TW202235620A - 用於治療癌症的ａｍｕｃ＿１１００和免疫檢查點調節劑的組合療法 - Google Patents

Abstract

本揭露內容提供一種包含Amuc_1100（或表現所述Amuc_1100的經基因工程改造的宿主細胞）和免疫檢查點調節劑的組合物，和其用途。

Description

用於治療癌症的AMUC_1100和免疫檢查點調節劑的組合療法

本揭露內容大體上關於癌症治療和免疫性提高的領域。

免疫檢查點療法為癌症治療中的一種突破性療法。免疫檢查點包含維持自身耐受性和説明免疫反應的抑制路徑和刺激路徑。目前，存在若干經批准用於治療癌症患者的免疫檢查點抑制劑藥物，並且更多所述種類的治療劑正在開發中（Andrews, L.P.等人，《自然·免疫學（ Nat Immunol）》, 2019. 20 (11): 第1425-1434頁）。此外，正在研究刺激檢查點路徑（如OX40、ICOS、GITR、4-1BB、CD40）的激動劑或靶向腫瘤微環境組分（如IDO或TLR）的分子（Julian A. Marin-Acevedo等人，《血液學和腫瘤學雜誌（ Journal of Hematology & Oncology）》, 11, 39 (2018)）。然而，免疫檢查點調節劑藥物的功效在各種癌症類型當中不同。舉例來說，對抗PD-1抗體的反應率在一些癌症（黑色素瘤、高微衛星不穩定性（microsatellite instability，MSI）腫瘤）中在40%到70%範圍內，而反應率在大多數其它癌症中限於10%到25%，或甚至在其它癌症（三陰性乳癌、微衛星穩定（microsatellite stable，MSS）結腸直腸癌等）中限於＜10%（Schoenfeld, A.J.等人，《癌細胞（ Cancer Cell）》, 2020. 37 (4): 第443-455頁；Ciardiello, D.等人，《癌症治療綜述（ Cancer Treat Rev）》, 2019. 76: 第22-32頁；Adams, S.等人，《美國醫學會腫瘤學雜誌（ JAMA Oncol）》, 2019）。此外，疾病可以最終在最初對癌症免疫療法起反應的患者中發生進展。總的來說，僅小部分癌症患者群體可以長期受益於癌症免疫療法。儘管已有超過一千個臨床研究探索用於癌症中的經過批准或開發中的免疫檢查點調節劑的組合療法策略，但尚不存在證實高度有效的策略。確切地說，開發免疫檢查點抑制劑的高效和協同組合療法以實現癌症中的長期和持久反應是一個巨大難題（Xin Yu, J.等人，《自然評論藥物發現（ Nat Rev Drug Discov）》, 2020. 19 (3): 第163-164頁）。

近期的證據表明，腸道微生物群組合物，尤其某些細菌菌株可以預測或增加癌症免疫療法的功效。將嗜黏蛋白阿克曼氏菌（ Akkermansia muciniphila）接種到經抗生素處理的無特定病原體的小鼠中顯著增強了抗PD-1治療黑色素瘤的治療功效（Routy, B.等人，《科學（ Science）》, 2018. 359 (6371): 第91-97頁）。然而，不清楚是腸道微生物群組合物的哪一種或多種組分發揮增強抗PD-1治療功效的功能。

仍需要治療癌症的新穎療法。

在一個方面，本揭露內容提供一種治療或預防有需要的個體的癌症的方法，其包括：a）向個體施用有效量的能夠調節腸道免疫性的腸道免疫性調節劑；以及b）向個體施用有效量的免疫檢查點調節劑。

在另一方面，本揭露內容提供一種改善接受免疫檢查點調節劑的治療的個體中癌症的治療反應的方法，其包括向個體施用有效量的腸道免疫性調節劑，任選地與有效量的免疫檢查點調節劑一起施用。

在另一方面，本揭露內容提供一種在個體中誘導或改善腸道免疫性的方法，其包括向個體施用有效量的腸道免疫性調節劑以及有效量的免疫檢查點調節劑。

在另一方面，本揭露內容提供一種在接受抗癌治療並且表現出腸道免疫性降低的個體中改善癌症治療反應的方法，其包括向個體施用有效量的腸道免疫性調節劑。

在另一方面，本揭露內容提供一種治療或預防有需要的個體的癌症的方法，其包括向個體施用有效量的Amuc_1100或表現Amuc_1100的經基因工程改造的宿主細胞，以及有效量的免疫檢查點調節劑。

在另一方面，本揭露內容提供一種改善接受免疫檢查點調節劑的治療的個體中癌症的治療反應的方法，其包括向個體施用有效量的Amuc_1100或表現Amuc_1100的經基因工程改造的宿主細胞，任選地與有效量的免疫檢查點調節劑一起施用。

在另一方面，本揭露內容提供一種在個體中誘導或改善腸道免疫性的方法，其包括向個體施用有效量的Amuc_1100或表現Amuc_1100的經基因工程改造的宿主細胞以及有效量的免疫檢查點調節劑。

在另一方面，本揭露內容提供一種在接受抗癌治療並且表現出腸道免疫性降低的個體中改善癌症治療反應的方法，其包括向個體施用有效量的Amuc_1100或表現Amuc_1100的經基因工程改造的宿主細胞。

在某些實施方案中，所述Amuc_1100為天然存在的Amuc_1100或其功能等效物。在某些實施方案中，所述功能等效物保持至少部分調節腸道免疫性和/或活化toll樣受體2（TLR2）的活性。在某些實施方案中，所述功能等效物包含所述天然存在的Amuc_1100的突變體、片段、融合物、衍生物、提高其穩定性的等效物或其任何組合。在某些實施方案中，所述Amuc_1100包含選自由SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3組成的群組的胺基酸序列，或具有與前述胺基酸序列的至少80%序列一致性且仍保持調節腸道免疫性和/或活化toll樣受體2（TLR2）的實質活性的胺基酸序列。

在某些實施方案中，所述Amuc_1100在選自由以下組成的群組的位置處包含一個或多個突變：R36、S37、L39、D40、K41、K42、I43、K48、E49、K51、S52、R62、S63、K70、E71、L72、N73、R74、Y75、A76、K77、A78、Y86、K87、P88、F89、L90、A91、F103、Q104、K108、T109、F110、R111、D112、K119、K120、K121、N122、L124、I125、W131、L132、G133、F134、Q135、Y137、S138、L150、G151、F152、E153、L154、K155、A156、L160、V161、K163、L164、A165、L169、S170、K171、F172、I173、K174、V175、Y176、R177、W200、T201、L205、E206、F209、Q210、R213、E214、L217、K218、A219、M220、N221、Y229、L230、R237、I238、R242、M243、M244、P245、K255、P256、L268、T269、K287、P288、Y289、M290、K292、E293、F296、V297、F306、N307、K310和A311，其中編號相對於SEQ ID NO: 1。在某些實施方案中，所述Amuc_1100在選自由以下組成的群組的位置處包含一個或多個突變：S37、V175、Y289和F296，其中編號相對於SEQ ID NO: 1。在某些實施方案中，Amuc_1100包含Y289A突變，其中編號相對於SEQ ID NO: 1。

在某些實施方案中，所述免疫檢查點調節劑為針對免疫檢查點分子的抗體或其抗原結合片段或化合物。在某些實施方案中，所述免疫檢查點調節劑包含一個或多個選自由以下組成的群組的免疫刺激檢查點的活化劑：CD2、CD3、CD7、CD16、CD27、CD30、CD70、CD83、CD28、CD80（B7-1）、CD86（B7-2）、CD40、CD40L（CD154）、CD47、CD122、CD137、CD137L、OX40（CD134）、OX40L（CD252）、NKG2C、4-1BB、LIGHT、PVRIG、SLAMF7、HVEM、BAFFR、ICAM-1、2B4、LFA-1、GITR、ICOS（CD278）、ICOSLG（CD275）和其任何組合。在某些實施方案中，所述免疫檢查點調節劑包含一個或多個選自由以下組成的群組的免疫抑制檢查點的抑制劑：LAG3（CD223）、A2AR、B7-H3（CD276）、B7-H4（VTCN1）、BTLA（CD272）、BTLA、CD160、CTLA-4（CD152）、IDO1、IDO2、TDO、KIR、LAIR-1、NOX2、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、VISTA、SIGLEC-7（CD328）、TIGIT、PVR（CD155）、TGFβ、SIGLEC9（CD329）和其任何組合。在某些實施方案中，所述免疫檢查點調節劑為一個或多個免疫抑制檢查點的抑制劑，較佳地抑制或減少PD-1與其配體中的任一種之間的相互作用的抗體或其抗原結合片段或化合物。在某些實施方案中，所述免疫檢查點調節劑為針對PD-L1、PD-L2或PD-1的抗體或其抗原結合片段或化合物。

在某些實施方案中，所述個體已表現出對所述免疫檢查點調節劑的不良反應或抗藥性。在某些實施方案中，所述個體經測定對所述免疫檢查點調節劑具有原發性（ de novo）耐藥或獲得性耐藥。

在某些實施方案中，所述個體是癌症患者，其中所述癌症選自由以下組成的群組：結腸直腸癌、乳癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、前列腺癌、腎癌、子宮頸癌、骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、甲狀腺癌、子宮內膜癌、子宮癌、膀胱癌、神經內分泌癌、頭頸癌、肝癌、鼻咽癌、睾丸癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、黑色素瘤、基底細胞癌、皮膚癌、鱗狀細胞皮膚癌、隆凸性皮膚纖維肉瘤、梅克爾細胞癌（Merkel cell carcinoma）、成膠質細胞瘤、神經膠質瘤、肉瘤和間皮瘤。

在某些實施方案中，所述Amuc_1100或表現所述Amuc_1100的經基因工程改造的宿主細胞的施用是透過口服施用。在某些實施方案中，所述Amuc_1100或表現所述Amuc_1100的經基因工程改造的宿主細胞的施用在所述免疫檢查點調節劑之前、之後或與其同時進行。

在某些實施方案中，所述宿主細胞包含益生微生物體或非病原性微生物體。在某些實施方案中，所述宿主細胞包含外源性表現卡匣，所述外源性表現卡匣包含編碼可操作地連接於訊號肽的Amuc_1100的核苷酸序列，任選地，其中所述經基因工程改造的宿主細胞從1×10 ⁹CFU的所述經基因工程改造的宿主細胞分泌至少10 ng Amuc_1100。

在另一方面，本揭露內容提供一種包含外源性表現卡匣的經基因工程改造的宿主細胞，所述外源性表現卡匣包含編碼可操作地連接於訊號肽的Amuc_1100的核苷酸序列，任選地，其中所述經基因工程改造的宿主細胞從1×10 ⁹CFU的所述經基因工程改造的宿主細胞分泌至少10 ng Amuc_1100。

在另一方面，本揭露內容提供一種重組表現卡匣，其包含編碼可操作地連接於訊號肽的Amuc_1100的核苷酸序列和一個或多個調節元件。

在某些實施方案中，所述宿主細胞包含益生微生物體或非病原性微生物體。在某些實施方案中，所述外源性表現卡匣整合於所述經基因工程改造的宿主細胞的質體中。在某些實施方案中，所述外源性表現卡匣整合於所述經基因工程改造的宿主細胞的基因組中。

在某些實施方案中，所述外源性表現卡匣包含編碼可操作地連接於訊號肽的Amuc_1100的核苷酸序列，其中所述訊號肽可操作地連接於所述Amuc_1100的N端。在某些實施方案中，所述訊號肽包含選自由SEQ ID NO: 76到82和其具有至少80%序列一致性的同源序列組成的群組的胺基酸序列。在某些實施方案中，所述訊號肽是Usp45訊號肽。在某些實施方案中，所述訊號肽可以透過存在於所述宿主細胞中的分泌系統加工。在某些實施方案中，所述分泌系統對於所述宿主細胞是原生或非原生的系統。在某些實施方案中，所述宿主細胞為益生細菌。在某些實施方案中，所述分泌系統經工程改造和/或優化以使得至少一種外膜蛋白編碼基因被刪除、失活或抑制。在某些實施方案中，所述外膜蛋白選自由以下組成的群組：OmpC、OmpA、OmpF、OmpT、pldA、pagP、tolA、Pal、To1B、degS、mrcA和lpp。在某些實施方案中，所述分泌系統經工程改造以使得至少一種伴侶蛋白編碼基因被擴增、過表現或活化。在某些實施方案中，所述伴侶蛋白選自由以下組成的群組：dsbA、dsbC、dnaK、dnaJ、grpE、groES、groEL、tig、fkpA、surA、skp、PpiD和DegP。

在某些實施方案中，所述表現卡匣進一步包含一個或多個調節元件，所述調節元件包含一個或多個選自由以下組成的群組的元件：啟動子、核糖體結合位點（RBS）、順反子、終止子和其任何組合。在某些實施方案中，所述啟動子為組成型啟動子或誘導型啟動子。

在某些實施方案中，所述啟動子為內源啟動子或外源啟動子。在某些實施方案中，所述組成型啟動子包含選自由SEQ ID NO: 14到54和其具有至少80%序列一致性的同源序列組成的群組的核苷酸序列。在某些實施方案中，所述組成型啟動子包含SEQ ID NO: 15。在某些實施方案中，所述誘導型啟動子包含選自由SEQ ID NO: 55到58和其具有至少80%序列一致性的同源序列組成的群組的核苷酸序列。在某些實施方案中，所述誘導型啟動子包含SEQ ID NO: 58。

在某些實施方案中，所述RBS包含選自由SEQ ID NO: 70到73和其具有至少80%序列一致性的同源序列組成的群組的核苷酸序列。在某些實施方案中，所述順反子包含選自由SEQ ID NO: 66到69和其具有至少80%序列一致性的同源序列組成的群組的核苷酸序列。在某些實施方案中，所述終止子為T7終止子。在某些實施方案中，所述終止子為rrnB T1 T7Te終止子。在某些實施方案中，所述終止子包含如SEQ ID NO: 74所示的核苷酸序列。

在某些實施方案中，本揭露內容的經基因工程改造的宿主細胞進一步包含營養缺陷相關基因中的至少一個失活或缺失。在某些實施方案中，所述營養缺陷相關基因選自由以下組成的群組：thyA、cysE、glnA、ilvD、leuB、lysA、serA、metA、glyA、hisB、ilvA、pheA、proA、thrC、trpC、tyrA、uraA、dapF、flhD、metB、metC、proAB、yhbV、yagG、hemB、secD、secF、ribD、ribE、thiL、dxs、ispA、dnaX、adk、hemH、IpxH、cysS、fold、rplT、infC、thrS、nadE、gapA、yeaZ、aspS、argS、pgsA、yeflA、metG、folE、yejM、gyrA、nrdA、nrdB、folC、accD、fabB、gltX、ligA、zipA、dapE、dapA、der、hisS、ispG、suhB、tadA、acpS、era、rnc、fisB、eno、pyrG、chpR、Igt、ft＞aA、pgk、yqgD、metK、yqgF、plsC、ygiT、pare、ribB、cca、ygjD、tdcF、yraL、yihA、ftsN、murl、murB、birA、secE、nusG、rplJ、rplL、rpoB、rpoC、ubiA、plsB、lexA、dnaB、ssb、alsK、groS、psd、orn、yjeE、rpsR、chpS、ppa、valS、yjgP、yjgQ、dnaC、ribF、IspA、ispH、dapB、folA、imp、yabQ、flsL、flsl、murE、murF、mraY、murD、ftsW、murG、murC、ftsQ、ftsA、ftsZ、IpxC、secM、secA、can、folK、hemL、yadR、dapD、map、rpsB、in/B、nusA、ftsH、obgE、rpmA、rplU、ispB、murA、yrbB、yrbK、yhbN、rpsl、rplM、degS、mreD、mreC、mreB、accB、accC、yrdC、def、fint、rplQ、rpoA、rpsD、rpsK、rpsM、entD、mrdB、mrdA、nadD、hlepB、rpoE、pssA、yfiO、rplS、trmD、rpsP、ffh、grpE、yfjB、csrA、ispF、ispD、rplW、rplD、rplC、rpsJ、fusA、rpsG、rpsL、trpS、yr/F、asd、rpoH、ftsX、ftsE、ftsY、frr、dxr、ispU、rfaK、kdtA、coaD、rpmB、djp、dut、gmk、spot、gyrB、dnaN、dnaA、rpmH、rnpA、yidC、tnaB、glmS、glmU、wzyE、hemD、hemC、yigP、ubiB、ubiD、hemG、secY、rplO、rpmD、rpsE、rplR、rplF、rpsH、rpsN、rplE、rplX、rplN、rpsQ、rpmC、rplP、rpsC、rplV、rpsS、rplB、cdsA、yaeL、yaeT、lpxD、fabZ、IpxA、IpxB、dnaE、accA、tilS、proS、yafF、tsf、pyrH、olA、rlpB、leuS、Int、glnS、fldA、cydA、in/A、cydC、ftsK、lolA、serS、rpsA、msbA、IpxK、kdsB、mukF、mukE、mukB、asnS、fabA、mviN、rne、yceQ、fabD、fabG、acpP、tmk、holB、lolC、lolD、lolE、purB、ymflC、minE、mind、pth、rsA、ispE、lolB、hemA、prfA、prmC、kdsA、topA、ribA、fabi、racR、dicA、yd B、tyrS、ribC、ydiL、pheT、pheS、yhhQ、bcsB、glyQ、yibJ和gpsA。

在某些實施方案中，本揭露內容的宿主細胞是一種或多種選自由以下組成的群組的物質的營養缺陷體：尿嘧啶、白胺酸、組織胺酸、色胺酸、賴胺酸、甲硫胺酸、腺嘌呤和非天然存在的胺基酸。在某些實施方案中，所述非天然存在的胺基酸選自由以下組成的群組：l-4,4ʹ-聯苯丙胺酸、對乙醯基-l-苯丙胺酸、對碘-l-苯丙胺酸和對疊氮基-l-苯丙胺酸。

在某些實施方案中，本揭露內容的宿主細胞包含別構調控的轉錄因子，所述轉錄因子能夠檢測調節所述轉錄因子的活性的環境中的訊號，其中不存在所述訊號將引起細胞死亡。

在某些實施方案中，本揭露內容的益生微生物體為益生細菌或益生酵母。在某些實施方案中，所述益生細菌選自由以下組成的群組：擬桿菌（ Bacteroides）、雙歧桿菌（ Bifidobacterium）、梭菌（ Clostridium）、埃希氏菌（ Escherichia）、乳桿菌（ Lactobacillus）和乳球菌（ Lactococcus），任選地，所述益生細菌屬於埃希氏菌屬，並且任選地，所述益生細菌屬於物種大腸桿菌（ Escherichia coli）的菌株 Nissle 1917（ EcN）。在某些實施方案中，所述益生酵母選自由以下組成的群組：釀酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae）、產朊假絲酵母 （ Candida utilis）、乳酸克魯維酵母（ Kluyveromyces lactis）和卡氏酵母（ Saccharomyces carlsbergensis）。

在另一方面，本揭露內容提供一種組合物，其包含本揭露內容的經基因工程改造的宿主細胞和生理學上可接受的載劑。

在另一方面，本揭露內容提供一種組合物，其包含：a）本揭露內容的經基因工程改造的宿主細胞或分離的Amuc_1100；和b）免疫檢查點抑制劑。

在某些實施方案中，本揭露內容的組合物是可食用的。在某些實施方案中，所述組合物是益生組合物。

在另一方面，本揭露內容提供一種試劑盒，其包含：a）包含本揭露內容的經基因工程改造的宿主細胞或包含分離的Amuc_1100的第一組合物；和b）包含免疫檢查點抑制劑的第二組合物。

在某些實施方案中，所述第一組合物是可食用組合物，和/或所述第二組合物進一步包含藥學上可接受的載劑。在某些實施方案中，所述第一組合物是食品增補劑。在某些實施方案中，所述第二組合物適於口服施用或腸胃外施用。

在另一方面，本揭露內容提供本揭露內容的經基因工程改造的宿主細胞，其用於與免疫檢查點調節劑組合使用。

在另一方面，本揭露內容提供一種包含本揭露內容的重組表現卡匣的核酸運載體，其用於與免疫檢查點調節劑組合使用。

在另一方面，本揭露內容提供一種包含本揭露內容中任一項所述的經基因工程改造的宿主細胞或分離的Amuc_1100的口服組合物，其用於與包含免疫檢查點調節劑的製劑組合使用。

在某些實施方案中，所述包含免疫檢查點調節劑的製劑是腸胃外製劑。在某些實施方案中，所述包含免疫檢查點調節劑的製劑是口服製劑。

在另一方面，本揭露內容提供一種非天然存在的Amuc_1100蛋白，其中所述Amuc_1100蛋白包含Y289A突變，其中編號相對於SEQ ID NO: 1。

在另一方面，本揭露內容還提供一種核酸，其編碼本文提供的所述Amuc_1100蛋白。

在另一方面，本揭露內容提供Usp45訊號肽在建構表現載體中的用途，所述表現載體包含編碼目標多肽的多核苷酸，其中所述表現載體適合在大腸桿菌中表現以允許所述目標多肽從所述大腸桿菌中表現和分泌。

在另一方面，本揭露內容提供Usp45訊號肽用於建構表現載體，所述表現載體包含編碼目標多肽的多核苷酸，其中所述表現載體適合在大腸桿菌中表現以允許所述目標多肽從所述大腸桿菌中表現和分泌。

在另一方面，本揭露內容提供表現載體，其包含編碼可操作地連接至Usp45訊號肽的目標多肽的多核苷酸，其中所述表現載體適合在大腸桿菌中表現以允許所述目標多肽從所述大腸桿菌中表現和分泌。

在某些實施方案中，所述Usp45訊號肽包含如SEQ ID NO: 59所示的序列。

在某些實施方案中，所述大腸桿菌是大腸桿菌的共生菌株。

在某些實施方案中，所述共生菌株是大腸桿菌Nissle 1917菌株。

在某些實施方案中，所述目標多肽包含Amuc_1100。

在某些實施方案中，所述Amuc_1100是天然存在的Amuc_1100或其功能等效物。

在某些實施方案中，所述目標多肽是除Amuc_1100之外的多肽。

在另一方面，本揭露內容提供了一種經基因工程改造的大腸桿菌，其包含外源性表現卡匣，所述外源性表現卡匣包含編碼可操作地連接至Usp45訊號肽的目標多肽的多核苷酸。

在某些實施方案中，本文提供的所述經基因工程改造的大腸桿菌能夠表現和分泌所述目標多肽。

在整個本揭露內容中，冠詞「一（a/an）」和「所述」在本文中用於指一個（種）或超過一個（種）（即，至少一個（種））所述冠詞的語法物件。舉例來說，「一抗體」意指一種抗體或多於一種抗體。

以下對本揭露內容的描述僅打算說明本揭露內容的各種實施方案。因此，所論述的具體修改不應被解釋為對本揭露內容範圍的限制。所屬技術領域的通常知識者將顯而易見，可在不脫離本揭露內容的範圍的情況下得到各種等效物、進行改變和修改，且應理解所述等效實施方案將包含在本文中。本文引用的所有參考文獻，包含出版物、專利和專利申請，均以全文引用的方式併入本文中。

I. 定義

如本文所用，術語「胺基酸」是指含有胺（-NH ₂）和羧基（-COOH）官能團以及每種胺基酸特有的側鏈的有機化合物。胺基酸的名稱在本揭露內容中也以標準的單字母或三字母代碼表示，其概述如下。

名稱	三字母代碼	單字母代碼
丙胺酸	Ala	A
精胺酸	Arg	R
天門冬醯胺	Asn	N
天門冬胺酸	Asp	D
半胱胺酸	Cys	C
麩胺酸	Glu	E
麩醯胺酸	Gln	Q
甘胺酸	Gly	G
組織胺酸	His	H
白胺酸異白胺酸	Ile	I
白胺酸	Leu	L
賴胺酸	Lys	K
甲硫胺酸	Met	M
苯丙胺酸	Phe	F
脯胺酸	Pro	P
絲胺酸	Ser	S
蘇胺酸	Thr	T
色胺酸	Trp	W
酪胺酸	Tyr	Y
纈胺酸	Val	V

如本文所用，術語「抗體」包含與特異性抗原結合的任何免疫球蛋白、單株抗體、多株抗體、多價抗體、二價抗體、單價抗體、多特異性抗體或雙特異性抗體。原生完整抗體包含兩條重（H）鏈和兩條輕（L）鏈。哺乳動物重鏈分類為α、δ、ε、γ和μ，每條重鏈由可變區（VH）以及第一、第二、第三和任選的第四恆定區（分別為CH1、CH2、CH3、CH4）組成；哺乳動物輕鏈分類為λ或κ，而每條輕鏈由可變區（VL）和恆定區組成。抗體呈「Y」形，其中Y的主幹由透過二硫鍵結合在一起的兩條重鏈的第二和第三恆定區組成。Y的每個臂包含與單條輕鏈的可變區和恆定區結合的單條重鏈的可變區和第一恆定區。輕鏈和重鏈的可變區負責抗原結合。兩條鏈的可變區一般含有三個高度可變的環，稱為互補決定區（CDR）（輕鏈CDR包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，重鏈CDR包含HCDR1、HCDR2、HCDR3）。本文中所公開的抗體和抗原結合片段的CDR邊界可透過Kabat、IMGT、Chothia或Al-Lazikani慣例來定義或識別（Al-Lazikani, B., Chothia, C., Lesk, A. M., 《分子生物學雜誌（ J. Mol. Biol.）》, 273(4), 927 (1997)；Chothia, C.等人，《分子生物學雜誌》 12月5日;186(3):651-63 (1985)；Chothia, C.和Lesk, A.M., 《分子生物學雜誌》, 196,901 (1987)；Chothia, C.等人，《自然（ Nature）》. 12月21-28日;342(6252):877-83 (1989)；Kabat E.A.等人，《免疫學感興趣的蛋白質的序列（Sequences of Proteins of Immunological Interest）》，第5版，美國國家衛生研究院公共衛生服務部（Public Health Service, National Institutes of Health），馬里蘭州貝塞斯達（Bethesda, Md.）(1991)；Marie-Paule Lefranc等人，《發育與比較免疫學（ Developmental and Comparative Immunology）》, 27: 55-77 (2003)；Marie-Paule Lefranc等人，《免疫組學研究（ Immunome Research）》, 1(3), (2005)；Marie-Paule Lefranc, 《B細胞的分子生物學（第二版）（Molecular Biology of B cells (second edition)）》，第26章, 481-514, (2015)）。三個CDR插在被稱為構架區（FR）（輕鏈FR包含LFR1、LFR2、LFR3和LFR4，重鏈FR包含HFR1、HFR2、HFR3和HFR4）的側接鏈段（stretch）之間，所述側接鏈段比CDR更高度保守且形成支撐高度可變環的骨架。重鏈和輕鏈的恆定區不涉及抗原結合，但展現出各種效應功能。基於抗體重鏈恆定區的胺基酸序列來對抗體分類。抗體的五個主要類別或同型是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，分別以α、δ、ε、γ和μ重鏈的存在為特徵。將數種主要抗體類別劃分為亞類，如IgG1（γ1重鏈）、IgG2（γ2重鏈）、IgG3（γ3重鏈）、IgG4（γ4重鏈）、IgA1（α1重鏈）或IgA2（α2重鏈）。

在某些實施方案中，本文提供的抗體涵蓋任何其抗原結合片段。如本文所用，術語「抗原結合片段」是指由抗體的一部分形成的包含一個或多個CDR的抗體片段，或與抗原結合但不包含完整原生抗體結構的任何其它抗體片段。抗原結合片段的實例包含但不限於雙功能抗體、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫鍵穩定的Fv片段（dsFv）、(dsFv)2、雙特異性dsFv（dsFv-dsFv'）、二硫鍵穩定的雙功能抗體（ds雙功能抗體）、單鏈抗體分子（scFv）、scFv二聚體（二價雙功能抗體）、雙特異性抗體、多特異性抗體、駱駝化單結構域抗體、奈米抗體、結構域抗體和二價結構域抗體。抗原結合片段能夠與親本抗體所結合的相同抗原結合。

與胺基酸序列有關的「保守取代」是指胺基酸殘基被含具有類似物理化學特性的側鏈的不同胺基酸殘基置換。舉例來說，可在具有疏水性側鏈的胺基酸殘基（例如Met、Ala、Val、Leu和Ile）間、具有中性親水性側鏈的胺基酸殘基（例如Cys、Ser、Thr、Asn和Gln）間、具有酸性側鏈的胺基酸殘基（例如Asp、Glu）間、具有鹼性側鏈的胺基酸殘基（例如His、Lys和Arg）間、或具有芳香族側鏈的胺基酸殘基（例如Trp、Tyr和Phe）間進行保守取代。如所屬領域中已知，保守取代通常不會引起蛋白質構象結構的顯著變化，並且因此可保留蛋白質的生物活性。

如本文所用，術語「有效量」或「藥學上有效量」是指產生所需結果所必需的一種或多種藥劑的量和/或劑量和/或劑量方案，例如足以在個體中緩和與個體正在接受療法的疾病病狀相關的一種或多種症狀的量，或足以減輕個體中疾病病狀的嚴重程度或延緩其進展的量（例如治療有效量），足以降低個體中疾病病狀的風險或延緩其發作，和/或降低其最終嚴重程度的量（例如預防有效量）。

如本文所用，術語「編碼（encoded/encoding）」是指能夠轉錄成mRNA和/或轉譯成肽或蛋白質。術語「編碼序列」或「基因」是指編碼肽或蛋白質的多核苷酸序列。這兩個術語可以在本揭露內容中互換使用。在一些實施方案中，編碼序列是由信使RNA（mRNA）逆轉錄的互補DNA（cDNA）序列。在一些實施方案中，編碼序列是mRNA。

如本文所用，術語「同源」是指在最好比對時，與另一序列具有至少60%（例如至少65%、70%、75%、80%、85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%）序列一致性的核酸序列（或其互補股）或胺基酸序列。

「分離」的物質已透過人工方式自天然狀態改變。如果「分離」的組合物或物質存在於自然界中，則所述組合物或物質已經從其原始環境改變或從其原始環境移出，或這兩種情況都有。例如，天然地存在於活動物體內的多核苷酸或多肽不是「分離」的，但如果相同多核苷酸或多肽與其天然狀態的共存材料充分地分離，由此以實質上純的狀態存在，那麼所述多核苷酸或多肽是「分離」的。「分離」的核酸序列是指分離的核酸分子的序列。「分離」的多肽或其片段、變異體或衍生物是指不處於其天然環境中的多肽。不需要特定的純化水準。出於本發明的目的，認為在宿主細胞（包含但不限於細菌或哺乳動物細胞）中表現的以重組方式產生的多肽和蛋白質，以及分離、分級或部分或實質上透過任何適合技術純化的原生或重組多肽是分離的。重組肽、多肽或蛋白質是指透過重組DNA技術產生（即由透過編碼肽、多肽或蛋白質的外源性重組DNA表現建構體轉化的細胞、微生物或哺乳動物產生）的肽、多肽或蛋白質。在大多數細菌培養物中表現的蛋白質或肽通常將不含聚醣。前述肽、多肽、蛋白質的片段、衍生物、類似物或變異體和其任何組合也包含為肽、多肽和蛋白質。

術語「可操作地連接（operably link/operably linked）」是指兩個或更多個所關注的生物序列在存在或不存在間隔子或連接子的情況下的並接，使得它們處於允許它們以預期方式起作用的關係中。當關於多肽使用時，其意指多肽序列以允許連接的產物具有預期的生物學功能的方式連接。例如，抗體可變區可以可操作地連接於恆定區，以提供具有抗原結合活性的穩定產物。所述術語還可以關於多核苷酸使用。舉例來說，當編碼多肽的多核苷酸可操作地連接於調節序列（例如啟動子、增強子、沉默子序列等）時，其意指多核苷酸序列以允許調節多肽由多核苷酸的表現的方式連接。

術語「多肽」、「肽」和「蛋白質」在本文中可互換地用以指胺基酸殘基的聚合物。所述術語還適用於其中一個或多個胺基酸殘基是對應天然存在的胺基酸的人工化學類比物的胺基酸聚合物，並且適用於天然存在的胺基酸聚合物和非天然存在的胺基酸聚合物。

如本文所用，術語「核苷酸序列」、「核酸」或「多核苷酸」包含寡核苷酸（即短多核苷酸）。其還指合成的和/或非天然存在的核酸分子（例如，包含核苷酸類似物或經修飾的主鏈殘基或鍵）。所述術語還指單股或雙股形式的去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸寡核苷酸。所述術語涵蓋含有天然核苷酸類似物的核酸。所述術語還涵蓋具有合成主鏈的核酸樣結構。除非另外指示，否則特定多核苷酸序列還隱含地涵蓋其保守修飾變異體（例如簡併密碼子取代）、等位基因、直系同源物、SNP和互補序列，以及明確指示的序列。具體來說，可以透過產生其中一個或多個選定（或所有）密碼子的第三位置被混合鹼基和/或去氧肌苷殘基取代的序列實現簡併密碼子取代（參見Batzer等人，《核酸研究（ Nucleic Acid Res.）》 19:5081 (1991)；Ohtsuka等人，《生物化學雜誌（ J. Biol. Chem.）》 260:2605-2608 (1985)；和Rossolini等人，《分子細胞探針（ Mol. Cell. Probes）》 8:91-98 (1994)）。

關於胺基酸序列（或核酸序列）的術語「序列一致性百分比（%）」定義為在比對序列並在必要時引入空位以實現最大數目的相同胺基酸（或核酸）後，候選序列中與參考序列中的胺基酸（或核酸）殘基相同的胺基酸（或核酸）殘基的百分比。換句話說，胺基酸序列（或核酸序列）的序列一致性百分比（%）可以透過將相對於其比較的參考序列相同的胺基酸殘基（或鹼基）的數目除以候選序列或參考序列中胺基酸殘基（或鹼基）的總數（以較短者為准）來計算。胺基酸殘基的保守取代可視為或可不視為相同殘基。出於確定胺基酸（或核酸）序列一致性百分比的目的進行的比對可例如使用以下實現：可公開獲得的工具，如BLASTN、BLASTp（可見於美國國家生物技術資訊中心（U.S. National Center for Biotechnology Information；NCBI）的網站，另外參見Altschul S.F.等人，《分子生物學雜誌》, 215:403-410 (1990)；Stephen F.等人，《核酸研究（ Nucleic Acids Res.）》, 25:3389-3402 (1997)）、ClustalW2（可見於歐洲生物資訊研究所（European Bioinformatics Institute）網站，另外參見Higgins D.G.等人，《酶學方法（ Methods in Enzymology）》, 266:383-402 (1996)；Larkin M.A.等人，《生物資訊學（Bioinformatics）》（英格蘭牛津（Oxford, England））, 23(21): 2947-8 (2007)）和ALIGN或Megalign（DNASTAR）軟體。所屬技術領域的通常知識者可使用所述工具所提供的預設參數，或可視需要例如透過選擇適合演算法來自訂比對的參數。

如本文所用，術語「益生菌」是指微生物細胞製備物（如活微生物細胞），其當以有效量施用時，對個體的健康或康樂提供有益作用。按照定義，所有益生菌都具有經證實的非病原性特徵。在一個實施方案中，這些健康益處與改善人類或動物微生物群的平衡和/或恢復正常微生物群相關。

如本文所用，術語「協同（synergistic/synergistically）」是指提供大於兩種或更多種作為單獨療法提供的藥劑的治療效果的總和的治療效果的兩種或更多種藥劑。

如本文所用，術語「個體」包含人類和非人類動物。非人類動物包含所有脊椎動物，例如哺乳動物和非哺乳動物，如非人類靈長類動物、小鼠、大鼠、貓、兔、羊、狗、牛、雞、兩棲動物和爬行動物。除指出的以外，術語「患者」或「個體」在本文中可互換使用。

如本文所用，疾病、病症或病狀的「治療（treating/treatment）」包含預防或緩解疾病、病症或病狀，減緩疾病、病症或病狀的發作或發展速率，降低罹患疾病、病症或病狀的風險，預防或延緩與疾病、病症或病狀相關的症狀的發展，減少或結束與疾病、病症或病狀相關的症狀，使疾病、病症或病狀完全或部分消退，治癒疾病、病症或病狀，或其某一組合。

如本文所用，術語「載體」是指一種運載體，可將遺傳元件可操作地插入其中，以實現所述遺傳元件的表現，從而產生由所述遺傳元件編碼的蛋白質、RNA或DNA，或複製所述遺傳元件。載體可用於轉化、轉導或轉染宿主細胞，以使其攜帶的遺傳元件在宿主細胞內表現。不同載體可適合於不同宿主細胞。載體的實例包含質體；噬菌質體；黏質體；人工染色體，如酵母人工染色體（YAC）、細菌人工染色體（BAC）或P1衍生的人工染色體（PAC）；噬菌體，如λ噬菌體或M13噬菌體；和動物病毒。載體可以含有多種用於控制表現的元件，包含啟動子序列、轉錄起始序列、增強子序列、可選元件和報告基因。另外，載體可以含有複製起點。載體還可以包含有助於其進入細胞的材料，包含但不限於病毒粒子、脂質體或蛋白質包衣。載體可以是表現載體或轉殖載體。

