устекинумаба; и очистку, концентрирование и/или определение состава препарата устекинумаба для получения фармацевтической композиции, содержащей устекинумаб, если препарат соответствует целевому уровню гликана G0F.collecting ustekinumab expressed by the cell population, thereby obtaining a ustekinumab preparation; and purifying, concentrating and/or determining the composition of the ustekinumab drug to obtain a pharmaceutical composition containing ustekinumab, if the drug meets the target glycan level G0F.
В некоторых случаях в изобретении предложены способы получения лекарственного препарата устекинумаба, имеющего целевой уровень одного или более гликанов, причем способ включает в себя культивирование популяции клеток, полученных методами генной инженерии, для экспрессии устекинумаба в определенных условиях, при этом условия характеризуются параметрами, включающими в себя выбранный уровень галактозы и время культивирования клеток, и при этом уровень галактозы иIn some cases, the invention provides methods for producing a drug formulation of ustekinumab having a target level of one or more glycans, the method comprising culturing a population of genetically engineered cells to express ustekinumab under specified conditions, the conditions being characterized by parameters including: the selected galactose level and cell culture time, and at the same time the galactose level and
- 1 046459 время обратно пропорциональны друг другу;- 1 046459 time are inversely proportional to each other;
сбор устекинумаба, экспрессированного клеткой, с получением таким образом препарата устекинумаба; и очистку, концентрирование и/или определение состава препарата устекинумаба для получения лекарственного препарата устекинумаба, если препарат устекинумаба соответствует целевому уровню одного или более гликанов.collecting ustekinumab expressed by the cell, thereby obtaining the drug ustekinumab; and purifying, concentrating and/or determining the composition of the ustekinumab drug to obtain the ustekinumab drug, if the ustekinumab drug meets the target level of one or more glycans.
В некоторых вариантах осуществления целевой уровень одного или более гликанов представляет собой целевой уровень гликана, выбранного из группы, состоящей из G0F, сиалилированного гликана и G2F. В некоторых вариантах осуществления целевой уровень одного или более гликанов представляет собой целевой уровень G0F.In some embodiments, the target level of one or more glycans is a target level of a glycan selected from the group consisting of G0F, sialylated glycan, and G2F. In some embodiments, the target level of one or more glycans is the target level of G0F.
В некоторых вариантах осуществления предложенные способы включают в себя культивирование популяции клеток млекопитающих, полученных методами генной инженерии, для экспрессии устекинумаба. В некоторых вариантах осуществления клетки млекопитающих выбраны из клеток СНО, клеток HEK 293, клеток фибросаркомы НТ 1080, клеток PER.C6, клеток САР, клеток HKB-11, клеток HuH-7, клеток NS0 и клеток SP 2/0.In some embodiments, the proposed methods include culturing a population of genetically engineered mammalian cells to express ustekinumab. In some embodiments, the mammalian cells are selected from CHO cells, HEK 293 cells, HT 1080 fibrosarcoma cells, PER.C6 cells, CAP cells, HKB-11 cells, HuH-7 cells, NS0 cells, and SP 2/0 cells.
В некоторых вариантах осуществления в предложенных способах стадию культивирования выполняют с использованием непрерывного процесса культивирования. В некоторых вариантах осуществления предложенные способы включают в себя культивирование, которое выполняется с использованием процесса перфузионного культивирования (например, процесса перфузионного культивирования с использованием системы фильтрации с переменным тангенциальным потоком (ATF)). В некоторых определенных вариантах осуществления предложенные способы включают в себя культивирование клеток млекопитающих, полученных методами генной инженерии, для экспрессии устекинумаба (например, клетки SP 2/0, которые экспрессируют устекинумаб) с использованием процесса перфузионного культивирования.In some embodiments, in the proposed methods, the cultivation step is performed using a continuous cultivation process. In some embodiments, the proposed methods include culture that is performed using a perfusion culture process (eg, a perfusion culture process using an alternating tangential flow filtration (ATF) system). In some certain embodiments, the proposed methods include culturing genetically engineered mammalian cells to express ustekinumab (eg, SP 2/0 cells that express ustekinumab) using a perfusion culture process.
В некоторых вариантах осуществления предложены способы, включающие в себя сбор устекинумаба, экспрессированного клетками, дважды или более раз в пределах диапазона времени, соответствующего времени культивирования клеток.In some embodiments, methods are provided that include collecting ustekinumab expressed by the cells twice or more times within a time range corresponding to the time of culturing the cells.
В некоторых вариантах осуществления целевой уровень гликана G0F находится в диапазоне от 20 до 80% G0F относительно общего содержания гликана. В некоторых вариантах осуществления целевой уровень гликана G0F находится в диапазоне от 25 до 65% G0F относительно общего содержания гликана.In some embodiments, the target G0F glycan level is in the range of 20 to 80% G0F relative to total glycan content. In some embodiments, the target G0F glycan level is in the range of 25 to 65% G0F relative to total glycan content.
В некоторых вариантах осуществления предложенные способы относятся к изготовлению и/или получению устекинумаба, имеющего целевой уровень гликана G0F в диапазоне от 20 до 40% G0F относительно общего содержания гликана. В некоторых вариантах осуществления способ получения устекинумаба, имеющего целевой уровень гликана G0F в диапазоне от 20 до 40% G0F относительно общего содержания гликана, включает в себя выбранный уровень галактозы при концентрации 0 мМ и времени культивирования клеток в диапазоне от 7 до 15 дней.In some embodiments, the proposed methods relate to the manufacture and/or production of ustekinumab having a target G0F glycan level in the range of 20 to 40% G0F relative to total glycan content. In some embodiments, a method for producing ustekinumab having a target G0F glycan level ranging from 20 to 40% G0F relative to total glycan content includes a selected level of galactose at a concentration of 0 mM and a cell culture time ranging from 7 to 15 days.
В некоторых вариантах осуществления предложенные способы относятся к изготовлению и/или получению устекинумаба, имеющего целевой уровень гликана G0F в диапазоне от 40 до 80% G0F относительно общего содержания гликана. В некоторых вариантах осуществления способ получения устекинумаба, имеющего целевой уровень гликана G0F в диапазоне от 40 до 80% G0F относительно общего содержания гликана, включает в себя выбранный уровень галактозы при концентрации в диапазоне от 15 до 30 мМ и времени культивирования клеток в диапазоне от 16 до 60 дней. В некоторых определенных вариантах осуществления время культивирования клеток находится в диапазоне от 25 до 42 дней.In some embodiments, the proposed methods relate to the manufacture and/or production of ustekinumab having a target G0F glycan level in the range of 40 to 80% G0F relative to total glycan content. In some embodiments, a method of producing ustekinumab having a target G0F glycan level ranging from 40 to 80% G0F relative to total glycan content includes a selected level of galactose at a concentration ranging from 15 to 30 mM and cell culture time ranging from 16 to 30 mM. 60 days. In some certain embodiments, the cell culture time ranges from 25 to 42 days.
В некоторых вариантах осуществления предложенные способы включают в себя выбор целевого уровня гликана G0F. В некоторых вариантах осуществления целевой уровень гликана G0F находится в диапазоне от 20 до 80% G0F относительно общего содержания гликана. В некоторых определенных вариантах осуществления целевой уровень гликана G0F находится в диапазоне от 20 до 40% G0F относительно общего содержания гликана, при этом способ включает в себя выбранный уровень галактозы при концентрации 0 мМ и времени культивирования клеток в диапазоне от 7 до 15 дней. В некоторых определенных вариантах осуществления целевой уровень гликана G0F находится в диапазоне от 40 до 80% G0F относительно общего содержания гликана, при этом способ включает в себя выбранный уровень галактозы при концентрации в диапазоне от 15 до 30 мМ и времени культивирования клеток в диапазоне от 16 до 60 дней.In some embodiments, the proposed methods include selecting a target level of the G0F glycan. In some embodiments, the target G0F glycan level is in the range of 20 to 80% G0F relative to total glycan content. In certain embodiments, the target G0F glycan level is in the range of 20 to 40% G0F relative to total glycan content, wherein the method includes a selected level of galactose at a concentration of 0 mM and a cell culture time ranging from 7 to 15 days. In certain embodiments, the target G0F glycan level is in the range of 40 to 80% G0F relative to total glycan content, wherein the method includes a selected level of galactose at a concentration ranging from 15 to 30 mM and cell culture time ranging from 16 to 30 mM. 60 days.
В некоторых вариантах осуществления в предложенных способах осуществляется контроль за выбранным уровнем галактозы на протяжении всей стадии культивирования (например, контроль в процессе культивирования с t=0 до сбора).In some embodiments, the proposed methods control the selected level of galactose throughout the cultivation stage (for example, control during the cultivation process from t=0 to harvest).
В некоторых вариантах осуществления предложенные способы дополнительно включают в себя измерение уровня гликана G0F. В некоторых вариантах осуществления, если измеренный уровень гликана G0F находится в диапазоне от 20 до 80% G0F относительно общего содержания гликана (например, в диапазоне от 20 до 40% G0F относительно общего содержания гликана, например в диапазоне от 40 до 80% G0F относительно общего содержания гликана), то проводится стадия очистки, концентрирования и/или определения состава препарата устекинумаба.In some embodiments, the proposed methods further include measuring the level of the G0F glycan. In some embodiments, if the measured G0F glycan level is in the range of 20 to 80% G0F relative to total glycan content (e.g., in the range of 20 to 40% G0F relative to total glycan content, e.g., in the range of 40 to 80% G0F relative to total glycan content), then the stage of purification, concentration and/or determination of the composition of the ustekinumab drug is carried out.
Эти и другие аспекты изобретения более подробно описаны ниже и в пунктах формулы изобретения.These and other aspects of the invention are described in more detail below and in the claims.
- 2 046459- 2 046459
Краткое описание графических материаловBrief description of graphic materials
Включенные в настоящий документ чертежи, состоящие из следующих фигур, предназначены только для иллюстрации и не носят ограничительного характера.The drawings included herein, consisting of the following figures, are for illustrative purposes only and are not intended to be limiting.
На фиг. 1 представлено сравнение профилей гликанов различных препаратов и источников устекинумаба. Содержание гликана G0F приведено на левой верхней панели; содержание гликана G1F-A приведено на правой верхней панели; содержание гликана G1F-B приведено на левой нижней панели; а общий уровень сиалилирования приведен на правой нижней панели. Сплошными кружками обозначены стандартные белковые препараты (RPP) из США (черные сплошные кружки) и Европы (заштрихованные сплошные кружки). Символы в крайней правой части каждой панели относятся к исследуемым препаратам устекинумаба, которые были культивированы в разных объемах. Сплошными заштрихованными квадратами обозначены образцы, культивированные в 3 л, белыми квадратами обозначены образцы из сателлитной культуры, сплошными треугольниками обозначены образцы, культивированные в 100 л, и сплошными ромбами обозначены образцы, культивированные в 250 л. Относительное содержание каждого гликана отражено на соответствующей панели, при этом образцы на каждой панели подразделяли на четыре группы, приведенные по оси х слева направо: группа 1 RPP из стандартных образцов 90 мг/мл (крайняя слева), группа 2 RPP из стандартных образцов 90 мг/мл (вторая слева), 5 мг/мл RPP (третья слева) и исследуемые препараты устекинумаба (крайняя справа).In fig. Figure 1 shows a comparison of the glycan profiles of different drugs and sources of ustekinumab. G0F glycan content is shown in the upper left panel; G1F-A glycan content is shown in the upper right panel; G1F-B glycan content is shown in the lower left panel; and the overall level of sialylation is given in the lower right panel. Solid circles indicate standard protein preparations (RPPs) from the USA (black solid circles) and Europe (filled solid circles). The symbols on the far right of each panel refer to study ustekinumab preparations that were cultured in different volumes. Solid shaded squares indicate samples cultured at 3 L, white squares indicate samples from a satellite culture, solid triangles indicate samples cultured at 100 L, and solid diamonds indicate samples cultured at 250 L. The relative abundance of each glycan is shown in the corresponding panel, with samples in each panel divided into four groups, shown along the x-axis from left to right: group 1 RPP from 90 mg/ml standard samples (far left), group 2 RPP from 90 mg standard samples /mL (second from left), 5 mg/mL RPP (third from left), and ustekinumab study drugs (far right).