II. 治療方法、重組表現卡匣和經基因工程改造的宿主細胞

所屬領域中眾所周知，腫瘤在其起始和進展期間演變以避免被免疫系統破壞。雖然最近使用免疫檢查點調節劑逆轉這一抗藥性已展現一些成功，但僅小部分癌症患者群體可以長期受益於癌症免疫療法。

在一個方面，本揭露內容提供一種治療或預防有需要的個體的癌症的方法，其包括：a）向個體施用有效量的能夠調節腸道免疫性的腸道免疫性調節劑；以及b）向個體施用有效量的免疫檢查點調節劑。

在另一方面，本揭露內容提供一種改善接受免疫檢查點調節劑的治療的個體中癌症的治療反應的方法，其包括向個體施用有效量的腸道免疫性調節劑，任選地與有效量的免疫檢查點調節劑一起施用。

在另一方面，本揭露內容提供一種在個體中誘導或改善腸道免疫性的方法，其包括向個體施用有效量的腸道免疫性調節劑以及有效量的免疫檢查點調節劑。

在另一方面，本揭露內容提供一種在接受抗癌治療並且表現出腸道免疫性降低的個體中改善癌症治療反應的方法，其包括向個體施用有效量的腸道免疫性調節劑。

如本文所用，術語「腸道免疫性調節劑」是指可以調節和/或促進腸道免疫系統功能，和/或維持、恢復或增加哺乳動物（例如人類）中的腸黏膜屏障的物理完整性的生物物質。在一些實施方案中，腸道免疫性調節劑能夠調節toll樣受體2（TLR2）的活性。在一些實施方案中，腸道免疫性調節劑能夠活化TLR2。

TLR2在檢測來自細菌、真菌和寄生蟲的多樣範圍的微生物病原體相關分子模式中起重要作用。TLR2與腸上皮細胞和免疫細胞中的細胞表面上的TLR1和TLR6形成異二聚體。TLR2二聚體的活化觸發訊息訊號級聯以引發宿主中的多樣先天性和後天性免疫反應。此外，TLR2活化增加腸上皮細胞間連接並且因此增強腸道屏障。

在某些實施方案中，腸道免疫性調節劑包含Amuc_1100。

另外，本發明人意外地發現Amuc_1100和其功能等效物可與一種或多種免疫檢查點調節劑協同作用，使得一種或多種免疫檢查點調節劑的治療作用可得到提高或增強，和/或對一種或多種免疫檢查點調節劑的抗藥性可得到減少、延遲或預防。實際上，本發明人證實Amuc_1100（例如純化的重組Amuc_1100蛋白質或表現Amuc_1100的經基因工程改造的宿主細胞）和免疫檢查點調節劑（例如抗PD-1抗體）的組合展現多於用對應單療法觀察到的結果的協同抗腫瘤效果（例如用於抑制腫瘤生長）。

在一個方面，本揭露內容提供一種治療或預防有需要的個體的癌症的方法，其包括向個體施用有效量的Amuc_1100或表現Amuc_1100的經基因工程改造的宿主細胞，以及有效量的免疫檢查點調節劑。

在另一方面，本揭露內容提供一種改善接受免疫檢查點調節劑的治療的個體中癌症的治療反應的方法，其包括向個體施用有效量的Amuc_1100或表現Amuc_1100的經基因工程改造的宿主細胞，任選地與有效量的免疫檢查點調節劑一起施用。

在另一方面，本揭露內容提供一種在個體中誘導或改善腸道免疫性的方法，其包括向個體施用有效量的Amuc_1100或表現Amuc_1100的經基因工程改造的宿主細胞以及有效量的免疫檢查點調節劑。

在另一方面，本揭露內容提供一種在接受抗癌治療並且表現出腸道免疫性降低的個體中改善癌症治療反應的方法，其包括向個體施用有效量的Amuc_1100或表現Amuc_1100的經基因工程改造的宿主細胞。

A.    Amuc_1100

Amuc_1100已知為嗜黏蛋白阿克曼氏菌（「 A. muciniphila」）細菌種中保存的外膜蛋白。連同兩個其它成員Amuc_1099和Amuc_1101，Amuc_1100位於涉及IV型菌毛樣形成的基因簇內（Ottman等人，公共科學圖書館·綜合（ PLoS One）, 2017）。Amuc_1100的示範性胺基酸序列公開於GenBank：ACD04926.1中。在本揭露內容中，術語「Amuc_1100」和「AMUC_1100」可互換地使用。

如本文所用，術語「Amuc_1100」廣泛涵蓋Amuc_1100多肽，以及Amuc_1100多核苷酸，例如編碼Amuc_1100多肽的DNA或RNA序列。如本文所用，術語「Amuc_1100」進一步涵蓋天然存在的Amuc_1100的所有功能等效物。如本文中關於Amuc_1100所用的術語「功能等效物」意思是儘管胺基酸序列或多核苷酸序列或化學結構具有差異，但仍至少部分保留天然存在的Amuc_1100的一種或多種生物功能的任何Amuc_1100變異體。天然存在的Amuc_1100的生物功能包含但不限於a）調節和/或促進哺乳動物的腸道免疫系統功能，b）維持、恢復和/或增加哺乳動物的腸黏膜屏障的物理完整性，c）啟動TLR2，d）提高哺乳動物中對癌症免疫療法（例如免疫檢查點調節劑）的免疫反應，和e）降低、延遲和/或預防哺乳動物中對一種或多種免疫檢查點調節劑的抗藥性。

在某些實施方案中，Amuc_1100的功能等效物保持母體分子的實質生物活性。在某些實施方案中，本文所述的Amuc_1100的功能等效物仍保持與天然存在的Amuc_1100實質上類似的功能，例如，Amuc_1100的功能等效物可保持天然存在的Amuc_1100的至少部分（例如，至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%）例如調節腸道免疫性和/或活化TLR2的活性。

如本文中關於Amuc_1100所用的術語「變異體」涵蓋所有種類的不同形式的Amuc_1100，包含但不限於天然存在的Amuc_1100的片段、突變體、融合物、衍生物、類比物或其任何組合。

如本文所用，術語「突變體」是指與親本序列具有至少70%序列一致性的多肽或多核苷酸。突變體可以與親本序列相差一個或多個胺基酸殘基或一個或多個核苷酸。舉例來說，突變體可具有親本序列的一個或多個胺基酸殘基或一個或多個核苷酸的取代（包含但不限於保守取代）、添加、缺失、插入或截短或其任何組合。在某些實施方案中，突變Amuc_1100與天然存在的對應物具有至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列一致性。

如本文所用，術語「片段」是指任何長度的親本多肽或親本多核苷酸的部分序列。片段仍可以保持親本序列的至少部分功能。

當關於胺基酸序列（例如肽、多肽或蛋白質）使用時，術語「融合（fusion/fused）」是指例如透過化學鍵結或重組方式將兩個或更多個胺基酸序列組合成不天然存在的單一胺基酸序列。融合胺基酸序列可以透過兩個編碼多核苷酸序列的遺傳重組產生，並且可以透過將含有重組多核苷酸的建構體引入到宿主細胞中的方法表現。

如本文中關於多肽或多核苷酸所用的術語「衍生物」是指化學修飾的多肽或多核苷酸，其中一個或多個明確定義數目的取代基已經共價連接於多肽的一個或多個特定胺基酸殘基或多核苷酸的一個或多個特定核苷酸。對多肽的示範性化學修飾可以是例如一個或多個胺基酸的烷基化、醯化、酯化、醯胺化、磷酸化、醣基化、標記、甲基化或與一個或多個部分結合。對多核苷酸的示範性化學修飾可以是（a）末端修飾，例如5'端修飾或3'端修飾，（b）核鹼基（或「鹼基」）修飾，包含鹼基的置換或去除，（c）糖修飾，包含在2'、3'和/或4'位置處的修飾，和（d）主鏈修飾，包含磷酸二酯鍵的修飾或置換。

如本文關於Amuc_1100所用的術語「天然存在」意思是Amuc_1100多肽或多核苷酸的序列與自然界中發現的序列或那些序列相同。天然存在的Amuc_1100可為原生或野生型的Amuc_1100序列或其片段，即使所述片段本身可能未於自然界中發現。天然存在的Amuc_1100還可包含天然存在的變異體，如在不同細菌菌株中發現的突變體或同功異構物或不同原生序列。天然存在的全長Amuc_1100多肽具有317個胺基酸殘基的長度。天然存在的Amuc_1100的示範性胺基酸序列包含但不限於Amuc_1100（1-317）（SEQ ID NO: 1）、Amuc_1100（31-317）（SEQ ID NO: 2）和Amuc_1100（81-317）（SEQ ID NO: 3）。儘管不希望受任何理論束縛，但某些天然存在的Amuc_1100片段（例如Amuc_1100（31-317）（SEQ ID NO: 2）和Amuc_1100（81-317）（SEQ ID NO: 3））可以比全長對應物更高的親和力結合和活化TLR2。

在某些實施方案中，Amuc_1100包含Amuc_1100多肽。在一些實施方案中，Amuc_1100多肽包含或為天然存在的Amuc_1100。在一些實施方案中，天然存在的Amuc_1100具有SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3的胺基酸序列。

在一些實施方案中，Amuc_1100多肽包含天然存在的Amuc_1100多肽的功能等效物。

Amuc_1100多肽的功能等效物可包含天然存在的Amuc_1100的突變體、片段、融合物、衍生物、提高其穩定性的等效物或其任何組合。Amuc_1100的功能等效物可包含天然存在的Amuc_1100的人工產生的變異體，如透過重組方法或化學合成獲得的人工多肽序列。Amuc_1100的功能等效物可在活性不受影響的前提下包含非天然存在的胺基酸殘基。適合的非天然胺基酸包含例如β-氟丙胺酸、1-甲基組織胺酸、γ-亞甲基麩胺酸、α-甲基白胺酸、4,5-脫氫賴胺酸、羥基脯胺酸、3-氟苯丙胺酸、3-氨基酪胺酸、4-甲基色胺酸等。

在某些實施方案中，Amuc_1100多肽在選自由以下組成的群組的位置處包含一個或多個（例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25個或更多個）突變：R36、S37、L39、D40、K41、K42、I43、K48、E49、K51、S52、R62、S63、K70、E71、L72、N73、R74、Y75、A76、K77、A78、Y86、K87、P88、F89、L90、A91、F103、Q104、K108、T109、F110、R111、D112、K119、K120、K121、N122、L124、I125、W131、L132、G133、F134、Q135、Y137、S138、L150、G151、F152、E153、L154、K155、A156、L160、V161、K163、L164、A165、L169、S170、K171、F172、I173、K174、V175、Y176、R177、W200、T201、L205、E206、F209、Q210、R213、E214、L217、K218、A219、M220、N221、Y229、L230、R237、I238、R242、M243、M244、P245、K255、P256、L268、T269、K287、P288、Y289、M290、K292、E293、F296、V297、F306、N307、K310和A311，其中編號相對於SEQ ID NO: 1。不希望受任何理論所束縛，相信突變可用於提高Amuc_1100多肽的穩定性，使得與天然存在的對應物相比，其較不易於被酶消化。

在某些實施方案中，Amuc_1100多肽在選自由以下組成的群組的位置處包含一個或多個（例如2、3或4個）突變：S37、V175、Y289和F296，其中編號相對於SEQ ID NO: 1。在某些實施方案中，Amuc_1100多肽包含Y289A突變，其中編號相對於SEQ ID NO: 1。在某些實施方案中，Amuc_1100多肽包含SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5的胺基酸序列。

在某些實施方案中，Amuc_1100多肽進一步在N端或C端處包含標籤或胺基酸延伸。標籤可用於Amuc_1100多肽的純化。胺基酸延伸可用於提高穩定性或減少清除率。可以使用任何適合的標籤或延伸，例如His-標籤（例如6×His標籤）、蛋白質A、lacZ（β-gal）、麥芽糖結合蛋白質（MBP）、鈣調蛋白結合肽（CBP）、內含肽-甲殼質結合結構域（內含肽-CBD）標籤、基於鏈黴親和素/生物素的標籤、串聯親和純化（TAP）標籤、表位標籤、報告基因標籤等。

在某些實施方案中，Amuc_1100多肽進一步包含將標籤與Amuc_1100多肽的其餘部分分隔開的酶消化位點。酶消化位點可用於在需要時去除標籤。適合酶消化位點的實例包含腸激酶識別位點（例如DDDDK）、因子Xa識別位點、吉能酶（genenase）I識別位點、弗林蛋白酶（furin）識別位點等。

如下文表1中所示，Amuc_1100多肽以及包含標籤和/或酶消化位點的Amuc_1100多肽的示範性胺基酸序列提供於SEQ ID NO: 1-13中。

表 1. 示範性 Amuc_1100 的胺基酸序列

SEQ ID NO.	名稱 / 描述	胺基酸序列
1	Amuc_1100（1-317）	MSNWITDNKPAAMVAGVGLLLFLGLSATGYIVNSKRSELDKKISIAAKEIKSANAAEITPSRSSNEELEKELNRYAKAVGSLETAYKPFLASSALVPTTPTAFQNELKTFRDSLISSCKKKNILITDTSSWLGFQVYSTQAPSVQAASTLGFELKAINSLVNKLAECGLSKFIKVYRPQLPIETPANNPEESDEADQAPWTPMPLEIAFQGDRESVLKAMNAITGMQDYLFTVNSIRIRNERMMPPPIANPAAAKPAAAQPATGAASLTPADEAAAPAAPAIQQVIKPYMGKEQVFVQVSLNLVHFNQPKAQEPSED
2	Amuc_1100（31-317）	MIVNSKRSELDKKISIAAKEIKSANAAEITPSRSSNEELEKELNRYAKAVGSLETAYKPFLASSALVPTTPTAFQNELKTFRDSLISSCKKKNILITDTSSWLGFQVYSTQAPSVQAASTLGFELKAINSLVNKLAECGLSKFIKVYRPQLPIETPANNPEESDEADQAPWTPMPLEIAFQGDRESVLKAMNAITGMQDYLFTVNSIRIRNERMMPPPIANPAAAKPAAAQPATGAASLTPADEAAAPAAPAIQQVIKPYMGKEQVFVQVSLNLVHFNQPKAQEPSED
3	Amuc_1100（81-317）	MSLETAYKPFLASSALVPTTPTAFQNELKTFRDSLISSCKKKNILITDTSSWLGFQVYSTQAPSVQAASTLGFELKAINSLVNKLAECGLSKFIKVYRPQLPIETPANNPEESDEADQAPWTPMPLEIAFQGDRESVLKAMNAITGMQDYLFTVNSIRIRNERMMPPPIANPAAAKPAAAQPATGAASLTPADEAAAPAAPAIQQVIKPYMGKEQVFVQVSLNLVHFNQPKAQEPSED
4	Amuc_1100（31-317，Y289A）	MIVNSKRSELDKKISIAAKEIKSANAAEITPSRSSNEELEKELNRYAKAVGSLETAYKPFLASSALVPTTPTAFQNELKTFRDSLISSCKKKNILITDTSSWLGFQVYSTQAPSVQAASTLGFELKAINSLVNKLAECGLSKFIKVYRPQLPIETPANNPEESDEADQAPWTPMPLEIAFQGDRESVLKAMNAITGMQDYLFTVNSIRIRNERMMPPPIANPAAAKPAAAQPATGAASLTPADEAAAPAAPAIQQVIKP AMGKEQVFVQVSLNLVHFNQPKAQEPSED
5	Amuc_1100（81-317，Y289A）	MSLETAYKPFLASSALVPTTPTAFQNELKTFRDSLISSCKKKNILITDTSSWLGFQVYSTQAPSVQAASTLGFELKAINSLVNKLAECGLSKFIKVYRPQLPIETPANNPEESDEADQAPWTPMPLEIAFQGDRESVLKAMNAITGMQDYLFTVNSIRIRNERMMPPPIANPAAAKPAAAQPATGAASLTPADEAAAPAAPAIQQVIKP AMGKEQVFVQVSLNLVHFNQPKAQEPSED
6	Amuc_1100（31-317），在C端處具有6×his標籤	MIVNSKRSELDKKISIAAKEIKSANAAEITPSRSSNEELEKELNRYAKAVGSLETAYKPFLASSALVPTTPTAFQNELKTFRDSLISSCKKKNILITDTSSWLGFQVYSTQAPSVQAASTLGFELKAINSLVNKLAECGLSKFIKVYRPQLPIETPANNPEESDEADQAPWTPMPLEIAFQGDRESVLKAMNAITGMQDYLFTVNSIRIRNERMMPPPIANPAAAKPAAAQPATGAASLTPADEAAAPAAPAIQQVIKPYMGKEQVFVQVSLNLVHFNQPKAQEPSEDHHHHHH
7	Amuc_1100（81-317），在C端處具有6×his標籤	MSLETAYKPFLASSALVPTTPTAFQNELKTFRDSLISSCKKKNILITDTSSWLGFQVYSTQAPSVQAASTLGFELKAINSLVNKLAECGLSKFIKVYRPQLPIETPANNPEESDEADQAPWTPMPLEIAFQGDRESVLKAMNAITGMQDYLFTVNSIRIRNERMMPPPIANPAAAKPAAAQPATGAASLTPADEAAAPAAPAIQQVIKPYMGKEQVFVQVSLNLVHFNQPKAQEPSEDHHHHHH
8	Amuc_1100（31-317，Y289A），在C端處具有6×his標籤	MIVNSKRSELDKKISIAAKEIKSANAAEITPSRSSNEELEKELNRYAKAVGSLETAYKPFLASSALVPTTPTAFQNELKTFRDSLISSCKKKNILITDTSSWLGFQVYSTQAPSVQAASTLGFELKAINSLVNKLAECGLSKFIKVYRPQLPIETPANNPEESDEADQAPWTPMPLEIAFQGDRESVLKAMNAITGMQDYLFTVNSIRIRNERMMPPPIANPAAAKPAAAQPATGAASLTPADEAAAPAAPAIQQVIKP AMGKEQVFVQVSLNLVHFNQPKAQEPSEDHHHHHH
9	Amuc_1100（81-317，Y289A），在C端處具有6×his標籤	MSLETAYKPFLASSALVPTTPTAFQNELKTFRDSLISSCKKKNILITDTSSWLGFQVYSTQAPSVQAASTLGFELKAINSLVNKLAECGLSKFIKVYRPQLPIETPANNPEESDEADQAPWTPMPLEIAFQGDRESVLKAMNAITGMQDYLFTVNSIRIRNERMMPPPIANPAAAKPAAAQPATGAASLTPADEAAAPAAPAIQQVIKP AMGKEQVFVQVSLNLVHFNQPKAQEPSEDHHHHHH
10	Amuc_1100（31-317），在N端處具有6×his標籤和腸激酶識別位點	MHHHHHHDDDDKIVNSKRSELDKKISIAAKEIKSANAAEITPSRSSNEELEKELNRYAKAVGSLETAYKPFLASSALVPTTPTAFQNELKTFRDSLISSCKKKNILITDTSSWLGFQVYSTQAPSVQAASTLGFELKAINSLVNKLAECGLSKFIKVYRPQLPIETPANNPEESDEADQAPWTPMPLEIAFQGDRESVLKAMNAITGMQDYLFTVNSIRIRNERMMPPPIANPAAAKPAAAQPATGAASLTPADEAAAPAAPAIQQVIKPYMGKEQVFVQVSLNLVHFNQPKAQEPSED
11	Amuc_1100（81-317），在N端處具有6×his標籤和腸激酶識別位點	MHHHHHHDDDDKSLETAYKPFLASSALVPTTPTAFQNELKTFRDSLISSCKKKNILITDTSSWLGFQVYSTQAPSVQAASTLGFELKAINSLVNKLAECGLSKFIKVYRPQLPIETPANNPEESDEADQAPWTPMPLEIAFQGDRESVLKAMNAITGMQDYLFTVNSIRIRNERMMPPPIANPAAAKPAAAQPATGAASLTPADEAAAPAAPAIQQVIKPYMGKEQVFVQVSLNLVHFNQPKAQEPSED
12	Amuc_1100（31-317，Y289A），在N端處具有6×his標籤和腸激酶識別位點	MHHHHHHDDDDKIVNSKRSELDKKISIAAKEIKSANAAEITPSRSSNEELEKELNRYAKAVGSLETAYKPFLASSALVPTTPTAFQNELKTFRDSLISSCKKKNILITDTSSWLGFQVYSTQAPSVQAASTLGFELKAINSLVNKLAECGLSKFIKVYRPQLPIETPANNPEESDEADQAPWTPMPLEIAFQGDRESVLKAMNAITGMQDYLFTVNSIRIRNERMMPPPIANPAAAKPAAAQPATGAASLTPADEAAAPAAPAIQQVIKP AMGKEQVFVQVSLNLVHFNQPKAQEPSED
13	Amuc_1100（81-317，Y289A），在N端處具有6×his標籤和腸激酶識別位點	MHHHHHHDDDDKSLETAYKPFLASSALVPTTPTAFQNELKTFRDSLISSCKKKNILITDTSSWLGFQVYSTQAPSVQAASTLGFELKAINSLVNKLAECGLSKFIKVYRPQLPIETPANNPEESDEADQAPWTPMPLEIAFQGDRESVLKAMNAITGMQDYLFTVNSIRIRNERMMPPPIANPAAAKPAAAQPATGAASLTPADEAAAPAAPAIQQVIKP AMGKEQVFVQVSLNLVHFNQPKAQEPSED

本技術領域中具有通常知識者能夠理解，表1所列的Amuc_1100的胺基酸序列N端的甲硫胺酸（M）由起始密碼子編碼，但在蛋白成熟過程中會被酶切掉。在某些實施方式中，上述Amuc_1100的胺基酸序列可以不包括N端的甲硫胺酸（M）。但是，編碼甲硫胺酸（M）的密碼子在轉譯過程中是必要的，因此，在關於基因工程菌的實施方式中，Amuc_1100的編碼序列包括編碼甲硫胺酸（M）的密碼子。

本文所提供的Amuc_1100多肽可透過所屬領域中的各種眾所周知方法產生，例如從天然材料分離和純化、重組表現、化學合成等。所產生的Amuc_1100多肽可透過所屬領域中眾所周知的純化方法進一步純化。

Amuc_1100多核苷酸可包含編碼本文所提供的Amuc_1100多肽中的任一種多肽的多核苷酸。

B. 經基因工程改造的宿主細胞

在某些實施方案中，本文所提供的方法包含向個體施用有效量的表現本文所提供的Amuc_1100的經基因工程改造的宿主細胞。本揭露內容的另一方面為提供一種包含外源性表現卡匣的經基因工程改造的宿主細胞，所述外源性表現卡匣包含編碼可操作地連接於訊號肽的Amuc_1100的核苷酸序列，其中經基因工程改造的宿主細胞從1×10 ⁹CFU的經基因工程改造的宿主細胞分泌至少20 ng、至少15 ng、至少10 ng、至少9 ng、至少8 ng、至少7 ng、至少6 ng、至少5 ng、至少4 ng、至少3 ng、至少2 ng、至少1 ng Amuc_1100。

在某些實施方案中，經基因工程改造的宿主細胞包含外源性表現卡匣，所述外源性表現卡匣包含編碼可操作地連接於訊號肽的Amuc_1100的核苷酸序列，其中經基因工程改造的宿主細胞從1×10 ⁹CFU的經基因工程改造的宿主細胞分泌至少20 ng、至少15 ng、至少10 ng、至少9 ng、至少8 ng、至少7 ng、至少6 ng、至少5 ng、至少4 ng、至少3 ng、至少2 ng、至少1 ng Amuc_1100。

經基因工程改造的宿主細胞（例如經基因工程改造的細菌）為在藥物開發探索中的新型治療劑。在一些實施方案中，將一種或多種疾病治癒基因整合到細菌基因組中，且活的經工程改造的細菌充當遞送系統，以在調節病原性訊號的身體部位（例如小腸或結腸）處產生一種或多種基因藥物。其被稱為細菌載體基因療法或重組活生物治療產品（LBP）。其為開發用於人類疾病的新穎類別的藥劑的人類微生物群和合成生物學兩個領域中的新方法。本發明人意外地發現，本發明中使用的經基因工程改造的宿主細胞實現與自然界中嗜黏蛋白阿克曼氏菌產生的Amuc_1100的量相比，顯著增強的Amuc_1100的表現和分泌。在某些實施方案中，本發明中使用的經基因工程改造的宿主細胞產生的Amuc_1100的表現量與自然界中嗜黏蛋白阿克曼氏菌產生的Amuc_1100的表現量相比提高至少10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%。此外，一些已有的研究資料表明，阿克曼氏菌對宿主生理條件具有正反兩面作用。儘管有研究支持使用活的或者滅活的阿克曼氏菌能提高癌症對PD-1抗體的反應率，Amuc_1100蛋白或者表現Amuc_1100的經基因工程改造的細菌所賦予的增強作用應該更加安全和更有特異性。

儘管術語「基因工程改造」常常用於描述大量用於生物體的遺傳訊息的人工修飾的技術，但在整個說明書和請求項書中，所述術語僅關於從供體微生物體和適合的載體形成重組DNA，基於所需遺傳訊息選擇，並且將所選擇的DNA引入到適合的微生物體（宿主微生物體）中，由此所需（外來）遺傳訊息成為宿主的遺傳互補序列的一部分的體外技術而採用。如在整個說明書和申請專利範圍中所用，術語「經基因工程改造的宿主細胞」意指透過此技術製備的宿主細胞。

如本文所用，術語「宿主細胞」是指其中以允許編碼Amuc_1100的多核苷酸表現的方式引入外源性表現卡匣（包含含有表現卡匣的載體）的細胞。宿主細胞還包含本發明宿主細胞或其衍生物的任何後代。應理解，所有後代可能與母細胞不同，因為可能存在在複製期間發生的突變。然而，當使用術語「宿主細胞」時，包含所述後代。可用於本發明的宿主細胞包含細菌細胞、真菌細胞（例如酵母細胞）、植物細胞或動物細胞。在某一實施方案中，宿主細胞為低級真核細胞，如酵母細胞，或宿主細胞可為原核細胞，如細菌細胞。將表現卡匣引入到宿主細胞中可以透過磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚醣介導的轉染或電穿孔實現（Davis, L.、Dibner, M.、Battey, I., 《基本分子生物學方法（ Basic Methods in Molecular Biology）》（1986））。

在一些實施方案中，本揭露內容的宿主細胞包含益生微生物體。如本文所用，術語「微生物體」包含細菌、古細菌、酵母、藻類和絲狀真菌。在一些實施方案中，本發明中使用的微生物體是非病原性微生物體。「非病原性微生物體」是指不能在宿主中引起疾病或有害反應的微生物體。在一些實施方案中，非病原性微生物體不含脂多醣（LPS）。在一些實施方案中，非病原性微生物體為共生細菌。在一些實施方案中，非病原性微生物體為減毒病原性細菌。

在一些實施方案中，經基因工程改造的宿主細胞（例如細菌）為革蘭氏陰性細菌（Gram-negative bacteria）。經基因工程改造的宿主細胞（例如細菌）為革蘭氏陽性細菌（Gram-positive bacteria）。示範性細菌包含但不限於芽孢桿菌（ Bacillus）（例如凝結芽孢桿菌（ Bacillus coagulans）、枯草芽孢桿菌（ Bacillus subtilis））、擬桿菌（ Bacteroides）（例如脆弱擬桿菌（ Bacteroides fragilis）、枯草擬桿菌（ Bacteroides subtilis）、多形擬桿菌（ Bacteroides thetaiotaomicron））、雙歧桿菌（ Bifidobacterium）（例如青春雙歧桿菌（ Bifidobacterium adolescentis）、兩歧雙歧桿菌（ Bifidobacterium bifidum）、短雙歧桿菌（ Bifidobacterium breve） UCC2003、嬰兒雙歧桿菌（ Bifidobacterium infantis）、乳酸雙歧桿菌（ Bifidobacterium lactis）、長雙歧桿菌（ Bifidobacterium longum））、短桿菌（ Brevibacteria）、柄桿菌（ Caulobacter）、梭菌（ Clostridium）（例如丙酮丁醇梭菌（ Clostridium acetobutylicum）、丁酸梭菌（ Clostridium butyricum）、丁酸梭菌 M-55、宮入丁酸梭菌（ Clostridium butyricum miyairi）、匙形梭菌（ Clostridium cochlearum）、費爾西納梭菌（ Clostridium felsineum）、溶組織梭菌（ Clostridium histolyticum）、多酶梭菌（ Clostridium multifermentans）、諾維氏梭菌（ Clostridium novyi-ΝΎ）、類腐敗梭菌（ Clostridium paraputrificum）、巴氏梭菌（ Clostridium pasteureanum）、蝕果膠梭菌（ Clostridium pectinovorum）、產氣莢膜梭菌（ Clostridium perfringens）、紅色梭菌（ Clostridium roseum）、生孢梭菌（ Clostridium sporogenes）、第三梭菌（ Clostridium tertium）、破傷風梭菌（ Clostridium tetani）、酪丁酸梭菌（ Clostridium tyrobutyricum））、短小棒狀杆茵（ Corynebacterium parvum）、腸球菌（ Enterococcus）、大腸桿菌（ Escherichia coli）（例如大腸桿菌 MG1655、大腸桿菌 Nissle 1917）、乳桿菌（ Lactobacillus）、乳球菌（ Lactococcus）、李斯特菌（ Listeria）、分支桿菌（ Mycobacterium）（例如牛分支桿菌（ Mycobacterium bovis））、酵母（ Saccharomyces）、沙門氏菌（ Salmonella）（豬霍亂沙門氏菌（ Salmonella choleraesuis）、鼠傷寒沙門氏菌（ Salmonella typhimurium））、葡萄球菌（ Staphylococcus）、鏈球菌（ Streptococcus）、弧菌（ Vibrio）（例如霍亂弧菌（ Vibrio cholera））。在某些實施方案中，經基因工程改造的細菌選自由以下組成的群組：屎腸球菌（ Enterococcus faecium）、嗜酸乳桿菌（ Lactobacillus acidophilus）、保加利亞乳桿菌（ Lactobacillus bulgaricus）、乾酪乳桿菌（ Lactobacillus casei）、約氏乳桿菌（ Lactobacillus johnsonii）、副乾酪乳桿菌（ Lactobacillus paracasei）、胚芽乳桿菌（ Lactobacillus plantarum）、洛德乳桿菌（ Lactobacillus reuteri）、鼠李糖乳桿菌（ Lactobacillus rhamnosus ）、雷特氏乳球菌（ Lactococcus lactis）和布拉迪酵母（ Saccharomyces boulardii）。在一些實施方案中，經基因工程改造的細菌為大腸桿菌。

「益生微生物體」是指在攝食時可提供健康益處的微生物體。益生微生物體（也稱為「益生菌」）通常作為具有特別添加的活性活培養物（如優酪乳、大豆優酪乳中）的發酵食品的一部分或作為膳食增補劑被攝食。一般來說，益生菌幫助腸道微生物群保持（或重新找到）其平衡、完整性和多樣性。益生菌的作用可以是菌株依賴性的。因此在本發明的上下文中，「益生組合物」不限於食品或食品增補劑，但其通常指示包含有益於患者的微生物體的任何細菌組合物。所述益生組合物可因此為藥劑或藥物。

在一些實施方案中，益生微生物體為益生細菌或益生酵母。在一些實施方案中，益生細菌選自由以下組成的群組：擬桿菌、雙歧桿菌（例如兩歧雙歧桿菌）、梭菌、埃希氏菌、乳桿菌（例如嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、副乾酪乳桿菌、胚芽乳桿菌）和乳球菌，任選地，所述益生細菌屬於埃希氏菌屬，並且任選地，所述益生細菌屬於物種大腸桿菌的菌株 Nissle 1917（ EcN）。在一些實施方案中，益生酵母選自由以下組成的群組：釀酒酵母、產朊假絲酵母、乳酸克魯維酵母和卡氏酵母。在一些實施方案中，益生微生物體為大腸桿菌的菌株 Nissle 1917（ EcN）。

在一些實施方案中，外源性表現卡匣整合於經基因工程改造的宿主細胞的質體中。「質體」意指與宿主細胞的一種或多種染色體不同並且與一種或多種染色體分開複製的實質上小於染色體的環狀或線性DNA分子。「質體」可以約每細胞一個拷貝數或每細胞超過一個拷貝數形式存在。一般來說，宿主細胞內質體的維持需要抗生素選擇，但也可以使用營養缺陷體互補。

在一些實施方案中，外源性表現卡匣整合於經基因工程改造的宿主細胞的基因組中。在一些實施方案中，外源性表現卡匣透過CRISPR-Cas基因組編輯系統整合於經基因工程改造的宿主細胞的基因組中。測試所選擇的基因組位點並且將其用於整合Amuc_1100基因卡匣。將對基因卡匣和細菌基因組進行一系列修飾以確保異源基因將以一定量表現並且將對底盤（chassis）宿主細胞的生物化學和生理活性沒有重大負面影響。

i. 表現卡匣

本文所提供的表現Amuc_1100的經基因工程改造的宿主細胞包含外源性表現卡匣，所述外源性表現卡匣包含編碼任選地可操作地連接於訊號肽的本文所提供的Amuc_1100多肽的多核苷酸序列，和一個或多個調節元件。本揭露內容的另一方面為提供所述外源性表現卡匣，其包含編碼本文所提供的Amuc_1100多肽的多核苷酸序列。

如本文所用，術語「表現卡匣」是指能夠引導特定核苷酸序列在適當的宿主細胞中表現的DNA序列，包含可操作地連接於所關注的核苷酸序列的啟動子，所述所關注的核苷酸序列可操作地連接於終止訊號。其還通常包含核苷酸序列恰當轉譯所需的序列。編碼區通常編碼所關注蛋白質，但也可以在反義方向的意義上編碼所關注的功能RNA，例如反義RNA或非轉譯RNA。包含所關注的核苷酸序列的表現卡匣可以是嵌合的，這意味著其元件中的至少一個相對於其其它元件中的至少一個是異源的。

表現卡匣適合於在本文所提供的宿主細胞中表現Amuc_1100多肽。表現卡匣可以裸核酸建構體的形式使用。或者，表現卡匣可以作為核酸載體（例如，如上文所描述的表現載體）的一部分引入。適合於宿主細胞（如細菌細胞、真菌細胞（例如酵母細胞）、植物細胞或動物細胞）的載體可以包含質體和病毒載體。載體可以包含側接表現卡匣的序列，所述序列包含與真核基因組序列，例如哺乳動物基因組序列或病毒基因組序列同源的序列。這將允許透過同源重組將表現卡匣引入真核細胞或病毒的基因組中。

如本文所用，術語「重組」是指在體外合成或以其它方式操縱的多核苷酸（例如，「重組多核苷酸」或「重組表現卡匣」），指使用重組多核苷酸或重組表現卡匣在細胞或其它生物系統中產生產物的方法，或指由重組多核苷酸編碼的多肽（「重組蛋白」）。重組多核苷酸涵蓋接合到表現卡匣或載體中的來自不同來源的核酸分子，以表現例如融合蛋白；或透過誘導性或組成性表現多肽產生的蛋白質（例如，本發明的表現卡匣或載體可操作地連接於異源多核苷酸，例如Amuc_1100編碼序列）。重組表現卡匣涵蓋可操作地連接於一個或多個調節元件的重組多核苷酸。

在一些實施方案中，表現卡匣包含一個或多個調節元件，所述調節元件包含一個或多個選自由以下組成的群組的元件：啟動子、核糖體結合位點（RBS）、順反子、終止子和其任何組合。

如本文所用，術語「啟動子」是指含有RNA聚合酶的結合位點並且起始DNA轉錄的通常在編碼區上游的非轉譯DNA序列。啟動子區還可包含充當基因表現的調控因子的其它元件。在一些實施方案中，啟動子適合於起始經基因工程改造的宿主細胞中的編碼Amuc_1100多肽的多核苷酸。在一些實施方案中，啟動子為組成型啟動子或誘導型啟動子。