На фиг. 2 представлено изменение профиля гликана G0F в зависимости от продолжительности сбора. Крайний слева столбец (белый) отражает содержание RPP G0F группы 1, второй столбец слева (черный) обозначает численность RPP G0F группы 2, третий столбец слева обозначает среднее содержание G0F в образцах, культивированных за период от 7 до 42 дней. Заштрихованные столбцы (начиная с четвертого столбца слева и далее до крайнего справа столбца) отражают содержание G0F в образцах, культивированных в течение указанного числа дней в диапазоне от 7 дней (D7) до 42 дней (D42, крайний справа столбец).In fig. Figure 2 shows the change in the G0F glycan profile depending on the collection duration. The leftmost column (white) represents the abundance of group 1 RPP G0F, the second column from the left (black) represents the abundance of group 2 RPP G0F, and the third column from the left indicates the average G0F content of samples cultured over a period of 7 to 42 days. The shaded bars (from the fourth column from the left to the rightmost column) represent the G0F content of samples cultured for the indicated number of days ranging from 7 days (D7) to 42 days (D42, rightmost column).
На фиг. 3 представлено сравнение профилей основных гликанов и их заряженных вариантов в различных условиях культивирования. Вдоль оси х каждой панели слева направо приведены группа 1 RPP (крайняя слева), группа 2 RPP, устекинумаб, культивированный в 3 л DS, устекинумаб, культивированный в 100 л DS, устекинумаб, культивированный в 250 л DS, препарат устекинумаба NCM-2 и препарат устекинумаба NCM-1 (крайний справа).In fig. Figure 3 shows a comparison of the profiles of the main glycans and their charged variants under various cultivation conditions. Along the x-axis of each panel, from left to right, are RPP group 1 (far left), RPP group 2, ustekinumab cultured in 3 L DS, ustekinumab cultured in 100 L DS, ustekinumab cultured in 250 L DS, ustekinumab preparation NCM-2, and ustekinumab drug NCM-1 (far right).
Некоторые определенияSome definitions
Если прямо не указано иное, используемая в настоящем изобретении терминология в целом соответствует ее общепринятым в данной области значениям. Ниже приведены определения некоторых терминов в явной форме; значения этих и других терминов в конкретных случаях в данном изобретении будут очевидны специалистам в данной области из контекста.Unless otherwise expressly stated, the terminology used in the present invention generally corresponds to its generally accepted meaning in the art. Below are definitions of some terms in explicit form; the meanings of these and other terms in specific instances in this invention will be apparent to those skilled in the art from the context.
Чтобы настоящее изобретение было более понятным, ниже сначала приведены некоторые определения терминов. Дополнительные определения представленных ниже терминов и других терминов приведены в тексте описания.To make the present invention more clear, some definitions of terms are first provided below. See the text for additional definitions of the terms below and other terms.
В настоящем изобретении термины около или приблизительно, применяемые к одной или более интересующим величинам, означает величину, аналогичную указанной стандартной величине. В определенных вариантах осуществления термин приблизительно или около обозначает диапазон величин, которые находятся в пределах 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% или меньше от указанной стандартной величины.In the present invention, the terms about or about, when applied to one or more quantities of interest, mean a value similar to the specified standard value. In certain embodiments, the term approximately or about refers to a range of values that are within the range of 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% or less of the specified standard value.
Термины контрольный, контролируемый, контролирующий, используемые в настоящем изобретении в отношении контроля целевого уровня одного или более гликанов (например, галактозы, например, G0F) устекинумаба, означают выбор, сохранение и/или корректировку одного или более условий культивирования для получения устекинумаба. Коррекция может включать в себя увеличение или уменьшение для одного или более условий культивирования при получении устекинумаба. В настоящем изобретении контролируемый целевой уровень одного или более гликанов относится к получению устекинумаба с желаемым уровнем одного или более гликанов с минимальным отклонением продукта. В некоторых вариантах осуществления контролируемый целевой уровень G0F меняется в зависимости от образца для одного и того же производственного цикла и/или партии не более чем на 20, 15, 10 или 5%. В некоторых вариантах осуществления контроль целевого уровня одного или более гликанов обеспечивает однородность характеристик получения устекинумаба (например, однородность характеристик от партии к партии, однородность характеристик образцов, полученных от какого-либо конкретного процесса производства).The terms control, controlled, control, as used in the present invention with respect to controlling the target level of one or more glycans (eg, galactose, eg, G0F) of ustekinumab, mean selecting, maintaining, and/or adjusting one or more culture conditions to produce ustekinumab. The adjustment may include an increase or decrease for one or more culture conditions when receiving ustekinumab. In the present invention, a controlled target level of one or more glycans refers to producing ustekinumab with the desired level of one or more glycans with minimal product deviation. In some embodiments, the monitored target G0F level varies from sample to sample for the same production run and/or batch by no more than 20%, 15%, 10%, or 5%. In some embodiments, control of the target level of one or more glycans ensures uniform performance of ustekinumab (eg, uniform performance from batch to batch, uniform performance of samples obtained from any particular manufacturing process).
В настоящем изобретении термин гликан относится к соединению, содержащему по меньшей мере один остаток сахара (например, моносахарид). Гликаны могут представлять собой мономеры или полимеры из остатков сахаров и могут быть линейными или разветвленными. Гликан может включать в себя природные остатки сахаров (например, глюкозу, N-ацетилглюкозамин, N-ацетилнейраминовую кислоту, галактозу, маннозу, фукозу, гексозу, арабинозу, рибозу, ксилозу и т.д.) и/или модифицированные сахара (например, 2'-фторрибозу, 2'-дезоксирибозу, фосфоманнозу, 6'-сульфо-Ы-ацетилглюкозамин и т.д.). Термин гликан включает в себя гомополимеры и гетерополимеры остатков сахаров. Термин гликан также охваIn the present invention, the term glycan refers to a compound containing at least one sugar residue (eg, monosaccharide). Glycans can be monomers or polymers of sugar residues and can be linear or branched. The glycan may include natural sugar moieties (e.g. glucose, N-acetylglucosamine, N-acetylneuraminic acid, galactose, mannose, fucose, hexose, arabinose, ribose, xylose, etc.) and/or modified sugars (e.g. '-fluororibose, 2'-deoxyribose, phosphomannose, 6'-sulfo-N-acetylglucosamine, etc.). The term glycan includes homopolymers and heteropolymers of sugar residues. The term glycan also covers
- 3 046459 тывает гликановый компонент гликоконъюгата (например, гликопротеин, гликолипид, протеогликан и т.д.). Термин также охватывает свободные гликаны, включая гликаны, которые были отщеплены или иным образом высвобождены из гликоконъюгата.- 3 046459 is the glycan component of a glycoconjugate (for example, glycoprotein, glycolipid, proteoglycan, etc.). The term also includes free glycans, including glycans that have been cleaved or otherwise released from the glycoconjugate.
В настоящем изобретении термин галактозилированный гликан относится к гликану, который включает в себя по меньшей мере один остаток сахара галактозы. В некоторых вариантах осуществления галактозилированный гликан представляет собой гликан G1, G2, G1F, G2F, А1 и/или А2. К негалактозилированным гликанам относятся G0F или G0. В некоторых вариантах осуществления целевой уровень галактозилированного гликана может относиться к наличию галактозилированного гликана (например, G2F) и/или к целевому уровню негалактозилированного гликана (например, G0F).In the present invention, the term galactosylated glycan refers to a glycan that includes at least one galactose sugar residue. In some embodiments, the galactosylated glycan is a G1, G2, G1F, G2F, A1, and/or A2 glycan. Non-galactosylated glycans include G0F or G0. In some embodiments, the target level of galactosylated glycan may refer to the presence of galactosylated glycan (eg, G2F) and/or the target level of non-galactosylated glycan (eg, G0F).
В настоящем изобретении термин выделенный обозначает вещество и/или объект, который был (1) отделен от по меньшей мере некоторых из компонентов, с которыми он был связан при первоначальном получении (в природе и/или в экспериментальных условиях); и/или (2) создан, произведен, приготовлен и/или изготовлен человеком.In the present invention, the term isolated refers to a substance and/or entity that has been (1) separated from at least some of the components with which it was originally associated (in nature and/or under experimental conditions); and/or (2) created, produced, prepared and/or manufactured by man.
Выделенные вещества и/или объекты могут быть отделены от приблизительно 10%, приблизительно 20%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90%, приблизительно 91%, приблизительно 92%, приблизительно 93%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99% или более чем приблизительно 99% других компонентов, с которыми они были первоначально связаны. В некоторых вариантах осуществления выделенные агенты имеют степень чистоты, равную приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 91%, приблизительно 92%, приблизительно 93%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99% или более чем приблизительно 99%. В настоящем изобретении вещество является чистым, если оно по существу не содержит других компонентов. В некоторых вариантах осуществления, как будет понятно специалистам в данной области, вещество может по-прежнему рассматриваться как выделенное или даже чистое после объединения с определенными другими компонентами, такими как, например, один или более носителей или эксципиентов (например, буфером, растворителем, водой и т.д.); в таких вариантах осуществления процент выделения или чистоты вещества рассчитывается без включения таких носителей или эксципиентов. В качестве лишь одного примера в некоторых вариантах осуществления биологический полимер, например полипептид или полинуклеотид, встречающийся в природе, считается выделенным, когдаThe isolated substances and/or objects can be separated from about 10%, about 20%, about 30%, about 40%, about 50%, about 60%, about 70%, about 80%, about 90%, about 91%, about 92%, about 93%, about 94%, about 95%, about 96%, about 97%, about 98%, about 99%, or more than about 99% of the other components with which they were originally associated. In some embodiments, the isolated agents have a purity of about 80%, about 85%, about 90%, about 91%, about 92%, about 93%, about 94%, about 95%, about 96%, about 97% , about 98%, about 99%, or more than about 99%. In the present invention, a substance is pure if it is substantially free of other components. In some embodiments, as will be appreciated by those skilled in the art, a substance may still be considered isolated or even pure after combining with certain other components, such as, for example, one or more carriers or excipients (e.g., buffer, solvent, water etc.); in such embodiments, the percentage recovery or purity of the substance is calculated without the inclusion of such carriers or excipients. As just one example, in some embodiments, a biological polymer, such as a naturally occurring polypeptide or polynucleotide, is considered to be isolated when
а) по природе своего происхождения или источника получения он не связан с некоторыми или со всеми компонентами, сопровождающими его интактное состояние в природе;a) by the nature of its origin or source of production, it is not related to some or all of the components accompanying its intact state in nature;
b) он является по существу свободным от других полипептидов или нуклеиновых кислот того же биологического вида из числа видов, которые его продуцируют в природе;b) it is essentially free from other polypeptides or nucleic acids of the same species among the species that produce it in nature;
с) он экспрессируется или иным способом связан с компонентами клетки или иной экспрессионной системы, которая не относится к тем биологическим видам, которые его продуцируют в природе.c) it is expressed or otherwise associated with components of a cell or other expression system that is not from the species that produces it in nature.
Таким образом, например, в некоторых вариантах осуществления полипептид, полученный путем химического синтеза или синтеза в клеточной системе, отличной от продуцирующей его в природе, считается выделенным полипептидом. Альтернативно или дополнительно в некоторых вариантах осуществления полипептид, который был подвергнут очистке с использованием одного или более способов, может рассматриваться как выделенный полипептид в соответствии со степенью его отделения от других компонентов,Thus, for example, in some embodiments, a polypeptide produced by chemical synthesis or synthesis in a cellular system other than the one that naturally produces it is considered an isolated polypeptide. Alternatively or additionally, in some embodiments, a polypeptide that has been purified using one or more methods may be considered an isolated polypeptide according to the degree of its separation from other components,
а) с которыми он связан в природе; и/илиa) with which it is associated in nature; and/or
b) с которыми он был связан при первоначальном получении.b) with which it was associated when originally received.
В настоящем изобретении термин технологический подход относится к элементу процесса культивирования (например, к одному или более условиям культивирования), который можно контролировать для увеличения или уменьшения содержания одного или более гликанов в продукте антитела. В настоящем изобретении предложен новый технологический подход, который опирается на использование установленного соотношения между концентрацией галактозы в культуральной среде и временем культивирования. Как описано в настоящем изобретении, обратно пропорциональное соотношение между концентрацией галактозы в культуральной среде и временем культивирования в культуральной среде можно использовать как технологический подход для получения устекинумаба с целевым уровнем одного или более гликанов (например, галактозилирование). В некоторых вариантах осуществления технологический подход включает в себя выбранный уровень галактозы и время культивирования клеток для контроля уровня одного или более гликанов (например, галактозилирование, например, G0F) устекинумаба (например, уровень одного или более гликанов в культуре или препарате устекинумаба).In the present invention, the term technological approach refers to an element of the culture process (eg, one or more culture conditions) that can be controlled to increase or decrease the content of one or more glycans in the antibody product. The present invention proposes a new technological approach that relies on the use of an established relationship between the concentration of galactose in the culture medium and the culture time. As described in the present invention, the inverse relationship between the concentration of galactose in the culture medium and the time of cultivation in the culture medium can be used as a technological approach to obtain ustekinumab with a target level of one or more glycans (eg, galactosylation). In some embodiments, the technology approach includes a selected galactose level and cell culture time to control the level of one or more glycans (e.g., galactosylation, e.g., G0F) of ustekinumab (e.g., the level of one or more glycans in a culture or preparation of ustekinumab).
В настоящем изобретении термин сайт N-гликозилирования Fc-области относится к аминокислотному остатку в Fc-области, с которым N-связан гликан. В некоторых определенных вариантах осуществления сайт N-гликозилирования устекинумаба находится в тяжелой цепи в положении Asn299.In the present invention, the term Fc region N-glycosylation site refers to the amino acid residue in the Fc region to which the glycan is N-linked. In certain embodiments, the ustekinumab N-glycosylation site is located on the heavy chain at position Asn299.
Как правило, в настоящем изобретении термин белок означает полипептид (т.е. цепь из по меньшей мере двух аминокислот, связанных друг с другом пептидными связями). Белки могут включать вGenerally, in the present invention, the term protein means a polypeptide (ie, a chain of at least two amino acids linked to each other by peptide bonds). Proteins may include
- 4 046459 себя фрагменты помимо аминокислот (например, могут представлять собой гликопротеины) и/или могут быть обработаны или модифицированы иным образом. Специалистам в данной области будет очевидно, что белок может представлять собой полную полипептидную цепь, продуцируемую клеткой (с сигнальной последовательностью или без нее), или может представлять собой ее функциональный участок. Специалистам в данной области дополнительно будет очевидно, что иногда белок может включать в себя более одной полипептидной цепи, например связанной одной или более дисульфидными связями или связанной другими способами.- 4 046459 themselves fragments other than amino acids (for example, may be glycoproteins) and/or may be processed or otherwise modified. Those skilled in the art will appreciate that a protein can be a complete polypeptide chain produced by a cell (with or without a signal sequence) or can be a functional region thereof. Those skilled in the art will further appreciate that sometimes a protein may include more than one polypeptide chain, such as linked by one or more disulfide bonds or linked in other ways.
В настоящем изобретении термин извлечение обозначает процесс перевода агента или объекта в состояние, по существу свободное от других ранее связанных компонентов, например, посредством выделения, например, с использованием методик очистки, известных в данной области. В некоторых вариантах осуществления агент или объект извлекают из природного источника и/или источника, содержащего клетки.As used herein, the term recovery refers to the process of bringing an agent or object into a state substantially free of other previously bound components, for example, through isolation, for example, using purification techniques known in the art. In some embodiments, the agent or object is derived from a natural source and/or a source containing cells.
В настоящем изобретении термин образец (образцы) относится к отдельно полученным образцам. В некоторых вариантах осуществления оценка отдельных образцов включает в себя оценку образцов из одного и того же цикла культивирования (например, в разные моменты времени в процессе приготовления) или из разных циклов культивирования (например, в разные циклы культивирования).In the present invention, the term sample(s) refers to separately obtained samples. In some embodiments, evaluation of individual samples includes evaluation of samples from the same culture run (eg, at different time points during preparation) or from different culture runs (eg, different culture runs).
В настоящем изобретении термин целевое значение или целевой уровень обозначает предварительно заданный уровень одного или более конкретных гликанов, таких как галактозилированные гликаны и/или сиалилированные гликаны. В некоторых вариантах осуществления целевое значение представляет собой уровень одного или более конкретных гликанов, таких как галактозилированные гликаны (например, G0, G1, G2, G0F, G1F, G2F или комбинации) и/или сиалилированные гликаны (например, моносиалилированные, дисиалилированные или комбинации), в стандартном продукте устекинумаба или значение приведено в описании или в сводном протоколе сопровождения партии фармацевтического продукта. В некоторых определенных вариантах осуществления целевое значение представляет собой уровень гликанов G0F в продукте устекинумаба.In the present invention, the term target value or target level refers to a predetermined level of one or more specific glycans, such as galactosylated glycans and/or sialylated glycans. In some embodiments, the target value is the level of one or more specific glycans, such as galactosylated glycans (e.g., G0, G1, G2, G0F, G1F, G2F, or combinations) and/or sialylated glycans (e.g., monosialylated, disialylated, or combinations) , in the standard product of ustekinumab or the value is given in the description or in the summary protocol for maintaining a batch of the pharmaceutical product. In some certain embodiments, the target value is the level of G0F glycans in the ustekinumab product.
В некоторых вариантах осуществления целевое значение относится к абсолютному уровню (например, числу молей) одного или более гликанов (например, галактозилированных гликанов (например, одного или более видов галактозилированных гликанов) и/или сиалилированных гликанов (например, одного или более видов сиалилированных гликанов)) в препарате устекинумаба. В некоторых вариантах осуществления целевое значение относится к уровню одного или более гликанов (например, галактозилированных гликанов (например, одного или более видов галактозилированных гликанов) и/или сиалилированных гликанов (например, одного или более видов сиалилированных гликанов)) в препарате устекинумаба по отношению к общему уровню гликана в препарате устекинумаба. В некоторых вариантах осуществления целевое значение выражено как процент, который относится к числу молей одного или более гликанов (например, гликанов Fc) по отношению к общему числу молей гликанов (например, гликанов Fc) в препарате устекинумаба. В некоторых вариантах осуществления процент относится к числу молей одного или более PNGаза F-высвобожденных гликанов Fc по отношению к общему числу молей обнаруженных PNGαза F-высвобожденных гликанов Fc.In some embodiments, the target value refers to the absolute level (e.g., number of moles) of one or more glycans (e.g., galactosylated glycans (e.g., one or more species of galactosylated glycans) and/or sialylated glycans (e.g., one or more species of sialylated glycans) ) in the drug ustekinumab. In some embodiments, the target value refers to the level of one or more glycans (e.g., galactosylated glycans (e.g., one or more types of galactosylated glycans) and/or sialylated glycans (e.g., one or more types of sialylated glycans)) in the ustekinumab formulation relative to total glycan level in ustekinumab. In some embodiments, the target value is expressed as a percentage that refers to the number of moles of one or more glycans (eg, Fc glycans) relative to the total number of moles of glycans (eg, Fc glycans) in the ustekinumab formulation. In some embodiments, the percentage refers to the number of moles of one or more PNGase F-released Fc glycans relative to the total number of moles of PNGase F-released Fc glycans detected.
В настоящем изобретении термин препарат устекинумаба относится к смеси белков устекинумаба, полученных в соответствии с конкретным способом получения. Белки устекинумаба в препарате устекинумаба включают в себя множество копий устекинумаба (т.е. имеющих одинаковую или по существу одинаковую аминокислотную последовательность), но со смесью гликанов, связанных с белком. В некоторых случаях препарат устекинумаба готовят с использованием способа и/или системы, описанной в настоящем изобретении. Способы получения могут включать в себя стадию приготовления с помощью рекомбинантных технологий с использованием культивированных клеток, сконструированных таким образом, чтобы они экспрессировали устекинумаб (или экспрессировали устекинумаб на соответствующем уровне или в соответствующих условиях). В некоторых вариантах осуществления способ получения может включать в себя стадию выделения, в ходе которой устекинумаб отделяют от определенных компонентов сконструированных клеток (например, посредством лизиса клеток и осаждения белкового компонента центрифугированием). В некоторых вариантах осуществления способ получения также может включать в себя стадию очистки, в ходе которой устекинумаб отделяют (например, хроматографией) от других клеточных компонентов, например от других белков или органических компонентов, которые использовали на предшествующих стадиях. Следует понимать, что эти стадии не имеют ограничительного характера и что может быть включено любое число дополнительных стадий получения. Разные препараты устекинумаба могут быть приготовлены одним и тем же способом производства, но в разное время (например, в разных циклах или препаратах). Альтернативно разные препараты устекинумаба могут быть приготовлены разными способами производства. Двум способам получения могут быть присущи любые отличия (например, экспрессионный вектор, тип сконструированных клеток, условия культивирования, процедура выделения, условия очистки и т.д.).In the present invention, the term ustekinumab preparation refers to a mixture of ustekinumab proteins obtained in accordance with a particular production method. The ustekinumab proteins in a ustekinumab formulation include multiple copies of ustekinumab (ie, having the same or substantially the same amino acid sequence), but with a mixture of glycans associated with the protein. In some cases, the ustekinumab preparation is prepared using the method and/or system described in the present invention. Methods of production may include the step of preparing using recombinant technologies using cultured cells engineered to express ustekinumab (or to express ustekinumab at an appropriate level or under appropriate conditions). In some embodiments, the production method may include an isolation step during which ustekinumab is separated from certain components of the engineered cells (eg, through cell lysis and precipitation of the protein component by centrifugation). In some embodiments, the production method may also include a purification step in which ustekinumab is separated (eg, by chromatography) from other cellular components, such as other proteins or organic components that were used in previous steps. It should be understood that these steps are not limiting and that any number of additional production steps may be included. Different formulations of ustekinumab may be prepared using the same manufacturing method but at different times (eg, in different cycles or formulations). Alternatively, different formulations of ustekinumab may be prepared by different manufacturing methods. There may be any inherent differences between the two production methods (eg, expression vector, type of cells constructed, culture conditions, isolation procedure, purification conditions, etc.).