術語「組成型啟動子」是指能夠促進在其控制下和/或與其可操作地連接的編碼序列或基因的連續轉錄的啟動子。組成型啟動子和變異體是所屬領域中眾所周知的，並且包含但不限於BBa_J23119、BBa_J23101、BBa_J23102、BBa_J23103、BBa_J23109、BBa_J23110、BBa_J23114、BBa_J23117、USP45_啟動子、Amuc_1102_啟動子、OmpA_啟動子、BBa_J23100、BBa_J23104、BBa_J23105、BBa_I14018、BBa_J45992、BBa_J23118、BBa_J23116、BBa_J23115、BBa_J23113、BBa_J23112、BBa_J23111、BBa_J23108、BBa_J23107、BBa_J23106、BBa_I14033、BBa_K256002、BBa_K1330002、BBa_J44002、BBa_J23150、BBa_I14034、Oxb19、oxb20、BBa_K088007、Ptet、Ptrc、PlacUV5、BBa_K292001、BBa_K292000、BBa_K137031和BBa_K137029。示範性組成型啟動子的核苷酸序列包含選自由以下組成的群組的核苷酸序列：如表2中所示的SEQ ID NO: 14-54，和其具有至少80%（例如至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%）序列一致性的同源序列。在一些實施方案中，組成型啟動子包含SEQ ID NO: 15的核苷酸序列。在一些實施方案中，所述啟動子在體外，例如在培養、擴增和/或製造條件下具有活性。在一些實施方案中，所述啟動子在體內，例如在體內環境，例如腸道和/或腫瘤微環境中存在的條件下具有活性。

如本文所用，術語「誘導型啟動子」是指可以透過外部刺激，如化學、光、激素、壓力或病原體，在一種或多種細胞類型中啟用的受調控的啟動子。誘導型啟動子和變異體為所屬領域中眾所周知的，並且包含但不限於PLteto1、galP1、PLlacO1、Pfnrs。在一些實施方案中，示範性誘導型啟動子的核苷酸序列包含選自由以下組成的群組的核苷酸序列：如表2中所示的SEQ ID NO: 55-58，和其具有至少80%（例如至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%）序列一致性的同源序列。在一些實施方案中，誘導型啟動子包含SEQ ID NO: 58的核苷酸序列。

在一些實施方案中，啟動子為內源啟動子或外源啟動子。如本文所用，「外源啟動子」是指與編碼區可操作組合的啟動子，其中所述啟動子不是生物體基因組中與所述編碼區天然相關的啟動子。基因組中與編碼區天然相關或相連的啟動子被稱為所述編碼區的「內源啟動子」。

如本文所用，術語「核糖體結合位點」（「RBS」）是指起始蛋白質轉譯時核糖體結合於的mRNA上的序列。RBS為大約35個核苷酸長，並且含有三個離散結構域：（1）Shine-Dalgarno（SD）序列，（2）間隔區，和（3）編碼序列（CDS）的前五到六個密碼子。RBS和變異體在所屬領域中眾所周知，並且包含但不限於USP45、合成型（Synthesized）、Amuc_1102、OmpA。示範性RBS的核苷酸序列包含選自由以下組成的群組的核苷酸序列：如表2中所示的SEQ ID NO: 70-73，和其具有至少80%（例如至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%）序列一致性的同源序列。

如本文所用，術語「順反子」是指經轉錄且編碼多肽的核酸序列的區段。順反子和變異體在所屬領域中眾所周知，並且包含但不限於GFP、BCD2、螢光素酶、MBP。示範性順反子的核苷酸序列包含選自由以下組成的群組的核苷酸序列：如表2中所示的SEQ ID NO: 66-69，和其具有至少80%（例如至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%）序列一致性的同源序列。

如本文所用，術語「終止子」是指可酶併入的核苷酸，其防止核苷酸後續併入到所得多核苷酸鏈，並且由此中斷聚合酶介導的延伸。在一些實施方案中，本揭露內容中使用的終止子為T7終止子。在一些實施方案中，終止子包含選自由以下組成的群組的核苷酸序列：如表2中所示的SEQ ID NO: 74-75，和其具有至少80%（例如至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%）序列一致性的同源序列。

在某些實施方案中，在本文所提供的外源性表現卡匣中，編碼Amuc_1100的多核苷酸序列可操作地連接於訊號肽。

如本文所用，術語「訊號肽」或「訊號序列」是指可以用於將異源多肽分泌到經培養細菌的周質或培養基中或將Amuc_1100多肽分泌到周質中的肽。異源多肽的訊號可以與細菌同源，或其可以是異源的，包含對於細菌中所產生的多肽原生的訊號。對於Amuc_1100，訊號序列通常為細菌細胞內源性的，但其不必是內源性的，只要其對於其目的有效即可。分泌肽的非限制性實例包含OppA（ECOLIN_07295）、OmpA、OmpF、cvaC、TorA、fdnG、dmsA、PelB、HlyA、黏附素（ECOLIN_19880）、DsbA（ECOLIN_21525）、Gltl（ECOLIN_03430）、GspD（ECOLIN_16495）、HdeB（ECOLIN_19410）、MalE（ECOLIN_22540）、PhoA（ECOLIN_02255）、PpiA（ECOLIN_18620）、TolB、tort、mglB和lamB。

在某些實施方案中，本文提供的用於Amuc_1100分泌的訊號肽包含Usp45、OmpA、DsbA、pelB、celCD、sat或Amuc_1100的內源訊號肽。編碼示範性訊號肽的核苷酸序列包含選自由以下組成的群組的核苷酸序列：如表2中所示的SEQ ID NO: 59-65，和其具有至少80%（例如至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%）序列一致性的同源序列。在一些實施方案中，訊號肽包含選自由以下組成的群組的胺基酸序列：如表3中所示的SEQ ID NO: 76-82，和其具有至少80%（例如至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%）序列一致性的同源序列。在一些實施方案中，訊號肽可操作地連接於Amuc_1100的N端。

在一些實施方案中，表現卡匣包含編碼可操作地連接於訊號肽和自轉運蛋白結構域的Amuc_1100的核苷酸序列，其中訊號肽和自轉運蛋白結構域可操作地連接於Amuc_1100的相對端，例如訊號肽可操作地連接於Amunc_1100的N端，並且自轉運蛋白結構域可操作地連接於Amunc_1100的C端。所述建構體可用於V型自分泌介導的分泌，其中在透過原生分泌系統（如Sec系統）將前體蛋白質從細胞質易位到周質隔室中時，去除N端訊號肽，並且另外，一旦自分泌物易位跨越外膜，可以透過自催化或蛋白酶催化的例如OmpT裂解去除C端自轉運蛋白結構域，從而將成熟蛋白質（例如Amuc_1100多肽）釋放到細胞外環境中。

表 2. 示範性啟動子、 RBS 、順反子、訊號肽和終止子的核苷酸序列

調節元件	名稱	核苷酸序列	SEQ ID NO.
組成型啟動子	BBa_J23119	ttgacagctagctcagtcctaggtataatgctagc	14
BBa_J23101	tttacagctagctcagtcctaggtattatgctagc	15
BBa_J23102	ttgacagctagctcagtcctaggtactgtgctagc	16
BBa_J23103	ctgatagctagctcagtcctagggattatgctagc	17
BBa_J23109	tttacagctagctcagtcctagggactgtgctagc	18
BBa_J23110	tttacggctagctcagtcctaggtacaatgctagc	19
BBa_J23114	tttatggctagctcagtcctaggtacaatgctagc	20
BBa_J23117	ttgacagctagctcagtcctagggattgtgctagc	21
USP45_啟動子	aaagtgttttgtaatcataaagaaatattaaggtggggtaggaatagtataatatgtttattcaaccgaacttaatg	22
Amuc_1102_啟動子	gggccgagcatgtggaaacacctctgccaggtcaagcccgcagccatgccgcatgtttttttcttgaccgcccgggcagaaccgtcgggcggagccgtgtcatgctccacacacgctacatggaaagaaacaagagatttttgctagccacagttcggtttttggtgtaactaatc	23
OmpA_啟動子	gtaaatttaggattaatcctggaactttttttgtcgcccagccaatgctttcagtcgtgactaattttccttgcggaggcttgtctgaagcggtttccgcgattttcttctgtaaattgtcgctgacaaaaaagattaaacgtaccttatacaagacttttttttcatatgcctgacggagttcacacttgtaagttttcaactacgttgtagactttacatcgccaggggtgctcggcataagccgaagatatcggtagagttaatattgagcagatccccggtgaaggatttaaccgtgttatctcgttggagatattcatggcgtattttggatga	24
BBa_J23100	ttgacggctagctcagtcctaggtacagtgctagc	25
BBa_J23104	ttgacagctagctcagtcctaggtattgtgctagc	26
BBa_J23105	tttacggctagctcagtcctaggtactatgctagc	27
BBa_I14018	gtttatacataggcgagtactctgttatgg	28
BBa_J45992	ggtttcaaaattgtgatctatatttaacaa	29
BBa_J23118	ttgacggctagctcagtcctaggtattgtgctagc	30
BBa_J23116	ttgacagctagctcagtcctagggactatgctagc	31
BBa_J23115	tttatagctagctcagcccttggtacaatgctagc	32
BBa_J23113	ctgatggctagctcagtcctagggattatgctagc	33
BBa_J23112	ctgatagctagctcagtcctagggattatgctagc	34
BBa_J23111	ttgacggctagctcagtcctaggtatagtgctagc	35
BBa_J23108	ctgacagctagctcagtcctaggtataatgctagc	36
BBa_J23107	tttacggctagctcagccctaggtattatgctagc	37
BBa_J23106	tttacggctagctcagtcctaggtatagtgctagc	38
BBa_I14033	agaggttccaactttcaccataatgaaaca	39
BBa_K256002	caccttcgggtgggcctttctgcgtttata	40
BBa_K1330002	ggctagctcagtcctaggtactatgctagc	41
BBa_J44002	aaagtgtgacgccgtgcaaataatcaatgt	42
BBa_J23150	ggctagctcagtcctaggtattatgctagc	43
BBa_I14034	taaacaactaacggacaattctacctaaca	44
Oxb19	aagctgttgtgaccgcttgctctagccagctatcgagttgtgaaccgatccatctagcaattggtctcgatctagcgataggcttcgatctagctatgtatcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtataatgtgtggtgctggttagcgcttgctat	45
oxb20	aagctgttgtgaccgcttgctctagccagctatcgagttgtgaaccgatccatctagcaattggtctcgatctagcgataggcttcgatctagctatgtagaaacgccgtgtgctcgatcgcttgataaggtccacgtagctgctataattgcttcaacagaacatattgactatccggtattacccggc	46
BBa_K088007	catacgccgttatacgttgtttacgctttg	47
Ptet	taattcctaatttttgttgacactctatcgttgatagagttattttaccactccctatcagtgatagagaaaa	48
Ptrc	ttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaattgtgag	49
PlacUV5	cccaggctttacactttatgcttccggctcgtataatgtgtggaattgtgag	50
BBa_K292001	tgctagctactagagattaaagaggagaaa	51
BBa_K292000	ggctagctcagtcctaggtacagtgctagc	52
BBa_K137031	ccccgaaagcttaagaatataattgtaagc	53
BBa_K137029	atatatatatatatataatggaagcgtttt	54
誘導型啟動子	PLteto1	tccctatcagtgatagagattgacatccctatcagtgatagagatactgagcacatcagcaggacgcactgacc	55
galP1	attccactaatttattccatgtcacacttttcgcatctttgttatgctatggttatttcataccataa	56
PLlacO1	ataaatgtgagcggataacaattgacattgtgagcggataacaagatactgagcacatcagcaggacgcactgacc	57
Pfnrs	aaaaacgccgcaaagtttgagcgaagtcaataaactctctacccattcagggcaatatctctctt	58
訊號肽	Usp45	atgaagaaaaagatcattagcgcgatcctgatgagcaccgtgattctgagcgcggcggcgccgctgagcggtgtttatgcg	59
OmpA	atgaagaaaaccgcgattgcgattgcggtggcgctggcgggtttcgcgaccgttgcgcaggcg	60
DsbA	atgaagaaaatctggctggcgctggcgggtctggtgctggcgttcagcgcgagcgcg	61
pelB	atgaagtacctgctgccgaccgcggcggcgggtctgctgctgctggcggcgcagccggcgatggcg	62
celCD	atggaaggaaacactcgtgaagacaattttaaacatttattaggtaatgacaatgttaaacgc	63
sat	atgaataaaatatactcccttaaatatagtgctgccactggcggactcattgctgtttctgaattagcgaaaagagtttctggtaaaacaaaccgaaaacttgtagcaacaatgttgtctctggctgttgccggtacagtaaatgca	64
Amuc_1100的內源訊號肽	atgagcaactggatcaccgacaacaaaccggctgcgatggttgcgggtgtgggcctgctgctgttcctgggtctgagcgcgaccggctac	65
順反子	GFP	atgcgtaaaggcgaagagaaggaggttaactga	66
BCD2	atgaaagcaattttcgtactgaaacatcttaatcatgctaaggaggttttctaa	67
螢光素酶	atgattatgtccggttataaggaggttaactga	68
MBP	atgaaaatcgaagcaggtaaactggtacagaaggaggttaactga	69
RBS	USP45	ggaggaaaaattaaaaaagaac	70
合成型	aaagaggagaaa	71
Amuc_1102	agggaa	72
OmpA	taacgagg	73
終止子	終止子1	cgagctcgatagtgctagtgtagatcgctactagagccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctctactagagtcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcgtttatatactagaagcggccgctgcag	74
終止子2	cgagctcgatagtgctagtgtagatcgctactagagccaggcatcaaataaaacgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctctactagagtcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcgtttatatactagaagcggccgctgcag	75

表 3. 示範性訊號肽的胺基酸序列

SEQ ID NO.	名稱	胺基酸序列
76	Usp45	MKKKIISAILMSTVILSAAAPLSGVYA
77	OmpA	MKKTAIAIAVALAGFATVAQA
78	DsbA	MKKIWLALAGLVLAFSASA
79	pelB	MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA
80	celCD	MEGNTREDNFKHLLGNDNVKR
81	sat	MNKIYSLKYSAATGGLIAVSELAKRVSGKTNRKLVATMLSLAVAGTVNA
82	Amuc_1100的內源訊號肽	MSNWITDNKPAAMVAGVGLLLFLGLSATGY

ii. 宿主細胞中的分泌系統和 / 或輸出路徑

在一些實施方案中，訊號肽可以透過存在於經基因工程改造的宿主細胞（例如經基因工程改造的細菌）中的輸出路徑和/或分泌系統加工。訊號肽通常在輸出的前體蛋白質的N端，並且可以將前體蛋白質引導到細菌細胞質膜中的輸出路徑。分泌系統能夠在從經工程改造的宿主細胞（如細菌）分泌成熟蛋白質之前從前體蛋白質去除訊號肽。

如本文所用，術語「分泌系統」在本文中與「輸出系統」和「輸出路徑」可互換地使用，是指能夠從微生物（例如細菌細胞質）分泌或輸出所表現的多肽產物（例如Amuc_1100多肽）的原生或非原生分泌機制。如大腸桿菌的革蘭氏陰性細菌中從外向內，存在外膜（OM）、肽聚醣細胞壁、周質、內膜（IM）和細胞質隔室。OM為極有效且選擇性的滲透性屏障。OM為由內葉處的磷脂和外葉處的醣脂以及脂蛋白和β桶形蛋白組成的脂質雙層。OM透過稱為Lpp的脂蛋白固定到底層肽聚醣。周質密集地填充有蛋白質，且其比細胞質更黏稠。IM為磷脂雙層並且主要位置容納在能量產生、脂質生物合成、蛋白質分泌和轉運中起作用的膜蛋白。

在細菌中，存在兩種常見蛋白質輸出路徑，包含普遍存在的一般分泌（或Sec）路徑和雙精胺酸易位（或Tat）路徑。通常，Sec路徑處理未折疊狀態的較高分子量前體蛋白質，其中訊號肽將基質蛋白質靶向到膜結合的Sec移位酶。前體目標蛋白質遞送到移位酶並且透過SecA、SecD和SecF穿過SecYEG孔。伴侶蛋白SecB、GroEL-GroES、DnaK-DnaJ-GrpE輔助目標蛋白運輸。Tat路徑通常運輸完全折疊或甚至寡聚狀態的蛋白質，且革蘭氏陰性和陽性細菌中都由組分TatA、TatB和TatC組成。在膜易位之後，透過訊號肽酶去除訊號肽並且分泌成熟蛋白質。

對於革蘭氏陰性細菌，其具有專用單步分泌系統，並且分泌系統的非限制性實例包含Sat分泌系統、I型分泌系統（T1SS）、II型分泌系統（T2SS）、III型分泌系統（T3SS）、IV型分泌系統（T4SS）、V型分泌系統（T5SS）、VI型分泌系統（T6SS）和多藥物流出泵的抗藥性-結瘤-分裂（resistance-nodulation-division，RND）家族、各種單膜分泌系統。

在一些實施方案中，分泌系統對於經基因工程改造的宿主細胞是原生或非原生的系統。對於宿主細胞「原生」意思是分泌系統通常存在於宿主細胞中，而對於宿主細胞「非原生」意思是分泌系統不通常存在於宿主細胞中，例如額外分泌系統，如來自細菌或病毒的不同物種、菌株或亞菌株的分泌系統，或與來自同一亞型的宿主細胞的未經修飾的分泌系統相比經修飾和/或突變的分泌系統。

在一些實施方案中，分泌系統經工程改造和/或優化以使得經基因工程改造的宿主細胞中的至少一種外膜蛋白編碼基因被刪除、失活或抑制。在一些實施方案中，所述外膜蛋白選自由以下組成的群組：OmpC、OmpA、OmpF、OmpT、pldA、pagP、tolA、Pal、To1B、degS、mrcA和lpp。

為了製造能夠分泌所需治療性蛋白質或肽的革蘭氏陰性細菌（例如EcN），需要基因工程改造細菌宿主並且使其具有「漏」或去穩定化的外膜，但不影響宿主細菌化學物理活性。基因，例如lpp、ompC、ompA、ompF、ompT、pldA、pagP、tolA、to1B、pal、degS、degP和nlpI可以被刪除或誘發突變以產生「漏」的外膜。Lpp為細菌細胞中最豐富的多肽，且充當細菌細胞壁與肽聚醣的主要「訂書針」。lpp的缺失對細菌生長具有極小影響，但增加Amuc_1100的分泌，例如增加至少一倍。誘導型啟動子可以用於替換所選擇的一種或多種基因的內源啟動子以使對細胞存活率的負面影響最小化。

基因或編碼區的「刪除/缺失」或「失活」或「抑制」意指使由所述基因或編碼區編碼的酶或蛋白質不產生，或以非活性形式產生於宿主細胞中，或以低於在相同或類似生長條件下在宿主細胞的野生型形式中發現的含量的含量在宿主細胞中產生。這可以透過例如以下方法中的一種或多種實現：（1）同源重組，（2）基於RNA干擾的技術，（3）ZFN和TALEN，（4）CRISPR/Cas系統。

在一些實施方案中，分泌系統經工程改造以使得至少一種伴侶蛋白編碼基因被擴增、過表現或活化。

伴侶蛋白涉及許多重要的生物過程，如寡聚蛋白複合物的蛋白質折疊和聚集，使蛋白質前體維持在未折疊狀態以促進蛋白質跨膜運輸，並使變性的蛋白質能夠解聚和修復。其主要是輔助其它肽維持正常構象，以形成正確的寡聚結構，從而發揮正常的生理功能。各種伴侶蛋白是所屬領域中眾所周知的。在一些實施方案中，伴侶蛋白選自由以下組成的群組：dsbA、dsbC、dnaK、dnaJ、grpE、groES、groEL、tig、fkpA、surA、skp、PpiD和DegP。在一些實施方案中，伴侶蛋白選自由以下組成的群組：來自70 kDa熱休克蛋白（Hsp70）的胞質SSA亞家族的Ssa1p、Ssa2p、Ssa3p和Ssa4p，BiP、Kar2、Lhs1、Sil1、Sec63、蛋白二硫鍵異構酶Pdi1p。

基因或編碼區的「過表現（overexpressed/overexpression）」意指使由所述基因或編碼區編碼的酶或蛋白質以高於在相同或類似生長條件下在宿主細胞的野生型形式中發現的含量的含量在宿主細胞中產生。這可以透過例如以下方法中的一種或多種實現：（1）安設更強的啟動子，（2）安設更強的核糖體結合位點，如5'-AGGAGG的DNA序列，位於轉譯起始密碼子上游約四到十個鹼基處，（3）安設終止子或更強的終止子，（4）改進在編碼區中的一個或多個位點處的密碼子的選擇，（5）提高mRNA穩定性，和（6）透過在染色體中引入多個拷貝數或將卡匣置於多拷貝數質體上來增加基因的拷貝數。由過表現的基因產生的酶或蛋白質稱為「過產生」的。「過表現」的基因或「過產生」的蛋白質可以對於宿主細胞是原生的，或其可以透過基因工程改造方法從不同生物體移植到宿主細胞中，在後一種情況下，酶或蛋白質和編碼酶或蛋白質的基因或編碼區稱為「外來」或「異源」的。外來或異源基因和蛋白質為過表現和過產生的，因為其不存在於未工程改造的宿主細胞中。

對於酵母，分泌系統主要包含初生蛋白質易位、內質網（ER）中的蛋白質折疊、醣基化、蛋白質分選和運輸。轉譯期間訊號肽一從核糖體出現，新合成的膜或分泌蛋白質就由訊號識別顆粒（SRP）識別，隨後靶向到穿過Sec61或Ssh1易位子孔的轉譯後分泌。已實施各種方法以改進酵母中的異源蛋白質產生：（1）工程改造訊號肽並且提高啟動子強度和質體拷貝數；（2）工程改造宿主菌株的轉譯後路徑，例如過表現ER折疊伴侶蛋白和囊泡運輸組件，和減少細胞間和細胞外蛋白水解。異源蛋白質的分泌的示範性酵母分泌訊號肽包含釀酒酵母α-交配因子（α-Mating Factor，α-MF）肽原前體（pre pro-peptide）、來自馬克斯克魯維酵母（ Kluyveromyces marxianus）的菊粉酶的訊號肽、來自普通菜豆凝集素（ Phaseolus vulgaris agglutinin）的PHAE的訊號肽、病毒毒素原前體（prepro toxin）的訊號肽、米根黴（Rhizopus oryzae）澱粉酶或來自真菌裡氏木黴（ Trichoderma reesei）的疏水蛋白訊號序列的訊號肽。

iii. 基因組整合位點

在一些實施方案中，外源性表現卡匣整合於經基因工程改造的宿主細胞的基因組中。在一些實施方案中，外源性表現卡匣透過CRISPR-Cas基因組編輯系統整合於經基因工程改造的宿主細胞的基因組中。本文提供的任何適合的宿主細胞都可以經工程改造，以使得外源性表現卡匣整合到基因組中。

在一些實施方案中，經基因工程改造的宿主細胞為大腸桿菌的菌株 Nissle 1917（ EcN），並且外源性表現卡匣整合到EcN基因組中的位點中。EcN基因組中的適合整合位點可為表4中列出的任何位點（圖14中展示，agaI/rsmI作為實例展示）。在一些實施方案中，EcN基因組中的適合整合位點為整合位點agaI/rsmI。

用於本發明中的Amuc_1100整合的EcN基因組的基因組位點包含表4中列出的任何位點。不希望受任何理論束縛，但認為表4中列出的EcN的基因組位點對於插入Amuc_1100的表現卡匣，透過以下特徵中的至少一個是有利的：（1）所述位點的工程改造所影響的一種或多種細菌基因不是EcN生長所必需的，並且不改變宿主細菌的生物化學和生理活性，（2）所述位點可以容易地被編輯，和（3）所述位點中的Amuc_1100基因卡匣可以被轉錄。整合位點地圖展示於圖15中。用於編輯EcN中的對應基因組位點的sgRNA序列展示於下表4中。

表 4. 用於編輯 EcN 中的對應基因組位點的 sgRNA 序列 .

整合位點	sgRNA	SEQ ID NO.
agaI/rsmI（約3645 kbp）	ggcgagttaacgacgacaca	83
araBC（約69 kbp）	cgttgaactgggtgtggaat	84
cadA（約4822 kbp）	ctgaaaccgctgcggcgatg	85
cadA（約4822 kbp）	gttcgcagtggaagtaccgt	86
dapA（約2842 kbp）	ctgtgcaaacaagtgtctca	87
kefB（約3840 kbp）	gccggaagacactatgaagc	88
lacZ（約450 kbp）	tcgcacagcgtgtaccacag	89
maeB（約2819 kbp）	gaaggggaagaggcgcgcgt	90
malE/K:（約4687 kbp）	cggtttagttcacagaagcc	91
malP/T（約3908 kbp）	ttgcgtattttcaaaaagcg	92
rhtB/C:（約4409 kbp）	tcatcagagtaagtcggata	93
yicS/nepI（約4241 kbp）	ctgaccaacgcttctttacc	94
adhE（約1467 kbp）	ccgaagtccctgtgtgcttt	95
galK（約816 kbp）	ccctgccactcacaccattc	96
glk（約2763 kbp）	ccttctcctggcaagcttac	97
ldhA（約1586 kbp）	cgacaagaagtacctgcaac	98
lldD（約4148 kbp）	gttatcgtgatgcgcattct	99
maeA（約1675 kbp）	taacacccagcccgatgccc	100
nth（約1800 kbp）	atattactggaacaacataa	101
pflB（約975 kbp）	ccgtgacgttatccgcacca	102
rnC（約2939 kbp）	tatcgccttcatccacacga	103
tkrA（ghrB）（約4090 kbp）	ccgggctggatgtcttcgaa	104
yieN（ravA）（約2327 kbp）	gagggtgagccataatgaag	105
yjcS（約4772 kbp）	ggatatgtggggtaacgacg	106
LPP（約1846 kbp）	acgttcaggctgctaaagat	107

iv. 營養缺陷體

在一些實施方案中，本揭露內容的宿主細胞進一步包含營養缺陷相關基因中的至少一個失活或缺失。

為了產生環境友好型細菌，可以透過誘發突變使細菌細胞生存所必需的一些必需基因被刪除或失活，使經工程改造的細菌成為營養缺陷體。如本文所用，術語「營養缺陷體」是指宿主細胞（例如微生物體菌株）的生長需要特定代謝物的外部來源，所述代謝物由於後天基因缺陷而不能合成。如本文所用，術語「營養缺陷相關基因」是指宿主細胞（例如微生物體，如細菌）生存所需的基因。營養缺陷相關基因可以是微生物體產生生存或生長所必需的營養素所必需的，或者可以是檢測環境中調節轉錄因子活性的訊號所必需的，其中不存在所述訊號將引起細胞死亡。

在一些實施方案中，營養缺陷型修飾意圖使微生物體在缺乏外源添加的生存或生長所必需的營養素時死亡，因為所述微生物體缺乏產生必需營養素所必需的一種或多種基因。在一些實施方案中，本文所述的經基因工程改造的細菌中的任一種還包含細胞生存和/或生長所需基因的缺失或突變。

細菌中的各種營養缺陷相關基因是所屬領域中眾所周知的。示範性營養缺陷相關基因包含但不限於：thyA、cysE、glnA、ilvD、leuB、lysA、serA、metA、glyA、hisB、ilvA、pheA、proA、thrC、trpC、tyrA、uraA、dapF、flhD、metB、metC、proAB、yhbV、yagG、hemB、secD、secF、ribD、ribE、thiL、dxs、ispA、dnaX、adk、hemH、IpxH、cysS、fold、rplT、infC、thrS、nadE、gapA、yeaZ、aspS、argS、pgsA、yeflA、metG、folE、yejM、gyrA、nrdA、nrdB、folC、accD、fabB、gltX、ligA、zipA、dapE、dapA、der、hisS、ispG、suhB、tadA、acpS、era、rnc、fisB、eno、pyrG、chpR、Igt、ft＞aA、pgk、yqgD、metK、yqgF、plsC、ygiT、pare、ribB、cca、ygjD、tdcF、yraL、yihA、ftsN、murl、murB、birA、secE、nusG、rplJ、rplL、rpoB、rpoC、ubiA、plsB、lexA、dnaB、ssb、alsK、groS、psd、orn、yjeE、rpsR、chpS、ppa、valS、yjgP、yjgQ、dnaC、ribF、IspA、ispH、dapB、folA、imp、yabQ、flsL、flsl、murE、murF、mraY、murD、ftsW、murG、murC、ftsQ、ftsA、ftsZ、IpxC、secM、secA、can、folK、hemL、yadR、dapD、map、rpsB、in/B、nusA、ftsH、obgE、rpmA、rplU、ispB、murA、yrbB、yrbK、yhbN、rpsl、rplM、degS、mreD、mreC、mreB、accB、accC、yrdC、def、fint、rplQ、rpoA、rpsD、rpsK、rpsM、entD、mrdB、mrdA、nadD、hlepB、rpoE、pssA、yfiO、rplS、trmD、rpsP、ffh、grpE、yfjB、csrA、ispF、ispD、rplW、rplD、rplC、rpsJ、fusA、rpsG、rpsL、trpS、yr/F、asd、rpoH、ftsX、ftsE、ftsY、frr、dxr、ispU、rfaK、kdtA、coaD、rpmB、djp、dut、gmk、spot、gyrB、dnaN、dnaA、rpmH、rnpA、yidC、tnaB、glmS、glmU、wzyE、hemD、hemC、yigP、ubiB、ubiD、hemG、secY、rplO、rpmD、rpsE、rplR、rplF、rpsH、rpsN、rplE、rplX、rplN、rpsQ、rpmC、rplP、rpsC、rplV、rpsS、rplB、cdsA、yaeL、yaeT、lpxD、fabZ、IpxA、IpxB、dnaE、accA、tilS、proS、yafF、tsf、pyrH、olA、rlpB、leuS、Int、glnS、fldA、cydA、in/A、cydC、ftsK、lolA、serS、rpsA、msbA、IpxK、kdsB、mukF、mukE、mukB、asnS、fabA、mviN、rne、yceQ、fabD、fabG、acpP、tmk、holB、lolC、lolD、lolE、purB、ymflC、minE、mind、pth、rsA、ispE、lolB、hemA、prfA、prmC、kdsA、topA、ribA、fabi、racR、dicA、yd B、tyrS、ribC、ydiL、pheT、pheS、yhhQ、bcsB、glyQ、yibJ和gpsA。

在一種修飾中，必需基因thyA被刪除或被另一基因替代，使得經基因工程改造的細菌依賴於外源胸腺嘧啶而生長或生存。向生長培養基添加胸腺嘧啶或天然具有高胸腺嘧啶含量的人體腸道可以支援thyA營養缺陷型細菌的生長和生存。這種修飾是為了確保經基因工程改造的細菌不能在腸道外或在缺乏營養缺陷基因產物的環境中生長和生存。

在一些實施方案中，宿主細胞是一種或多種選自由以下組成的群組的物質的營養缺陷體：尿嘧啶、白胺酸、組織胺酸、色胺酸、賴胺酸、甲硫胺酸、腺嘌呤和非天然存在的胺基酸。在一些實施方案中，非天然存在的胺基酸選自由以下組成的群組：l-4,4ʹ-聯苯丙胺酸、對乙醯基-l-苯丙胺酸、對碘-l-苯丙胺酸和對疊氮基-l-苯丙胺酸。

在一些實施方案中，宿主細胞包含別構調控的轉錄因子，所述轉錄因子能夠檢測調節所述轉錄因子的活性的環境中的訊號，其中不存在所述訊號將引起細胞死亡。所述「訊號傳導分子-轉錄因子」對可以包含選自由以下組成的群組的任一種或多種：色胺酸-TrpR、IPTG-LacI、苯甲酸酯衍生物-XylS、ATc-TetR、半乳糖-GalR、雌二醇-雌激素受體雜合蛋白、纖維二糖-CelR和高絲胺酸內酯-luxR。

v. 內源質體的缺失

在一些實施方案中，經基因工程改造的細菌具有一種或多種內源質體的缺失。

一些底盤細菌宿主包含一種或多種內源質體，其為其轉錄消耗相當多的資源。不受任何理論束縛，認為刪除這些內源質體以釋放可以更好地用於異源基因表現的資源。

一種或多種內源質體可以透過所屬領域中已知的方法從目標宿主細胞去除。舉例來說，EcN包含兩種內源質體pMUT1和pMUT2，其可以透過以下方法從EcN去除。將表現pMUT1的sgRNA的pCBT003_pMUT1_sgRNA和pCBT001質體轉化到EcN中以去除pMUT1（EcNΔpMUT1）。為了刪除pMUT2，類比、製造抗卡那黴素（kanamycin）性質體pMUT2（pMUT2-kana）且轉移到EcNΔpMUT1中。隨後，在補充有卡那黴素的LB瓊脂板上選擇經轉化菌株。EcNΔpMUT1/pMUT2-kana在補充有增加濃度的卡那黴素的LB液體中生長若干代直至pMUT2完全被pMUT2-kana替換。EcNΔpMUT1/pMUT2-kana的pMUT2替換轉殖用pCBT001轉化，且隨後用表現卡那黴素基因的sgRNA的質體pCBT003_Kana-sgRNA轉化以切割和去除pMUT2-kana。耗乏兩種內源質體的EcN菌株可以透過PCR檢測檢驗。

vi. 分泌產率增強的調節元件和整合位點的組合

經基因工程改造的宿主細胞（如細菌）中的異源蛋白質的分泌產率通常較低。為了治療疾病，宿主細胞必須能夠產生和分泌足夠量的Amuc_1100，並且還應維持宿主細胞的健康。本發明人測試了多種基因組整合位點、調節元件和分泌系統，並且鑒別出可以在Amuc_1100表現和分泌中提供出人意料的效果的組合。

在某些實施方案中，經基因工程改造的宿主細胞（例如細菌）的特徵在於：（1）具有可以增加Amuc_1100轉錄的調節元件的組合；（2）具有整合到多個基因組位點中的Amuc_1100基因的多於一個拷貝數；（3）具有經修飾以得到更好的蛋白分泌的訊號肽；（4）具有經修飾的分泌系統，其產生「漏」的外膜；（5）具有額外伴侶基因；（6）具有減少的內源質體或去除內源質體；或其任何組合。

本發明人已經個別地或組合地集中測試基因組整合位點、啟動子、RBS和順反子，以增加Amuc_1100基因轉錄。

在某些實施方案中，經基因工程改造的宿主細胞包含提供經基因工程改造的宿主細胞中Amuc_1100基因的轉錄增加的啟動子、RBS和順反子的組合。啟動子、RBS和順反子可以選自表2中的列表，以及本文中涵蓋組合中的任一種。

在一些實施方案中，啟動子選自由以下組成的群組：BBa_J23119、BBa_J23101、BBa_J23102、BBa_J23103、BBa_J23109、BBa_J23110、BBa_J23114、BBa_J23117、USP45_啟動子、Amuc_1102_啟動子、OmpA_啟動子、BBa_J23100、BBa_J23104、BBa_J23105、BBa_I14018、BBa_J45992、BBa_J23118、BBa_J23116、BBa_J23115、BBa_J23113、BBa_J23112、BBa_J23111、BBa_J23108、BBa_J23107、BBa_J23106、BBa_I14033、BBa_K256002、BBa_K1330002、BBa_J44002、BBa_J23150、BBa_I14034、Oxb19、oxb20、BBa_K088007、Ptet、Ptrc、PlacUV5、BBa_K292001、BBa_K292000、BBa_K137031、BBa_K137029、PLteto1、galP1、PLlacO1和Pfnrs。在一些實施方案中，啟動子包含BBa_ J23101。在一些實施方案中，啟動子為BBa_ J23101。在一些實施方案中，RBS選自由以下組成的群組：USP45、合成型、Amuc_1102和OmpA。在一些實施方案中，順反子選自由以下組成的群組：GFP、BCD2、螢光素酶和MBP。

在一些實施方案中，啟動子包含BBa_J23101，RBS包含選自由以下組成的群組的至少一種（例如1、2、3、4種）：USP45、合成型、Amuc_1102和OmpA，和/或順反子包含選自由以下組成的群組的至少一種（例如1、2、3、4種）：GFP、BCD2、螢光素酶和MBP。

在一些實施方案中，啟動子包含Pfnrs，RBS包含選自由以下組成的群組的至少一種（例如1、2、3、4種）：USP45、合成型、Amuc_1102和OmpA，和/或順反子包含選自由以下組成的群組的至少一種（例如1、2、3、4種）：GFP、BCD2、螢光素酶和MBP。

在以上提供的實施方案中的任一個中，終止子選自表2中列出的任何終止子。在一些實施方案中，終止子是T7終止子。

在一些實施方案中，啟動子包含BBa_J23101或Pfnrs，RBS包含SEQ ID NO: 71，訊號肽包含USP45，並且終止子包含終止子1。在一些實施方案中，啟動子包含BBa_J23101或Pfnrs，RBS包含SEQ ID NO: 71，訊號肽包含USP45，並且終止子包含終止子2。在一些實施方案中，啟動子包含SEQ ID NO: 15，RBS包含SEQ ID NO: 71，訊號肽的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 59，並且終止子包含SEQ ID NO: 74。在一些實施方案中，啟動子包含SEQ ID NO: 15，RBS包含SEQ ID NO: 71，訊號肽的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 59，並且終止子包含SEQ ID NO: 75。