Вся литература и аналогичные материалы, цитируемые в настоящей заявке, включая без ограничений патенты, заявки на патенты, статьи, книги, научные трактаты и веб-страницы, независимо от формата такой литературы и аналогичных материалов, полностью включены в настоящий документ путемAll literature and similar materials cited in this application, including, without limitation, patents, patent applications, articles, books, scientific treatises and web pages, regardless of the format of such literature and similar materials, are incorporated herein in their entirety by
- 5 046459 ссылки. В случае если один или более из включенной в настоящий документ литературы и аналогичных материалов отличаются от настоящей заявки или противоречит ей, включая без ограничений определенные термины, использование терминов, описанные методики и т.п., данная заявка имеет преобладающую силу. В настоящем изобретении заголовки разделов служат исключительно для целей структурирования документа и никоим образом не должны рассматриваться как ограничивающие объект изобретения.- 5 046459 links. To the extent that one or more of the literature and similar materials included herein differ from or conflict with this application, including, without limitation, defined terms, usage of terms, techniques described, etc., this application shall control. In the present invention, section headings are for document structuring purposes only and should in no way be construed as limiting the subject matter of the invention.
Подробное описание определенных вариантов осуществленияDetailed Description of Certain Embodiments
В настоящем изобретении по меньшей мере частично приведено открытие технологических подходов для получения устекинумаба, имеющего целевые уровни одного или более гликанов (например, галактозилирование, например, гликаны G0F). Контроль состава и уровней гликанов в процессе получения антител по-прежнему является проблемой. Гликозилирование терапевтических антител может влиять на их безопасность и/или эффективность (Zhang et al. (2016), Drug Discovery Today, 21(5):740-765). Соответственно важно иметь возможность обеспечить однородность состава гликанов при получении устекинумаба (например, однородность характеристик в разных партиях, однородность характеристик образцов, полученных в каком-либо конкретном производственном процессе). В ходе исследования характеристик стандартного белка продукта устекинумаба (RPP) были обнаружены две отдельные популяции гликанов RPP устекинумаба.The present invention provides at least in part the discovery of technological approaches for producing ustekinumab having target levels of one or more glycans (eg, galactosylation, eg, G0F glycans). Controlling glycan composition and levels during antibody production remains a challenge. Glycosylation of therapeutic antibodies may affect their safety and/or efficacy (Zhang et al. (2016), Drug Discovery Today, 21(5):740-765). Accordingly, it is important to be able to ensure homogeneity of glycan composition during the production of ustekinumab (eg, uniformity of characteristics across different batches, uniformity of characteristics of samples obtained in a particular manufacturing process). A characterization study of ustekinumab's standard product protein (RPP) identified two distinct populations of ustekinumab RPP glycans.
В настоящем изобретении приведена разработка подходов для контроля состава гликанов в процессе изготовления устекинумаба. В настоящем изобретении описаны технологические подходы для получения устекинумаба с целевыми уровнями конкретных гликанов, при этом идентифицирован профиль гликанов в каждом из RPP. В процессе разработки представленных подходов в настоящем изобретении определяется взаимосвязь между концентрацией галактозы в культуральной среде и временем культивирования. Настоящее изобретение дает представление о том, что взаимосвязь между концентрацией галактозы в культуральной среде и временем культивирования (например, непрерывного культивирования) можно использовать как технологический подход для контроля целевого уровня одного или более гликанов (например, галактозилирование) в устекинумабе в культуре.The present invention provides the development of approaches for controlling glycan composition during the manufacturing process of ustekinumab. The present invention describes technological approaches for producing ustekinumab with target levels of specific glycans, while identifying the profile of glycans in each of the RPPs. In developing the presented approaches, the present invention determines the relationship between the concentration of galactose in the culture medium and the culture time. The present invention provides insight that the relationship between galactose concentration in the culture medium and culture time (eg, continuous culture) can be used as a technology approach to control the target level of one or more glycans (eg, galactosylation) in ustekinumab in culture.
Настоящее изобретение дополнительно дает представление от том, что для контроля уровня гликанов (например, галактозилирование) может использоваться обратно пропорциональная зависимость между уровнем галактозы и временем (т.е. продолжительностью культивирования). Способы культивирования по настоящему изобретению для контроля состава гликанов включают в себя способы непрерывного культивирования (например, перфузионное культивирование).The present invention further provides that the inverse relationship between galactose level and time (ie, culture duration) can be used to control glycan levels (eg, galactosylation). The culture methods of the present invention for monitoring glycan composition include continuous culture methods (eg, perfusion culture).
Устекинумаб.Ustekinumab.
В настоящем изобретении частично предложены способы и процессы изготовления, приготовления, контроля или иного получения устекинумаба с конкретными профилями гликанов.The present invention provides, in part, methods and processes for making, preparing, monitoring, or otherwise producing ustekinumab with specific glycan profiles.
Устекинумаб представляет собой антитело, которое специфически связывается с субъединицей р-40 как IL-12, так и IL-23. Исследовали применение устекинумаба при ряде заболеваний человека, включая псориаз, псориатический артрит, болезнь Крона и рассеянный склероз.Ustekinumab is an antibody that specifically binds to the p-40 subunit of both IL-12 and IL-23. Ustekinumab has been studied in a number of human diseases, including psoriasis, psoriatic arthritis, Crohn's disease and multiple sclerosis.
В некоторых вариантах осуществления устекинумаб включает в себя последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3, которые отличаются не более чем на 3 аминокислотных остатка от последовательностей HCDR, как указано в SEQ ID NO: 1, и последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3, которые отличаются не более чем на 3 аминокислотных остатка от последовательностей LCDR, как указано в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления устекинумаб включает в себя последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3, которые отличаются не более чем на 2 аминокислотных остатка или не более чем на 1 аминокислотный остаток от последовательностей HCDR, как указано в SEQ ID NO: 1, и последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3, которые отличаются не более чем на 2 аминокислотных остатка или не более чем на 1 аминокислотный остаток от последовательностей LCDR, как указано в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления устекинумаб включает в себя вариабельный домен тяжелой цепи, который отличается не более чем на 3 аминокислотных остатка от последовательности, как указано в SEQ ID NO: 1, и вариабельный домен легкой цепи, который отличается не более чем на 3 аминокислотных остатка от последовательности, как указано в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления устекинумаб включает в себя вариабельный домен тяжелой цепи, включающий в себя последовательность, которая отличается не более чем на 5 аминокислотных остатков от последовательности, как указано в SEQ ID NO: 1, и вариабельный домен легкой цепи, включающий в себя последовательность, которая отличается не более чем на 5 аминокислотных остатков от последовательности SEQ ID NO: 2.In some embodiments, ustekinumab includes HCDR1, HCDR2, and HCDR3 sequences that differ by no more than 3 amino acid residues from the HCDR sequences as defined in SEQ ID NO: 1, and LCDR1, LCDR2, and LCDR3 sequences that differ by no more than 3 amino acid residues from the LCDR sequences as defined in SEQ ID NO: 2. In some embodiments, ustekinumab includes HCDR1, HCDR2, and HCDR3 sequences that differ by no more than 2 amino acid residues or by no more than 1 amino acid residue from HCDR sequences as defined in SEQ ID NO: 1, and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 sequences that differ by no more than 2 amino acid residues or by no more than 1 amino acid residue from the LCDR sequences as defined in SEQ ID NO: 2. In some embodiments, ustekinumab includes a heavy chain variable domain that differs by no more than 3 amino acid residues from the sequence as set forth in SEQ ID NO: 1, and a light chain variable domain that differs by no more than 3 amino acid residues from sequence as set forth in SEQ ID NO: 2. In some embodiments, ustekinumab includes a heavy chain variable domain including a sequence that differs by no more than 5 amino acid residues from the sequence as set forth in SEQ ID NO: 1, and a light chain variable domain comprising a sequence that differs by no more than 5 amino acid residues from the sequence of SEQ ID NO: 2.
В некоторых вариантах осуществления устекинумаб включает в себя последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3, как указано в SEQ ID NO: 1, и последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3, как указано в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления устекинумаб включает в себя вариабельный домен тяжелой цепи, как указано в SEQ ID NO: 1, и вариабельный домен легкой цепи, как указано в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления устекинумаб включает в себя тяжелую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 1, и/или легкую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 2.In some embodiments, ustekinumab includes the sequences HCDR1, HCDR2, and HCDR3, as set forth in SEQ ID NO: 1, and the sequences LCDR1, LCDR2, and LCDR3, as set forth in SEQ ID NO: 2. In some embodiments, ustekinumab includes a variable a heavy chain domain as defined in SEQ ID NO: 1, and a light chain variable domain as defined in SEQ ID NO: 2. In some embodiments, ustekinumab includes a heavy chain comprising the sequence of SEQ ID NO: 1, and/or light chain containing the sequence SEQ ID NO: 2.
SEQ ID NO: 1, последовательность тяжелой цепи устекинумаба (жирным шрифтом выделена поSEQ ID NO: 1, ustekinumab heavy chain sequence (in bold).
- 6 046459 следовательность вариабельного домена с подчеркнутыми последовательностями CDR):- 6 046459 sequence of the variable domain with underlined CDR sequences):
EVOLVOSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTTYWLGWVROMPGKGLDWIGI MSPVDSDIRYSPSFQGOVTMSVDKSITTAYLOWNSLKASDTAMYYCARRRPGOGY FDFWGQGTLVTVSSSSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDK THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKEVOLVOSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTTYWLGWVROMPGKGLDWIGI MSPVDSDIRYSPSFQGOVTMSVDKSITTAYLOWNSLKASDTAMYYCARRRPGOGY FDFWGQGTLVTVSSSSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNV NHKPSNTKVDKRVEPKSCDK THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 2, последовательность легкой цепи устекинумаба (жирным шрифтом выделена последовательность вариабельного домена с подчеркнутыми последовательностями CDR):SEQ ID NO: 2, ustekinumab light chain sequence (variable domain sequence in bold with CDR sequences underlined):
DIOMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASOGISSWLAWYOOKPEKAPKSLIYAASS LOSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATYYCOQYNIYPYTFGOGTKLEIKRTVA APSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKD STYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDIOMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASOGISSWLAWYOOKPEKAPKSLIYAASS LOSGVPSRFSGSSGTDFTLTISSLOPEDFATYYCOQYNIYPYTFGOGTKLEIKRTVA APSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKD STYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ GLSSPVTKSFNRGEC
Способы культивирования.Cultivation methods.
В некоторых случаях в изобретении предложены способы изготовления фармацевтической композиции, содержащей устекинумаб, имеющий целевой уровень одного или более гликанов, причем способ включает в себя выбор уровня галактозы и времени культивирования клеток, при этом уровень галактозы и время обратно пропорциональны друг другу;In some cases, the invention provides methods for making a pharmaceutical composition containing ustekinumab having a target level of one or more glycans, the method including selecting a galactose level and a cell culture time, wherein the galactose level and time are inversely proportional to each other;
культивирование популяции клеток, полученных методами генной инженерии, для экспрессии устекинумаба в условиях, включающих выбранный уровень галактозы и время;culturing a population of genetically engineered cells to express ustekinumab under conditions including a selected level of galactose and time;
сбор устекинумаба, экспрессированного популяцией клеток, с получением таким образом препарата устекинумаба; и очистку, концентрирование и/или определение состава препарата устекинумаба для получения фармацевтической композиции, содержащей устекинумаб, если препарат соответствует целевому уровню одного или более гликанов.collecting ustekinumab expressed by the population of cells, thereby obtaining a ustekinumab preparation; and purifying, concentrating and/or determining the composition of the ustekinumab drug to obtain a pharmaceutical composition containing ustekinumab, if the drug meets the target level of one or more glycans.
В некоторых вариантах осуществления целевой уровень одного или более гликанов представляет собой целевой уровень гликана, выбранного из группы, состоящей из G0F, сиалилированного гликана и G2F. В некоторых вариантах осуществления целевой уровень одного или более гликанов представляет собой целевой уровень G0F.In some embodiments, the target level of one or more glycans is a target level of a glycan selected from the group consisting of G0F, sialylated glycan, and G2F. In some embodiments, the target level of one or more glycans is the target level of G0F.
В некоторых случаях в изобретении предложены способы получения лекарственного препарата устекинумаба, имеющего целевой уровень одного или более гликанов, причем способ включает в себя культивирование популяции клеток, полученных методами генной инженерии, для экспрессии устекинумаба в определенных условиях, при этом условия характеризуются параметрами, включающими в себя выбранный уровень галактозы и время культивирования клеток, и при этом уровень галактозы и время обратно пропорциональны друг другу;In some cases, the invention provides methods for producing a drug formulation of ustekinumab having a target level of one or more glycans, the method comprising culturing a population of genetically engineered cells to express ustekinumab under specified conditions, the conditions being characterized by parameters including: the selected galactose level and cell culture time, and the galactose level and time are inversely proportional to each other;
сбор устекинумаба, экспрессированного клеткой, с получением таким образом препарата устекинумаба; и очистку, концентрирование и/или определение состава препарата устекинумаба для получения лекарственного препарата устекинумаба, если препарат устекинумаба соответствует целевому уровню одного или более гликанов.collecting ustekinumab expressed by the cell, thereby obtaining the drug ustekinumab; and purifying, concentrating and/or determining the composition of the ustekinumab drug to obtain the ustekinumab drug, if the ustekinumab drug meets the target level of one or more glycans.
В некоторых вариантах осуществления целевой уровень одного или более гликанов представляет собой целевой уровень гликана, выбранного из группы, состоящей из G0F, сиалилированного гликана и G2F. В некоторых вариантах осуществления целевой уровень одного или более гликанов представляет собой целевой уровень G0F.In some embodiments, the target level of one or more glycans is a target level of a glycan selected from the group consisting of G0F, sialylated glycan, and G2F. In some embodiments, the target level of one or more glycans is the target level of G0F.
В некоторых вариантах осуществления целевой уровень гликана G0F находится в диапазоне от 20 до 80% G0F относительно общего содержания гликана. В некоторых вариантах осуществления целевой уровень гликана G0F находится в диапазоне от 25 до 65% G0F относительно общего содержания гликана.In some embodiments, the target G0F glycan level is in the range of 20 to 80% G0F relative to total glycan content. In some embodiments, the target G0F glycan level is in the range of 25 to 65% G0F relative to total glycan content.
В некоторых вариантах осуществления предложенные способы относятся к изготовлению и/или получению устекинумаба, имеющего целевой уровень гликана G0F в диапазоне от 20 до 40% G0F относительно общего содержания гликана. В некоторых вариантах осуществления способ получения устекинумаба, имеющего целевой уровень гликана G0F в диапазоне от 20 до 40% G0F относительно общего содержания гликана, включает в себя выбранный уровень галактозы при 0 мМ и времени культивирования клеток в диапазоне от 7 до 15 дней.In some embodiments, the proposed methods relate to the manufacture and/or production of ustekinumab having a target G0F glycan level in the range of 20 to 40% G0F relative to total glycan content. In some embodiments, a method for producing ustekinumab having a target G0F glycan level ranging from 20 to 40% G0F relative to total glycan content includes a selected galactose level at 0 mM and a cell culture time ranging from 7 to 15 days.
В некоторых вариантах осуществления предложенные способы относятся к изготовлению и/или получению устекинумаба, имеющего целевой уровень гликана G0F в диапазоне от 40 до 80% G0F относительно общего содержания гликана. В некоторых вариантах осуществления способ получения устекинумаба, имеющего целевой уровень гликана G0F в диапазоне от 40 до 80% G0F относительно общего соIn some embodiments, the proposed methods relate to the manufacture and/or production of ustekinumab having a target G0F glycan level in the range of 40 to 80% G0F relative to total glycan content. In some embodiments, a method of producing ustekinumab having a target G0F glycan level in the range of 40 to 80% G0F relative to total
- 7 046459 держания гликана, включает в себя выбранный уровень галактозы при концентрации в диапазоне от 15 до 30 мМ и времени культивирования клеток в диапазоне от 16 до 60 дней. В некоторых определенных вариантах осуществления время культивирования клеток находится в диапазоне от 25 до 42 дней.- 7 046459 glycan retention, includes a selected level of galactose at a concentration ranging from 15 to 30 mM and cell culture time ranging from 16 to 60 days. In some certain embodiments, the cell culture time ranges from 25 to 42 days.
В некоторых вариантах осуществления предложенные способы дополнительно включают в себя выбор целевого уровня гликана G0F. В некоторых вариантах осуществления целевой уровень гликана G0F находится в диапазоне от 20 до 80% G0F относительно общего содержания гликана. В некоторых определенных вариантах осуществления целевой уровень гликана G0F находится в диапазоне от 20 до 40% G0F относительно общего содержания гликана, при этом способ включает в себя выбранный уровень галактозы при концентрации 0 мМ и времени культивирования клеток в диапазоне от 7 до 15 дней. В некоторых определенных вариантах осуществления целевой уровень гликана G0F находится в диапазоне от 40 до 80% G0F относительно общего содержания гликана, при этом способ включает в себя выбранный уровень галактозы при концентрации в диапазоне от 15 до 30 мМ и времени культивирования клеток в диапазоне от 16 до 60 дней.In some embodiments, the proposed methods further include selecting a target level of the G0F glycan. In some embodiments, the target G0F glycan level is in the range of 20 to 80% G0F relative to total glycan content. In certain embodiments, the target G0F glycan level is in the range of 20 to 40% G0F relative to total glycan content, wherein the method includes a selected level of galactose at a concentration of 0 mM and a cell culture time ranging from 7 to 15 days. In certain embodiments, the target G0F glycan level is in the range of 40 to 80% G0F relative to total glycan content, wherein the method includes a selected level of galactose at a concentration ranging from 15 to 30 mM and cell culture time ranging from 16 to 30 mM. 60 days.
В некоторых вариантах осуществления предложенные способы дополнительно включают в себя измерение уровня гликана G0F. В некоторых вариантах осуществления, если измеренный уровень гликана G0F находится в диапазоне от 20 до 80% G0F относительно общего содержания гликана (например, в диапазоне от 20 до 40% G0F относительно общего содержания гликана, например в диапазоне от 40 до 80% G0F относительно общего содержания гликана), то проводится стадия очистки, концентрирования и/или определения состава препарата устекинумаба.In some embodiments, the proposed methods further include measuring the level of the G0F glycan. In some embodiments, if the measured G0F glycan level is in the range of 20 to 80% G0F relative to total glycan content (e.g., in the range of 20 to 40% G0F relative to total glycan content, e.g., in the range of 40 to 80% G0F relative to total glycan content), then the stage of purification, concentration and/or determination of the composition of the ustekinumab drug is carried out.
В некоторых вариантах осуществления предложены способы изготовления и/или получения устекинумаба, имеющего целевой уровень гликана, в том числе целевой уровень сиалилированного гликана и/или гликана G2F. В табл. 1 ниже предложены условия для устекинумаба с целевыми уровнями сиалилированного гликана и/или гликана G2F.In some embodiments, methods are provided for the manufacture and/or production of ustekinumab having a target level of glycan, including a target level of sialylated glycan and/or G2F glycan. In table 1 below proposes conditions for ustekinumab with target levels of sialylated glycan and/or G2F glycan.
Таблица 1Table 1
Примеры условий получения препаратов устекинумаба с целевыми уровнями G2F и сиалилированных гликановExamples of conditions for obtaining ustekinumab drugs with target levels of G2F and sialylated glycans
В некоторых вариантах осуществления предложенные способы относятся к изготовлению и/или получению устекинумаба, имеющего целевой уровень сиалилированного гликана в диапазоне от 15 до 30% сиалилированного гликана относительно общего содержания гликана. В некоторых вариантах осуществления способ получения устекинумаба, имеющего целевой уровень сиалилированного гликана в диапазоне от 15 до 30% сиалилированного гликана относительно общего содержания гликана, включает в себя выбранный уровень галактозы при концентрации 0 мМ и времени культивирования клеток в диапазоне от 7 до 15 дней.In some embodiments, the proposed methods relate to the manufacture and/or production of ustekinumab having a target level of sialylated glycan in the range of 15 to 30% sialylated glycan relative to total glycan content. In some embodiments, a method for producing ustekinumab having a target level of sialylated glycan in the range of 15 to 30% sialylated glycan relative to total glycan content includes a selected level of galactose at a concentration of 0 mM and a cell culture time ranging from 7 to 15 days.
В некоторых вариантах осуществления предложенные способы относятся к изготовлению и/или получению устекинумаба, имеющего целевой уровень сиалилированного гликана в диапазоне от 5 до 15% сиалилированного гликана относительно общего содержания гликана. В некоторых вариантах осуществления способ получения устекинумаба, имеющего целевой уровень гликана G0F в диапазоне от 5 до 15% сиалилированного гликана относительно общего содержания гликана, включает в себя выбранный уровень галактозы при концентрации в диапазоне от 15 до 30 мМ и времени культивирования клеток в диапазоне от 16 до 60 дней. В некоторых определенных вариантах осуществления время культивирования клеток находится в диапазоне от 25 до 42 дней.In some embodiments, the proposed methods relate to the manufacture and/or production of ustekinumab having a target level of sialylated glycan in the range of 5 to 15% sialylated glycan relative to total glycan content. In some embodiments, a method for producing ustekinumab having a target G0F glycan level ranging from 5 to 15% sialylated glycan relative to total glycan content includes a selected level of galactose at a concentration ranging from 15 to 30 mM and cell culture time ranging from 16 up to 60 days. In some certain embodiments, the cell culture time ranges from 25 to 42 days.
В некоторых вариантах осуществления предложенные способы относятся к изготовлению и/или получению устекинумаба, имеющего целевой уровень гликана G2F в диапазоне от 5 до 10% G2F относительно общего содержания гликана. В некоторых вариантах осуществления способ получения устекинумаба, имеющего целевой уровень гликана G2F в диапазоне от 5 до 10% G2F относительно общего содержания гликана, включает в себя выбранный уровень галактозы при концентрации 0 мМ и времени культивирования клеток в диапазоне от 7 до 15 дней.In some embodiments, the proposed methods relate to the manufacture and/or production of ustekinumab having a target G2F glycan level in the range of 5 to 10% G2F relative to total glycan content. In some embodiments, a method for producing ustekinumab having a target G2F glycan level in the range of 5 to 10% G2F relative to total glycan content includes a selected level of galactose at a concentration of 0 mM and a cell culture time ranging from 7 to 15 days.
В некоторых вариантах осуществления предложенные способы относятся к изготовлению и/или получению устекинумаба, имеющего целевой уровень гликана G2F в диапазоне от 1 до 5% G0F относительно общего содержания гликана. В некоторых вариантах осуществления способ получения устекинумаба, имеющего целевой уровень гликана G2F в диапазоне от 1 до 5% G2F относительно общего содержания гликана, включает в себя выбранный уровень галактозы при концентрации в диапазоне от 15 до 30 мМ и времени культивирования клеток в диапазоне от 16 до 60 дней. В некоторых определенных вариантах осуществления время культивирования клеток находится в диапазоне от 25 до 42 дней.In some embodiments, the proposed methods relate to the manufacture and/or production of ustekinumab having a target G2F glycan level in the range of 1 to 5% G0F relative to total glycan content. In some embodiments, a method for producing ustekinumab having a target G2F glycan level in the range of 1 to 5% G2F relative to total glycan content includes a selected level of galactose at a concentration ranging from 15 to 30 mM and a cell culture time ranging from 16 to 30 mM. 60 days. In some certain embodiments, the cell culture time ranges from 25 to 42 days.