示範性優化Amuc_1100基因卡匣展示於以下SEQ ID NO: 108和SEQ ID NO: 148中。

SEQ ID NO: 108 (啟動子J23101_ RBS_ usp45_ his 標籤_ 腸激酶__ Amuc_1100_ 終止子 1)：

SEQ ID NO: 148 (啟動子J23101_ RBS_ usp45_ his 標籤_ 腸激酶__ Amuc_1100_ 終止子 2)：

在某些實施方案中，經基因工程改造的宿主細胞包含或進一步包含整合到經基因工程改造的宿主細胞的多個基因組位點中的多於一個Amuc_1100基因的拷貝數。

在一些實施方案中，整合位點可以是選自由以下組成的群組的任一個或多個位點：agaI/rsmI、araBC、cadA、cadA、dapA、kefB、lacZ、maeB、malE/K、malP/T、rhtB/C、yicS/nepI、adhE、galK、glk、ldhA、lldD、maeA、nth、pflB、rnC、tkrA（ghrB）、yieN（ravA）、yjcS和LPP。在一些實施方案中，整合位點可以選自表4中列出的任何位點。在一些實施方案中，整合位點為整合位點agaI/rsmI。

在某些實施方案中，經基因工程改造的宿主細胞包含或進一步包含伴侶基因的一個或多個額外拷貝數，或伴侶基因的表現增加。伴侶基因可以選自由以下組成的群組：dsbA、dsbC、dnaK、dnaJ、grpE、groES、groEL、tig、fkpA、surA、skp、PpiD、DegP和其任何組合。在某些實施方案中，伴侶基因選自由以下組成的群組：dsbA、dsbC、dnaK、dnaJ、grpE、groES、groEL、tig、fkpA、surA或其任何組合。在某些實施方案中，經基因工程改造的宿主細胞包含一種或多種選自由以下組成的群組的伴侶基因：dsbA、dsbC、dnaK、dnaJ、grpE和其任何組合。在某些實施方案中，經基因工程改造的宿主細胞包含一種或多種選自由以下組成的群組的伴侶基因：groES、groEL、tig、fkpA、surA和其任何組合。伴侶基因中的一些或全部可為宿主細胞（例如細菌）基因組中的插入的一個或多個拷貝數，或其原生啟動子可以被更強的啟動子替換，以便增加其表現量。

在某些實施方案中，經基因工程改造的宿主細胞在編碼外膜蛋白的基因中包含或進一步包含失活或缺失。外膜蛋白為LPP。

圖16展示一個編碼Amuc_1100基因卡匣的經基因工程改造和優化的EcN的實例。在此經工程改造的菌株中，調整包含啟動子、RBS、順反子和編碼訊號肽的元件的Amuc_1100基因調節元件。將三個Amuc_1100基因卡匣拷貝數插入到不同位點（agaI/rsmI、malPT和pflB）中，透過插入包含dsbA、dsbC、dnaK、dnaJ、grpE、groES、groEL、tig、fkpA和surA的伴侶基因，並且還透過刪除lpp和thyA基因來修飾宿主EcN。

C. 免疫檢查點調節劑

免疫檢查點是免疫系統的調節因子，並且屬於免疫抑制路徑或免疫刺激路徑，負責T細胞反應的協同刺激性或抑制性的相互作用，並且調節和維持自身耐受性和生理免疫反應。

如本文所用，術語「免疫刺激路徑」一般是指對宿主中免疫系統具有刺激作用的訊號傳導路徑，其可以積極地調節細胞因子分泌、NK細胞活化、T細胞增殖和抗體產生等。本文所使用的免疫刺激檢查點分子可以是任何已知或稍後發現的免疫刺激檢查點分子。免疫刺激路徑中發現的非限制性免疫刺激檢查點分子可以尤其包含：CD2、CD3、CD7、CD16、CD27、CD30、CD70、CD83、CD28、CD80（B7-1）、CD86（B7-2）、CD40、CD40L（CD154）、CD47、CD122、CD137、CD137L、OX40（CD134）、OX40L（CD252）、NKG2C、4-1BB、LIGHT、PVRIG、SLAMF7、HVEM、BAFFR、ICAM-1、2B4、LFA-1、GITR、ICOS（CD278）或ICOSLG（CD275）。

如本文所用，術語「免疫抑制路徑」一般是指對宿主中免疫系統具有抑制作用的宿主中的訊號傳導路徑，其可以負面地調節細胞因子分泌、NK細胞活化、T細胞增殖和抗體產生等。本文所使用的免疫抑制檢查點分子可以是任何已知或稍後發現的免疫抑制檢查點分子。免疫抑制路徑中發現的非限制性免疫抑制檢查點分子可以尤其包含：LAG3（CD223）、A2AR、B7-H3（CD276）、B7-H4（VTCN1）、BTLA（CD272）、BTLA、CD160、CTLA-4（CD152）、IDO1、IDO2、TDO、KIR、LAIR-1、NOX2、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、VISTA、SIGLEC-7（CD328）、TIGIT、PVR（CD155）、TGFβ或SIGLEC9（CD329）。

如本文所用，術語「免疫檢查點調節劑」是指調節（例如，完全或部分地減少、抑制、干擾、活化、刺激、增加、加強或支持）免疫刺激或免疫抑制路徑內的一個或多個免疫檢查點的功能的分子。

在一些實施方案中，本文所提供的免疫檢查點調節劑包含免疫活化劑，其可完全或部分地活化、刺激、增加、加強、支持或正調節免疫刺激路徑內的一個或多個免疫檢查點的功能，或可完全或部分地降低、抑制、干擾或負調節免疫抑制路徑內的一個或多個免疫檢查點的功能。

免疫檢查點調節劑通常能夠調節（i）自身耐受性和/或（ii）免疫反應的幅度和/或持續時間。較佳地，在本揭露內容中使用的免疫檢查點調節劑調節一個或多個人類檢查點分子的功能，並且因此為「人類免疫檢查點調節劑」。

在一些實施方案中，所述免疫檢查點調節劑包含一個或多個選自由以下組成的群組的免疫刺激檢查點的活化劑：CD2、CD3、CD7、CD16、CD27、CD30、CD70、CD83、CD28、CD80（B7-1）、CD86（B7-2）、CD40、CD40L（CD154）、CD47、CD122、CD137、CD137L、OX40（CD134）、OX40L（CD252）、NKG2C、4-1BB、LIGHT、PVRIG、SLAMF7、HVEM、BAFFR、ICAM-1、2B4、LFA-1、GITR、ICOS（CD278）、ICOSLG（CD275）和其任何組合。

在一些實施方案中，所述免疫檢查點調節劑包含一個或多個選自由以下組成的群組的免疫抑制檢查點的抑制劑：LAG3（CD223）、A2AR、B7-H3（CD276）、B7-H4（VTCN1）、BTLA（CD272）、BTLA、CD160、CTLA-4（CD152）、IDO1、IDO2、TDO、KIR、LAIR-1、NOX2、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、VISTA、SIGLEC-7（CD328）、TIGIT、PVR（CD155）、TGFβ、SIGLEC9（CD329）和其任何組合。

這些上文所提及的免疫刺激和免疫抑制路徑中的調節劑的細節在所屬領域中已知，參見例如WO 97/28259；WO 98/16247；WO 99/11275；Krieg AM等人，1995；Yamamoto S等人，1992；Ballas ZK等人，1996；Klinman DM等人，1997；Sato Y等人，1996；Pisetsky DS，1996；Shimada S等人，1986；Cowdery JS等人，1996；Roman H等人，1997；Lipford GB等人，1997；WO 98/55495和WO 00/61151等。

在一些實施方案中，本揭露內容的免疫檢查點調節劑為針對本揭露內容的免疫檢查點的抗體或其抗原結合片段或化合物。針對免疫檢查點的抗體的非限制性實例包含抗PD-1抗體（包含但不限於納武單抗（Nivolumab）、匹立珠單抗（Pidilizumab）、派立珠單抗（Pembrolizumab）（MK-3475/SCH900475、拉立珠單抗（lambrolizumab）、REGN2810、PD-1（Agenus））、抗PD-L1抗體（包含但不限於度伐單抗（durvalumab）（MEDI4736）、阿維魯單抗（avelumab）（MSB0010718C）和阿特珠單抗（atezolizumab）（MPDL3280A、RG7446、R05541267））、抗PDL-2抗體（包含但不限於AMP-224（描述於WO2010027827和WO2011066342中））、CTLA-4抗體（包含但不限於伊匹單抗（Ipilimumab）和曲美單抗（Tremelimumab）（CP675206））、抗4-1BB抗體（包含但不限於PF-05082566和烏瑞魯單抗（Urelumab））、LAG3抗體（包含但不限於BMS-986016）、抗CD27抗體（包含但不限於瓦力單抗（Varlilumab））。

在一些實施方案中，在本文所提供的方法中，使用超過一種免疫檢查點調節劑（例如抗PD-1抗體和抗PD-L1抗體）。

在一些實施方案中，免疫檢查點調節劑調節（或抑制）免疫抑制檢查點。在一些實施方案中，免疫抑制檢查點為PD-L1、PD-L2或PD-1。在一些實施方案中，免疫檢查點調節劑抑制PD-1與其配體中的任一種之間的相互作用。在一些實施方案中，免疫檢查點調節劑包含抑制或減少PD-1與其配體中的任一種之間的相互作用或訊號傳導（例如PD-L1/PD-L2或PD-1之間的相互作用）的抗體（例如人類抗體、人源化抗體或嵌合抗體）或其抗原結合片段或化合物。在一些實施方案中，免疫檢查點調節劑包含抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗PD-L2抗體、小分子PD-1抑制劑、小分子PD-L1抑制劑或小分子PD-L2抑制劑。

在一些實施方案中，本文所述的抗體（如抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體或抗PD-L2抗體）進一步包含人類或鼠類恆定區。在一些實施方案中，人類恆定區選自由以下組成的群組：IgG1、IgG2、IgG2、IgG3、IgG4。在一些實施方案中，人類恆定區為IgG1。在一些實施方案中，鼠類恆定區選自由以下組成的群組：IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3。在一些實施方案中，抗體具有減少或極小的效應功能。在一些實施方案中，極小效應功能由原核細胞中的產生造成。在一些實施方案中，極小效應功能由「無效應子Fc突變」或非醣基化造成。

因此，本文所使用的抗體可以經醣基化。抗體的醣基化通常是N-連接型或O-連接型。N-連接型是指碳水化合物部分連接於天門冬醯胺殘基的側鏈。三肽序列天門冬醯胺-X-絲胺酸和天門冬醯胺-X-蘇胺酸（其中X是除脯胺酸以外的任何胺基酸）是碳水化合物部分與天門冬醯胺側鏈的酶連接的識別序列。因此，多肽中這些三肽序列中任一種的存在產生了潛在的醣基化位點。O-連接型醣基化是指糖N-乙醯基半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一種連接於羥基胺基酸，最通常絲胺酸或蘇胺酸，但也可以使用5-羥基脯胺酸或5-羥基賴胺酸。透過改變胺基酸序列以使得上文所描述的三肽序列中的一種（用於N-連接型醣基化位點）被去除來方便地實現形成抗體的醣基化位點的去除。改變可以透過用另一胺基酸殘基（例如甘胺酸、丙胺酸或保守取代）取代醣基化位點內的天門冬醯胺、絲胺酸或蘇胺酸殘基而進行。

抗體或其抗原結合片段可以使用所屬領域中已知的方法，例如透過包含以下的製程製造：在適於產生所述抗體或片段的條件下，以適合於表現的形式培養含有編碼先前所描述的抗PD-1、抗PD-L1或抗PDL2抗體或抗原結合片段中的任一種的核酸的宿主細胞，並且回收抗體或片段。

針對本揭露內容的免疫檢查點的化合物可以是小分子化合物。如本文所用，術語「小分子化合物」意指可充當生物過程的酶基質或調節因子的低分子量化合物。一般來說，「小分子化合物」為大小小於約5千道爾頓（kD）的分子。在一些實施方案中，小分子小於約4 kD、3 kD、約2 kD或約1 kD。在一些實施方案中，小分子小於約800道爾頓（D）、約600 D、約500 D、約400 D、約300 D、約200 D或約100 D。在一些實施方案中，小分子小於約2000 g/mol、小於約1500 g/mol、小於約1000 g/mol、小於約800 g/mol或小於約500 g/mol。在一些實施方案中，小分子是非聚合物。在一些實施方案中，根據本揭露內容，小分子不是蛋白質、多肽、寡肽、肽、多核苷酸、寡核苷酸、多醣、醣蛋白、蛋白多醣等。在一些實施方案中，小分子為治療性的。在一些實施方案中，小分子是佐劑。在一些實施方案中，小分子是藥物。

在一些實施方案中，個體已表現出對免疫檢查點調節劑的不良反應或抗藥性。對免疫檢查點調節劑的「不良反應」或「抗藥性」是指接受免疫檢查點調節劑的治療的個體對治療無反應或對治療反應不良，並且由此個體的疾病、病症或病狀未得到治療。如本文所用，術語「抗藥性」是指對於治療劑（如免疫檢查點調節劑）具有難治性或復發或非反應性。可以透過現有技術中已知的方式來確定個體對免疫檢查點調節劑的治療的反應。

在一些實施方案中，個體經測定對免疫檢查點調節劑具有原發性抗藥或獲得性抗藥。如本文所用，「原發性抗藥」是指在用給定藥劑治療之前存在的抗藥性。因此，「對免疫檢查點調節劑的原發性抗藥」意味著個體在免疫檢查點調節劑治療之前對免疫檢查點調節劑具有抗藥性或非反應性。如本文所用，「獲得性耐藥」是指在用給定藥劑進行至少一次治療之後所獲得的抗藥性。在至少一次治療之前，疾病不對藥劑具有抗藥性（並且因此，疾病如同無抗藥性病症那樣對第一次治療有反應）。舉例來說，對免疫檢查點調節劑具有獲得性抗藥的個體為最初對免疫檢查點調節劑的至少一次治療有反應，且此後對免疫檢查點調節劑的後續治療產生抗藥性的個體。

D. 適應症

如上文所提及，本揭露內容提供一種治療或預防有需要的個體的癌症的方法，本揭露內容還提供一種改善接受免疫檢查點調節劑的治療的個體中癌症的治療反應的方法。術語「癌症」和「腫瘤」在本文中可互換地使用，並且是指其中細胞展現相對異常、不受控和/或自主生長，使得其呈現異常升高的增殖速率和/或特徵在於細胞增殖的顯著失控的異常生長表型的疾病、病症或病狀。在一些實施方案中，由於致癌基因的表現和活性或腫瘤抑制基因（如成視網膜細胞瘤蛋白質（Rb））的有缺陷的表現和/或活性，所述細胞部分或完全展現所述特徵。癌細胞通常呈腫瘤形式，但所述細胞可單獨存在於動物體內，或可為非致瘤性癌細胞，如白血病細胞。如本文所用，術語「癌症」包含惡變前癌症以及惡性癌症。

短語「改善治療反應」可以包含例如延遲疾病進展或減少或抑制癌症復發。

如本文所用，「延遲疾病進展」意味著推遲、阻礙、減緩、延緩、穩定化和/或延遲疾病（如癌症）的發展。這一延遲可以具有不同時間長度，取決於疾病病史和/或所治療的個體。如所屬技術領域的通常知識者顯而易見，足夠或顯著延遲可以實際上涵蓋預防，從而個體不罹患疾病。舉例來說，可延遲晚期癌症，例如轉移的發展。

如本文所用，「減少或抑制癌症復發」意思是減少或抑制腫瘤或癌症復發或腫瘤或癌症進展。如本文所公開，癌症復發和/或癌症進展包含但不限於癌症轉移。

在一些實施方案中，本揭露內容的癌症選自由以下組成的群組：結腸直腸癌、乳癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌、腎癌、子宮頸癌、骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、甲狀腺癌、子宮內膜癌、子宮癌、膀胱癌、神經內分泌癌、頭頸癌、肝癌、鼻咽癌、睾丸癌、肺癌（例如小細胞肺癌、非小細胞肺癌）、黑色素瘤、基底細胞癌、皮膚癌、鱗狀細胞皮膚癌、隆凸性皮膚纖維肉瘤、梅克爾細胞癌、成膠質細胞瘤、神經膠質瘤、肉瘤和間皮瘤。在一些實施方案中，癌症為乳癌。

如上文所提及，本揭露內容還提供一種在個體（例如人類）中誘導或改善腸道免疫性的方法。腸道微生物群居於人類已有數百萬年。細菌和人類已經確立了相對穩定且共生的進化關係。此關係使得腸道細菌具有調節和塑造腸道免疫系統和生理機能的功能。腸道微生物群失調已與多種疾病相關，所述疾病包含癌症、代謝疾病、自身免疫疾病、心血管疾病、神經退化性疾病、肝病等。近期的證據表明，腸道微生物群組合物，尤其某些細菌菌株可以預測或增加癌症免疫療法的功效。儘管許多控制腸道免疫性與腸道微生物群之間的複雜相互作用的詳細分子機制仍未被破解，但本發明人出乎意料地發現Amuc_1100（或表現Amuc_1100的經基因工程改造的宿主細胞）與免疫檢查點調節劑的組合可協同誘導或改善個體的腸道免疫性。

E. 組合

本文提供的Amuc_1100或表現Amuc_1100的經基因工程改造的宿主細胞可以透過所屬領域中已知的任何途徑施用，例如腸胃外（例如，皮下、腹膜內、靜脈內（包含靜脈內輸注）、肌肉內或皮內注射）或非腸胃外（例如，口服、鼻內、眼內、舌下、經直腸或局部）途徑。在一些實施方案中，施用是透過口服施用。

在一些實施方案中，與免疫檢查點調節劑組合施用的本文所提供的Amuc_1100或表現Amuc_1100的經基因工程改造的宿主細胞可與免疫檢查點調節劑同時施用，並且在這些實施方案中的某些中，Amuc_1100或表現Amuc_1100的經基因工程改造的宿主細胞和免疫檢查點調節劑可以作為同一藥物組合物的一部分施用。然而，與免疫檢查點調節劑「組合」施用的Amuc_1100或表現Amuc_1100的經基因工程改造的宿主細胞不必與藥劑同時施用或以與藥劑相同的組合物施用。在免疫檢查點調節劑之前或之後施用的Amuc_1100或表現Amuc_1100的經基因工程改造的宿主細胞被視為如本文中所使用的與免疫檢查點調節劑「組合」施用的短語，即使Amuc_1100或表現Amuc_1100的經基因工程改造的宿主細胞和免疫檢查點調節劑透過不同途徑施用（例如Amuc_1100或表現Amuc_1100的經基因工程改造的宿主細胞口服施用，而免疫檢查點調節劑透過注射施用）。舉例來說，Amuc_1100（或表現Amuc_1100的經基因工程改造的宿主細胞）可在免疫檢查點調節劑之前施用（例如5小時、10小時、12小時、24小時、48小時、72小時、96小時、1週、2週、3週等），施用要麼準時（punctually）要麼在施用免疫檢查點調節劑之前進行若干次，只要其在重疊時間範圍期間在個體中發揮作用即可。對於另一實例，Amuc_1100（或表現Amuc_1100的經基因工程改造的宿主細胞）可在免疫檢查點調節劑之前施用某一時間段（例如5小時、10小時、12小時、24小時、48小時、72小時、96小時、1週、2週、3週等），且隨後同時施用Amuc_1100（或表現Amuc_1100的經基因工程改造的宿主細胞）和免疫檢查點調節劑。當可能時，根據額外治療劑的產品資訊表單中列出的時間表或根據《醫師案頭參考2003（Physicians'Desk Reference 2003）》（《醫師案頭參考》第57版；Medical Economics Company；ISBN：1563634457；第57版（2002年11月））或所屬領域中眾所周知的方案，施用與本文中所揭露的Amuc_1100或表現Amuc_1100的經基因工程改造的宿主細胞組合施用的一種或多種免疫檢查點調節劑。

在一些實施方案中，本揭露內容還提供包含本揭露內容的重組表現卡匣的核酸載體，其用於與免疫檢查點調節劑組合使用。

在另一方面，本揭露內容還提供本揭露內容的經基因工程改造的宿主細胞，其用於與免疫檢查點調節劑組合使用。

III. 試劑盒

在另一方面，本揭露內容提供一種試劑盒，其包含：（a）包含本揭露內容的經基因工程改造的宿主細胞或包含分離的Amuc_1100的第一組合物；和（b）包含免疫檢查點抑制劑的第二組合物。

在一些實施方案中，第一組合物是可食用組合物，和/或第二組合物進一步包含藥學上可接受的載劑。在一些實施方案中，第一組合物是食品增補劑。在一些實施方案中，第二組合物適於口服施用或腸胃外施用。

必要時，所述試劑盒可進一步包含各種常規藥物試劑盒組分中的一種或多種，例如具有一種或多種藥學上可接受的載劑的容器、額外容器等，如對所屬技術領域的通常知識者將顯而易見。試劑盒中還可以包含作為插頁或標籤的說明書，指示應施用的組分的量、施用指南和/或混合組分的指南。

IV. 組合物

A. 包含 Amuc_1100 或其功能等效物的組合物

在一個方面，本揭露內容提供一種組合物，其包含本揭露內容的Amuc_1100或其功能等效物和生理學上可接受的載劑。

在一些實施方案中，Amuc_1100包含Amuc_1100多肽。在一些實施方案中，Amuc_1100多肽為重組Amuc_1100多肽。在一些實施方案中，Amuc_1100多肽為經純化的重組Amuc_1100多肽。在一些實施方案中，經純化的重組Amuc_1100多肽的純度為至少80重量%、85重量%、90重量%、91重量%、92重量%、93重量%、94重量%、95重量%、96重量%、97重量%、98重量%、99重量%、99.5重量%或99.9重量%。

用於本文所公開的組合物的生理學上可接受的載劑可包含例如生理學上可接受的液體、凝膠或固體載劑、水性媒劑、非水性媒劑、抗微生物劑、等滲劑、緩衝劑、抗氧化劑、懸浮劑/分散劑、螯合劑（sequestering/chelating agent）、稀釋劑、佐劑、賦形劑或無毒輔助物質、所屬領域中已知的其它組分或其各種組合。

為了進一步說明，水性媒劑可包含如氯化鈉注射液、林格注射液、等滲右旋糖注射液、無菌水注射液或右旋糖和乳酸林格注射液；非水性媒劑可包含如植物來源的不揮發性油、棉籽油、玉米油、芝麻油或花生油；抗微生物劑可為抑細菌或抑真菌濃度，和/或可以添加到在多劑量容器中的組合物中，所述容器包含苯酚或甲酚、汞劑、苯甲醇、氯丁醇、甲基和丙基對羥基苯甲酸酯、硫柳汞、苯紮氯銨和苄索氯銨。等滲劑可以包含如氯化鈉或右旋糖；緩衝劑可以包含如磷酸鹽或檸檬酸鹽緩衝劑；抗氧化劑可以包含如硫酸氫鈉；懸浮劑和分散劑可以包含如羧甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素或聚乙烯吡咯烷酮；螯合劑可以包含如乙二胺四乙酸（EDTA）或乙二醇四乙酸（EGTA）、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、氫氧化鈉、鹽酸、檸檬酸或乳酸。適合的賦形劑可包含例如水、生理鹽水、右旋糖、甘油或乙醇。適合的無毒輔助物質可包含例如潤濕劑或乳化劑、pH緩衝劑、穩定劑、溶解性增強劑或如乙酸鈉、脫水山梨糖醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或環糊精的試劑。

在一些實施方案中，本文所提供的組合物可為藥物組合物。在一些實施方案中，本文所提供的組合物可以是食品增補劑。本文所提供的組合物除本文所提供的Amuc_1100之外可以包含藥學上、營養學上（nutritionally/alimentarily）或生理學上可接受的載劑。優選形式將取決於預期施用模式和（治療性）應用。載劑可以是適合於將本文提供的Amuc_1100遞送到哺乳動物（例如人類）的胃腸道，較佳地哺乳動物的腸黏膜屏障（更較佳地結腸黏膜屏障）附近或內的任何相容性生理學上可接受的無毒物質。

組合物可為液體溶液、懸浮液、乳液、丸劑、膠囊、片劑、持續釋放製劑或散劑。口服製劑可包含標準載劑，如藥物級甘露糖醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、聚乙烯吡咯烷酮、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。

B. 包含表現 Amuc_1100 或其功能等效物的經基因工程改造的宿主細胞的組合物

在另一方面，本揭露內容還提供一種組合物，其包含表現Amuc_1100或其功能等效物的經基因工程改造的宿主細胞和生理學上可接受的載劑。宿主細胞可以約10 ⁴到約10 ¹³或約10 ⁴到約10 ¹⁵個菌落形成單位（CFU）範圍內的量存在於組合物中。舉例來說，宿主細胞的有效量可以是約10 ⁵CFU到約10 ¹³或約10 ¹⁴CFU，較佳地約10 ⁶CFU到約10 ¹³CFU，較佳地約10 ⁷CFU到約10 ¹²CFU，更佳地約10 ⁸CFU到約10 ¹²CFU的量。宿主細胞可以是活細胞或可以是死細胞。宿主細胞的有效性與本文所提供的Amuc_1100的存在相關。

在一些實施方案中，本文所揭露的組合物可以經配製用於口服施用，並且可以是營養或滋養組合物，例如食品、食品增補劑、飼料或飼料增補劑，如乳製品，例如發酵乳製品，如優酪乳或優酪乳飲料。在此情況下，組合物可包含營養學上可接受的載劑，其可為適合的食物基。所屬技術領域的通常知識者知道可涵蓋活或死微生物體且可呈現為食品增補劑（例如，丸劑、片劑等）或功能性食品（例如飲料、發酵優酪乳等）的多種配方。本文所公開的組合物還可以在膠囊、丸劑、液體溶液中配製為藥劑，例如配製為囊封的凍乾細菌等。

本文所公開的組合物可以被配製成單次施用或多次施用而對給定個體有效。舉例來說，單次施用實質上有效降低施用組合物的哺乳動物個體的靶向疾病病狀的監測症狀。

在一些實施方案中，配製組合物以使得單一口服劑量含有至少或至少約1×10 ⁴CFU的細菌實體和/或真菌實體，且單一口服劑量將通常含有約或至少1×10 ⁴、1×10 ⁵、1×10 ⁶、1×10 ⁷、1×10 ⁸、1×10 ⁹、1×10 ¹⁰、1×10 ¹¹、1×10 ¹²、1×10 ¹³的細菌實體和/或真菌實體。如果已知，例如給定菌株的細胞的濃度或所有菌株的合計濃度為例如每克組合物或每施用劑量1×10 ⁴、1×10 ⁵、1×10 ⁶、1×10 ⁷、1×10 ⁸、1×10 ⁹、1×10 ¹⁰、1×10 ¹¹、1×10 ¹²、1×10 ¹³個活細菌實體（例如CFU）。

在一些配方中，按品質計，組合物含有至少或至少約0.5%、1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或大於90%本揭露內容的宿主細胞。在一些配方中，按品質計，所施用的劑量不超過200、300、400、500、600、700、800、900毫克或1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8或1.9克的本揭露內容的宿主細胞。

C. 包含 Amuc_1100 （或本文所公開的經基因工程改造的宿主細胞）和免疫檢查點調節劑的組合物

在另一方面，本揭露內容提供一種組合物，其包含：（a）本揭露內容的經基因工程改造的宿主細胞或本揭露內容的分離的Amuc_1100；和（b）本揭露內容的免疫檢查點抑制劑。在一些實施方案中，組合物是可食用的。

在另一方面，本揭露內容提供一種包含本揭露內容的經基因工程改造的宿主細胞或分離的Amuc_1100的組合物，其用於與包含本揭露內容的免疫檢查點調節劑的製劑組合使用。在一些實施方案中，組合物可以透過所屬領域中已知的任何途徑向個體施用，例如非腸胃外（例如，口服、鼻內、眼內、舌下、經直腸或局部）途徑。

在一些實施方案中，組合物是口服組合物。在一些實施方案中，包含免疫檢查點調節劑的製劑為腸胃外（例如皮下、腹膜內、靜脈內（包含靜脈內輸注）、肌肉內或皮內注射）製劑。在一些實施方案中，包含免疫檢查點調節劑的製劑是口服製劑。

在另一方面，本揭露內容提供包含Amuc_1100（或表現Amuc_1100的經基因工程改造的宿主細胞）的組合物用於製造用於治療或預防癌症的藥劑的用途。

在另一方面，本揭露內容提供包含Amuc_1100（或表現Amuc_1100的經基因工程改造的宿主細胞）的組合物用於製造用於改善接受免疫檢查點調節劑的治療的個體中癌症的治療反應的藥劑的用途。

在另一方面，本揭露內容提供包含Amuc_1100（或表現Amuc_1100的經基因工程改造的宿主細胞）的組合物用於製造用於在個體中誘導或改善腸道免疫性的藥劑的用途。

在另一方面，本揭露內容提供包含Amuc_1100（或表現Amuc_1100的經基因工程改造的宿主細胞）的組合物用於製造用於在接受抗癌治療並且表現出腸道免疫性降低的個體中改善癌症治療反應的藥劑的用途。

提供以下實施方案是為了更好地說明所要求的發明，而不應理解為限制本發明的範圍。下述所有特定組合物、材料和方法完全或部分地落入本發明的範圍內。這些特定組合物、材料和方法並不意圖限制本發明，而是僅說明落入本發明範圍內的特定實施方案。在不脫離本發明範圍的情況下，所屬技術領域的通常知識者無需履行發明能力即可開發出等效組合物、材料和方法。應理解，可對本文所述的程式作出許多變更，但仍在本發明的範圍內。本發明人打算將所述變化形式包含在本發明的範圍內。

V.    Amuc_1100 突變體

本揭露內容還提供了一種非天然存在的Amuc_1100蛋白。在某些實施方案中，Amuc_1100多肽包含一種或多種（例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多種）在選自由以下組成的組的位置的突變：R36、S37、L39、D40、K41、K42、I43、K48、E49、K51、S52、R62、S63、K70、E71、L72、N73、R74、Y75、A76、K77、A78、Y86、K87、P88、F89、L90、A91、F103、Q104、K108、T109、F110、R111、D112、K119、K120、K121、N122、L124、I125、W131、L132、G133、F134、Q135、Y137、S138、L150、G151、F152、E153、L154、K155、A156、L160、V161、K163、L164、A165、L169、S170、K171、F172、I173、K174、V175、Y176、R177、W200、T201、L205、E206、F209、Q210、R213、E214、L217、K218、A219、M220、N221、Y229、L230、R237、I238、R242、M243、M244、P245、K255、P256、L268、T269、K287、P288、Y289、M290、K292、E293、F296、V297、F306、N307、K310和A311，其中編號相對於 SEQ ID NO: 1。

在某些實施方案中，所述Amuc_1100多肽在選自由以下組成的組的位置處包含一個或多個（例如2、3或4個）突變：S37、V175、Y289和F296，其中編號相對於SEQ ID NO：1。在某些實施方案中，所述Amuc_1100多肽包含Y289A突變，其中編號相對於SEQ ID NO：1。在某些實施方案中，所述Amuc_1100多肽包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的胺基酸序列。

本文提供的非天然存在的Amuc_1100蛋白，例如上述包含Y289A突變的Amuc_1100突變體，表現出比天然存在的對應物更高的酶消化抗性，因此對於在具有酶（該酶可以在Amuc_1100從經工程改造的細菌分泌並釋放到環境中時降解Amuc_1100）的環境中表現本文提供的Amuc_1100的經工程改造的細菌中的用途將是有利的。

另一方面，本揭露內容還提供了編碼上述非天然存在的Amuc_1100蛋白的核酸。編碼非天然存在的Amuc_1100蛋白的核酸可由本技術領域中具有通常知識者使用各種可公開獲得的工具例如tblastn（可在美國國立生物技術資訊中心（NCBI）的網站上獲得）獲得和/或優化。本技術領域中具有通常知識者可以使用工具提供的預設參數，或者可以定制適合於blast的參數，例如透過選擇合適的演算法。

VI.   Usp45 訊號肽

本揭露內容還提供了Usp45訊號肽在建構表現載體中的用途，所述表現載體包含編碼目標多肽的多核苷酸，其中所述表現載體適合在大腸桿菌中表現以允許所述目標多肽從所述大腸桿菌中表現和分泌。

本文還提供了Usp45訊號肽，用於建構表現載體，所述表現載體包含編碼目標多肽的多核苷酸，其中所述表現載體適合在大腸桿菌中表現以允許所述目標多肽從所述大腸桿菌中表現和分泌。

本文還提供了一種表現載體，其包含編碼可操作地連接至Usp45訊號肽的目標多肽的多核苷酸，其中所述表現載體適合在大腸桿菌中表現以允許所述目標多肽從所述大腸桿菌中表現和分泌。

在另一個方面，本揭露內容還提供了一種經基因工程改造的大腸桿菌，其包含外源性表現卡匣，所述外源性表現卡匣包含編碼可操作地連接至Usp45訊號肽的目標多肽的多核苷酸。本文提供的經基因工程改造的大腸桿菌能夠表現和分泌所述目標多肽。

在某些實施方案中，上述Usp45訊號肽包含如SEQ ID NO: 59所示的序列。在某些實施方案中，所述大腸桿菌是大腸桿菌的共生菌株，例如大腸桿菌Nissle 1917菌株。

所述目標多肽可以包含本文提供的Amuc_1100。所述目標多肽還可以包括除Amuc_1100之外的多肽。

Usp45訊號肽是乳酸乳球菌（ Lactococcus lactis）主要分泌蛋白的訊號肽，它是乳酸乳球菌中蛋白質分泌最常用的訊號肽（參見，例如， Jhonatan et al., Appl Environ Microbiol. 2020 Aug; 86(16): e00903-20.）。通常，Usp45訊號肽被認為僅在乳酸乳球菌中起作用，並且從未考慮或探索過其在大腸桿菌中指導蛋白質分泌的能力。因此，Usp45訊號肽在大腸桿菌（例如大腸桿菌Nissle 1917菌株）中的用途，以及在工程化的大腸桿菌（例如使用Usp45作為訊號肽來分泌目標多肽的大腸桿菌Nissle 1917菌株）中的用途是新的，並且已經實現了目標多肽（例如Amuc_1100）從大腸桿菌（例如大腸桿菌Nissle 1917菌株）中出乎意料的高分泌。

實施例

實施例 1. 重組 Amuc_1100 和其突變體的產生

針對Amuc_1100（31-317）編碼優化的DNA序列在限制酶位點NdeI和XhoI建構於質體pET-22b(+)（命名為「pET-22b (+)_Amuc_1100」，如圖1中所示）中。隨後將質體轉化到大腸桿菌BL21（DE3）中。在37℃下將經轉化細菌在LB培養基中培養到0.8的OD600值的細胞密度。Amuc_1100（31-317）表現由乳糖類似物IPTG（0.1 mM）在16℃下誘導過夜，或由IPTG（1 mM）在37℃下誘導3小時。蛋白質表現透過SDS-PAGE凝膠和考馬斯藍（Coomassie blue）染色檢測。

收集Amuc_1100（31-317）表現誘導細菌，並且將其再懸浮於緩衝液（20 mM PB，500 mM NaCl，pH 7.4）中並且透過超音波處理溶解。細胞溶解物的上清液透過螯合SFF（Ni）柱純化且透過含咪唑的緩衝液洗脫。從螯合SFF（Ni）柱收集的Amuc_1100透過Q-HP柱富集並且透過含有降低濃度的NaCl的緩衝液（20 mM PB，500 mM NaCl，pH 7.4）洗脫。經純化的重組Amuc_1100（31-317）透過胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的混合物在非還原條件下在PBS中在37℃下消化30分鐘。樣品透過SDS-PAGE凝膠和考馬斯藍染色分析。

隨後使胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶消化的Amuc_1100（31-317）經歷MS分析以檢測蛋白質的消化位點。如圖2的SEQ ID NO: 145中所示，緊鄰標記「/」的胺基酸為對於酶消化敏感的位點。確切地說，Ser37、Val175、Tyr289和Phe296（編號相對於SEQ ID NO: 1）突出顯示為對於酶消化敏感的位點。

Amuc_1100（31-317）的一些突變體可以減少蛋白酶的蛋白質降解。由上文所描述的質體（圖1）表現的C端具有6×His標籤的Amuc_1100（31-317，Y289A）的胺基酸序列（SEQ ID NO: 146）和核苷酸序列（SEQ ID NO: 147）展示於圖2中。重組Amuc_1100（31-317）蛋白質和突變蛋白質（31-317，Y289A）在37℃下透過蛋白酶胰蛋白酶（0.01 mg/ml）和α-胰凝乳蛋白酶（0.01 mg/ml）消化30分鐘。隨後使樣品經歷SDS-PAGE凝膠電泳和考馬斯藍染色。如圖3A所示，與野生型Amuc_1100蛋白相比，Amuc_1100（31-317，Y289A）蛋白對酶消化的抵抗力更強，這表明單點突變Y289A可以賦予Amuc_1100更高的穩定性。

將表現人類TLR2受體和其報告基因的HEK293細胞（InvivoGen，hkb-htlr2）接種於96孔板中並且透過Amuc_1100（31-317）或突變重組Amuc_1100（31-317，Y289A）處理。報告基因活性透過QUANTI-Blue™（InvivoGen，rep-qbs2）檢測，並且細胞存活率透過遵循試劑盒說明書透過CellTiterGlo（Promega，G7573）檢測。結果展示於圖3B中（Pam3CSK4為TLR2配體的陽性對照組）。如圖3B中所示，對於TLR2活化，Amuc_1100（31-317）、Amuc_1100（31-317，Y289A）和Pam3CSK4的EC50分別為0.535 μg/ml、0.951 μg/ml、0.351 μg/ml。所有藥劑展示對細胞存活率無顯著影響。

實施例 2. Amuc_1100 （ 31-317 ）或其突變體在癌症治療中的用途

MMTV-PyVT轉基因C57BL/6雌性小鼠用於產生自發乳癌。將9.5週齡的小鼠隨機分成每組4-5隻小鼠的6組，並且進行藥劑處理。對照組中的小鼠每日透過經口管飼用PBS處理持續4週，加經口管飼一週後每日靜脈內注射PBS持續3週。五個測試組中的小鼠用以下處理：（1）Amuc_1100（31-317）蛋白的PBS溶液（3μg/kg），每日經口管飼持續4週，（2）Amuc_1100（31-317，Y289A）蛋白的PBS溶液（3μg/kg），每日經口管飼持續4週，（3）抗PD-1抗體（InVivoMAb抗小鼠PD-1（CD279）（株RMP1-14）（BioXcell，目錄號BE0146））（經口管飼PBS一週後），每三天靜脈內注射（10mg/kg）持續3週，（4）如上文所描述的Amuc_1100（31-317）蛋白和抗PD-1抗體的組合，即Amuc_1100（31-317）（3μg/kg）每日經口管飼持續一週，且隨後抗PD-1抗體（10mg/kg，每三天靜脈內注射）與Amuc_1100（31-317）（每日經口管飼）同時，再持續3週，（5）如上文所描述的Amuc_1100（31-317，Y289A）蛋白和抗PD-1抗體的組合，即Amuc_1100（31-317，Y289A）（3μg/kg）每日經口管飼持續一週，且隨後抗PD-1抗體（10mg/kg，每三天靜脈內注射）與Amuc_1100（31-317，Y289A）（3μg/kg）（每日經口管飼）同時，再持續3週。監測所有自發產生的腫瘤。每週兩次測量腫瘤大小。密切地監測小鼠的健康狀況。分析在藥劑處理之後小鼠中的每個腫瘤的腫瘤生長速率。在研究結束時，收集腫瘤組織並且將其固定於福馬林中。進行H&E染色以測定組織中的腫瘤細胞（深色染色）。染色結果展示於圖4中，且每一組中的每隻小鼠中的所有腫瘤的平均腫瘤生長速率展示於圖5中。

如圖4和圖5中所示，Amuc_1100（31-317）蛋白質、Amuc_1100（31-317，Y289A）蛋白質和抗PD-1抗體部分地抑制腫瘤生長，而Amuc_1100（31-317）蛋白質和抗PD-1抗體的組合，和Amuc_1100（31-317，Y289A）蛋白質和抗PD-1抗體的組合協同地抑制腫瘤生長，即，比單獨任一處理顯著更有效。

還測試了Amuc_1100（31-317）或Amuc_1100（Y289A）單獨或聯合抗PD-1抗體在治療結直腸癌小鼠模型（透過將MC-38細胞皮下注射到C57BL/6小鼠中建立）中的用途，也可以觀察到類似的Amuc_1100蛋白和抗PD-1抗體之間的協同作用。

實施例 3. Amuc_1100 或其突變體對小鼠模型中的體重增加的影響

將9.5週齡的小鼠隨機分成每組4-5隻小鼠的3組，並且進行藥劑處理。對照組和測試組中的小鼠分別透過每日經口管飼，用PBS、Amuc_1100（31-317）或Amuc_1100（31-317，Y289A）（3μg/kg）處理4週。每組中的每隻小鼠的體重每週測量兩次。結果展示，與對照組相比，測試組（即用Amuc_1100（31-317）或Amuc_1100（31-317，Y289A）處理）小鼠中未觀測到體重的顯著變化。

實施例 4. Amuc_1100 或其突變體對 Treg 浸潤的影響

MMTV-PyVT轉基因C57BL/6雌性小鼠用於產生自髮乳癌。將9.5週齡的小鼠隨機分成每組4-5隻小鼠的3組，並且進行藥劑處理。對照組和測試組中的小鼠分別透過每日經口管飼，用PBS、Amuc_1100（31-317）或Amuc_1100（31-317，Y289A）處理4週。在研究結束時，收集腫瘤組織並且將其固定於福馬林中。進行H&E染色或免疫螢光分析以測定腫瘤組織中免疫細胞（包含巨噬細胞、Treg、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞等）的分佈。

實施例 5. 細菌基因組編輯方案

5.1 sgRNA設計

在目標整合位點序列的兩股上尋找連同NGG PAM序列的20 bp序列（N20NGG）並且針對EnN基因組進行blast處理。選擇獨特的20 bp序列作為目標整合位點的sgRNA。選擇sgRNA上游和下游的300-500 bp序列作為左同源臂（LHA）和右同源臂（RHA）。

5.2 sgRNA質體建構

將sgRNA序列添加到pCBT003質體上gRNA骨架的反向引子的5'端，隨後將gRNA骨架與設計的sgRNA序列一起從pCBT003擴增，PCR產物和pCBT003質體都用PstI和SpeI進行消化，將消化的pCBT003質體去磷酸化，且隨後與消化的PCR片段接合，來產生pCBT003_sgRNA質體（圖6）。

pCBT003的核酸序列如圖19中的SEQ ID NO: 150所示。

5.3 供體基因卡匣設計

待整合到EcN基因組的目標基因由金斯瑞（GeneScript）在轉殖質體（例如pUC57）上合成（pUC57_Amuc_1100，如圖7中所示）。從質體pUC57_Amuc_1100擴增目標基因，從EcN的基因組擴增所選整合位點的LHA和RHA。用於這些片段的PCR的引子彼此具有15-20 bp的同源序列，因此它們可以透過重疊PCR與由LHA和RHA側接的目標基因接合。線性PCR產物用作供體基因卡匣。

5.4 質體電穿孔

5.4.1 製造EcN的電轉感受態細胞

將LB瓊脂板上的單一EcN菌落接種到試管中的3 mL LB培養基且在37℃下在震盪（225 rpm）下培育過夜，將300 μL此過夜培養物接種到125燒瓶中的30 mL LB培養基，在37℃下在震盪（225 rpm）下培育直到OD600達到約0.6，隨後，將細胞用20 mL、10 mL和5 mL 10%冰冷甘油洗滌3次，並且最終再懸浮於300 μL 10%冰冷甘油中，並且以每管100 μL分離到1.5 mL離心管。

5.4.2 pCBT001質體的電穿孔

將100-200 ng pCBT001質體（即表現Cas9蛋白的質體，參見SEQ ID NO: 149中的多核苷酸序列）添加到100 μL EcN電轉感受態細胞中，將混合物轉移到2 mm電穿孔比色皿，並且在2.5 kV、25 μF、200 Ω下電穿孔。隨後透過將細胞再懸浮於1 mL SOC中並且在30℃下在震盪（225 rpm）下培育兩小時來回收細胞。在回收之後，將所有細胞塗鋪於補充有50 μg/mL壯觀黴素（spectinomycin）和鏈黴素的LB瓊脂板上並且在30℃下培育過夜。板上生長的菌落為具有pCBT001質體的EcN（EcN/pCBT001，如圖8中所示）。

pCBT001的核酸序列如圖20中的SEQ ID NO: 149所示。

5.4.3 製造EcN/pCBT001的電轉感受態細胞

將補充有50 μg/mL壯觀黴素和鏈黴素的LB瓊脂板上的單一EcN/pCBT001菌落接種到試管中的補充有50 μg/mL壯觀黴素和鏈黴素的3 mL LB液體培養基，且在30℃下在震盪（225 rpm）下培育過夜，將300 μL此過夜培養物接種到125燒瓶中的補充有50 μg/mL壯觀黴素和鏈黴素的30 mL LB液體培養基，在30℃下在震盪（225 rpm）下培育。在培育1小時之後，將IPTG以1 mM的濃度添加到培養物中。當OD600達到約0.6時，將細胞用20 mL、10 mL和5 mL 10%冰冷甘油洗滌3次，並且最終再懸浮於300 μL 10%冰冷甘油中，並且以每管100 μL分離到1.5 mL離心管。

5.4.4 pCBT003_sgRNA質體和供體基因卡匣的電穿孔

含有由整合位點的LHA和RHA側接的目標基因的供體卡匣的約2 μg PCR產物，和表現整合位點的sgRNA的100到200 ng pCBT003_sgRNA被轉化到如章節5.4.2中所描述的EcN/pCBT001的電轉感受態細胞中。在30℃下在1 mL SOC中2小時回收之後，將所有細胞塗鋪於補充有50 μg/mL壯觀黴素、鏈黴素和100 μg/mL氨苄西林（ampicillin）的LB瓊脂板。

5.5 目標基因整合的驗證

用於驗證的引子設計在LHA的上游和RHA的下游。選取章節5.4.4的板上生長的單一菌落，且使用驗證引子基於PCR產物的大小選擇具有目標基因整合的恰當菌株。

5.6 pCBT003_sgRNA質體的去除

所選擇的恰當菌株在30℃下在震盪（220 rpm）下在補充有50 μg/mL壯觀黴素、鏈黴素和10 mM阿拉伯糖的LB液體培養基中培養過夜，隨後將培養物稀釋10 ⁶倍並且將100 μL塗鋪於補充有50 μg/mL壯觀黴素和鏈黴素的LB瓊脂板上。隨後在補充有50 μg/mL壯觀黴素、鏈黴素和100 μg/mL氨苄西林的LB瓊脂板和補充有50 μg/mL壯觀黴素和鏈黴素的LB瓊脂板上挑選並點樣單一菌落。僅生長在補充有50 μg/mL壯觀黴素和鏈黴素的LB瓊脂板上的菌落是pCBT003_sgRNA質體消除的菌落。

5.7 pCBT001質體的去除

將來自章節5.6的pCBT003_sgRNA消除的菌株在LB液體培養基中在42℃下培育過夜，隨後將培養物稀釋106倍並且將100 μL塗鋪於LB瓊脂板上。隨後在LB瓊脂板和補充有50 μg/mL壯觀黴素和鏈黴素的LB瓊脂板上挑選並點樣單一菌落。僅生長在LB瓊脂板上的菌落是pCBT001消除的菌落。

5.8膜蛋白剔除策略

用於剔除目標膜蛋白的sgRNA的設計和sgRNA質體的建構如前所述。選擇目標膜蛋白編碼基因上游和下游的300-500 bp序列作為左同源臂（LHA）和右同源臂（RHA）。所選剔除位點的LHA和RHA從EcN的基因組進行擴增。用於擴增這些片段的PCR引子彼此具有15-20 bp的同源序列，因此它們可以透過重疊PCR連接起來，得到的包含LHA-RHA的PCR產物用作供體基因。將得到的供體片段的PCR產物和表現剔除位點sgRNA的pCBT003_sgRNA質體同時轉化入電轉感受態細胞中，得到的單菌落用剔除位點的驗證引子進行擴增，基於擴增條帶的大小篩選成功從基因組中刪除目標蛋白的菌株。

實施例中所剔除的膜蛋白包括tolQ、tolR、tolA、pal、lpp、mrcA和ompT。tolQ剔除位點的sgRNA序列如SEQ ID NO: 166所示，該tolQ剔除位點的兩側同源臂序列分別如SEQ ID NO: 167和168所示；tolR剔除位點的sgRNA序列如SEQ ID NO: 169所示，該tolR剔除位點的兩側同源臂序列分別如SEQ ID NO: 170和171所示；tolA剔除位點的sgRNA序列如SEQ ID NO: 172所示，該tolA剔除位點的兩側同源臂序列分別如SEQ ID NO: 173和174所示；pal剔除位點的sgRNA序列如SEQ ID NO: 175所示，該pal剔除位點的兩側同源臂序列分別如SEQ ID NO: 176和177所示；lpp剔除位點的sgRNA序列如SEQ ID NO: 178所示，該lpp剔除位點的兩側同源臂序列分別如SEQ ID NO: 179和180所示；mrcA剔除位點的sgRNA序列如SEQ ID NO: 181所示，該mrcA剔除位點的兩側同源臂序列分別如SEQ ID NO: 182和183所示；ompT剔除位點的sgRNA序列如SEQ ID NO: 184所示，該ompT剔除位點的兩側同源臂序列分別如SEQ ID NO: 185和186所示。

靶向tolQ位點的sgRNA序列（SEQ ID NO: 166）： gggaaacgggataatctgag

tolQ位點的左同源臂（LHA）序列（SEQ ID NO: 167）： gtgaatacaacgctgtttcgatggccggttcgtgtctactatgaagataccgatgccggtggtgtggtgtaccacgccagttacgtcgctttttatgaaagagcacgcacagagatgctgcgtcatcatcatttcagtcaacaggcgctgatggctgaacgcgttgcctttgtggtacgtaaaatgacggtggaatattacgcacctgcgcggctcgacgatatgctcgaaatacagactgaaataacatcaatgcgtggcacctctttggttttcacgcaacgtattgtcaacgccgagaatactttgttgaatgaagcagaggttctggttgtttgcgttgacccactcaaaatgaagcctcgtgcgcttcccaagtctattgtcgcggagtttaagcagtga

tolQ位點的右同源臂（RHA）序列（SEQ ID NO: 168）： gccatggccagagcgcgtggacgaggtcgtcgcgatctcaagtccgaaatcaacattgtaccgttgctggacgtactgctggtgctgttgctgatctttatggcgacagcgcccatcatcacccagagcgtggaggtcgatctgccagacgctactgaatcacaggcggtgagcagtaacgataatccgccagtgattgttgaagtgtctggtattggtcagtacaccgtggtggttgagaaagatcgtctggagcgtttaccaccagagcaggtggtggcggaagtgtccagccgtttcaaggccaacccgaaaacggtctttctgatcggtggcgcaaaagatgtgccttacgatgaaataattaaagcactgaacttgttacatagtgcgggtgtgaaatcggttggtttaatgacgcagcctatctaaacatctgcgtttcccttgcttgaaagagagcgggtaacaggcgaacagtttttggaaaccgaga

靶向tolR位點的sgRNA序列（SEQ ID NO: 169）： tggtattggtcagtacaccg

tolR位點的左同源臂（LHA）序列（SEQ ID NO: 170）： gcatcgtgccaatagccatgcgccggaagccgtagtggaaggggcgtcgcgtgcgatgcgtatttccatgaatcgtgaacttgaaaatctggaaacgcacattcctttcctcggtacggttggctccatcagcccgtatattggtctgtttggtacggtctgggggatcatgcacgcctttatcgccctcggggcggtaaaacaagcaacactgcaaatggttgcgcccggtatcgcagaagcgttgattgcgacggcaattggtttgttcgccgcaattccggcggtaatggcttataaccgcctcaaccagcgcgtaaacaaactggaactgaattacgacaactttatggaagagtttaccgcgattctgcaccgccaggcgtttaccgttagcgagagcaacaaggggtaa

tolR位點的右同源臂（RHA）序列（SEQ ID NO: 171）： acatctgcgtttcccttgcttgaaagagagcgggtaacaggcgaacagtttttggaaaccgagagtgtcaaaggcaaccgaacaaaacgacaagctcaagcgggcgataattatttcagcagtgctgcatgtcatcttatttgcggcgctgatctggagttcgttcgatgagaatatagaagcttcagccggaggcggcggtggttcgtccatcgacgctgtcatggttgattcaggtgcggtagttgaacagtacaaacgtatgcaaagccaggaatcaagcgcgaagcgttctgatgagcagcgcaagatgaaggagcagcaggctgctgaagaactgcgtgagaaacaagcggctgaacaggaacgcctgaagcaacttgagaaagagcggttagcggctcaggagcagaaaaagcaggctgaagaagccgcaaaacaggccgagttaaagcagaagcaagcggaagaggc

靶向tolA位點的sgRNA序列（SEQ ID NO: 172）： agaactgcgtgagaaacaag

tolA點的左同源臂（LHA）序列（SEQ ID NO: 173）： gccatggccagagcgcgtggacgaggtcgtcgcgatctcaagtccgaaatcaacattgtaccgttgctggacgtactgctggtgctgttgctgatctttatggcgacagcgcccatcatcacccagagcgtggaggtcgatctgccagacgctactgaatcacaggcggtgagcagtaacgataatccgccagtgattgttgaagtgtctggtattggtcagtacaccgtggtggttgagaaagatcgtctggagcgtttaccaccagagcaggtggtggcggaagtgtccagccgtttcaaggccaacccgaaaacggtctttctgatcggtggcgcaaaagatgtgccttacgatgaaataattaaagcactgaacttgttacatagtgcgggtgtgaaatcggttggtttaatgacgcagcctatctaaacatctgcgtttcccttgcttgaaagagagcgggtaacaggcgaacagtttttggaaaccgaga

tolA位點的右同源臂（RHA）序列（SEQ ID NO: 174）： tcgcgatgttgactgttccgacggtcaacatcaggcaccggttgccacggggttctggtagttttgtgtattttagtttgttaacattctgctaaattatcgtgggccatcggtccagataagggagatatgatgaagcaggcattacgagtagcatttggttttctcatactgtgggcatcagttctgcatgctgaagtccgcattgtgatcgacagcggtgtagattccggtcgtcctattggtgttgttcctttccagtgggcggggcctggtgcggcacctgaagatattggcggcatcgttgctgctgacttgcgtaacagcggtaaatttaatccgttagatcgtgctcgtttgccacagcagccgggtagtgcgcaggaagtacaaccagctgcatggtccgcgctgggcattgacgctgtggttgtcggtcaggtcactccgaatccggatggttcttacaatgttgcttatcaacttgttgacactggcgg

靶向pal位點的sgRNA序列（SEQ ID NO: 175）： agtcaccgtagaaggtcacg

pal位點的左同源臂（LHA）序列（SEQ ID NO: 176）： tggtcgcagtaacaataccgaaccgacctggttcccggacagccagaacctggcatttacttctgaccaggccggtcgtccgcaggtttataaagtgaatatcaacggcggtgcgccacaacgtattacctgggaaggttcgcagaaccaggatgcggatgtcagcagcgacggtaaatttatggtaatggtcagctccaacggtgggcagcagcacattgccaaacaagatctggcaacgggaggcgtacaagttctgtcgtccacgttcctggatgaaacgccaagtctggcacctaacggcactatggtaatctacagctcttctcaggggatgggatccgtgctgaatttggtttctacagatgggcgtttcaaagcgcgtcttccggcaactgatggacaggtcaaattccctgcctggtcgccgtatctgtgataataattaattgaatagtaaaggaatcattgaa

pal位點的右同源臂（RHA）序列（SEQ ID NO: 177）： gagaattgcatgagcagtaacttcagacatcaactattgagtctgtcgttactggttggtatagcggccccctgggccgcttttgctcaggcaccaatcagtagtgtcggctcaggctcggtcgaagaccgcgtcactcaacttgagcgtatttctaatgctcacagccagcttttaacccaactccagcaacaactctctgataatcaatccgatattgattccctgcgtggtcagattcaggaaaatcagtatcaactgaatcaggtcgtggagcggcaaaagcagatcctgttgcagatcgacagcctcagcagcggtggtgcagcggcgcaatcaaccagcggcgatcaaagcggtgtggcggcatcaacgacgccgacagctgatgctggtactgcgaatgctggcgcgccggtgaaaagcggtgatgcaaacacggattacaatgcagctattgcgctggtgcag

靶向lpp位點的sgRNA序列（SEQ ID NO: 178）： acgttcaggctgctaaagat

lpp位點的左同源臂（LHA）序列（SEQ ID NO: 179）： aatacttcccggatgccaccatcctggcactgaccaccaacgaaaaaacggctcaccagttagtactgagcaaaggtgttgtgccgcagctggttaaagagatcacatctactgatgacttctaccgtctgggtaaagaactggctctgcagagcggtctggcacacaaaggtgatgtcgtagttatggtttctggtgcactggtaccgagcggcactactaacaccgcatctgttcacgtcctgtaatattgcttttgtgaattaatttgtatatcgaagcgccctgatgggcgctttttttatttaatcgataaccagaagcaataaaaaatcaaatcggatttcactatataatctcactttatctaagatgaatccgatggaagcatcctgttttctctcaatttttttatctaaaacccagcgttcgatgcttctttgagcgaacgatcaaaaataagtgccttcccatcaaaaaaa

lpp位點的右同源臂（RHA）序列（SEQ ID NO: 180）： cctgtgaagtgaaaaatggcgcacattgtgcgccatttttttgcctgctatttaccgctactgcgtcgcgcgtaacatattcccttgctctggttccccattctgcgctgactctactgaaggcgcattgctggctgcgggagttgctccactgctcaccgcaaccggataccctgcccgacgatacaacgctttatcgactaacttctgatctacagccttattgtctttaaattgcgtaaagcctgctggcagcgtgtacggcattgtctgaacgttctgctgttcttctgccgatagtggtcgatgtacttcaacataacgcatcccgttaggttccacggaatatttcaccggttcgttgatcactttcaccggtgttcccgtccgcacgctggagaataaagctttaatatccggtgcattcatgcgaataca

靶向mrcA位點的sgRNA序列（SEQ ID NO: 181）： caaaccgttcctctacaccg

mrcA位點的左同源臂（LHA）序列（SEQ ID NO: 182）： gacagccaggccatttgctcccgctcaccgagggacatcgacgggcgtggaaatgaccgctgtaatgtgcgactggcgggaaacgccaacataatgtgatgacgctgcggcagttcacgactccacggtaacaacgtgttagccagccgctgcacatcaacaatccgcccatctttgataatgtcgttctccagtggcaaccgccaccagcggtgcaataagcattcttttgcgctccgcacgatagcaaccgctaccgcttcttgctgttgtaaatgcaaaccaatttgccagttcttaaatgccattgtgatgatctccttatcacccgtcactctgacgggtatatcaatgcgtctggcttgcctttatactaccgcgcgtttgtttataaactgcccaaatgaaactaaatgg

mrcA位點的右同源臂（RHA）序列（SEQ ID NO: 183）： ttaaaaaggcgcttcggcgcctttttcagtttgctgacaaagtgcacttgtttatgccagatgcgggtgaacgcgttatccggccaacaaaaaattgaaaattcaataaattgcaggaacttcgtaagcctgataagcgttgtgcatcaggcaaacttcacgcatttacactcgcccctgccctttcaaccattcgcgcacgaggaacagcgcgctgacattacgcgcttcgttgaagtcaggggcttccagcaaatccatcatatgcgccagcggccagcgcacctgtggtagcggctctggctcatcgccttccagtgattccgggtagagatcttgcgctaccacgatattcattttgctggaaaagtaagacggtgccatgctgagcttcttcaaaaaagtcagatcgttcgcaccaaatccaacctcttcttttagctcgcggttagcggcttca

靶向ompT位點的sgRNA序列（SEQ ID NO: 184）： cctgggactcatggccggat

ompT位點的左同源臂（LHA）序列（SEQ ID NO: 185）： cccagcccttgtcgatgccgcgttcaggctagcttcgttcaaatccattaaagatatcagactactctcaggtacgtgagtaaggtaaaacccagttccaacgccaatatccagatggttgttacctaaatgttccagaaagtgtggaagaaggtgttcctttgtaggacatccccatgcaagccgatttgatactcccaaaacccaccagtcataaagctttagggtaagtggtgtgtaaattttagccccatcatctgtgttttttttcattagtttcaccgtgttatagttttatttgtgaattaaatcaattatagagatgaattacaaggggttaaatgatgccacggcataacgaatttgaatatattgggtcttgtgttgcggtaagaggttacacgccaggacgcaggttaaatgcttacaatattaggggatattgtttgcttttaacggtaaacaaattccccggggctatacaataccaccggggagaaaatctatttaacgttg

ompT位點的右同源臂（RHA）序列（SEQ ID NO: 186）： aaaaggtctccattcaatcgttttaatgattgagtatgtattttttatatctaacttaatgagtcaattgtatattgccccactgtttatattttgtttaacattgaatttttgtcacaatgcgctgtcagttttttagtttaattgtctgtttgtgttttgtattgtggttttatgggctaattatttttttctttgtggagtttttatctattcaagtgccatgcctttagatgcatattagcgataatagcatgaggtttatcctcaattgctgtgttttttagtataaaaaagaggaacaaaactgagacacataaggcctcgcaatggcttgcaaggttttacatattttgaggtggtggaacgtgtgaacgcagagatggcgcggtaatttgttgatttaaaatgtcgttcttggagtttctaagtcgtgggctacaggttcgaatcctgcagggcgagccatttcctcgccatttatttgttcccttttacaaattacaccatcactttgttgtcgcggttttgctaaataattggaacacgtcagacgaataaaatgaaaacagaaattctgctaaacaattcatcttgccaggattttgattaggaaagtgaaa

實施例 6. 編碼和分泌 Amuc_1100 （ 31-317 ）的經基因工程改造的細菌的產生

6.1 Amuc_1100表現卡匣的建構

（1）Amuc_1100表現卡匣的PCR

Amuc_1100編碼序列、訊號肽、啟動子、RBS以及順反子等由金斯瑞（GeneScript）在轉殖質體pUC57上合成。Amuc_1100編碼序列、訊號肽、啟動子、RBS以及順反子等以合成質體為範本進行擴增。（pUC57_Amuc_1100，如圖7所示）。整合位點的LHA和RHA從EcN的基因組進行擴增。轉錄終止子以質體pCBT003為範本擴增。用於擴增這些片段的PCR引子彼此具有15-20 bp的同源序列，因此它們可以透過重疊PCR進行連接，得到側接LHA和RHA的供體基因片段表現卡匣，表現卡匣中元件從5’到3’按如下順序排列：5’-啟動子-RBS-順反子-訊號肽-Amuc_1100編碼序列-終止子。Amuc_1100編碼序列為野生型Amuc_1100編碼序列（SEQ ID NO: 1，表5中表示為「野生型」）或Amuc_1100 Y289A突變體（第289位的編號相對於SEQ ID NO: 1，表5中表示為Y289A）。

使用PCR反應擴增目標基因，隨後根據與第5.4.1節所述方法類似的方法製備電轉感受態細胞。然後，根據與第5.4.2節所述方法類似的方法進行電轉感受態細胞電穿孔。電穿孔後的恢復按以下步驟進行。

電穿孔後立即在細胞中加入1mL SOC，在30℃下、220rpm孵育細胞1~2小時，然後將細胞全部接種至含有抗生素的LB瓊脂板上，30℃孵育過夜。

（2）Amuc_1100表現卡匣的基因組整合

使用CRISPR-Cas9將Amuc_1100表現卡匣的PCR片段整合至EcN的選定位點。簡而言之，將Amuc_1100表現卡匣PCR片段和質體pCBT003_agaI/rsmI_sgRNA、pCBT003_malP/T-sgRNA、pCBT003_pflB-sgRNA或pCBT003_lldD-sgRNA（一個代表，pCBT003_agaI/rsmI_sgRNA如圖10所示，稱為ZL-003_agaI/rsmI_sgRNA）電穿孔至含有pCBT001（ZL-001）的EcN菌株。透過PCR驗證了各個Amuc_1100表現卡匣的成功整合。

為了獲得具有多個拷貝數的Amuc_1100表現菌株，將兩個、三個或更多的表現卡匣整合到EcN基因組中；當插入一個拷貝數的Amuc_1100時，整合位點為EcN基因組的agaI/rsmI位點；當插入兩個拷貝數的Amuc_1100時，第一和第二整合位點為EcN基因組的agaI/rsmI位點和malP/T位點；當插入三個拷貝數的Amuc_1100時，第一、第二和第三整合位點為agaI/rsmI位點、malP/T位點和pflB位點。

靶向agaI/rsmI位點的sgRNA序列如SEQ ID NO: 200所示，該agaI/rsmI位點的兩側同源臂序列分別如SEQ ID NO: 201和202所示。靶向malP/T位點的sgRNA序列如SEQ ID NO: 203所示，該malP/T位點的兩側同源臂序列分別如SEQ ID NO: 204和205所示。靶向pflB位點的sgRNA序列如SEQ ID NO: 206所示，該pflB位點的兩側同源臂序列分別如SEQ ID NO: 207和208所示。靶向lldD位點的sgRNA序列如SEQ ID NO: 209所示，該lldD位點的兩側同源臂序列分別如SEQ ID NO: 210和211所示。靶向maeA位點的sgRNA序列如SEQ ID NO: 212所示，該maeA位點的兩側同源臂序列分別如SEQ ID NO: 213和214所示。

靶向agaI/rsmI位點的sgRNA序列（SEQ ID NO: 200）： tgtgtcgtcgttaactcgcc

agaI/rsmI位點的左同源臂（LHA）序列（SEQ ID NO: 201）： gccgcgcacgctgattttttatgaatctacccaccgtctgttagatagcctggaagatatcgttgcggtattaggcgaatcccgttacgtggttctggcgcgtgagctaaccaaaacctgggaaaccattcacggcgcgcccgttggcgagctgctggcgtgggtaaaagaagatgaaaaccgtcgcaaaggcgaaatggtgctgattgtcgaaggccataaagcgcaggaaaatgacttgcctgctgatgccctgcgcacgctggcgctgctacaggcagaactgccgctgaaaaaagcggcggcgctggccgcagaaattcacggcgtgaagaaaaatgcgctgtataagtatgcgctggagcagcagggagagtgattacaggcgtcgcagcaggaatagcgctac

agaI/rsmI位點的右同源臂（RHA）序列（SEQ ID NO: 202）： tcacgcatgtgaaatggttatgcagccataaaaatgaagccgggatagcggtggagactttagccgtgagaaaacgttctgtcgcatcctgttttccttcgccagtcaccagtaacaaaacttcgcgggcattgagaatatccttcaggcctaaggtgatcccacgagtcacgggacggtccgcggtttttaacatctcatgttgctgtgttctggcatcaagttgactgatatggcaggctggttgcaggctttctcccggttcgttcagcccaagatgaccgtttttccccaatccgagaacgcataaatccagaccgcctttgcgcgcaatcaggttcgttacccgttcgcactctgtctcatttatctcttcggagcgaaagctgatgagctggtcttcac

靶向malP/T位點的sgRNA序列（SEQ ID NO: 203）： Cgctttttgaaaatacgcaa

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malP/T位點的右同源臂（RHA）序列（SEQ ID NO: 205）： cgtattttcaaaaagcggaaggtaactctataaattaagtaaaggagtgaaacagtttcacaagtaaaatatcaagtgtgctccatctcattcttaatagatttattaagatcatctttttagatggcactttcatcagaaatgaagaagaaacccttgcttaaatgaaactgatgaacataaggaaaataccgtacaacccagtattcacgctggatcagcgtcgttttaggtgagttgttaataaacatttggaattgtgacacagtgcaaattcagacacataaaaaaacgtcatcgcttgcattagaaaggtttctggccgaccttataaccattaattacgaagcgcaaaaaaaataatatttcctcattttccacagtgaagtgattaactatgctgattccgtcaaaattaagtcgtccggttcgactcgaccataccgtggttcgtga

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靶向lldD位點的sgRNA序列（SEQ ID NO: 209）： gttatcgtgatgcgcattct

lldD位點的左同源臂（LHA）序列（SEQ ID NO: 210）： ttccgcagccagcgattatcgcgccgcagcgcaacgcattctgccgccgttcctgttccactatatggatgggggggcatattctgaatacacgctgcgccgcaacgtggaagatttgtcagaagtggcgctgcgccagcgtattctgaaaaacatgtctgacttaagcctggaaacgacgctgtttaatgagaaattgtcgatgccggtggcgctaggtccggtaggtttgtgtggcatgtatgcgcgacgcggcgaagttcaggctgccaaagcagcagatgcgcatggcattccgtttactctctcgacggtttccgtttgcccgattgaagaagtggctccggctatcaaacgtccgatgtggttccagctttatgtgctgcgcgatcgcggctttatgcgtaacgccctggagcgagcaaaagccgcgggttgttcgacgctggttttcacc

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靶向maeA位點的sgRNA序列（SEQ ID NO: 212）： taacacccagcccgatgccc

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maeA位點的右同源臂（RHA）序列（SEQ ID NO: 214）： gagattttcgcgcttctgcaccagtttggtctggaaaggcagcaggttcggcatcttgtcggtcagcaggccaaagcgatcgaccataaagactttctgccgcgccgcttcctcgcttaatccttcgcgctgggtctgggcgatgatcatttcggcaatgccgcatcccgctgaacctgcgccaaggaagacgatttttttctcgcttaactgaccacctgccgcgcggctggctgcgatcagtgtgccgactgttaccgccgcggtgccctgaatgtcatcgttaaaagaacaaatttcattgcgatagcggttaagtaacggcatcgcatttttttgtgcgaagtcttcaaactgcaacagtacgtccggccagcgttgtttcacagcctggataaattcatcaacaaattcatagtattcgtcgtcagtgatacgcggattacgccagcccatatacagcggatcgttaagcagctgttggttgttggtgccgacatccagcaccaccggaagggtataggccggactgatgccgccacag

實施例中經基因工程改造的菌株總結於表5中。

表 5. Amuc_1100 表現菌株

經工程改造的細菌的名稱	啟動子	RBS	順反子	訊號肽	Amuc_1100編碼序列	終止子	剔除蛋白	是否表現分子伴侶
CBT1101	BBa_J23101	合成型	/	usp45	Y289A	終止子1	lpp	否
CBT1102	BBa_J23110	合成型	/	usp45	Y289A	終止子1	lpp	否
CBT1103	BBa_J23110	合成型	/	usp45	Y289A	終止子1	lpp	否
BBa_J23101	合成型	/	usp45	Y289A	終止子1	lpp	否
CBT1104	BBa_J23101	合成型	/	usp45	Y289A	終止子1	lpp	否
BBa_J23101	合成型	/	usp45	Y289A	終止子1	lpp	否
BBa_J23101	合成型	/	usp45	Y289A	終止子1	lpp	否
CBT1105	BBa_J23101	合成型	/	usp45	Y289A	終止子1	lpp	否
BBa_J23101	合成型	/	usp45	Y289A	終止子1	lpp	否
BBa_J23110	合成型	/	usp45	Y289A	終止子1	lpp	否
CBT1106	BBa_J23101	合成型	/	usp45	Y289A	終止子1	lpp	否
BBa_J23110	合成型	/	usp45	Y289A	終止子1	lpp	否
BBa_J23110	合成型	/	usp45	Y289A	終止子1	lpp	否
CBT1107	Pfnrs	合成型	/	usp45	Wildtype	終止子1	lpp+ompT	否
CBT1108	Pfnrs	合成型	/	usp45	野生型	終止子1	lpp+ompT	否
Pfnrs	合成型	/	usp45	野生型	終止子1	否
CBT1109	BBa_J23110	合成型	/	usp45	野生型	終止子1	lpp	否
BBa_J23110	合成型	/	usp45	野生型	終止子1	否
Pfnrs	合成型	/	usp45	野生型	終止子1	否
CBT1110	BBa_J23110	合成型	/	usp45	野生型	終止子1	lpp	否
BBa_J23110	合成型	/	usp45	野生型	終止子1	否
Pfnrs	合成型	/	usp45	野生型	終止子1	否
Pfnrs	合成型	/	usp45	野生型	終止子1	否
CBT1111	Pfnrs	合成型	/	usp45	野生型	終止子1	lpp+ompT	否
Pfnrs	合成型	/	usp45	野生型	終止子1	否
Pfnrs	合成型	/	usp45	野生型	終止子1	否
CBT1112	Pfnrs	合成型	/	usp45	野生型	終止子1	lpp+ompT	否
Pfnrs	合成型	/	usp45	野生型	終止子1	否
Pfnrs	合成型	/	usp45	野生型	終止子1	否
Pfnrs	合成型	/	usp45	野生型	終止子1	否
CBT1113	BBa_J23101	合成型	/	usp45	Y289A	終止子1		否
BBa_J23110	合成型	/	usp45	Y289A	終止子1		否
BBa_J23110	合成型	/	usp45	Y289A	終止子1		否
CBT1114	BBa_J23110	合成型	/	usp45	野生型	終止子1	lpp	否
BBa_J23110	合成型	/	usp45	野生型	終止子1	lpp	否
CBT1115	BBa_J23110	合成型	/	usp45	野生型	終止子1	lpp+ompT	否
BBa_J23110	合成型	/	usp45	野生型	終止子1	lpp+ompT	否
CBT1116	BBa_J23110	合成型	/	usp45	Y289A	終止子1	lpp	是
BBa_J23101	合成型	/	usp45	Y289A	終止子1	lpp
CBT1117	BBa_J23110	合成型	/	usp45	野生型	終止子1	lpp	否
BBa_J23101	合成型	/	usp45