В некоторых вариантах осуществления в предложенных способах осуществляется контроль за выIn some embodiments, the proposed methods control you
- 8 046459 бранным уровнем галактозы на протяжении всей стадии культивирования (например, контроль в процессе культивирования с t=0 до сбора).- 8 046459 controlled level of galactose throughout the entire cultivation stage (for example, control during the cultivation process from t=0 to collection).
В некоторых вариантах осуществления предложенные способы включают в себя культивирование популяции клеток млекопитающих, полученных методами генной инженерии, для экспрессии устекинумаба. В некоторых вариантах осуществления клетки млекопитающих выбраны из клеток СНО, клеток HEK 293, клеток фибросаркомы НТ 1080, клеток PER.C6, клеток САР, клеток HKB-11, клеток HuH-7, клеток NS0 и клеток SP 2/0.In some embodiments, the proposed methods include culturing a population of genetically engineered mammalian cells to express ustekinumab. In some embodiments, the mammalian cells are selected from CHO cells, HEK 293 cells, HT 1080 fibrosarcoma cells, PER.C6 cells, CAP cells, HKB-11 cells, HuH-7 cells, NS0 cells, and SP 2/0 cells.
В некоторых вариантах осуществления в предложенных способах стадию культивирования выполняют с использованием непрерывного процесса культивирования. В некоторых вариантах осуществления предложенные способы включают в себя культивирование, которое выполняется с использованием процесса перфузионного культивирования (например, процесса перфузионного культивирования с использованием системы фильтрации с переменным тангенциальным потоком (ATF)). В некоторых определенных вариантах осуществления предложенные способы включают в себя культивирование клеток млекопитающих, полученных методами генной инженерии, для экспрессии устекинумаба (например, клетки SP 2/0, которые экспрессируют устекинумаб) с использованием процесса перфузионного культивирования.In some embodiments, in the proposed methods, the cultivation step is performed using a continuous cultivation process. In some embodiments, the proposed methods include culturing that is performed using a perfusion culturing process (eg, a perfusion culturing process using an alternating tangential flow filtration (ATF) system). In some certain embodiments, the proposed methods include culturing genetically engineered mammalian cells to express ustekinumab (eg, SP 2/0 cells that express ustekinumab) using a perfusion culture process.
В некоторых вариантах осуществления предложены способы, включающие в себя сбор устекинумаба, экспрессированного клетками, дважды или более раз в пределах диапазона времени, соответствующего времени культивирования клеток.In some embodiments, methods are provided that include collecting ustekinumab expressed by the cells twice or more times within a time range corresponding to the time of culturing the cells.
В некоторых вариантах осуществления целевое значение представляет собой предварительно заданную спецификацию фармацевтического продукта или критерий контроля качества для фармацевтического препарата, например сертификат анализа (CofA), сертификат испытаний (CofT) или сводный протокол сопровождения партии. В некоторых вариантах осуществления спецификация продукта представляет собой описание продукта на листке-вкладыше Управления по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными средствами США, листке-вкладыше для врача, в статье Фармакопеи США или статье Европейской фармакопеи.In some embodiments, the target value is a predetermined pharmaceutical product specification or quality control criterion for the pharmaceutical product, such as a certificate of analysis (CofA), certificate of test (CofT), or summary batch protocol. In some embodiments, the product specification is a description of the product on a US Food and Drug Administration package insert, prescriber package insert, USP monograph, or European Pharmacopoeia monograph.
По существу способы культивирования клеток настоящего изобретения включают в себя культивирование при температуре в диапазоне от 25 до 40°С и при силе тяжести, действующей на поверхности земли. В некоторых вариантах осуществления предложенные способы культивирования популяции клеток достаточны для экспрессии продукта устекинумаба. Среда для культивирования клеток по существу содержит соответствующий источник энергии и соединения, регулирующие клеточный цикл. По существу культуральная среда включает в себя, например, аминокислоты, витамины, неорганические соли и глюкозу, известные специалистам в данной области. В некоторых вариантах осуществления рН клеточной культуральной среды составляет от 6 до 8. Среды для культивирования животных клеток хорошо известны в данной области и постоянно оптимизируются специалистами в данной области для конкретной цели и/или типа клеток.Essentially, the cell culturing methods of the present invention involve culturing at a temperature in the range of 25 to 40° C. and under gravity acting on the surface of the earth. In some embodiments, the proposed methods for culturing a population of cells are sufficient to express the ustekinumab product. The cell culture medium essentially contains an appropriate energy source and cell cycle regulating compounds. As such, the culture medium includes, for example, amino acids, vitamins, inorganic salts and glucose known to those skilled in the art. In some embodiments, the pH of the cell culture medium is between 6 and 8. Animal cell culture media are well known in the art and are continually optimized by those skilled in the art for a particular purpose and/or cell type.
В некоторых вариантах осуществления способы настоящего изобретения включают в себя культивирование популяции клеток посредством системы непрерывного культивирования клеток (например, системы перфузионного культивирования клеток). В некоторых вариантах осуществления система непрерывного культивирования клеток включает в себя резервуар биореактора и устройство для удержания клеток. В некоторых вариантах осуществления система непрерывного культивирования клеток включает в себя резервуар биореактора, устройство для удержания клеток, источник среды и сток для сбора отходов. В некоторых вариантах осуществления система непрерывного культивирования клеток включает в себя популяцию клеток (например, популяцию клеток, сконструированную для экспрессии устекинумаба, например, популяцию клеток, состоящую из клеток, сконструированных для экспрессии устекинумаба) и клеточные культуральные среды.In some embodiments, the methods of the present invention include culturing a population of cells through a continuous cell culture system (eg, a perfusion cell culture system). In some embodiments, the continuous cell culture system includes a bioreactor reservoir and a cell retention device. In some embodiments, a continuous cell culture system includes a bioreactor reservoir, a cell retention device, a media source, and a waste collection outlet. In some embodiments, the continuous cell culture system includes a population of cells (e.g., a population of cells engineered to express ustekinumab, e.g., a population of cells consisting of cells engineered to express ustekinumab) and cell culture media.
В некоторых вариантах осуществления устройство для удержания клеток представляет собой или включает в себя непрерывную центрифугу, фильтр переменного тангенциального потока (ATF), мембранный фильтр тангенциального потока (TFF), динамический фильтр, центробежный фильтр, ультразвуковой и диэлектрофоретический сепаратор или гравитационный отстойник. В некоторых конкретных вариантах осуществления устройство удержания клеток представляет собой или включает в себя ATF.In some embodiments, the cell retention device is or includes a continuous centrifuge, an alternating tangential flow filter (ATF), a tangential flow filter (TFF) membrane, a dynamic filter, a centrifugal filter, an ultrasonic and dielectrophoretic separator, or a gravity settler. In some specific embodiments, the cell retention device is or includes ATF.
В некоторых вариантах осуществления система биореактора включает в себя резервуар биореактора с мешалкой, устройство для удержания клеток, источник среды и сток для сбора отходов.In some embodiments, the bioreactor system includes a bioreactor tank with an agitator, a cell retention device, a media source, and a waste collection outlet.
В некоторых вариантах осуществления система биореактора (например, система перфузионного биореактора) включает в себя барботер. В некоторых вариантах осуществления система биореактора включает в себя барботер с просверленными отверстиями. В некоторых вариантах осуществления система биореактора включает в себя барботер с открытой трубкой. В некоторых вариантах осуществления система биореактора включает в себя шоттовский барботер.In some embodiments, the bioreactor system (eg, a perfusion bioreactor system) includes a bubbler. In some embodiments, the bioreactor system includes a bubbler with drilled holes. In some embodiments, the bioreactor system includes an open tube bubbler. In some embodiments, the bioreactor system includes a Schott bubbler.
В некоторых вариантах осуществления способы настоящего изобретения включают в себя культивирование популяции клеток (например, популяции клеток, сконструированных для экспрессии устекинумаба, например, популяции клеток, состоящей из клеток, сконструированных для экспрессии устекинумаба) в объеме в диапазоне от 1 до 3000 л. В некоторых вариантах осуществления предложенные способы включают в себя культивирование клеток млекопитающих, полученных методами генной инженеIn some embodiments, the methods of the present invention include culturing a population of cells (e.g., a population of cells engineered to express ustekinumab, e.g., a population of cells consisting of cells engineered to express ustekinumab) in a volume ranging from 1 to 3000 L. In some embodiments, the proposed methods include culturing genetically engineered mammalian cells
- 9 046459 рии для экспрессии устекинумаба в объеме по меньшей мере 25, 50, 100, 200, 250, 400, 500, 600, 800, 1000 или 2000 л. В некоторых вариантах осуществления предложенные способы включают в себя культивирование клеток млекопитающих, полученных методами генной инженерии для экспрессии устекинумаба в объеме от приблизительно 25 л до приблизительно 250 л.- 9 046459 riya for the expression of ustekinumab in a volume of at least 25, 50, 100, 200, 250, 400, 500, 600, 800, 1000 or 2000 l. In some embodiments, the proposed methods include culturing mammalian cells genetically engineered to express ustekinumab in a volume of from about 25 L to about 250 L.
Оценка гликанов.Glycan assessment.