6.2 Amuc_1100（31-317）表現卡匣的優化

施用於受試者（例如，受試者腸道）後，本文描述的經工程改造的細菌不僅能夠保持細菌活性，而且能夠有效表現Amuc_1100，同時還能將Amuc_1100蛋白有效分泌到經工程改造的細菌外。需要在底盤細菌的基因工程方面進行大量的優化嘗試，以獲得既能表現和分泌Amuc_1100蛋白，同時又不影響細菌自身活性的經工程改造的細菌。而對於經工程改造的細菌，特別是經工程改造的大腸桿菌中治療蛋白的表現和分泌的研究和報導非常有限，因此本實施例進一步測試了Amuc_1100蛋白的表現和分泌。

6.2.1訊號肽

（1）選擇了pelB（來自胡蘿蔔軟腐病果膠桿菌（ Pectobacterium carotovorum））、dsbA（來自大腸桿菌）、ompA（來自大腸桿菌）、Cel-CD（來自芽孢桿菌纖維素酶的催化結構域）、Amuc1100（來自嗜黏蛋白阿克曼菌）和usp45（來自乳酸乳球菌）訊號肽，建構能夠表現和分泌Amuc_1100蛋白的表現卡匣：將表現卡匣（Pfnrs-訊號肽-Amuc_1100蛋白-rrnB_T1_T7Te_終止子）連接入質體載體pCBT010（SEQ ID NO: 151）中。（2）將建構的質體電轉到EcN△lpp中。（3）將過夜培養菌液以1%比例接種於50mL LB培養基，在37℃下220rpm培養6h，7500rpm離心收集培養液上清和沉澱。（4）Western Blot測定不同訊號肽菌株分泌的Amuc_1100的表現。Western Blot樣品製備方法為：將40μL上清加入10μL上樣緩衝液，上樣量為10μL。

pCBT010的核酸序列（SEQ ID NO: 151）： gaattccggatgagcattcatcaggcgggcaagaatgtgaataaaggccggataaaacttgtgcttatttttctttacggtctttaaaaaggccgtaatatccagctgaacggtctggttataggtacattgagcaactgactgaaatgcctcaaaatgttctttacgatgccattgggatatatcaacggtggtatatccagtgatttttttctccattttagcttccttagctcctgaaaatctcgataactcaaaaaatacgcccggtagtgatcttatttcattatggtgaaagttggaacctcttacgtgccgatcaacgtctcattttcgccaaaagttggcccagggcttcccggtatcaacagggacaccaggatttatttattctgcgaagtgatcttccgtcacaggtatttattcgggatcctcgctcactgactcgctacgctcggtcgttcgactgcggcgagcggaaatggcttacgaacggggcggagatttcctggaagatgccaggaagatacttaacagggaagtgagagggccgcggcaaagccgtttttccataggctccgcccccctgacaagcatcacgaaatctgacgctcaaatcagtggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggcggctccctcgtgcgctctcctgttcctgcctttcggtttaccggtgtcattccgctgttatggccgcgtttgtctcattccacgcctgacactcagttccgggtaggcagttcgctccaagctggactgtatgcacgaaccccccgttcagtccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggaaagacatgcaaaagcaccactggcagcagccactggtaattgatttagaggagttagtcttgaagtcatgcgccggttaaggctaaactgaaaggacaagttttggtgactgcgctcctccaagccagttacctcggttcaaagagttggtagctcagagaaccttcgaaaaaccgccctgcaaggcggttttttcgttttcagagcaagagattacgcgcagaccaaaacgatctcaagaagatcatctgtaggtcgttcgctccaagctggaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagaatttctgccattcatccgcttattatcacttattcaggcgtagcaaccaggcgtttaagggcaccaataactgccttaaaaaaattacgccccgccctgccactcatcgcagtactgttgtaattcattaagcattctgccgacatggaagccatcacaaacggcatgatgaacctgaatcgccagcggcatcagcaccttgtcgccttgcgtataatatttgcccatggtgaaaacgggggcgaagaagttgtccatattggccacgtttaaatcaaaactggtgaaactcacccagggattggctgagacgaaaaacatattctcaataaaccctttagggaaataggccaggttttcaccgtaacacgccacatcttgcgaatatatgtgtagaaactgccggaaatcgtcgtggtattcactccagagcgatgaaaacgtttcagtttgctcatggaaaacggtgtaacaagggtgaacactatcccatatcaccagctcaccgtctttcattgccatacg

結果如圖12B和表6所示，相比Amuc_1100原有的訊號肽、大腸桿菌訊號肽Dsb和ompA、來自芽孢桿菌的Cel-CD訊號肽以及來自於胡蘿蔔軟腐病果膠桿菌的pelB訊號肽，使用Usp45訊號肽能夠顯著增加Amuc_1100的分泌量。該結果是出乎意料的，因為Usp45訊號肽一直被認為只在乳酸乳球菌中起作用，而從未考慮或探索其在大腸桿菌中指導蛋白分泌的能力。為了進一步檢測在經基因工程改造的細菌背景下（除上述表現載體轉染的細菌外）不同訊號肽的效率，選擇了訊號肽DsbA、OmpA、PelB和YebF，連同Usp45訊號肽一起，來建構經工程改造的細菌，其基因組中整合了攜帶不同訊號肽並表現非Amuc_1100蛋白的測試蛋白的表現卡匣。在LB中培養24小時後培養物中測試蛋白的上清液和細胞質產物如表6所示。其中，測試菌株1使用了dsbA訊號肽；測試菌株2使用了ompA訊號肽；測試菌株3使用了pelB訊號肽；測試菌株4使用了yebF訊號肽，測試菌株5使用了USP45訊號肽。在同樣的稀釋度下，使用OmpA、PelB和YebF訊號肽的經工程改造的細菌樣品中測試蛋白的濃度低於檢測基線；使用DsbA訊號肽的經工程改造的細菌樣品中測試蛋白的濃度高於檢測基線。當使用USP45訊號肽時，測試蛋白的產量顯著高於使用DsbA訊號肽的經工程改造的細菌的產量。

表6 使用不同訊號肽的經工程改造的細菌及測試蛋白的產量

菌株	表現卡匣中的訊號肽	測試蛋白的產量（ng/mL）
上清	細胞質
測試菌株1	DsbA	1.02±0.73	1.23±0.05
測試菌株2	OmpA	-*	-
測試菌株3	PelB	-	-
測試菌株4	YebF	-	-
測試菌株5	USP45	6.15±4.12	4.47±3.39

*「-」表示低於檢測基線

以上結果表明，Usp45訊號肽是最適合工程化大腸桿菌表現並分泌外源蛋白的訊號肽。

6.2.2 啟動子和拷貝數

首先測試了組成型啟動子BBa_J23101和BBa_J23110及其雙拷貝數組合對Amuc_1100（Y289A）蛋白的影響。為此，建構菌株如下：（1）CBT1101，含有由BBA_J23101啟動子驅動的單拷貝數Amuc_1100（Y289A）表現卡匣；（2）CBT1102，含有由BBA_J23110啟動子驅動的單拷貝數Amuc_1100（Y289A）表現卡匣；（3）CBT1103，含有由BBA_J23110啟動子驅動的雙拷貝數Amuc_1100（Y289A）表現卡匣；（4）CBT1104，含有由BBA_J23101啟動子驅動的三拷貝數Amuc_1100（Y289A）表現卡匣，（5）CBT1105，含有由BBA_J23101啟動子驅動的單拷貝數Amuc_1100（Y289A）表現卡匣和由BBA_J23110啟動子驅動的雙拷貝數Amuc_1100（Y289A）表現卡匣；（6）CBT1106，含有由BBA_J23110啟動子驅動的三拷貝數Amuc_1100（Y289A）表現卡匣。

實驗方法：將過夜培養的菌液以1%的比例接種於50mL LB培養基，37℃下220rpm培養6h，12000rpm離心收集培養液上清和沉澱。Western Blot（WB）樣品處理方法：取40μL上清，加入10μL上樣緩衝液；使用WB（上樣量10μL）來確定Amuc_1100的濃度，結果如圖13A所示，所有菌株均能夠成功分泌Amuc_1100蛋白，而具有雙拷貝數和三拷貝數表現卡匣的菌株表現出顯著更高的表現量。此外，使用上述兩個啟動子的Amuc_1100表現強度類似，二者均可用於Amuc_1100蛋白的表現。結論：BBA_J23110啟動子和BBA_J23101啟動子均可用於Amuc_1100的表現；增加表現卡匣的拷貝數能夠增加Amuc_1100蛋白的表現和分泌。

考慮到經工程改造的細菌進入腸道環境後，會處於缺氧環境中，因此進一步測試了厭氧型啟動子的表現和分泌效果。建構了使用單拷貝數厭氧型啟動子Pfnrs的菌株CBT1107，和使用雙拷貝數厭氧型啟動子Pfnrs的菌株CBT1108（菌株的具體結構資訊見表5）。

實驗方法：將過夜培養的菌液以1%的比例接種2瓶50 mL培養基，37℃下220rpm培養至OD 0.8。然後一瓶轉移至厭氧培養箱。此後4瓶菌液每1或2小時取樣，12000rpm離心並保存上清和沉澱樣品，用於WB檢測A1100濃度。Western Blot樣品處理方法：取40μL上清，加入10μL上樣緩衝液；使用WB（上樣量15μL）來確定Amuc_1100的濃度，結果如圖13B和13C所示。對比CBT1107和CBT1108在5h的有氧或厭氧培養後的蛋白產量（與標品20ng螢光強度相對值比較）可以看出，CBT1108菌株分泌的蛋白是CBT1107菌株的兩倍左右，這表明厭氧型啟動子Pfnrs可用於大腸桿菌中Amuc_1100蛋白的表現，並且增加拷貝數能夠提高表現和分泌效果。

接下來，建構了更多不同啟動子以及拷貝數組合的菌株，測試了有氧發酵條件（模擬體外生產環境）對Amuc_1100蛋白分泌的影響，建構和測試的菌株如下：CBT1117（含有兩個組成型啟動子，即BBa_J23110和BBa_J23101）、CBT1108（含有雙拷貝數Pfnrs啟動子）、CBT1109（含有雙拷貝數BBa_J23110啟動子+單拷貝數Pfnrs啟動子）和CBT1110（含有雙拷貝數BBa_J23110啟動子+雙拷貝數Pfnrs啟動子）。

實驗過程：挑取CBT1117、CBT1108、CBT1109和CBT1110的單菌落至50mL LB培養基中培養，37℃下220rpm培養7.5h，12000rpm離心取上清和沉澱並製備Western Blot樣品。Western Blot樣品處理方法：取40μL上清，加入10μL上樣緩衝液，使用WB（上樣量5μL）來確定Amuc_1100的濃度，結果如圖13D所示。

我們意外地發現，在有氧發酵的情況下（類比菌株生產的工業條件），使用厭氧型啟動子Pfnrs在保持菌株分泌Amuc_1100蛋白的活性方面更具有優勢（比較CBT1108和CBT1117）。同時，組成型啟動子加上單拷貝數的厭氧型啟動子（CBT1109）能夠增加Amuc_1100蛋白的分泌。但是如果進一步增加厭氧和有氧啟動子的拷貝數至四個（參見菌株CBT1110），並未帶來更多益處，表現量反而急劇降低。

接下來研究了不同拷貝數的Pfnrs啟動子（例如雙拷貝數、三拷貝數和四拷貝數）的影響，建構和/或測試的菌株如下：CBT1108（雙拷貝數）、CBT1111（三拷貝數）和CBT1112（四拷貝數）。實驗方法：將CBT1108、CBT1111和CBT1112單菌落加入至50 mL補充了1% Glu的LB培養基，37℃下220 rpm有氧培養2h後，轉移到厭氧培養箱繼續培養。總培養時間為8h，期間分別在6h和8h取菌液，12000rpm離心收集上清和沉澱並製備Western Blot樣品。Western Blot樣品處理方法為：取20μL上清，加入10μL上樣緩衝液和20μL PBS緩衝液，使用WB（上樣量5μL）來確定Amuc_1100的濃度。結果如圖13E所示，在有氧轉厭氧條件下，與具有雙拷貝數Pfnrs啟動子的菌株相比，具有三拷貝數和四拷貝數Pfnrs啟動子的菌株培養液上清含有更多的Amuc_1100蛋白。但是進一步分析菌株的生長狀況顯示，含有三拷貝數和四拷貝數厭氧啟動子的兩種菌株在轉厭氧培養後不久，其菌液OD ₆₀₀值就一直維持在很低的水準（見圖13F）。此外，發現培養基中出現了細菌裂解，這可能是由於過多拷貝數的厭氧啟動子導致Amuc_1100的過度表現，帶來了更大的壓力，使得細菌無法維持正常形態而最終導致裂解。

6.2.3 剔除外膜蛋白的影響

1）LPP蛋白剔除

根據實施例5.8的方案剔除經工程改造的細菌中的LPP蛋白。將過夜培養的CBT1103和CBT1113以1%的比例接種至50mL LB培養基，37℃下220 rpm培養7小時，12000 rpm離心收集上清和沉澱並製備Western Blot樣品。Western Blot樣品處理方法：取40μL上清，加入10μL上樣緩衝液，使用WB（上樣量10μL）來確定Amuc_1100的濃度，結果如圖13G所示。CBT1103具有雙拷貝數Amuc_1100表現卡匣並且剔除了LPP，CBT1113具有三拷貝數Amuc_1100表現卡匣並且具有完整LPP，CBT1103比CBT1113分泌甚至更多的Amuc_1100，這表明剔除LPP能夠有效促進Amuc_1100蛋白的分泌。

2）ompT基因剔除對Amuc_1100蛋白分泌的影響

實驗方法：將過夜培養的CBT1114和CBT1115菌液以1%的比例接種至50mL LB培養基，37℃下220 rpm培養7h，隨後12000 rpm離心取上清和沉澱製備Western Blot樣品。Western Blot樣品處理方法：取40μL上清，加入10μL上樣緩衝液，使用WB（上樣量10μL）來確定Amuc_1100的濃度。

如圖13H所示，未剔除ompT基因的CBT1114有明顯的雙條帶，而剔除了ompT基因的CBT1115雙條帶顯著減弱。這表明剔除ompT基因能夠有效阻止Amuc1100蛋白的降解。

6.2.4 分子伴侶

分子伴侶對Amuc_1100蛋白表現的影響。實驗方法：將過夜培養的CBT1103和CBT1116以1%的比例接種至50mL LB培養基，37℃下220rpm培養7小時，12000rpm離心收集上清和沉澱並製備Western Blot樣品。Western Blot樣品處理方法：取40μL上清，加入15μL上樣緩衝液，使用WB（上樣量10μL）來確定Amuc_1100的濃度。

如圖13I所示，是否使用分子伴侶對Amuc_1100蛋白的分泌不具有顯著的影響。

順反子

（1）EcN_agaI/rsmI_J23101_MBP_usp45_Amuc_1100的建構

順反子用於增加Amuc_1100（31-317）的轉錄，表2中列出的任何順反子可以如圖11中所示插入到Amuc_1100（31-317）表現卡匣。用於建構EcN_agaI/rsmI_J23101_MBP_ usp45_Amuc_1100的引子在以下表7中列出。

表 7. agaI/rsmI_J23101_MBP_usp45_Amuc_1100 引子

SEQ ID NO.	名稱	序列
119	agaI/rsmI_LH-F	gccgcgcacgctgattttttatgaatc
120	agaI/rsmI_LH-R	ctcgagacgtcgacaagctctagagtagcgctattcctgctgcga
121	J23101_MBP-F	cgctactctagagcttgtcgacgtctc
122	J23101_MBP-R	cctccttctgtaccagtttacctgcttcgattttcataagcttctttctcctctttcct
123	MBP_usp45_F	agcaggtaaactggtacagaaggaggttaactgatgaagaaaaagatcattagc
124	MBP_usp45-R	ctacgcttgctgttaacaatcgcataaacaccgctcagcg
125	Amuc_1100-F	ctgagcggtgtttatgcgattgttaacagcaagcgtagcg
126	Amuc_1100-R	cgatctacactagcactatcgagctcgttattagtggtgg
127	終止子-F	ccaccactaataacgagctcgatagtgctagtgtagatcg
128	終止子-R	ctgcagcggccgcttctagtat
129	agaI/rsmI_RH-F	tactagaagcggccgctgcagtcacgcatgtgaaatggttatgc
130	agaI/rsmI_RH-R	gtgaagaccagctcatcagctttcgc

Sat分泌系統

EcN_agaI/rsmI_J23101_sat_Amuc_1100_β結構域的建構

使用如圖12A中所示的自轉運蛋白結構域（β結構域）的sat分泌系統用於增加Amuc_1100（31-317）的分泌。用於建構EcN_agaI/rsmI_J23101_sat_Amuc_1100_β結構域的引子在下表8中列出。

表 8. agaI/rsmI_J23101_sat_Amuc_1100_β 結構域引子

SEQ ID NO.	名稱	序列
131	agaI/rsmI_LH-F	gccgcgcacgctgattttttatgaatc
132	agaI/rsmI_LH-R	ctcgagacgtcgacaagctctagagtagcgctattcctgctgcga
133	J23101_sat-F	cgctactctagagcttgtcgacgtctc
134	J23101_sat-R	attcataagcttctttctcctctttcctc
135	sat_F	ctcgaggaaagaggagaaagaagcttatgaataaaatatactcccttaaatatagtgc
136	sat-R	tgcatttactgtaccggcaaca
137	Amuc_1100-F	tctctggctgttgccggtacagtaaatgcaattgttaacagcaagcgtagcg
138	Amuc_1100-R	cgcagatcacccatacgtttgttaaggttgttgtggtggtggtgatgatgatct
139	β結構域-F	aaccttaacaaacgtatgggtgat
140	β結構域-R	cactatcgagctcgttatcagaaagagtaacggaagttggcg
141	終止子-F	acttccgttactctttctgataacgagctcgatagtgctagtg
142	終止子-R	ctgcagcggccgcttctagtat
143	agaI/rsmI_RH-F	tactagaagcggccgctgcagtcacgcatgtgaaatggttatgc
144	agaI/rsmI_RH-R	gtgaagaccagctcatcagctttcgc

實施例 7. 從經基因工程改造的 EcN 分泌的 Amuc_1100 （ 31-317 ）刺激 TLR2 訊號。

培養在實施例6中獲得的經基因工程改造的細菌EcN菌株CBT1108，並且在後期指數生長階段收集培養基。Amuc_1100（31-317）蛋白質透過含his標籤抗體的樹脂柱從培養基中分離。從分離的Amuc_1100（31-317）蛋白質去除內毒素。

透過TLR2報告基因分析測試Amuc_1100（31-317）活性。具體來說，HEK293/TLR2報告細胞在具有一定量的蛋白質的96孔板中刺激24小時，將報告酶的基質添加到細胞培養基中並且透過比色方法測量活性。

如圖17中所示，從經基因工程改造的EcN分泌的Amuc_1100（31-317）刺激TLR2訊號。本案提供的經工程改造的EcN能夠顯著增加Amuc_1100的活性，例如，刺激TLR2訊號的活性。

實施例 8. 乳癌小鼠模型中編碼 Amuc_1100 （ 31-317 ）（或其突變體）的經基因工程改造的 EcN 和抗 PD-1 抗體的組合對抑制腫瘤生長的影響。

本實施例中測試的經基因工程改造的EcN菌株為CBT1108。使用MMTV-PyVT轉基因C57BL/6雌性小鼠和EMT-6原位小鼠作為乳癌動物模型。9.5週齡的小鼠隨機分為6組，每組4-5隻，進行藥劑處理。當腫瘤大小達到100 mm ³時，將小鼠用每種藥劑進行處理。具體地，對照組小鼠每日PBS口服灌胃處理，持續4週，口服灌胃1週後附加每日靜脈注射PBS，持續3週。五個測試組的小鼠進行以下處理：（1）每日口服灌胃編碼Amuc_1100（31-317）的經基因工程改造的EcN，持續4週，（2）每日口服灌胃編碼Amuc_1100（31-317，Y289A）蛋白的經基因工程改造的EcN，持續4週，（3）每三日靜脈注射抗PD-1抗體（InVivoMAb抗小鼠PD-1抗體（CD279）（株RMP1-14）（BioXcell，目錄號BE0146）），持續3週，（4）每日口服灌胃編碼Amuc_1100（31-317）的經基因工程改造的EcN，持續1週，隨後抗PD-1抗體（每三日靜脈注射）與編碼Amuc_1100（31-317）的經基因工程改造的EcN（每日口服灌胃）同時再持續3週，（5）每日口服灌胃編碼Amuc_1100（31-317，Y289A）的經基因工程改造的EcN，持續1週，隨後抗PD-1抗體（每三日靜脈注射）與編碼Amuc_1100（31-317，Y289A）的經基因工程改造的EcN（每日口服灌胃）同時再持續3週。每週兩次測量每隻小鼠的腫瘤生長速度。在研究終點時，收集腫瘤組織並於福馬林中固定。用H&E染色來確定組織中的腫瘤細胞。

實施例 9. 乳癌小鼠模型中編碼 Amuc_1100 （ 31-317 ）的經基因工程改造的 EcN 和抗 PD-1 抗體的組合對抑制腫瘤生長的影響。

本實施例中測試的經基因工程改造的EcN菌株為CBT1117。將MMTV-PyMT腫瘤塊移植到C57BL/6雌性小鼠的乳腺脂肪墊中，建立MMTV-PyMT原位乳腺腫瘤模型。在接種後第13天，平均腫瘤體積為約100 mm ³，透過隨機成組法分為4組：不含基因修飾的EcN（對照細菌）組、表現兩個Amuc_1100表現卡匣的EcN（經工程改造的細菌）組、抗mPD-1抗體（PD-1抗體）組、組合治療組（經工程改造的細菌/抗PD-1抗體），每組5隻小鼠。以200 μL/8×10^10 CFU/小鼠的量灌胃給藥所述細菌，每日1次。以10 mg/kg的劑量腹腔注射抗PD-1抗體，每3天注射一次，共持續7天。每三天測量一次每隻小鼠的腫瘤大小。如圖18所示，編碼Amuc_1100的經工程改造的細菌和抗PD-1抗體的聯合使用顯著抑制了腫瘤的生長。

實施例 10. 編碼 Amuc_1100 （ 31-317 ）（或其突變體）的經基因工程改造的 EcN 和抗 PD-1 抗體的組合對體重變化和腫瘤中免疫細胞浸潤的影響。

透過與實施例9類似的方法對小鼠進行分組和處理。每週兩次測量每隻小鼠的體重。研究終點時，收集腫瘤組織用於後續分析免疫細胞的分佈（包括巨噬細胞、Treg細胞、CD4 ⁺T細胞、CD8 ⁺T細胞等）。

實施例 11. 乳癌小鼠模型中編碼 Amuc_1100 （ 31-317 ）的經基因工程改造的 EcN 和其他免疫檢查點抑制劑（ ICI ）的組合對抑制腫瘤生長的影響。

將MMTV-PyMT腫瘤塊移植到C57BL/6雌性小鼠的乳腺脂肪墊中，建立MMTV-PyMT原位乳腺腫瘤模型。在接種後第13天，平均腫瘤體積為約100 mm ³，透過隨機成組法分為四組：1）不含基因修飾的EcN（對照細菌）組，2）表現兩個Amuc_1100表現卡匣的EcN（經工程改造的細菌）組，3）ICI組，其包括以下組之一：抗PD-1抗體組、抗CTLA4抗體組、抗Lag-3抗體組、抗TIM-3抗體組、抗TIGIT抗體組、抗CD47抗體組、抗CD137抗體組、抗CD276抗體組或抗GITR抗體組，和4）組合治療組（經工程改造的細菌/ICI）。每組有五隻小鼠。以200 μL/8×10^10 CFU/小鼠的量灌胃給藥所述細菌，每日1次。以確定的劑量（例如，每3天10 mg/kg，共持續7天）腹腔給藥抗ICI抗體。每三天測量一次每隻小鼠的腫瘤大小。編碼Amuc_1100的經工程改造的細菌和ICI的聯合使用顯著抑制了腫瘤的生長。

無

圖1展示質體pET-22b (+)_Amuc_1100的質體概況。

圖2展示SEQ ID NO: 145-147的序列。

圖3A展示Amuc_1100（31-317，Y289A）突變蛋白的穩定性測定結果。重組Amuc_1100野生型（WT）和突變蛋白用蛋白酶胰蛋白酶（0.01mg/ml）和α-糜蛋白酶（0.01mg/ml）在25oC下消化30分鐘。對樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳和考馬斯藍染色。泳道A：不含蛋白酶的Amuc_1100 (31-317，Y289A)；泳道B：含蛋白酶的Amuc_1100（31-317，Y289A）；泳道C：不含蛋白酶的Amuc_1100（31-317，WT）；泳道D：含蛋白酶的Amuc_1100（31-317，WT）；MW：分子量標記（KD）。）

圖3B展示Amuc_1100（31-317）、Amuc_1100（31-317，Y289A）和Pam3CSK4（陽性對照組）的細胞存活率分析結果。

圖4展示用於測定分別透過PBS（陰性對照組）、Amuc_1100（31-317）、Amuc_1100（31-317，Y289A）、抗PD-1抗體、Amuc_1100（31-317）和抗PD-1抗體的組合、Amuc_1100（31-317，Y289A）和抗PD-1抗體的組合處理的組織中的腫瘤細胞的H&E染色結果。

圖5展示分別透過PBS（陰性對照組）、Amuc_1100（31-317）、Amuc_1100（31-317，Y289A）、抗PD-1抗體、Amuc_1100（31-317）和抗PD-1抗體的組合、Amuc_1100（31-317，Y289A）和抗PD-1抗體的組合處理的每隻小鼠的腫瘤生長速率。

圖6展示質體pCBT003_agaI/rsmI的質體概況。

圖7展示質體pUC57_Amuc_1100的質體概況。

圖8展示質體pCBT001的質體概況。

圖9展示說明使用CRISPR-Cas9將Amuc_1100（31-317）表現卡匣的PCR片段整合到EcN的agaI/rsmI位點中的示意圖。

圖10展示質體pCBT003_agaI/rsmI_sgRNA的質體概況。

圖11展示說明將一個或多個順反子插入到Amuc_1100（31-317）表現卡匣中的示意圖。

圖12A展示說明將一個或多個自轉運蛋白結構域插入到Amuc_1100表現卡匣中的示意圖。

圖12B展示用質體載體轉染的細菌中不同訊號肽的Amuc_1100分泌的蛋白質印跡結果。

圖13A展示Amuc_1100從經工程改造的細菌中的分泌，其中泳道A和泳道B：在啟動子BBA_J23101的控制下具有僅一個拷貝數的Amuc_1100（Y289A）的CBT1101；泳道C：在啟動子BBA_J23110的控制下具有僅一個拷貝數的Amuc_1100（Y289A）的CBT1102；泳道D：在啟動子BBA_J23110的控制下具有兩個拷貝數的Amuc_1100（Y289A）的CBT1103；泳道E：在啟動子BBA_J23101的控制下具有三個拷貝數的Amuc_1100（Y289A）的CBT1104；泳道F：在啟動子BBA_J23101的控制下具有兩個拷貝數的Amuc_1100（Y289A）和在啟動子BBA_J23110的控制下具有一個拷貝數的Amuc_1100（Y289A）的CBT1105；泳道G：在啟動子BBA_J23110的控制下具有三個拷貝數的Amuc_1100（Y289A）的CBT1106。

圖13B展示具有一個拷貝數的厭氧啟動子的CBT1107在有氧和厭氧條件下的Amuc_1100分泌。

圖13C展示具有兩個拷貝數的厭氧啟動子的CBT1108在有氧和厭氧條件下的Amuc_1100分泌。

圖13D展示具有不同啟動子組合的經工程改造的細菌在有氧條件下的Amuc_1100分泌。

圖13E展示具有不同啟動子組合的經工程改造的細菌在厭氧條件下的Amuc_1100分泌。

圖13F展示具有不同拷貝數的厭氧啟動子的經工程改造的細菌在具有從有氧到厭氧轉變的培養條件下的生長。

圖13G展示Lpp基因的剔除對Amuc_1100蛋白的分泌的影響。

圖13H展示ompT基因的剔除對Amuc_1100蛋白的分泌的影響。

圖13I展示來自CBT1116菌株或CBT1103菌株的Amuc_1100的表現。

圖14展示說明將Amuc_1100表現卡匣整合到EcN基因組的適合位點（例如agaI/rsmI）中的示意圖。

圖15展示整合位點地圖。

圖16展示一個編碼Amuc_1100基因卡匣的經基因工程改造和優化的EcN的實施方案。

圖17展示經基因工程改造的EcN分泌的Amuc_1100（31-317）的TLR2報告基因活性結果。

圖18展示每隻小鼠的腫瘤生長速率，這些小鼠經過如下處理：沒有基因修飾的EcN（陰性對照）、編碼雙拷貝數Amuc_1100基因卡匣的經基因改造的細菌、抗PD-1抗體或編碼雙拷貝數Amuc_1100基因卡匣的經基因工程改造的細菌與抗PD-1抗體的組合。

圖19展示pCBT003的核酸序列。

圖20展示pCBT001的核酸序列。

無

                         序列表
          <![CDATA[<110>  大陸商和度生物醫藥(上海)有限公司]]>
          <![CDATA[<120>  用於治療癌症的AMUC_1100和免疫檢查點調節劑的組合療法]]>
          <![CDATA[<140>  TW110146962]]>
          <![CDATA[<141>  2021-12-15]]>
          <![CDATA[<150>  PCT/CN2020/136426]]>
          <![CDATA[<151>  2020-12-15]]>
          <![CDATA[<150>  CN202110613387.8]]>
          <![CDATA[<151>  2021-06-02]]>
          <![CDATA[<160>  214   ]]>
          <![CDATA[<170>  PatentIn version 3.5]]>
          <![CDATA[<210>  1]]>
          <![CDATA[<211>  317]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  1]]>
          Met Ser Asn Trp Ile Thr Asp Asn Lys Pro Ala Ala Met Val Ala Gly 
          1               5                   10                  15      
          Val Gly Leu Leu Leu Phe Leu Gly Leu Ser Ala Thr Gly Tyr Ile Val 
                      20                  25                  30          
          Asn Ser Lys Arg Ser Glu Leu Asp Lys Lys Ile Ser Ile Ala Ala Lys 
                  35                  40                  45              
          Glu Ile Lys Ser Ala Asn Ala Ala Glu Ile Thr Pro Ser Arg Ser Ser 
              50                  55                  60                  
          Asn Glu Glu Leu Glu Lys Glu Leu Asn Arg Tyr Ala Lys Ala Val Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Leu Glu Thr Ala Tyr Lys Pro Phe Leu Ala Ser Ser Ala Leu Val 
                          85                  90                  95      
          Pro Thr Thr Pro Thr Ala Phe Gln Asn Glu Leu Lys Thr Phe Arg Asp 
                      100                 105                 110         
          Ser Leu Ile Ser Ser Cys Lys Lys Lys Asn Ile Leu Ile Thr Asp Thr 
                  115                 120                 125             
          Ser Ser Trp Leu Gly Phe Gln Val Tyr Ser Thr Gln Ala Pro Ser Val 
              130                 135                 140                 
          Gln Ala Ala Ser Thr Leu Gly Phe Glu Leu Lys Ala Ile Asn Ser Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Val Asn Lys Leu Ala Glu Cys Gly Leu Ser Lys Phe Ile Lys Val Tyr 
                          165                 170                 175     
          Arg Pro Gln Leu Pro Ile Glu Thr Pro Ala Asn Asn Pro Glu Glu Ser 
                      180                 185                 190         
          Asp Glu Ala Asp Gln Ala Pro Trp Thr Pro Met Pro Leu Glu Ile Ala 
                  195                 200                 205             
          Phe Gln Gly Asp Arg Glu Ser Val Leu Lys Ala Met Asn Ala Ile Thr 
              210                 215                 220                 
          Gly Met Gln Asp Tyr Leu Phe Thr Val Asn Ser Ile Arg Ile Arg Asn 
          225                 230                 235                 240 
          Glu Arg Met Met Pro Pro Pro Ile Ala Asn Pro Ala Ala Ala Lys Pro 
                          245                 250                 255     
          Ala Ala Ala Gln Pro Ala Thr Gly Ala Ala Ser Leu Thr Pro Ala Asp 
                      260                 265                 270         
          Glu Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ile Gln Gln Val Ile Lys Pro 
                  275                 280                 285             
          Tyr Met Gly Lys Glu Gln Val Phe Val Gln Val Ser Leu Asn Leu Val 
              290                 295                 300                 
          His Phe Asn Gln Pro Lys Ala Gln Glu Pro Ser Glu Asp 
          305                 310                 315         
          <![CDATA[<210>  2]]>
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          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  2]]>
          Met Ile Val Asn Ser Lys Arg Ser Glu Leu Asp Lys Lys Ile Ser Ile 
          1               5                   10                  15      
          Ala Ala Lys Glu Ile Lys Ser Ala Asn Ala Ala Glu Ile Thr Pro Ser 
                      20                  25                  30          
          Arg Ser Ser Asn Glu Glu Leu Glu Lys Glu Leu Asn Arg Tyr Ala Lys 
                  35                  40                  45              
          Ala Val Gly Ser Leu Glu Thr Ala Tyr Lys Pro Phe Leu Ala Ser Ser 
              50                  55                  60                  
          Ala Leu Val Pro Thr Thr Pro Thr Ala Phe Gln Asn Glu Leu Lys Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Phe Arg Asp Ser Leu Ile Ser Ser Cys Lys Lys Lys Asn Ile Leu Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Asp Thr Ser Ser Trp Leu Gly Phe Gln Val Tyr Ser Thr Gln Ala 
                      100                 105                 110         
          Pro Ser Val Gln Ala Ala Ser Thr Leu Gly Phe Glu Leu Lys Ala Ile 
                  115                 120                 125             
          Asn Ser Leu Val Asn Lys Leu Ala Glu Cys Gly Leu Ser Lys Phe Ile 
              130                 135                 140                 
          Lys Val Tyr Arg Pro Gln Leu Pro Ile Glu Thr Pro Ala Asn Asn Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Glu Ser Asp Glu Ala Asp Gln Ala Pro Trp Thr Pro Met Pro Leu 
                          165                 170                 175     
          Glu Ile Ala Phe Gln Gly Asp Arg Glu Ser Val Leu Lys Ala Met Asn 
                      180                 185                 190         
          Ala Ile Thr Gly Met Gln Asp Tyr Leu Phe Thr Val Asn Ser Ile Arg 
                  195                 200                 205             
          Ile Arg Asn Glu Arg Met Met Pro Pro Pro Ile Ala Asn Pro Ala Ala 
              210                 215                 220                 
          Ala Lys Pro Ala Ala Ala Gln Pro Ala Thr Gly Ala Ala Ser Leu Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Pro Ala Asp Glu Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ile Gln Gln Val 
                          245                 250                 255     
          Ile Lys Pro Tyr Met Gly Lys Glu Gln Val Phe Val Gln Val Ser Leu 
                      260                 265                 270         
          Asn Leu Val His Phe Asn Gln Pro Lys Ala Gln Glu Pro Ser Glu Asp 
                  275                 280                 285             
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          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<400>  3]]>
          Met Ser Leu Glu Thr Ala Tyr Lys Pro Phe Leu Ala Ser Ser Ala Leu 
          1               5                   10                  15      
          Val Pro Thr Thr Pro Thr Ala Phe Gln Asn Glu Leu Lys Thr Phe Arg 
                      20                  25                  30          
          Asp Ser Leu Ile Ser Ser Cys Lys Lys Lys Asn Ile Leu Ile Thr Asp 
                  35                  40                  45              
          Thr Ser Ser Trp Leu Gly Phe Gln Val Tyr Ser Thr Gln Ala Pro Ser 
              50                  55                  60                  
          Val Gln Ala Ala Ser Thr Leu Gly Phe Glu Leu Lys Ala Ile Asn Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Val Asn Lys Leu Ala Glu Cys Gly Leu Ser Lys Phe Ile Lys Val 
                          85                  90                  95      
          Tyr Arg Pro Gln Leu Pro Ile Glu Thr Pro Ala Asn Asn Pro Glu Glu 
                      100                 105                 110         
          Ser Asp Glu Ala Asp Gln Ala Pro Trp Thr Pro Met Pro Leu Glu Ile 
                  115                 120                 125             
          Ala Phe Gln Gly Asp Arg Glu Ser Val Leu Lys Ala Met Asn Ala Ile 
              130                 135                 140                 
          Thr Gly Met Gln Asp Tyr Leu Phe Thr Val Asn Ser Ile Arg Ile Arg 
          145                 150                 155                 160 
          Asn Glu Arg Met Met Pro Pro Pro Ile Ala Asn Pro Ala Ala Ala Lys 
                          165                 170                 175     
          Pro Ala Ala Ala Gln Pro Ala Thr Gly Ala Ala Ser Leu Thr Pro Ala 
                      180                 185                 190         
          Asp Glu Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ile Gln Gln Val Ile Lys 
                  195                 200                 205             
          Pro Tyr Met Gly Lys Glu Gln Val Phe Val Gln Val Ser Leu Asn Leu 
              210                 215                 220                 
          Val His Phe Asn Gln Pro Lys Ala Gln Glu Pro Ser Glu Asp 
          225                 230                 235             
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          <![CDATA[<400>  4]]>
          Met Ile Val Asn Ser Lys Arg Ser Glu Leu Asp Lys Lys Ile Ser Ile 
          1               5                   10                  15      
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                      20                  25                  30          
          Arg Ser Ser Asn Glu Glu Leu Glu Lys Glu Leu Asn Arg Tyr Ala Lys 
                  35                  40                  45              
          Ala Val Gly Ser Leu Glu Thr Ala Tyr Lys Pro Phe Leu Ala Ser Ser 
              50                  55                  60                  
          Ala Leu Val Pro Thr Thr Pro Thr Ala Phe Gln Asn Glu Leu Lys Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Phe Arg Asp Ser Leu Ile Ser Ser Cys Lys Lys Lys Asn Ile Leu Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Asp Thr Ser Ser Trp Leu Gly Phe Gln Val Tyr Ser Thr Gln Ala 
                      100                 105                 110         
          Pro Ser Val Gln Ala Ala Ser Thr Leu Gly Phe Glu Leu Lys Ala Ile 
                  115                 120                 125             
          Asn Ser Leu Val Asn Lys Leu Ala Glu Cys Gly Leu Ser Lys Phe Ile 
              130                 135                 140                 
          Lys Val Tyr Arg Pro Gln Leu Pro Ile Glu Thr Pro Ala Asn Asn Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Glu Ser Asp Glu Ala Asp Gln Ala Pro Trp Thr Pro Met Pro Leu 
                          165                 170                 175     
          Glu Ile Ala Phe Gln Gly Asp Arg Glu Ser Val Leu Lys Ala Met Asn 
                      180                 185                 190         
          Ala Ile Thr Gly Met Gln Asp Tyr Leu Phe Thr Val Asn Ser Ile Arg 
                  195                 200                 205             
          Ile Arg Asn Glu Arg Met Met Pro Pro Pro Ile Ala Asn Pro Ala Ala 
              210                 215                 220                 
          Ala Lys Pro Ala Ala Ala Gln Pro Ala Thr Gly Ala Ala Ser Leu Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Pro Ala Asp Glu Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ile Gln Gln Val 
                          245                 250                 255     
          Ile Lys Pro Ala Met Gly Lys Glu Gln Val Phe Val Gln Val Ser Leu 
                      260                 265                 270         
          Asn Leu Val His Phe Asn Gln Pro Lys Ala Gln Glu Pro Ser Glu Asp 
                  275                 280                 285             
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          <![CDATA[<400>  5]]>
          Met Ser Leu Glu Thr Ala Tyr Lys Pro Phe Leu Ala Ser Ser Ala Leu 
          1               5                   10                  15      
          Val Pro Thr Thr Pro Thr Ala Phe Gln Asn Glu Leu Lys Thr Phe Arg 
                      20                  25                  30          
          Asp Ser Leu Ile Ser Ser Cys Lys Lys Lys Asn Ile Leu Ile Thr Asp 
                  35                  40                  45              
          Thr Ser Ser Trp Leu Gly Phe Gln Val Tyr Ser Thr Gln Ala Pro Ser 
              50                  55                  60                  
          Val Gln Ala Ala Ser Thr Leu Gly Phe Glu Leu Lys Ala Ile Asn Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Val Asn Lys Leu Ala Glu Cys Gly Leu Ser Lys Phe Ile Lys Val 
                          85                  90                  95      
          Tyr Arg Pro Gln Leu Pro Ile Glu Thr Pro Ala Asn Asn Pro Glu Glu 
                      100                 105                 110         
          Ser Asp Glu Ala Asp Gln Ala Pro Trp Thr Pro Met Pro Leu Glu Ile 
                  115                 120                 125             
          Ala Phe Gln Gly Asp Arg Glu Ser Val Leu Lys Ala Met Asn Ala Ile 
              130                 135                 140                 
          Thr Gly Met Gln Asp Tyr Leu Phe Thr Val Asn Ser Ile Arg Ile Arg 
          145                 150                 155                 160 
          Asn Glu Arg Met Met Pro Pro Pro Ile Ala Asn Pro Ala Ala Ala Lys 
                          165                 170                 175     
          Pro Ala Ala Ala Gln Pro Ala Thr Gly Ala Ala Ser Leu Thr Pro Ala 
                      180                 185                 190         
          Asp Glu Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ile Gln Gln Val Ile Lys 
                  195                 200                 205             
          Pro Ala Met Gly Lys Glu Gln Val Phe Val Gln Val Ser Leu Asn Leu 
              210                 215                 220                 
          Val His Phe Asn Gln Pro Lys Ala Gln Glu Pro Ser Glu Asp 
          225                 230                 235             
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          Met Ile Val Asn Ser Lys Arg Ser Glu Leu Asp Lys Lys Ile Ser Ile 
          1               5                   10                  15      
          Ala Ala Lys Glu Ile Lys Ser Ala Asn Ala Ala Glu Ile Thr Pro Ser 
                      20                  25                  30          
          Arg Ser Ser Asn Glu Glu Leu Glu Lys Glu Leu Asn Arg Tyr Ala Lys 
                  35                  40                  45              
          Ala Val Gly Ser Leu Glu Thr Ala Tyr Lys Pro Phe Leu Ala Ser Ser 
              50                  55                  60                  
          Ala Leu Val Pro Thr Thr Pro Thr Ala Phe Gln Asn Glu Leu Lys Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Phe Arg Asp Ser Leu Ile Ser Ser Cys Lys Lys Lys Asn Ile Leu Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Asp Thr Ser Ser Trp Leu Gly Phe Gln Val Tyr Ser Thr Gln Ala 
                      100                 105                 110         
          Pro Ser Val Gln Ala Ala Ser Thr Leu Gly Phe Glu Leu Lys Ala Ile 
                  115                 120                 125             
          Asn Ser Leu Val Asn Lys Leu Ala Glu Cys Gly Leu Ser Lys Phe Ile 
              130                 135                 140                 
          Lys Val Tyr Arg Pro Gln Leu Pro Ile Glu Thr Pro Ala Asn Asn Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Glu Ser Asp Glu Ala Asp Gln Ala Pro Trp Thr Pro Met Pro Leu 
                          165                 170                 175     
          Glu Ile Ala Phe Gln Gly Asp Arg Glu Ser Val Leu Lys Ala Met Asn 
                      180                 185                 190         
          Ala Ile Thr Gly Met Gln Asp Tyr Leu Phe Thr Val Asn Ser Ile Arg 
                  195                 200                 205             
          Ile Arg Asn Glu Arg Met Met Pro Pro Pro Ile Ala Asn Pro Ala Ala 
              210                 215                 220                 
          Ala Lys Pro Ala Ala Ala Gln Pro Ala Thr Gly Ala Ala Ser Leu Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Pro Ala Asp Glu Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ile Gln Gln Val 
                          245                 250                 255     
          Ile Lys Pro Tyr Met Gly Lys Glu Gln Val Phe Val Gln Val Ser Leu 
                      260                 265                 270         
          Asn Leu Val His Phe Asn Gln Pro Lys Ala Gln Glu Pro Ser Glu Asp 
                  275                 280                 285             
          His His His His His His 
              290                 
          <![CDATA[<210>  7]]>
          <![CDATA[<211>  244]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  7]]>
          Met Ser Leu Glu Thr Ala Tyr Lys Pro Phe Leu Ala Ser Ser Ala Leu 
          1               5                   10                  15      
          Val Pro Thr Thr Pro Thr Ala Phe Gln Asn Glu Leu Lys Thr Phe Arg 
                      20                  25                  30          
          Asp Ser Leu Ile Ser Ser Cys Lys Lys Lys Asn Ile Leu Ile Thr Asp 
                  35                  40                  45              
          Thr Ser Ser Trp Leu Gly Phe Gln Val Tyr Ser Thr Gln Ala Pro Ser 
              50                  55                  60                  
          Val Gln Ala Ala Ser Thr Leu Gly Phe Glu Leu Lys Ala Ile Asn Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Val Asn Lys Leu Ala Glu Cys Gly Leu Ser Lys Phe Ile Lys Val 
                          85                  90                  95      
          Tyr Arg Pro Gln Leu Pro Ile Glu Thr Pro Ala Asn Asn Pro Glu Glu 
                      100                 105                 110         
          Ser Asp Glu Ala Asp Gln Ala Pro Trp Thr Pro Met Pro Leu Glu Ile 
                  115                 120                 125             
          Ala Phe Gln Gly Asp Arg Glu Ser Val Leu Lys Ala Met Asn Ala Ile 
              130                 135                 140                 
          Thr Gly Met Gln Asp Tyr Leu Phe Thr Val Asn Ser Ile Arg Ile Arg 
          145                 150                 155                 160 
          Asn Glu Arg Met Met Pro Pro Pro Ile Ala Asn Pro Ala Ala Ala Lys 
                          165                 170                 175     
          Pro Ala Ala Ala Gln Pro Ala Thr Gly Ala Ala Ser Leu Thr Pro Ala 
                      180                 185                 190         
          Asp Glu Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ile Gln Gln Val Ile Lys 
                  195                 200                 205             
          Pro Tyr Met Gly Lys Glu Gln Val Phe Val Gln Val Ser Leu Asn Leu 
              210                 215                 220                 
          Val His Phe Asn Gln Pro Lys Ala Gln Glu Pro Ser Glu Asp His His 
          225                 230                 235                 240 
          His His His His 
          <![CDATA[<210>  8]]>
          <![CDATA[<211>  294]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  8]]>
          Met Ile Val Asn Ser Lys Arg Ser Glu Leu Asp Lys Lys Ile Ser Ile 
          1               5                   10                  15      
          Ala Ala Lys Glu Ile Lys Ser Ala Asn Ala Ala Glu Ile Thr Pro Ser 
                      20                  25                  30          
          Arg Ser Ser Asn Glu Glu Leu Glu Lys Glu Leu Asn Arg Tyr Ala Lys 
                  35                  40                  45              
          Ala Val Gly Ser Leu Glu Thr Ala Tyr Lys Pro Phe Leu Ala Ser Ser 
              50                  55                  60                  
          Ala Leu Val Pro Thr Thr Pro Thr Ala Phe Gln Asn Glu Leu Lys Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Phe Arg Asp Ser Leu Ile Ser Ser Cys Lys Lys Lys Asn Ile Leu Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Asp Thr Ser Ser Trp Leu Gly Phe Gln Val Tyr Ser Thr Gln Ala 
                      100                 105                 110         
          Pro Ser Val Gln Ala Ala Ser Thr Leu Gly Phe Glu Leu Lys Ala Ile 
                  115                 120                 125             
          Asn Ser Leu Val Asn Lys Leu Ala Glu Cys Gly Leu Ser Lys Phe Ile 
              130                 135                 140                 
          Lys Val Tyr Arg Pro Gln Leu Pro Ile Glu Thr Pro Ala Asn Asn Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Glu Ser Asp Glu Ala Asp Gln Ala Pro Trp Thr Pro Met Pro Leu 
                          165                 170                 175     
          Glu Ile Ala Phe Gln Gly Asp Arg Glu Ser Val Leu Lys Ala Met Asn 
                      180                 185                 190         
          Ala Ile Thr Gly Met Gln Asp Tyr Leu Phe Thr Val Asn Ser Ile Arg 
                  195                 200                 205             
          Ile Arg Asn Glu Arg Met Met Pro Pro Pro Ile Ala Asn Pro Ala Ala 
              210                 215                 220                 
          Ala Lys Pro Ala Ala Ala Gln Pro Ala Thr Gly Ala Ala Ser Leu Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Pro Ala Asp Glu Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ile Gln Gln Val 
                          245                 250                 255     
          Ile Lys Pro Ala Met Gly Lys Glu Gln Val Phe Val Gln Val Ser Leu 
                      260                 265                 270         
          Asn Leu Val His Phe Asn Gln Pro Lys Ala Gln Glu Pro Ser Glu Asp 
                  275                 280                 285             
          His His His His His His 
              290                 
          <![CDATA[<210>  9]]>
          <![CDATA[<211>  244]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  9]]>
          Met Ser Leu Glu Thr Ala Tyr Lys Pro Phe Leu Ala Ser Ser Ala Leu 
          1               5                   10                  15      
          Val Pro Thr Thr Pro Thr Ala Phe Gln Asn Glu Leu Lys Thr Phe Arg 
                      20                  25                  30          
          Asp Ser Leu Ile Ser Ser Cys Lys Lys Lys Asn Ile Leu Ile Thr Asp 
                  35                  40                  45              
          Thr Ser Ser Trp Leu Gly Phe Gln Val Tyr Ser Thr Gln Ala Pro Ser 
              50                  55                  60                  
          Val Gln Ala Ala Ser Thr Leu Gly Phe Glu Leu Lys Ala Ile Asn Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Val Asn Lys Leu Ala Glu Cys Gly Leu Ser Lys Phe Ile Lys Val 
                          85                  90                  95      
          Tyr Arg Pro Gln Leu Pro Ile Glu Thr Pro Ala Asn Asn Pro Glu Glu 
                      100                 105                 110         
          Ser Asp Glu Ala Asp Gln Ala Pro Trp Thr Pro Met Pro Leu Glu Ile 
                  115                 120                 125             
          Ala Phe Gln Gly Asp Arg Glu Ser Val Leu Lys Ala Met Asn Ala Ile 
              130                 135                 140                 
          Thr Gly Met Gln Asp Tyr Leu Phe Thr Val Asn Ser Ile Arg Ile Arg 
          145                 150                 155                 160 
          Asn Glu Arg Met Met Pro Pro Pro Ile Ala Asn Pro Ala Ala Ala Lys 
                          165                 170                 175     
          Pro Ala Ala Ala Gln Pro Ala Thr Gly Ala Ala Ser Leu Thr Pro Ala 
                      180                 185                 190         
          Asp Glu Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ile Gln Gln Val Ile Lys 
                  195                 200                 205             
          Pro Ala Met Gly Lys Glu Gln Val Phe Val Gln Val Ser Leu Asn Leu 
              210                 215                 220                 
          Val His Phe Asn Gln Pro Lys Ala Gln Glu Pro Ser Glu Asp His His 
          225                 230                 235                 240 
          His His His His 
          <![CDATA[<210>  10]]>
          <![CDATA[<211>  299]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  10]]>
          Met His His His His His His Asp Asp Asp Asp Lys Ile Val Asn Ser 
          1               5                   10                  15      
          Lys Arg Ser Glu Leu Asp Lys Lys Ile Ser Ile Ala Ala Lys Glu Ile 
                      20                  25                  30          
          Lys Ser Ala Asn Ala Ala Glu Ile Thr Pro Ser Arg Ser Ser Asn Glu 
                  35                  40                  45              
          Glu Leu Glu Lys Glu Leu Asn Arg Tyr Ala Lys Ala Val Gly Ser Leu 
              50                  55                  60                  
          Glu Thr Ala Tyr Lys Pro Phe Leu Ala Ser Ser Ala Leu Val Pro Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Pro Thr Ala Phe Gln Asn Glu Leu Lys Thr Phe Arg Asp Ser Leu 
                          85                  90                  95      
          Ile Ser Ser Cys Lys Lys Lys Asn Ile Leu Ile Thr Asp Thr Ser Ser 
                      100                 105                 110         
          Trp Leu Gly Phe Gln Val Tyr Ser Thr Gln Ala Pro Ser Val Gln Ala 
                  115                 120                 125             
          Ala Ser Thr Leu Gly Phe Glu Leu Lys Ala Ile Asn Ser Leu Val Asn 
              130                 135                 140                 
          Lys Leu Ala Glu Cys Gly Leu Ser Lys Phe Ile Lys Val Tyr Arg Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Gln Leu Pro Ile Glu Thr Pro Ala Asn Asn Pro Glu Glu Ser Asp Glu 
                          165                 170                 175     
          Ala Asp Gln Ala Pro Trp Thr Pro Met Pro Leu Glu Ile Ala Phe Gln 
                      180                 185                 190         
          Gly Asp Arg Glu Ser Val Leu Lys Ala Met Asn Ala Ile Thr Gly Met 
                  195                 200                 205             
          Gln Asp Tyr Leu Phe Thr Val Asn Ser Ile Arg Ile Arg Asn Glu Arg 
              210                 215                 220                 
          Met Met Pro Pro Pro Ile Ala Asn Pro Ala Ala Ala Lys Pro Ala Ala 
          225                 230                 235                 240 
          Ala Gln Pro Ala Thr Gly Ala Ala Ser Leu Thr Pro Ala Asp Glu Ala 
                          245                 250                 255     
          Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ile Gln Gln Val Ile Lys Pro Tyr Met 
                      260                 265                 270         
          Gly Lys Glu Gln Val Phe Val Gln Val Ser Leu Asn Leu Val His Phe 
                  275                 280                 285             
          Asn Gln Pro Lys Ala Gln Glu Pro Ser Glu Asp 
              290                 295                 
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          <![CDATA[<400>  11]]>
          Met His His His His His His Asp Asp Asp Asp Lys Ser Leu Glu Thr 
          1               5                   10                  15      
          Ala Tyr Lys Pro Phe Leu Ala Ser Ser Ala Leu Val Pro Thr Thr Pro 
                      20                  25                  30          
          Thr Ala Phe Gln Asn Glu Leu Lys Thr Phe Arg Asp Ser Leu Ile Ser 
                  35                  40                  45              
          Ser Cys Lys Lys Lys Asn Ile Leu Ile Thr Asp Thr Ser Ser Trp Leu 
              50                  55                  60                  
          Gly Phe Gln Val Tyr Ser Thr Gln Ala Pro Ser Val Gln Ala Ala Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Leu Gly Phe Glu Leu Lys Ala Ile Asn Ser Leu Val Asn Lys Leu 
                          85                  90                  95      
          Ala Glu Cys Gly Leu Ser Lys Phe Ile Lys Val Tyr Arg Pro Gln Leu 
                      100                 105                 110         
          Pro Ile Glu Thr Pro Ala Asn Asn Pro Glu Glu Ser Asp Glu Ala Asp 
                  115                 120                 125             
          Gln Ala Pro Trp Thr Pro Met Pro Leu Glu Ile Ala Phe Gln Gly Asp 
              130                 135                 140                 
          Arg Glu Ser Val Leu Lys Ala Met Asn Ala Ile Thr Gly Met Gln Asp 
          145                 150                 155                 160 
          Tyr Leu Phe Thr Val Asn Ser Ile Arg Ile Arg Asn Glu Arg Met Met 
                          165                 170                 175     
          Pro Pro Pro Ile Ala Asn Pro Ala Ala Ala Lys Pro Ala Ala Ala Gln 
                      180                 185                 190         
          Pro Ala Thr Gly Ala Ala Ser Leu Thr Pro Ala Asp Glu Ala Ala Ala 
                  195                 200                 205             
          Pro Ala Ala Pro Ala Ile Gln Gln Val Ile Lys Pro Tyr Met Gly Lys 
              210                 215                 220                 
          Glu Gln Val Phe Val Gln Val Ser Leu Asn Leu Val His Phe Asn Gln 
          225                 230                 235                 240 
          Pro Lys Ala Gln Glu Pro Ser Glu Asp 
                          245                 
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          Met His His His His His His Asp Asp Asp Asp Lys Ile Val Asn Ser 
          1               5                   10                  15      
          Lys Arg Ser Glu Leu Asp Lys Lys Ile Ser Ile Ala Ala Lys Glu Ile 
                      20                  25                  30          
          Lys Ser Ala Asn Ala Ala Glu Ile Thr Pro Ser Arg Ser Ser Asn Glu 
                  35                  40                  45              
          Glu Leu Glu Lys Glu Leu Asn Arg Tyr Ala Lys Ala Val Gly Ser Leu 
              50                  55                  60                  
          Glu Thr Ala Tyr Lys Pro Phe Leu Ala Ser Ser Ala Leu Val Pro Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Pro Thr Ala Phe Gln Asn Glu Leu Lys Thr Phe Arg Asp Ser Leu 
                          85                  90                  95      
          Ile Ser Ser Cys Lys Lys Lys Asn Ile Leu Ile Thr Asp Thr Ser Ser 
                      100                 105                 110         
          Trp Leu Gly Phe Gln Val Tyr Ser Thr Gln Ala Pro Ser Val Gln Ala 
                  115                 120                 125             
          Ala Ser Thr Leu Gly Phe Glu Leu Lys Ala Ile Asn Ser Leu Val Asn 
              130                 135                 140                 
          Lys Leu Ala Glu Cys Gly Leu Ser Lys Phe Ile Lys Val Tyr Arg Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Gln Leu Pro Ile Glu Thr Pro Ala Asn Asn Pro Glu Glu Ser Asp Glu 
                          165                 170                 175     
          Ala Asp Gln Ala Pro Trp Thr Pro Met Pro Leu Glu Ile Ala Phe Gln 
                      180                 185                 190         
          Gly Asp Arg Glu Ser Val Leu Lys Ala Met Asn Ala Ile Thr Gly Met 
                  195                 200                 205             
          Gln Asp Tyr Leu Phe Thr Val Asn Ser Ile Arg Ile Arg Asn Glu Arg 
              210                 215                 220                 
          Met Met Pro Pro Pro Ile Ala Asn Pro Ala Ala Ala Lys Pro Ala Ala 
          225                 230                 235                 240 
          Ala Gln Pro Ala Thr Gly Ala Ala Ser Leu Thr Pro Ala Asp Glu Ala 
                          245                 250                 255     
          Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ile Gln Gln Val Ile Lys Pro Ala Met 
                      260                 265                 270         
          Gly Lys Glu Gln Val Phe Val Gln Val Ser Leu Asn Leu Val His Phe 
                  275                 280                 285             
          Asn Gln Pro Lys Ala Gln Glu Pro Ser Glu Asp 
              290                 295                 
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          Met His His His His His His Asp Asp Asp Asp Lys Ser Leu Glu Thr 
          1               5                   10                  15      
          Ala Tyr Lys Pro Phe Leu Ala Ser Ser Ala Leu Val Pro Thr Thr Pro 
                      20                  25                  30          
          Thr Ala Phe Gln Asn Glu Leu Lys Thr Phe Arg Asp Ser Leu Ile Ser 
                  35                  40                  45              
          Ser Cys Lys Lys Lys Asn Ile Leu Ile Thr Asp Thr Ser Ser Trp Leu 
              50                  55                  60                  
          Gly Phe Gln Val Tyr Ser Thr Gln Ala Pro Ser Val Gln Ala Ala Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Leu Gly Phe Glu Leu Lys Ala Ile Asn Ser Leu Val Asn Lys Leu 
                          85                  90                  95      
          Ala Glu Cys Gly Leu Ser Lys Phe Ile Lys Val Tyr Arg Pro Gln Leu 
                      100                 105                 110         
          Pro Ile Glu Thr Pro Ala Asn Asn Pro Glu Glu Ser Asp Glu Ala Asp 
                  115                 120                 125             
          Gln Ala Pro Trp Thr Pro Met Pro Leu Glu Ile Ala Phe Gln Gly Asp 
              130                 135                 140                 
          Arg Glu Ser Val Leu Lys Ala Met Asn Ala Ile Thr Gly Met Gln Asp 
          145                 150                 155                 160 
          Tyr Leu Phe Thr Val Asn Ser Ile Arg Ile Arg Asn Glu Arg Met Met 
                          165                 170                 175     
          Pro Pro Pro Ile Ala Asn Pro Ala Ala Ala Lys Pro Ala Ala Ala Gln 
                      180                 185                 190         
          Pro Ala Thr Gly Ala Ala Ser Leu Thr Pro Ala Asp Glu Ala Ala Ala 
                  195                 200                 205             
          Pro Ala Ala Pro Ala Ile Gln Gln Val Ile Lys Pro Ala Met Gly Lys 
              210                 215                 220                 
          Glu Gln Val Phe Val Gln Val Ser Leu Asn Leu Val His Phe Asn Gln 
          225                 230                 235                 240 
          Pro Lys Ala Gln Glu Pro Ser Glu Asp 
                          245                 
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          tttacagcta gctcagtcct aggtattatg ctagc                                  35
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          ctgatagcta gctcagtcct agggattatg ctagc                                  35
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          tttacagcta gctcagtcct agggactgtg ctagc                                  35
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          ttgacagcta gctcagtcct agggattgtg ctagc                                  35
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          aaagtgtttt gtaatcataa agaaatatta aggtggggta ggaatagtat aatatgttta       60
          ttcaaccgaa cttaatg                                                      77
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          gggccgagca tgtggaaaca cctctgccag gtcaagcccg cagccatgcc gcatgttttt       60
          ttcttgaccg cccgggcaga accgtcgggc ggagccgtgt catgctccac acacgctaca      120
          tggaaagaaa caagagattt ttgctagcca cagttcggtt tttggtgtaa ctaatc          176
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          <![CDATA[<400>  24]]>
          gtaaatttag gattaatcct ggaacttttt ttgtcgccca gccaatgctt tcagtcgtga       60
          ctaattttcc ttgcggaggc ttgtctgaag cggtttccgc gattttcttc tgtaaattgt      120
          cgctgacaaa aaagattaaa cgtaccttat acaagacttt tttttcatat gcctgacgga      180
          gttcacactt gtaagttttc aactacgttg tagactttac atcgccaggg gtgctcggca      240
          taagccgaag atatcggtag agttaatatt gagcagatcc ccggtgaagg atttaaccgt      300
          gttatctcgt tggagatatt catggcgtat tttggatga                             339
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          ttgacggcta gctcagtcct aggtatagtg ctagc                                  35
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          ctgacagcta gctcagtcct aggtataatg ctagc                                  35
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          tttacggcta gctcagccct aggtattatg ctagc                                  35
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          tttacggcta gctcagtcct aggtatagtg ctagc                                  35
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          <![CDATA[<400>  39]]>
          agaggttcca actttcacca taatgaaaca                                        30
          <![CDATA[<210>  40]]>
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          caccttcggg tgggcctttc tgcgtttata                                        30
          <![CDATA[<210>  41]]>
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          ggctagctca gtcctaggta ctatgctagc                                        30
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          aaagtgtgac gccgtgcaaa taatcaatgt                                        30
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          ggctagctca gtcctaggta ttatgctagc                                        30
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          taaacaacta acggacaatt ctacctaaca                                        30
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          <![CDATA[<400>  45]]>
          aagctgttgt gaccgcttgc tctagccagc tatcgagttg tgaaccgatc catctagcaa       60
          ttggtctcga tctagcgata ggcttcgatc tagctatgta tcactcatta ggcaccccag      120
          gctttacact ttatgcttcc ggctcgtata atgtgtggtg ctggttagcg cttgctat        178
          <![CDATA[<210>  46]]>
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          aagctgttgt gaccgcttgc tctagccagc tatcgagttg tgaaccgatc catctagcaa       60
          ttggtctcga tctagcgata ggcttcgatc tagctatgta gaaacgccgt gtgctcgatc      120
          gcttgataag gtccacgtag ctgctataat tgcttcaaca gaacatattg actatccggt      180
          attacccggc                                                             190
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          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  47]]>
          catacgccgt tatacgttgt ttacgctttg                                        30
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          <![CDATA[<400>  48]]>
          taattcctaa tttttgttga cactctatcg ttgatagagt tattttacca ctccctatca       60
          gtgatagaga aaa                                                          73
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          ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg tgtggaattg tgag                        44
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          cccaggcttt acactttatg cttccggctc gtataatgtg tggaattgtg ag               52
          <![CDATA[<210>  51]]>
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          <![CDATA[<400>  51]]>
          tgctagctac tagagattaa agaggagaaa                                        30
          <![CDATA[<210>  52]]>
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          ggctagctca gtcctaggta cagtgctagc                                        30
          <![CDATA[<210>  53]]>
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          ccccgaaagc ttaagaatat aattgtaagc                                        30
          <![CDATA[<210>  54]]>
          <![CDATA[<211>  30]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  54]]>
          atatatatat atatataatg gaagcgtttt                                        30
          <![CDATA[<210>  55]]>
          <![CDATA[<211>  74]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  55]]>
          tccctatcag tgatagagat tgacatccct atcagtgata gagatactga gcacatcagc       60
          aggacgcact gacc                                                         74
          <![CDATA[<210>  56]]>
          <![CDATA[<211>  68]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  56]]>
          attccactaa tttattccat gtcacacttt tcgcatcttt gttatgctat ggttatttca       60
          taccataa                                                                68
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          <![CDATA[<211>  76]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  57]]>
          ataaatgtga gcggataaca attgacattg tgagcggata acaagatact gagcacatca       60
          gcaggacgca ctgacc                                                       76
          <![CDATA[<210>  58]]>
          <![CDATA[<211>  65]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  58]]>
          aaaaacgccg caaagtttga gcgaagtcaa taaactctct acccattcag ggcaatatct       60
          ctctt                                                                   65
          <![CDATA[<210>  59]]>
          <![CDATA[<211>  81]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  59]]>
          atgaagaaaa agatcattag cgcgatcctg atgagcaccg tgattctgag cgcggcggcg       60
          ccgctgagcg gtgtttatgc g                                                 81