В некоторых вариантах осуществления гликаны устекинумаба анализируют (например, измеряют) любым доступным подходящим способом. В некоторых случаях структуру и композицию гликанов, описанных в настоящем изобретении, анализируют, например, с помощью одного или более из ферментных, хроматографических, масс-спектрометрических (МС), хроматографических с последующей МС, электрофоретических методов, электрофоретических методов с последующей МС, методов ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и их комбинаций. Примеры ферментативных способов включают в себя взаимодействие препарата устекинумаба с одним или более ферментами в условиях и в течение времени, достаточных для высвобождения одного или более гликана(ов) (например, одного или более доступного (-ых) гликана(ов)). В некоторых случаях один или более ферментов включают в себя PNGазу F. Примеры хроматографических способов включают в себя, без ограничений, активную анионообменную хроматографию с импульсным амперометрическим датчиком (SAX-PAD), жидкостную хроматографию (ЖХ), высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), сверхэффективную жидкостную хроматографию (СВЭЖХ), тонкослойную хроматографию (ТСХ), колоночную амидную хроматографию и их комбинации. Примеры масс-спектрометрии (МС) включают в себя, без ограничений, тандемную МС, ЖХ-МС, ЖХ-МС/МС, масс-спектрометрию с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-MS), масс-спектрометрию с преобразованием Фурье (FTMS), разделение по ионной подвижности с масс-спектрометрией (IMS-MS), диссоциацию с переносом электронов (ETD-MS) и их комбинации. Примеры электрофоретических способов включают в себя, без ограничений, капиллярный электрофорез (КЭ), КЭ-МС, гель-электрофорез, электрофорез в агарозном геле, электрофорез в акриламидном геле, электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ) с последующим вестерн-блоттингом с использованием антител, которые распознают конкретные структуры гликанов, и их комбинации. Примеры ядерного магнитного резонанса (ЯМР) включают в себя, без ограничений, одномерный ЯМР (Id-ЯМР), двухмерный ЯМР (2D-ЯМР), ЯМР с вращением образца под магическим углом с корреляционной спектроскопией (COSY-NMR), ЯМР с полной корреляционной спектроскопией (TOCSY-NMR), ЯМР с гетероядерной одноквантовой когерентностью (HSQC-NMR), ЯМР с гетероядерной многоквантовой когерентностью (HMQC-NMR), ротационный ЯМР со спектроскопией ядерного эффекта Оверхаузера (ROESY-NMR), спектроскопию ядерного эффекта Оверхаузера (NOESYNMR) и их комбинации.In some embodiments, ustekinumab glycans are analyzed (eg, measured) by any suitable method available. In some cases, the structure and composition of the glycans described in the present invention are analyzed, for example, using one or more of enzymatic, chromatographic, mass spectrometric (MS), chromatographic followed by MS, electrophoretic methods, electrophoretic methods followed by MS, nuclear methods magnetic resonance (NMR) and their combinations. Examples of enzymatic methods include reacting the drug ustekinumab with one or more enzymes under conditions and for a time sufficient to release one or more glycan(s) (eg, one or more accessible glycan(s)). In some cases, one or more enzymes include PNGase F. Examples of chromatographic methods include, but are not limited to, active anion exchange chromatography with a pulsed amperometric sensor (SAX-PAD), liquid chromatography (LC), high performance liquid chromatography (HPLC), ultra-performance liquid chromatography (HPLC), liquid chromatography (UHPLC), thin layer chromatography (TLC), amide column chromatography and combinations thereof. Examples of mass spectrometry (MS) include, but are not limited to, tandem MS, LC-MS, LC-MS/MS, matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-MS), Fourier transform mass spectrometry (FTMS), ion mobility separation with mass spectrometry (IMS-MS), electron transfer dissociation (ETD-MS) and combinations thereof. Examples of electrophoretic methods include, but are not limited to, capillary electrophoresis (CE), CE-MS, gel electrophoresis, agarose gel electrophoresis, acrylamide gel electrophoresis, sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) followed by Western blot analysis using antibodies that recognize specific glycan structures and their combinations. Examples of nuclear magnetic resonance (NMR) include, but are not limited to, one-dimensional NMR (Id-NMR), two-dimensional NMR (2D-NMR), spinning magic angle NMR with correlation spectroscopy (COSY-NMR), total correlation NMR spectroscopy (TOCSY-NMR), heteronuclear single quantum coherence NMR (HSQC-NMR), heteronuclear multiquantum coherence NMR (HMQC-NMR), rotational NMR with nuclear Overhauser effect spectroscopy (ROESY-NMR), nuclear Overhauser effect spectroscopy (NOESYNMR) and their combinations.
Клетки.Cells.
В способах, описанных в настоящем изобретении, может использоваться любая клетка-хозяин, которая может использоваться для экспрессии устекинумаба. В некоторых вариантах осуществления клетка, сконструированная для экспрессии устекинумаба, содержит одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих продукт устекинумаба, который включает в себя вариабельный домен тяжелой цепи, как указано в SEQ ID NO: 1, и/или вариабельный домен легкой цепи, как указано в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления клетка, сконструированная для экспрессии устекинумаба, содержит одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих продукт устекинумаба, который включает в себя тяжелую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 1, и/или легкую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления клетка, сконструированная для экспрессии устекинумаба, содержит одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих продукт устекинумаба, который включает в себя последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3, как указано в SEQ ID NO: 1, и последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3, как указано в SEQ ID NO: 2.The methods described in the present invention can use any host cell that can be used to express ustekinumab. In some embodiments, a cell engineered to express ustekinumab contains one or more nucleic acids encoding a ustekinumab product that includes a heavy chain variable domain as set forth in SEQ ID NO: 1 and/or a light chain variable domain as set forth in SEQ ID NO: 2. In some embodiments, a cell engineered to express ustekinumab contains one or more nucleic acids encoding an ustekinumab product that includes a heavy chain containing the sequence of SEQ ID NO: 1, and/or a light chain, comprising the sequence SEQ ID NO: 2. In some embodiments, a cell engineered to express ustekinumab contains one or more nucleic acids encoding an ustekinumab product that includes the sequences HCDR1, HCDR2, and HCDR3 as set forth in SEQ ID NO: 1, and the sequences LCDR1, LCDR2 and LCDR3 as indicated in SEQ ID NO: 2.
В некоторых вариантах осуществления клетка, сконструированная для экспрессии устекинумаба, содержит одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих продукт устекинумаба, который имеет ту же первичную аминокислотную последовательность, что и одобренный белок, например, в рамках процедуры вторичного одобрения, терапевтического или диагностического использования у людей или животных. В некоторых вариантах осуществления клетка, сконструированная для экспрессии устекинумаба, содержит одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих продукт устекинумаба, который отличается не более чем на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 или 20 остатков от одобренного терапевтического или диагностического белка. В некоторых вариантах осуществления клетка, сконструированная для экспрессии устекинумаба, содержит одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих белок, который имеет по меньшей мере 90, 95, 98, 99 или 100%-ную идентичность последовательности с одобренным терапевтическим или диагностическим белком. Термины та же первичная аминокислотная последовательность, первичная аминокислотная последовательность, которая отличается не более чем на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 или 20 остатков, последовательности, которые имеют по меньшей мере 98%-ную или более идентичность последовательности или аналогичные термины относятся к уровню идентичности между первичными аминокислотными последовательностями. В некоторых вариантах осуществления препарат или продукт белка содержит аминокислотные варианты, например молекулы, которые отличаются конIn some embodiments, a cell engineered to express ustekinumab contains one or more nucleic acids encoding a ustekinumab product that has the same primary amino acid sequence as the approved protein, for example, as part of a secondary approval process for therapeutic or diagnostic use in humans, or animals. In some embodiments, a cell engineered to express ustekinumab contains one or more nucleic acids encoding a ustekinumab product that differs by no more than 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, or 20 residues from an approved therapeutic or diagnostic protein. In some embodiments, a cell engineered to express ustekinumab contains one or more nucleic acids encoding a protein that has at least 90%, 95%, 98%, 99%, or 100% sequence identity with an approved therapeutic or diagnostic protein. Terms same primary amino acid sequence, primary amino acid sequence that differs by no more than 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 or 20 residues, sequences that have at least 98 % or greater sequence identity or similar terms refer to the level of identity between primary amino acid sequences. In some embodiments, the drug or protein product contains amino acid variants, such as molecules that differ in
- 10 046459 цевыми остатками, например одним или двумя концевыми остатками. В некоторых вариантах осуществления таких случаев идентичность сопоставляемой последовательности представляет собой идентичность между первичной аминокислотной последовательностью наиболее распространенных (например, наиболее распространенных активных) молекул в каждом из сравниваемых продуктов. В некоторых вариантах осуществления идентичность последовательности относится к аминокислотной последовательности, кодируемой нуклеиновой кислотой, которая может использоваться для получения продукта устекинумаба.- 10 046459 end residues, for example one or two end residues. In some embodiments of such cases, the sequence identity being compared is the identity between the primary amino acid sequence of the most abundant (eg, most abundant active) molecules in each of the products being compared. In some embodiments, the sequence identity refers to the amino acid sequence encoded by the nucleic acid that can be used to produce the ustekinumab product.
В некоторых вариантах осуществления клетки, сконструированные для экспрессии устекинумаба, представляют собой клетки млекопитающих.In some embodiments, the cells engineered to express ustekinumab are mammalian cells.
В некоторых вариантах осуществления клетки, сконструированные для экспрессии устекинумаба, представляют собой мышиные клетки. В некоторых вариантах осуществления клетка, сконструированная для экспрессии устекинумаба, получена из мышиной клеточной линии. К мышиным (например, полученным от мыши) клеточным линиям относятся, например клеточные линии мышиной миеломы, например, клетки NS0 и клетки SP 2/0.In some embodiments, the cells engineered to express ustekinumab are murine cells. In some embodiments, the cell engineered to express ustekinumab is derived from a murine cell line. Murine (eg, mouse-derived) cell lines include, for example, murine myeloma cell lines, such as NS0 cells and SP 2/0 cells.
В некоторых вариантах осуществления клетки, сконструированные для экспрессии устекинумаба, представляют собой человеческие клетки. В некоторых вариантах осуществления клетка, сконструированная для экспрессии устекинумаба, получена из человеческой клеточной линии. К человеческим клеточным линиям относятся, например, HEK 293: эмбриональные клетки почки человека 293; НТ-1080: из фибросаркомы с эпителиальным фенотипом; PER.C6: из эмбриональных клеток сетчатки человека, иммортализованных трансфекцией гена аденовируса E1; CAP: из амниоцитов человека, иммортализованных геном аденовируса типа 5 Е1; HKB-11: полученные слиянием HEK293-S и линии В-клеток человека в присутствии полиэтиленгликоля; и HuH-7: из гепатоцеллюлярной карциномы человека. В некоторых определенных вариантах осуществления чувствительные к сдвиговому воздействию клетки млекопитающих выбраны из клеток HEK 293, клеток фибросаркомы НТ 1080, клеток PER.C6, клеток САР, клеток HKB-11 и клеток HuH-7.In some embodiments, the cells engineered to express ustekinumab are human cells. In some embodiments, the cell engineered to express ustekinumab is derived from a human cell line. Human cell lines include, for example, HEK 293: human embryonic kidney cells 293; NT-1080: from fibrosarcoma with an epithelial phenotype; PER.C6: from human embryonic retinal cells immortalized by transfection of the adenovirus E1 gene; CAP: from human amniocytes immortalized by the gene of adenovirus type 5 E1; HKB-11: produced by fusing HEK293-S and a human B cell line in the presence of polyethylene glycol; and HuH-7: from human hepatocellular carcinoma. In certain embodiments, the mammalian shear-sensitive cells are selected from HEK 293 cells, HT 1080 fibrosarcoma cells, PER.C6 cells, CAP cells, HKB-11 cells, and HuH-7 cells.
В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток, экспрессирующих продукт устекинумаба, как описано в настоящем изобретении, получают с использованием рекомбинантных способов. Рекомбинантная экспрессия гена, такого как ген, кодирующий полипептид, например одиночное антитело, описанный в настоящем изобретении, может включать в себя конструирование экспрессионного вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий полипептид. После получения полинуклеотида вектор продукции полипептида может быть получен с помощью технологии рекомбинантной ДНК с использованием известных в данной области методик. Для конструирования экспрессионных векторов, содержащих последовательности, кодирующие полипептид, и соответствующих сигналов контроля транскрипции и трансляции могут использоваться известные способы. К таким способам относятся, например, методики рекомбинантной ДНК in vitro, синтетические методики и генетическая рекомбинация in vivo.In some embodiments, a population of cells expressing a ustekinumab product, as described in the present invention, is obtained using recombinant methods. Recombinant expression of a gene, such as a gene encoding a polypeptide, such as a single antibody described in the present invention, may involve constructing an expression vector containing a polynucleotide encoding the polypeptide. Once the polynucleotide is obtained, the polypeptide production vector can be produced by recombinant DNA technology using techniques known in the art. Known methods can be used to construct expression vectors containing polypeptide coding sequences and associated transcriptional and translational control signals. Such methods include, for example, in vitro recombinant DNA techniques, synthetic techniques and in vivo genetic recombination.
После получения описанного в настоящем изобретении продукта устекинумаба с помощью рекомбинантной экспрессии его можно очищать любым способом, известным специалистам в данной области, например, с помощью хроматографии (например, ионообменной, аффинной и колоночной хроматографии с распределением по размерам), центрифугирования, дифференциальной растворимости или с помощью любой другой стандартной методики очистки белков. Например, устекинумаб можно выделять и очищать посредством соответствующего отбора и комбинации аффинных колонок, например, колонки с белком А, с хроматографическими колонками, фильтрацией, ультрафильтрацией, с помощью процедур высаливания и диализа (см. Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Дополнительно, как описано в настоящем изобретении, чтобы упростить очистку, продукт устекинумаба может быть слит с гетерологичными полипептидными последовательностями.Once the ustekinumab product described herein is produced by recombinant expression, it can be purified by any method known to those skilled in the art, for example, by chromatography (e.g., ion exchange, affinity, and size distribution column chromatography), centrifugation, differential solubility, or using any other standard protein purification technique. For example, ustekinumab can be isolated and purified through appropriate selection and combination of affinity columns, e.g., protein A columns, chromatography columns, filtration, ultrafiltration, salting out procedures, and dialysis (see Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow, David Lane , Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Additionally, as described in the present invention, to facilitate purification, the ustekinumab product can be fused to heterologous polypeptide sequences.
Фармацевтические композиции.Pharmaceutical compositions.
Продукт устекинумаба, полученный или изготовленный с использованием любых из способов, систем и/или процессов, описанных в настоящем изобретении, может быть включен в состав фармацевтической композиции. Такую фармацевтическую композицию можно использовать для профилактики и/или лечения заболеваний. Фармацевтические композиции, содержащие устекинумаб, могут быть составлены способами, известными специалистам в данной области (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2000). Фармацевтическую композицию можно вводить парентерально в форме состава для инъекций, содержащего стерильный раствор или суспензию в воде или другую фармацевтически приемлемую жидкость. Например, фармацевтическую композицию можно составить, соответствующим образом комбинируя клеточный продукт (например, рекомбинантный белок, например, гликопротеин, например, отдельное антитело) с фармацевтически приемлемыми носителями или средами, такими как стерильная вода и физиологический солевой раствор, растительное масло, эмульгатор, суспендирующий агент, поверхностно-активное вещество, стабилизатор, ароматизирующий эксципиент, разбавитель, носитель, консервант, связующее вещество, с последующим смешиванием в форме однократной дозы, необходимой для общепринятой фармацевтической практики. Количество активного ингредиента, включенного в фармацевтический препарат, является таким, чтобы обеспечить подходящую дозу в указанном диапазоне.The ustekinumab product obtained or manufactured using any of the methods, systems and/or processes described in the present invention can be included in a pharmaceutical composition. Such a pharmaceutical composition can be used for the prevention and/or treatment of diseases. Pharmaceutical compositions containing ustekinumab can be formulated by methods known to those skilled in the art (see, for example, Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2000). The pharmaceutical composition can be administered parenterally in the form of an injection composition containing a sterile solution or suspension in water or other pharmaceutically acceptable liquid. For example, a pharmaceutical composition can be formulated by appropriately combining a cellular product (e.g., a recombinant protein, e.g., a glycoprotein, e.g., a single antibody) with pharmaceutically acceptable carriers or media, such as sterile water and physiological saline, vegetable oil, emulsifier, suspending agent , surfactant, stabilizer, flavoring excipient, diluent, carrier, preservative, binder, followed by mixing in a single dose form required for standard pharmaceutical practice. The amount of active ingredient included in the pharmaceutical preparation is such as to provide a suitable dose within the specified range.
- 11 046459- 11 046459
В некоторых вариантах осуществления препарат устекинумаба включает в себя сахарозу в качестве стабилизатора/регулятора тоничности. В некоторых вариантах осуществления препарат устекинумаба включает в себя гистидин (например, L-гистидин) в качестве буфера. В некоторых вариантах осуществления препарат устекинумаба включает в себя полисорбат-80 в качестве поверхностно-активного вещества. В некоторых определенных вариантах осуществления препарат устекинумаба включает в себя гистидин (например, L-гистидин), сахарозу и полисорбат-80.In some embodiments, the ustekinumab formulation includes sucrose as a stabilizer/tonicity regulator. In some embodiments, the ustekinumab formulation includes a histidine (eg, L-histidine) as a buffer. In some embodiments, the ustekinumab formulation includes polysorbate-80 as a surfactant. In some certain embodiments, the ustekinumab formulation includes histidine (eg, L-histidine), sucrose, and polysorbate-80.
В некоторых вариантах осуществления состав препарата устекинумаба предназначен для парентерального введения, например внутривенной инъекции, внутримышечной инъекции, внутрибрюшинной инъекции, подкожной инъекции. В некоторых вариантах осуществления состав препарат устекинумаба предназначен для подкожного введения.In some embodiments, the ustekinumab formulation is for parenteral administration, eg, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection. In some embodiments, the ustekinumab formulation is for subcutaneous administration.
Изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими примерами. Такие примеры приведены исключительно в целях иллюстрации. Их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем или содержание изобретения.The invention is further illustrated by the following examples. Such examples are provided for illustrative purposes only. They should not be construed as limiting in any way the scope or content of the invention.
ПримерыExamples
Пример 1. Определение сдвига в составе гликанов в продуктах устекинумаба.Example 1: Determination of glycan shifts in ustekinumab products.
В этом примере выявлен значительный сдвиг в составе гликанов в партиях доступных в продаже стандартных белков продуктов устекинумаба (RPP). В частности, в настоящем примере продемонстрировано, что изменения в составе гликанов среди партий доступного в продаже устекинумаба можно подразделить на два различных профиля гликанов. Эти две группы вариантов гликанов в настоящем изобретении называются группой 1, для которой характерен относительно высокий уровень гликана G0F, и группой 2, для которой характерен относительно низкий уровень гликана G0F.This example reveals a significant shift in glycan composition in batches of commercially available ustekinumab standard protein products (RPP). Specifically, the present example demonstrates that changes in glycan composition among batches of commercially available ustekinumab can be subdivided into two distinct glycan profiles. These two groups of glycan variants are referred to in the present invention as group 1, which is characterized by a relatively high level of the G0F glycan, and group 2, which is characterized by a relatively low level of the G0F glycan.
Анализировали 30 (тридцать) партий устекинумаба RPP. Из этих 30 партий 28 партий были из препаратов с концентрацией 90 мг/мл, а 2 партии были препаратами с концентрацией 5 мг/мл. Было установлено, что из 28 партий с 90 мг/мл устекинумаба RPP в 8 (восьми) из этих партий отмечался профиль гликанов группы 1, а в 20 (двадцати) партий отмечался профиль гликанов группы 2. См. фиг. 1.Thirty (30) lots of ustekinumab RPP were analyzed. Of these 30 lots, 28 lots were 90 mg/mL formulations and 2 lots were 5 mg/mL formulations. Of the 28 lots containing 90 mg/mL ustekinumab RPP, eight (8) of the lots were found to have a group 1 glycan profile, and twenty (20) of the lots had a group 2 glycan profile. See FIG. 1.
Сводная информация о среднем содержании основных соединений гликанов для образцов группы 1 и группы 2 приведена ниже в табл. 2.A summary of the average content of the main glycan compounds for samples of group 1 and group 2 is given below in table. 2.
Таблица 2table 2
Содержание основных гликанов в образцах устекинумаба группы 1 и группы 2Content of major glycans in group 1 and group 2 ustekinumab samples
Также анализировали исследуемые продукты устекинумаба, полученные культивированием (например, с помощью процесса перфузионного культивирования с ATF) с 5 мМ галактозы в течение 42 дней при разных объемах в диапазоне от 3 до 250 л. Содержание гликанов в этих исследовательских продуктах устекинумаба показана в крайней справа группе на каждой панели на фиг. 1. Профили гликанов в исследуемых продуктах устекинумаба находились в пределах диапазона для RPP группы 1 и группы 2. Таким образом, в настоящем примере идентифицированы две различные группы профилей гликанов для доступного в продаже устекинумаба RPP и показано, что в современных условиях культивирования получаются исследуемые продукты устекинумаба с промежуточными значениями содержания гликанов в пределах диапазонов, характерных для этих двух групп.Investigational ustekinumab products obtained by culturing (eg, using an ATF perfusion culture process) with 5 mM galactose for 42 days at different volumes ranging from 3 to 250 L were also analyzed. The glycan content of these ustekinumab investigational products is shown in the rightmost group in each panel in Fig. 1. The glycan profiles of the ustekinumab investigational products were within the range for group 1 and group 2 RPPs. In summary, the present example identifies two distinct groups of glycan profiles for the commercially available ustekinumab RPP and demonstrates that modern culture conditions produce ustekinumab investigational products with intermediate values of glycan content within the ranges characteristic of these two groups.
Пример 2. Время культивирования влияет на состав гликанов в устекинумабе.Example 2 Culture time affects the glycan composition of ustekinumab.
В настоящем примере продемонстрировано, что момент сбора является одним из элементов контроля состава гликанов в устекинумабе. Как показано на фиг. 2, содержание гликана G0F относительно общего содержания гликанов обычно снижается по мере увеличения времени культивирования. Например, препараты устекинумаба, собранные через 13 дней культивирования, содержали почти 50% гликанов G0F, тогда как образцы, собранные после 34 или более дней культивирования, содержали менее 30%The present example demonstrates that the timing of collection is one element of control of the glycan composition of ustekinumab. As shown in FIG. 2, the G0F glycan content relative to the total glycan content generally decreases as the culture time increases. For example, ustekinumab preparations collected after 13 days of culture contained almost 50% G0F glycans, whereas samples collected after 34 or more days of culture contained less than 30%.
--
Claims (1)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US62/786,821 | 2018-12-31 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA046459B1 true EA046459B1 (en) | 2024-03-15 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2732679T3 (en) | Cell culture procedures | |
| EP2975401B1 (en) | Improved method of mapping glycans of glycoproteins in serum samples | |
| RU2558367C2 (en) | Method of purifying polypeptide solutions | |
| US20220033487A1 (en) | Methods of Producing Ustekinumab | |
| EA008220B1 (en) | Composition containing erythropoitin-like molecules and method of their use | |
| KR20150138273A (en) | A method for increasing pyro-glutamic acid formation of a protein | |
| EA012162B1 (en) | Methods for refolding of recombinant antibodies | |
| KR20090005410A (en) | Anti-Aβ antibody | |
| US20220267413A1 (en) | Methods For The Treatment Of Neurodegeneration | |
| CN107531749A (en) | Ultrapureization DsbA and DsbC and its preparation and application | |
| Skeene et al. | One filter, one sample, and the N-and O-glyco (proteo) me: toward a system to study disorders of protein glycosylation | |
| EA046459B1 (en) | METHODS FOR OBTAINING USTEKINUMAB | |
| KR20210056372A (en) | Continuous cell culture method | |
| TWI654991B (en) | Composition comprising long-acting erythropoietin | |
| KR20210005689A (en) | Antibodies with a regulated glycan profile | |
| US20230357813A1 (en) | Hypersialylated immunoglobulin | |
| US11028184B2 (en) | Long-acting PCSK9-specific binding protein and application thereof | |
| De la Luz-Hernandez et al. | Cancer vaccine characterization: from bench to clinic | |
| JP6761536B2 (en) | Proprotein convertase Subtilisinkesin type 9 binding protein and its use | |
| EP4011390A1 (en) | Preparation comprising anti-pd-1/her2 bispecific antibody, and preparation method therefor and use thereof | |
| Zdebska et al. | Glycophorin A in two patients with congenital dyserythropoietic anemia type I and type II is partly unglycosylated. | |
| WO2018025270A1 (en) | Enriched modified vitamin d binding protein compositions and use thereof | |
| BR112021025769B1 (en) | METHODS FOR PRODUCING AFLIBERCEPT OBTAINED FROM A HOST CELL CULTIVATED IN A CHEMICALLY DEFINED MEDIUM (MQD) | |
| CN115078728A (en) | Rapid analysis method of fusion protein | |
| KR20180026688A (en) | Composition comprising long-acting Erythropoietin |