          <![CDATA[<210>  60]]>
          <![CDATA[<211>  63]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  60]]>
          atgaagaaaa ccgcgattgc gattgcggtg gcgctggcgg gtttcgcgac cgttgcgcag       60
          gcg                                                                     63
          <![CDATA[<210>  61]]>
          <![CDATA[<211>  57]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  61]]>
          atgaagaaaa tctggctggc gctggcgggt ctggtgctgg cgttcagcgc gagcgcg          57
          <![CDATA[<210>  62]]>
          <![CDATA[<211>  66]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  62]]>
          atgaagtacc tgctgccgac cgcggcggcg ggtctgctgc tgctggcggc gcagccggcg       60
          atggcg                                                                  66
          <![CDATA[<210>  63]]>
          <![CDATA[<211>  63]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  63]]>
          atggaaggaa acactcgtga agacaatttt aaacatttat taggtaatga caatgttaaa       60
          cgc                                                                     63
          <![CDATA[<210>  64]]>
          <![CDATA[<211>  147]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  64]]>
          atgaataaaa tatactccct taaatatagt gctgccactg gcggactcat tgctgtttct       60
          gaattagcga aaagagtttc tggtaaaaca aaccgaaaac ttgtagcaac aatgttgtct      120
          ctggctgttg ccggtacagt aaatgca                                          147
          <![CDATA[<210>  65]]>
          <![CDATA[<211>  90]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  65]]>
          atgagcaact ggatcaccga caacaaaccg gctgcgatgg ttgcgggtgt gggcctgctg       60
          ctgttcctgg gtctgagcgc gaccggctac                                        90
          <![CDATA[<210>  66]]>
          <![CDATA[<211>  33]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  66]]>
          atgcgtaaag gcgaagagaa ggaggttaac tga                                    33
          <![CDATA[<210>  67]]>
          <![CDATA[<211>  54]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  67]]>
          atgaaagcaa ttttcgtact gaaacatctt aatcatgcta aggaggtttt ctaa             54
          <![CDATA[<210>  68]]>
          <![CDATA[<211>  33]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  68]]>
          atgattatgt ccggttataa ggaggttaac tga                                    33
          <![CDATA[<210>  69]]>
          <![CDATA[<211>  45]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  69]]>
          atgaaaatcg aagcaggtaa actggtacag aaggaggtta actga                       45
          <![CDATA[<210>  70]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  70]]>
          ggaggaaaaa ttaaaaaaga ac                                                22
          <![CDATA[<210>  71]]>
          <![CDATA[<211>  12]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  71]]>
          aaagaggaga aa                                                           12
          <![CDATA[<210>  72]]>
          <![CDATA[<400>  72]]>
          000
          <![CDATA[<210>  73]]>
          <![CDATA[<400>  73]]>
          000
          <![CDATA[<210>  74]]>
          <![CDATA[<211>  186]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  74]]>
          cgagctcgat agtgctagtg tagatcgcta ctagagccag gcatcaaata aaacgaaagg       60
          ctcagtcgaa agactgggcc tttcgtttta tctgttgttt gtcggtgaac gctctctact      120
          agagtcacac tggctcacct tcgggtgggc ctttctgcgt ttatatacta gaagcggccg      180
          ctgcag                                                                 186
          <![CDATA[<210>  75]]>
          <![CDATA[<211>  173]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  75]]>
          cgagctcgat agtgctagtg tagatcgcta ctagagccag gcatcaaata aaacgaaaga       60
          ctgggccttt cgttttatct gttgtttgtc ggtgaacgct ctctactaga gtcacactgg      120
          ctcaccttcg ggtgggcctt tctgcgttta tatactagaa gcggccgctg cag             173
          <![CDATA[<210>  76]]>
          <![CDATA[<211>  27]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  76]]>
          Met Lys Lys Lys Ile Ile Ser Ala Ile Leu Met Ser Thr Val Ile Leu 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser Gly Val Tyr Ala 
                      20                  25          
          <![CDATA[<210>  77]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  77]]>
          Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala 
          1               5                   10                  15      
          Thr Val Ala Gln Ala 
                      20      
          <![CDATA[<210>  78]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  78]]>
          Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser 
          1               5                   10                  15      
          Ala Ser Ala 
          <![CDATA[<210>  79]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  79]]>
          Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ala Gln Pro Ala Met Ala 
                      20          
          <![CDATA[<210>  80]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  80]]>
          Met Glu Gly Asn Thr Arg Glu Asp Asn Phe Lys His Leu Leu Gly Asn 
          1               5                   10                  15      
          Asp Asn Val Lys Arg 
                      20      
          <![CDATA[<210>  81]]>
          <![CDATA[<211>  49]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  81]]>
          Met Asn Lys Ile Tyr Ser Leu Lys Tyr Ser Ala Ala Thr Gly Gly Leu 
          1               5                   10                  15      
          Ile Ala Val Ser Glu Leu Ala Lys Arg Val Ser Gly Lys Thr Asn Arg 
                      20                  25                  30          
          Lys Leu Val Ala Thr Met Leu Ser Leu Ala Val Ala Gly Thr Val Asn 
                  35                  40                  45              
          Ala 
          <![CDATA[<210>  82]]>
          <![CDATA[<211>  30]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  82]]>
          Met Ser Asn Trp Ile Thr Asp Asn Lys Pro Ala Ala Met Val Ala Gly 
          1               5                   10                  15      
          Val Gly Leu Leu Leu Phe Leu Gly Leu Ser Ala Thr Gly Tyr 
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          ctgtgcaaac aagtgtctca                                                   20
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          tcgcacagcg tgtaccacag                                                   20
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          ttgcgtattt tcaaaaagcg                                                   20
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          ccctgccact cacaccattc                                                   20
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          <![CDATA[<400>  97]]>
          ccttctcctg gcaagcttac                                                   20
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          <![CDATA[<400>  98]]>
          cgacaagaag tacctgcaac                                                   20
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          gttatcgtga tgcgcattct                                                   20
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          ccgtgacgtt atccgcacca                                                   20
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          tatcgccttc atccacacga                                                   20
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          ggatatgtgg ggtaacgacg                                                   20
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          acgttcaggc tgctaaagat                                                   20
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          tctagagctt gtcgacgtct cgagtttaca gctagctcag tcctaggtat tatgctagcc       60
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          tcaccaccac cacgacgacg acgacaaaat tgttaacagc aagcgtagcg agctggataa      240
          gaaaatcagc attgcggcga aagagatcaa gagcgcgaac gcggcggaaa ttaccccgag      300
          ccgtagcagc aacgaggaac tggagaaaga actgaaccgt tacgcgaagg cggttggtag      360
          cctggaaacc gcgtataaac cgtttctggc gagcagcgcg ctggtgccga ccaccccgac      420
          cgcgttccaa aacgagctga aaacctttcg tgacagcctg atcagcagct gcaagaaaaa      480
          gaacatcctg attaccgata ccagcagctg gctgggcttc caggtttaca gcacccaagc      540
          gccgagcgtg caggcggcga gcaccctggg ttttgagctg aaagcgatta acagcctggt      600
          taacaagctg gcggaatgcg gcctgagcaa attcatcaag gtgtatcgtc cgcagctgcc      660
          gattgaaacc ccggcgaaca acccggagga aagcgacgaa gcggatcagg cgccgtggac      720
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          ggcgaccggt gcggcgagcc tgaccccggc ggacgaggct gcggcgccgg ctgcgccggc      960
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          gaacctggtg cactttaacc agccgaaagc gcaagagccg agcgaagatt gacgagctcg     1080
          atagtgctag tgtagatcgc tactagagcc aggcatcaaa taaaacgaaa ggctcagtcg     1140
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          gccgcgcacg ctgatttttt atgaatc                                           27
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          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
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          ctcgagacgt cgacaagctc tagagtagcg ctattcctgc tgcga                       45
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          cgctactcta gagcttgtcg acgtctc                                           27
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          ctacgcttgc tgttaacaat cgcataaaca ccgctcagcg                             40
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          cgatctacac tagcactatc gagctcgtta ttagtggtgg                             40
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          ccaccactaa taacgagctc gatagtgcta gtgtagatcg                             40
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          tactagaagc ggccgctgca gtcacgcatg tgaaatggtt atgc                        44
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          gtgaagacca gctcatcagc tttcgc                                            26
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          gccgcgcacg ctgatttttt atgaatc                                           27
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          ctcgagacgt cgacaagctc tagagtagcg ctattcctgc tgcga                       45
          <![CDATA[<210>  133]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  133]]>
          cgctactcta gagcttgtcg acgtctc                                           27
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          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<400>  134]]>
          attcataagc ttctttctcc tctttcctc                                         29
          <![CDATA[<210>  135]]>
          <![CDATA[<211>  58]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  135]]>
          ctcgaggaaa gaggagaaag aagcttatga ataaaatata ctcccttaaa tatagtgc         58
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          <![CDATA[<400>  136]]>
          tgcatttact gtaccggcaa ca                                                22
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          tctctggctg ttgccggtac agtaaatgca attgttaaca gcaagcgtag cg               52
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          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  138]]>
          cgcagatcac ccatacgttt gttaaggttg ttgtggtggt ggtgatgatg atct             54
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          <![CDATA[<400>  139]]>
          aaccttaaca aacgtatggg tgat                                              24
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          <![CDATA[<400>  140]]>
          cactatcgag ctcgttatca gaaagagtaa cggaagttgg cg                          42
          <![CDATA[<210>  141]]>
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          acttccgtta ctctttctga taacgagctc gatagtgcta gtg                         43
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          ctgcagcggc cgcttctagt at                                                22
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          tactagaagc ggccgctgca gtcacgcatg tgaaatggtt atgc                        44
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          gtgaagacca gctcatcagc tttcgc                                            26
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          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  145]]>
          Met Ile Val Asn Ser Lys Arg Ser Glu Leu Asp Lys Lys Ile Ser Ile 
          1               5                   10                  15      
          Ala Ala Lys Glu Ile Lys Ser Ala Asn Ala Ala Glu Ile Thr Pro Ser 
                      20                  25                  30          
          Arg Ser Ser Asn Glu Glu Leu Glu Lys Glu Leu Asn Arg Tyr Ala Lys 
                  35                  40                  45              
          Ala Val Gly Ser Leu Glu Thr Ala Tyr Lys Pro Phe Leu Ala Ser Ser 
              50                  55                  60                  
          Ala Leu Val Pro Thr Thr Pro Thr Ala Phe Gln Asn Glu Leu Lys Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Phe Arg Asp Ser Leu Ile Ser Ser Cys Lys Lys Lys Asn Ile Leu Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Asp Thr Ser Ser Trp Leu Gly Phe Gln Val Tyr Ser Thr Gln Ala 
                      100                 105                 110         
          Pro Ser Val Gln Ala Ala Ser Thr Leu Gly Phe Glu Leu Lys Ala Ile 
                  115                 120                 125             
          Asn Ser Leu Val Asn Lys Leu Ala Glu Cys Gly Leu Ser Lys Phe Ile 
              130                 135                 140                 
          Lys Val Tyr Arg Pro Gln Leu Pro Ile Glu Thr Pro Ala Asn Asn Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Glu Ser Asp Glu Ala Asp Gln Ala Pro Trp Thr Pro Met Pro Leu 
                          165                 170                 175     
          Glu Ile Ala Phe Gln Gly Asp Arg Glu Ser Val Leu Lys Ala Met Asn 
                      180                 185                 190         
          Ala Ile Thr Gly Met Gln Asp Tyr Leu Phe Thr Val Asn Ser Ile Arg 
                  195                 200                 205             
          Ile Arg Asn Glu Arg Met Met Pro Pro Pro Ile Ala Asn Pro Ala Ala 
              210                 215                 220                 
          Ala Lys Pro Ala Ala Ala Gln Pro Ala Thr Gly Ala Ala Ser Leu Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Pro Ala Asp Glu Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ile Gln Gln Val 
                          245                 250                 255     
          Ile Lys Pro Tyr Met Gly Lys Glu Gln Val Phe Val Gln Val Ser Leu 
                      260                 265                 270         
          Asn Leu Val His Phe Asn Gln Pro Lys Ala Gln Glu Pro Ser Glu Asp 
                  275                 280                 285             
          Leu Glu His His His His His His 
              290                 295     
          <![CDATA[<210>  146]]>
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          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  146]]>
          Met Ile Val Asn Ser Lys Arg Ser Glu Leu Asp Lys Lys Ile Ser Ile 
          1               5                   10                  15      
          Ala Ala Lys Glu Ile Lys Ser Ala Asn Ala Ala Glu Ile Thr Pro Ser 
                      20                  25                  30          
          Arg Ser Ser Asn Glu Glu Leu Glu Lys Glu Leu Asn Arg Tyr Ala Lys 
                  35                  40                  45              
          Ala Val Gly Ser Leu Glu Thr Ala Tyr Lys Pro Phe Leu Ala Ser Ser 
              50                  55                  60                  
          Ala Leu Val Pro Thr Thr Pro Thr Ala Phe Gln Asn Glu Leu Lys Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Phe Arg Asp Ser Leu Ile Ser Ser Cys Lys Lys Lys Asn Ile Leu Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Asp Thr Ser Ser Trp Leu Gly Phe Gln Val Tyr Ser Thr Gln Ala 
                      100                 105                 110         
          Pro Ser Val Gln Ala Ala Ser Thr Leu Gly Phe Glu Leu Lys Ala Ile 
                  115                 120                 125             
          Asn Ser Leu Val Asn Lys Leu Ala Glu Cys Gly Leu Ser Lys Phe Ile 
              130                 135                 140                 
          Lys Val Tyr Arg Pro Gln Leu Pro Ile Glu Thr Pro Ala Asn Asn Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Glu Ser Asp Glu Ala Asp Gln Ala Pro Trp Thr Pro Met Pro Leu 
                          165                 170                 175     
          Glu Ile Ala Phe Gln Gly Asp Arg Glu Ser Val Leu Lys Ala Met Asn 
                      180                 185                 190         
          Ala Ile Thr Gly Met Gln Asp Tyr Leu Phe Thr Val Asn Ser Ile Arg 
                  195                 200                 205             
          Ile Arg Asn Glu Arg Met Met Pro Pro Pro Ile Ala Asn Pro Ala Ala 
              210                 215                 220                 
          Ala Lys Pro Ala Ala Ala Gln Pro Ala Thr Gly Ala Ala Ser Leu Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Pro Ala Asp Glu Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ile Gln Gln Val 
                          245                 250                 255     
          Ile Lys Pro Ala Met Gly Lys Glu Gln Val Phe Val Gln Val Ser Leu 
                      260                 265                 270         
          Asn Leu Val His Phe Asn Gln Pro Lys Ala Gln Glu Pro Ser Glu Asp 
                  275                 280                 285             
          Leu Glu His His His His His His 
              290                 295     
          <![CDATA[<210>  147]]>
          <![CDATA[<211>  891]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  147]]>
          atgatcgtga atagtaagcg tagcgaactg gataagaaga ttagcattgc cgccaaagaa       60
          attaaatctg caaatgcagc agaaattaca cctagtcgca gcagcaatga agaactggag      120
          aaagaactga atcgttatgc aaaggcagtt ggcagcctgg aaaccgccta taaaccgttt      180
          ctggcaagca gtgcactggt tccgaccaca cctaccgcat ttcagaatga actgaagact      240
          ttccgtgata gtctgattag tagctgcaag aagaagaata ttctgattac cgataccagt      300
          agttggctgg gtttccaggt ttatagcacc caggcaccga gcgtgcaggc cgcaagtacc      360
          ctgggtttcg aactgaaagc cattaatagt ctggtgaata aactggccga atgtggcctg      420
          agcaaattta ttaaagttta tcgtccgcag ctgccgattg aaacacctgc caataatccg      480
          gaagaaagcg atgaagcaga tcaggcaccg tggacaccta tgccgctgga aattgcattt      540
          cagggcgatc gtgaaagcgt gctgaaagcc atgaatgcca ttaccggcat gcaggattat      600
          ctgtttaccg tgaatagtat tcgcattcgc aatgaacgca tgatgccgcc gccgattgcc      660
          aatccggcag ccgcaaagcc ggcagccgcc cagcctgcaa ccggtgcagc aagcctgaca      720
          cctgcagatg aagcagcagc accggcagca cctgcaattc agcaggttat taaaccggcc      780
          atgggcaaag aacaggtgtt tgttcaggtt agcctgaatc tggtgcattt caatcagccg      840
          aaagcacagg aaccgagcga agatctcgag caccaccacc accaccactg a               891
          <![CDATA[<210>  148]]>
          <![CDATA[<211>  1245]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  148]]>
          tctagagctt gtcgacgtct cgagtttaca gctagctcag tcctaggtat tatgctagcc       60
          tcgaggaaag aggagaaaga agcttatgaa gaaaaagatc attagcgcga tcctgatgag      120
          caccgtgatt ctgagcgcgg cggcgccgct gagcggtgtt tatgcgggta gcagccatca      180
          tcaccaccac cacgacgacg acgacaaaat tgttaacagc aagcgtagcg agctggataa      240
          gaaaatcagc attgcggcga aagagatcaa gagcgcgaac gcggcggaaa ttaccccgag      300
          ccgtagcagc aacgaggaac tggagaaaga actgaaccgt tacgcgaagg cggttggtag      360
          cctggaaacc gcgtataaac cgtttctggc gagcagcgcg ctggtgccga ccaccccgac      420
          cgcgttccaa aacgagctga aaacctttcg tgacagcctg atcagcagct gcaagaaaaa      480
          gaacatcctg attaccgata ccagcagctg gctgggcttc caggtttaca gcacccaagc      540
          gccgagcgtg caggcggcga gcaccctggg ttttgagctg aaagcgatta acagcctggt      600
          taacaagctg gcggaatgcg gcctgagcaa attcatcaag gtgtatcgtc cgcagctgcc      660
          gattgaaacc ccggcgaaca acccggagga aagcgacgaa gcggatcagg cgccgtggac      720
          cccgatgccg ctggagatcg cgttccaggg tgaccgtgaa agcgttctga aagcgatgaa      780
          cgcgattacc ggcatgcaag attacctgtt taccgtgaac agcatccgta ttcgtaacga      840
          acgtatgatg ccgccgccaa tcgcgaaccc ggctgcggcg aagccggctg cggcgcagcc      900
          ggcgaccggt gcggcgagcc tgaccccggc ggacgaggct gcggcgccgg ctgcgccggc      960
          gatccagcaa gttattaaac cgtatatggg caaggaacag gtgttcgttc aagtgagcct     1020
          gaacctggtg cactttaacc agccgaaagc gcaagagccg agcgaagatt gacgagctcg     1080
          atagtgctag tgtagatcgc tactagagcc aggcatcaaa taaaacgaaa gactgggcct     1140
          ttcgttttat ctgttgtttg tcggtgaacg ctctctacta gagtcacact ggctcacctt     1200
          cgggtgggcc tttctgcgtt tatatactag aagcggccgc tgcag                     1245
          <![CDATA[<210>  149]]>
          <![CDATA[<211>  15460]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  149]]>
          ctgctcgcgc aggctgggtg ccaagctctc gggtaacatc aaggcccgat ccttggagcc       60
          cttgccctcc cgcacgatga tcgtgccgtg atcgaaatcc agatccttga cccgcagttg      120
          caaaccctca ctgatccgca tgcggatctt gctgtaggca taggcttggt tatgccggta      180
          ctgccgggcc tcttgcggga ttacgaaatc atcctgtgga gcttagtagg tttagcaaga      240
          tggcagcgcc taaatgtaga atgataaaag gattaagaga ttaatttccc taaaaatgat      300
          aaaacaagcg ttttgaaagc gcttgttttt ttggtttgca gtcagagtag aatagaagta      360
          tcaaaaaaag caccgactcg gtgccacttt ttcaagttga taacggacta gccttatttt      420
          aacttgctat gctgttttga atggttccaa caagattatt ttataacttt tataacaaat      480
          aatcaaggag aaattcaaag aaatttatca gccataaaac aatacttaat actatagaat      540
          gataacaaaa taaactactt tttaaaagaa ttttgtgtta taatctattt attattaagt      600
          attgggtaat attttttgaa gagatatttt gaaaaagaaa aattaaagca tattaaacta      660
          atttcggagg tcattaaaac tattattgaa atcatcaaac tcattatgga tttaatttaa      720
          actttttatt ttaggaggca aaaatggata agaaatactc aataggctta gatatcggca      780
          caaatagcgt cggatgggcg gtgatcactg atgaatataa ggttccgtct aaaaagttca      840
          aggttctggg aaatacagac cgccacagta tcaaaaaaaa tcttataggg gctcttttat      900
          ttgacagtgg agagacagcg gaagcgactc gtctcaaacg gacagctcgt agaaggtata      960
          cacgtcggaa gaatcgtatt tgttatctac aggagatttt ttcaaatgag atggcgaaag     1020
          tagatgatag tttctttcat cgacttgaag agtctttttt ggtggaagaa gacaagaagc     1080
          atgaacgtca tcctattttt ggaaatatag tagatgaagt tgcttatcat gagaaatatc     1140
          caactatcta tcatctgcga aaaaaattgg tagattctac tgataaagcg gatttgcgct     1200
          taatctattt ggccttagcg catatgatta agtttcgtgg tcattttttg attgagggag     1260
          atttaaatcc tgataatagt gatgtggaca aactatttat ccagttggta caaacctaca     1320
          atcaattatt tgaagaaaac cctattaacg caagtggagt agatgctaaa gcgattcttt     1380
          ctgcacgatt gagtaaatca agacgattag aaaatctcat tgctcagctc cccggtgaga     1440
          agaaaaatgg cttatttggg aatctcattg ctttgtcatt gggtttgacc cctaatttta     1500
          aatcaaattt tgatttggca gaagatgcta aattacagct ttcaaaagat acttacgatg     1560
          atgatttaga taatttattg gcgcaaattg gagatcaata tgctgatttg tttttggcag     1620
          ctaagaattt atcagatgct attttacttt cagatatcct aagagtaaat actgaaataa     1680
          ctaaggctcc cctatcagct tcaatgatta aacgctacga tgaacatcat caagacttga     1740
          ctcttttaaa agctttagtt cgacaacaac ttccagaaaa gtataaagaa atcttttttg     1800
          atcaatcaaa aaacggatat gcaggttata ttgatggggg agctagccaa gaagaatttt     1860
          ataaatttat caaaccaatt ttagaaaaaa tggatggtac tgaggaatta ttggtgaaac     1920
          taaatcgtga agatttgctg cgcaagcaac ggacctttga caacggctct attccccatc     1980
          aaattcactt gggtgagctg catgctattt tgagaagaca agaagacttt tatccatttt     2040
          taaaagacaa tcgtgagaag attgaaaaaa tcttgacttt tcgaattcct tattatgttg     2100
          gtccattggc gcgtggcaat agtcgttttg catggatgac tcggaagtct gaagaaacaa     2160
          ttaccccatg gaattttgaa gaagttgtcg ataaaggtgc ttcagctcaa tcatttattg     2220
          aacgcatgac aaactttgat aaaaatcttc caaatgaaaa agtactacca aaacatagtt     2280
          tgctttatga gtattttacg gtttataacg aattgacaaa ggtcaaatat gttactgaag     2340
          gaatgcgaaa accagcattt ctttcaggtg aacagaagaa agccattgtt gatttactct     2400
          tcaaaacaaa tcgaaaagta accgttaagc aattaaaaga agattatttc aaaaaaatag     2460
          aatgttttga tagtgttgaa atttcaggag ttgaagatag atttaatgct tcattaggta     2520
          cctaccatga tttgctaaaa attattaaag ataaagattt tttggataat gaagaaaatg     2580
          aagatatctt agaggatatt gttttaacat tgaccttatt tgaagatagg gagatgattg     2640
          aggaaagact taaaacatat gctcacctct ttgatgataa ggtgatgaaa cagcttaaac     2700
          gtcgccgtta tactggttgg ggacgtttgt ctcgaaaatt gattaatggt attagggata     2760
          agcaatctgg caaaacaata ttagattttt tgaaatcaga tggttttgcc aatcgcaatt     2820
          ttatgcagct gatccatgat gatagtttga catttaaaga agacattcaa aaagcacaag     2880
          tgtctggaca aggcgatagt ttacatgaac atattgcaaa tttagctggt agccctgcta     2940
          ttaaaaaagg tattttacag actgtaaaag ttgttgatga attggtcaaa gtaatggggc     3000
          ggcataagcc agaaaatatc gttattgaaa tggcacgtga aaatcagaca actcaaaagg     3060
          gccagaaaaa ttcgcgagag cgtatgaaac gaatcgaaga aggtatcaaa gaattaggaa     3120
          gtcagattct taaagagcat cctgttgaaa atactcaatt gcaaaatgaa aagctctatc     3180
          tctattatct ccaaaatgga agagacatgt atgtggacca agaattagat attaatcgtt     3240
          taagtgatta tgatgtcgat cacattgttc cacaaagttt ccttaaagac gattcaatag     3300
          acaataaggt cttaacgcgt tctgataaaa atcgtggtaa atcggataac gttccaagtg     3360
          aagaagtagt caaaaagatg aaaaactatt ggagacaact tctaaacgcc aagttaatca     3420
          ctcaacgtaa gtttgataat ttaacgaaag ctgaacgtgg aggtttgagt gaacttgata     3480
          aagctggttt tatcaaacgc caattggttg aaactcgcca aatcactaag catgtggcac     3540
          aaattttgga tagtcgcatg aatactaaat acgatgaaaa tgataaactt attcgagagg     3600
          ttaaagtgat taccttaaaa tctaaattag tttctgactt ccgaaaagat ttccaattct     3660
          ataaagtacg tgagattaac aattaccatc atgcccatga tgcgtatcta aatgccgtcg     3720
          ttggaactgc tttgattaag aaatatccaa aacttgaatc ggagtttgtc tatggtgatt     3780
          ataaagttta tgatgttcgt aaaatgattg ctaagtctga gcaagaaata ggcaaagcaa     3840
          ccgcaaaata tttcttttac tctaatatca tgaacttctt caaaacagaa attacacttg     3900
          caaatggaga gattcgcaaa cgccctctaa tcgaaactaa tggggaaact ggagaaattg     3960
          tctgggataa agggcgagat tttgccacag tgcgcaaagt attgtccatg ccccaagtca     4020
          atattgtcaa gaaaacagaa gtacagacag gcggattctc caaggagtca attttaccaa     4080
          aaagaaattc ggacaagctt attgctcgta aaaaagactg ggatccaaaa aaatatggtg     4140
          gttttgatag tccaacggta gcttattcag tcctagtggt tgctaaggtg gaaaaaggga     4200
          aatcgaagaa gttaaaatcc gttaaagagt tactagggat cacaattatg gaaagaagtt     4260
          cctttgaaaa aaatccgatt gactttttag aagctaaagg atataaggaa gttaaaaaag     4320
          acttaatcat taaactacct aaatatagtc tttttgagtt agaaaacggt cgtaaacgga     4380
          tgctggctag tgccggagaa ttacaaaaag gaaatgagct ggctctgcca agcaaatatg     4440
          tgaatttttt atatttagct agtcattatg aaaagttgaa gggtagtcca gaagataacg     4500
          aacaaaaaca attgtttgtg gagcagcata agcattattt agatgagatt attgagcaaa     4560
          tcagtgaatt ttctaagcgt gttattttag cagatgccaa tttagataaa gttcttagtg     4620
          catataacaa acatagagac aaaccaatac gtgaacaagc agaaaatatt attcatttat     4680
          ttacgttgac gaatcttgga gctcccgctg cttttaaata ttttgataca acaattgatc     4740
          gtaaacgata tacgtctaca aaagaagttt tagatgccac tcttatccat caatccatca     4800
          ctggtcttta tgaaacacgc attgatttga gtcagctagg aggtgactga agtatatttt     4860
          agatgaagat tatttcttaa taactaaaaa tatggtataa tactcttaat aaatgcagta     4920
          atacaggggc ttttcaagac tgaagtctag ctgagacaaa tagtgcgatt acgaaatttt     4980
          ttagacaaaa atagtctacg aggttttaga gctatgctgt tttgaatggt cccaaaactg     5040
          cagcgcaata gttggcgaag taatcgcaac atccgcatta aaatctagcg agggctttac     5100
          taagctccgc aaaaaacccc gcccctgaca gggcggggtt ttttcgcgcc cgatccttgg     5160
          agcccttgcc ctcccgcacg atgatcgtgc cgtgatcgaa atccagatcc ttgacccgca     5220
          gttgcaaacc ctcactgatc cgcatgctta tgacaacttg acggctacat cattcacttt     5280
          ttcttcacaa ccggcacgga actcgctcgg gctggccccg gtgcattttt taaatacccg     5340
          cgagaaatag agttgatcgt caaaaccaac attgcgaccg acggtggcga taggcatccg     5400
          ggtggtgctc aaaagcagct tcgcctggct gatacgttgg tcctcgcgcc agcttaagac     5460
          gctaatccct aactgctggc ggaaaagatg tgacagacgc gacggcgaca agcaaacatg     5520
          ctgtgcgacg ctggcgatat caaaattgct gtctgccagg tgatcgctga tgtactgaca     5580
          agcctcgcgt acccgattat ccatcggtgg atggagcgac tcgttaatcg cttccatgcg     5640
          ccgcagtaac aattgctcaa gcagatttat cgccagcagc tccgaatagc gcccttcccc     5700
          ttgcccggcg ttaatgattt gcccaaacag gtcgctgaaa tgcggctggt gcgcttcatc     5760
          cgggcgaaag aaccccgtat tggcaaatat tgacggccag ttaagccatt catgccagta     5820
          ggcgcgcgga cgaaagtaaa cccactggtg ataccattcg cgagcctccg gatgacgacc     5880
          gtagtgatga atctctcctg gcgggaacag caaaatatca cccggtcggc aaacaaattc     5940
          tcgtccctga tttttcacca ccccctgacc gcgaatggtg agattgagaa tataaccttt     6000
          cattcccagc ggtcggtcga taaaaaaatc gagataaccg ttggcctcaa tcggcgttaa     6060
          acccgccacc agatgggcat taaacgagta tcccggcagc aggggatcat tttgcgcttc     6120
          agccatactt ttcatactcc cgccattcag agaagaaacc aattgtccat attgcatcag     6180
          acattgccgt cactgcgtct tttactggct cttctcgcta accaaaccgg taaccccgct     6240
          tattaaaagc attctgtaac aaagcgggac caaagccatg acaaaaacgc gtaacaaaag     6300
          tgtctataat cacggcagaa aagtccacat tgattatttg cacggcgtca cactttgcta     6360
          tgccatagca tttttatcca taagattagc ggatcctacc tgacgctttt tatcgcaact     6420
          ctctactgtt tctccatgta ggtcgttcgc tccaagcgtt ttagagctag aaatagcaag     6480
          ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accagacccc gttgatgata     6540
          ccgctgcctt actgggtgca ttagccagtc tgaatgacct cgagttttag agctatgctg     6600
          ttttgaatgg tcccaaaact tcagcacact gagacttgtt gagttccatg ttttagagct     6660
          atgctgtttt gaatggactc cattcaacat tgccgatgat aacttgagaa agagggttaa     6720
          taccagcagt cggatacctt cctattcttt ctgttaaagc gttttcatgt tataataggc     6780
          aaaagaagag tagtgtgatc gtccattccg acgtcgagcc gttccataca gaagctgggc     6840
          gaacaaacga tgctcgcctt ccagaaaacc gaggatgcga accacttcat ccggggtcag     6900
          caccaccggc aagcgccgcg acggccgagg tcttccgatc tcctgaagcc agggcagatc     6960
          cgtgcacagc accttgccgt agaagaacag caaggccgcc aatgcctgac gatgcgtgga     7020
          gaccgaaacc ttgcgctcgt tcgccagcca ggacagaaat gcctcgactt cgctgctgcc     7080
          caaggttgcc gggtgacgca caccgtggaa acggatgaag gcacgaaccc agtggacata     7140
          agcctgttcg gttcgtaagc tgtaatgcaa gtagcgtatg cgctcacgca actggtccag     7200
          aaccttgacc gaacgcagcg gtggtaacgg cgcagtggcg gttttcatgg cttgttatga     7260
          ctgttttttt ggggtacagt ctatgcctcg ggcatccaag cagcaagcgc gttacgccgt     7320
          gggtcgatgt ttgatgttat ggagcagcaa cgatgttacg cagcagggca gtcgccctaa     7380
          aacaaagtta aacatcatga gggaagcggt gatcgccgaa gtatcgactc aactatcaga     7440
          ggtagttggc gtcatcgagc gccatctcga accgacgttg ctggccgtac atttgtacgg     7500
          ctccgcagtg gatggcggcc tgaagccaca cagtgatatt gatttgctgg ttacggtgac     7560
          cgtaaggctt gatgaaacaa cgcggcgagc tttgatcaac gaccttttgg aaacttcggc     7620
          ttcccctgga gagagcgaga ttctccgcgc tgtagaagtc accattgttg tgcacgacga     7680
          catcattccg tggcgttatc cagctaagcg cgaactgcaa tttggagaat ggcagcgcaa     7740
          tgacattctt gcaggtatct tcgagccagc cacgatcgac attgatctgg ctatcttgct     7800
          gacaaaagca agagaacata gcgttgcctt ggtaggtcca gcggcggagg aactctttga     7860
          tccggttcct gaacaggatc tatttgaggc gctaaatgaa accttaacgc tatggaactc     7920
          gccgcccgac tgggctggcg atgagcgaaa tgtagtgctt acgttgtccc gcatttggta     7980
          cagcgcagta accggcaaaa tcgcgccgaa ggatgtcgct gcctactggg caatggagcg     8040
          cctgccggcc cagtatcagc ccgtcatact tgaagctaga caggcttatc ttggacaaga     8100
          agaagatcgc ttggcctcgc gcgcagatca gttggaagaa tttgtccact acgtgaaagg     8160
          cgagatcacc aaggtagtcg gcaaataatg tctaacaatt cgttcaagcc gacgccgctt     8220
          cgcggcgcgg cttaactcaa gcgttagatg cactaagcac ataattgctc acagccaaac     8280
          tatcaggtca agtctgcttt tattattttt aagcgtgcat aataagccct acacaaattg     8340
          ggagatatat catgaaaggc tggctttttc ttgttatcgc aatagttggc gaagtaatcg     8400
          caacatccgc attaaaatct agcgagggct ttactaagct cctgcagaga tctgaattcc     8460
          ctagagagac gaaagtgatt gcgcctaccc ggatattatc gtgaggatgc gtcatcgcca     8520
          ttgctcccca aatacaaaac caatttcagc cagtgcctcg tccatttttt cgatgaactc     8580
          cggcacgatc tcgtcaaaac tcgccatgta cttttcatcc cgctcaatca cgacataatg     8640
          caggccttca cgcttcatac gcgggtcata gttggcaaag taccaggcat tttttcgcgt     8700
          cacccacatg ctgtactgca cctgggccat gtaagctgac tttatggcct cgaaaccacc     8760
          gagccggaac ttcatgaaat cccgggaggt aaacgggcat ttcagttcaa ggccgttgcc     8820
          gtcactgcat aaaccatcgg gagagcaggc ggtacgcata ctttcgtcgc gatagatgat     8880
          cggggattca gtaacattca cgccggaagt gaattcaaac agggttctgg cgtcgttctc     8940
          gtactgtttt ccccaggcca gtgctttagc gttaacttcc ggagccacac cggtgcaaac     9000
          ctcagcaagc agggtgtgga agtaggacat tttcatgtca ggccacttct ttccggagcg     9060
          gggttttgct atcacgttgt gaacttctga agcggtgatg acgccgagcc gtaatttgtg     9120
          ccacgcatct tccccctgtt cgacagctct cacatcgatc ccggtacgct gcaggataat     9180
          gtccggtgtc atgctgccac cttctgctct gcggctttct gtttcaggaa tccaagagct     9240
          tttactgctt cggcctgtgt cagttctgac gatgcacgaa tgtcgcggcg aaatatctgg     9300
          gaacagagcg gcaataagtc gtcatcccat gttttatcca gggcgatcag cagagtgtta     9360
          atctcctgca tggtttcatc gttaaccgga gtgatgtcgc gttccggctg acgttctgca     9420
          gtgtatgcag tattttcgac aatgcgctcg gcttcatcct tgtcatagat accagcaaat     9480
          ccgaaggcca gacgggcaca ctgaatcatg gctttatgac gtaacatccg tttgggatgc     9540
          gactgccacg gccccgtgat ttctctgcct tcgcgagttt tgaatggttc gcggcggcat     9600
          tcatccatcc attcggtaac gcagatcgga tgattacggt ccttgcggta aatccggcat     9660
          gtacaggatt cattgtcctg ctcaaagtcc atgccatcaa actgctggtt ttcattgatg     9720
          atgcgggacc agccatcaac gcccaccacc ggaacgatgc cattctgctt atcaggaaag     9780
          gcgtaaattt ctttcgtcca cggattaagg ccgtactggt tggcaacgat cagtaatgcg     9840
          atgaactgcg catcgctggc atcaccttta aatgccgtct ggcgaagagt ggtgatcagt     9900
          tcctgtgggt cgacagaatc catgccgaca cgttcagcca gcttcccagc cagcgttgcg     9960
          agtgcagtac tcattcgttt tatacctctg aatcaatatc aacctggtgg tgagcaatgg    10020
          tttcaaccat gtaccggatg tgttctgcca tgcgctcctg aaactcaaca tcgtcatcaa    10080
          acgcacgggt aatggatttt ttgctggccc cgtggcgttg caaatgatcg atgcatagcg    10140
          attcaaacag gtgctggggc aggccttttt ccatgtcgtc tgccagttct gcctctttct    10200
          cttcacgggc gagctgctgg tagtgacgcg cccagctctg agcctcaaga cgatcctgaa    10260
          tgtaataagc gttcatggct gaactcctga aatagctgtg aaaatatcgc ccgcgaaatg    10320
          ccgggctgat taggaaaaca ggaaaggggg ttagtgaatg cttttgcttg atctcagttt    10380
          cagtattaat atccattttt tataagcgtc gactgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc    10440
          tcacaattcc acacattata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat    10500
          gagtgagaat tcggatctcg acgggatgtt gattctgtca tggcatatcc ttacaactta    10560
          aaaaagcaaa agggccgcag atgcgaccct tgtgtatcaa acaagacgat taaaaatctt    10620
          cgttagtttc tgctacgcct tcgctatcat ctacagagaa atccggcgtt gagttcgggt    10680
          tgctcagcag caactcacgt actttcttct cgatctcttt cgcggtttcc gggttatctt    10740
          tcagccaggc agtcgcattc gctttaccct gaccgatctt ctcacctttg tagctgtacc    10800
          acgcgcctgc tttctcgatc agcttctctt ttacgcccag gtcaaccagt tcgccgtaga    10860
          agttgatacc ttcgccgtag aggatctgga attcagcctg tttaaacggc gcagcgattt    10920
          tgttcttcac cactttcacg cgggtttcgc tacccaccac gttttcgccc tctttcaccg    10980
          cgccgatacg acggatgtcg agacgaacag aggcgtagaa tttcagcgcg ttaccaccgg    11040
          tagtggtttc cgggttaccg aacatcacac caattttcat acggatctgg ttgatgaaga    11100
          tcagcagcgt gttggactgc ttcaggttac ccgccagctt acgcatcgcc tggctcatca    11160
          tacgtgccgc aaggcccatg tgagagtcgc cgatttcgcc ttcgatttcc gctttcggcg    11220
          tcagtgccgc cacggagtca acgacgataa cgtctactgc gccagaacgc gccagggcgt    11280
          cacagatttc cagtgcctgc tcgccggtgt ccggctggga gcacagcagg ttgtcgatat    11340
          cgacgcccag tttacgtgcg tagattgggt ccagcgcgtg ttcagcatcg ataaacgcac    11400
          aggttttacc ttcacgctgc gctgcggcga tcacctgcag cgtcagcgtg gttttaccgg    11460
          aagattccgg tccgtagatt tcgacgatac ggcccatcgg cagaccacct gccccaagcg    11520
          cgatatccag tgaaagcgaa ccggtagaga tggtttccac atccatggaa cggtcttcac    11580
          ccaggcgcat gatggagcct ttaccaaatt gtttctcaat ctggcccagt gctgccgcca    11640
          acgctttctg tttgttttcg tcgatagcca tttttactcc tgtcatgccg ggtaataccg    11700
          gatagtcaat atgttctgtt gaagcaatta tactgtatgc tcatacagta tcaagtgttt    11760
          tgtagaaatt gttgccacaa ggtctgcaat gcatacgcag tagcctgacg acgcaccgca    11820
          tcacggtcgc cgctgaagca tcccgccggg taatgccttc accgcgggca gtggcaaaag    11880
          caaaccagac ggtgccgaca ggcttctcta gatccgccta cctttcacga gttgcgcagt    11940
          ttgtctgcaa gactctatga gaagcagata agcgataagt ttgctcaaca tcttctcggg    12000
          cataagtcgg acaccatggc atcacagtat cgtgatgaca gaggcaggga gtgggacaaa    12060
          attgaaatca aataatgatt ttattttgac tgatagtgac ctgttcgttg caacaaattg    12120
          ataagcaatg ccaagcttgg cactggctga tcagctagct cactgcccgc tttccagtcg    12180
          ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg    12240
          cgtattgggc gccagggtgg tttttctttt caccagtgag acgggcaaca gctgattgcc    12300
          cttcaccgcc tggccctgag agagttgcag caagcggtcc acgctggttt gccccagcag    12360
          gcgaaaatcc tgtttgatgg tggttaacgg cgggatataa catgagctgt cttcggtatc    12420
          gtcgtatccc actaccgaga tatccgcacc aacgcgcagc ccggactcgg taatggcgcg    12480
          cattgcgccc agcgccatct gatcgttggc aaccagcatc gcagtgggaa cgatgccctc    12540
          attcagcatt tgcatggttt gttgaaaacc ggacatggca ctccagtcgc cttcccgttc    12600
          cgctatcggc tgaatttgat tgcgagtgag atatttatgc cagccagcca gacgcagacg    12660
          cgccgagaca gaacttaatg ggcccgctaa cagcgcgatt tgctggtgac ccaatgcgac    12720
          cagatgctcc acgcccagtc gcgtaccgtc ttcatgggag aaaataatac tgttgatggg    12780
          tgtctggtca gagacatcaa gaaataacgc cggaacatta gtgcaggcag cttccacagc    12840
          aatggcatcc tggtcatcca gcggatagtt aatgatcagc ccactgacgc gttgcgcgag    12900
          aagattgtgc accgccgctt tacaggcttc gacgccgctt cgttctacca tcgacaccac    12960
          cacgctggca cccagttgat cggcgcgaga tttaatcgcc gcgacaattt gcgacggcgc    13020
          gtgcagggcc agactggagg tggcaacgcc aatcagcaac gactgtttgc ccgccagttg    13080
          ttgtgccacg cggttgggaa tgtaattcag ctccgccatc gccgcttcca ctttttcccg    13140
          cgttttcgca gaaacgtggc tggcctggtt caccacgcgg gaaacggtct gataagagac    13200
          accggcatac tctgcgacat cgtataacgt tactggtttc acattcacca ccctgaattg    13260
          actctcttcc gggcgctatc atgccatacc gcgaaaggtt ttgcaccatt cgatgctagc    13320
          ccatgggtat ggacagtttt ccctttgata tgtaacggtg aacagttgtt ctacttttgt    13380
          ttgttagtct tgatgcttca ctgatagata caagagccat aagaacctca gatccttccg    13440
          tatttagcca gtatgttctc tagtgtggtt cgttgttttt gcgtgagcca tgagaacgaa    13500
          ccattgagat catacttact ttgcatgtca ctcaaaaatt ttgcctcaaa actggtgagc    13560
          tgaatttttg cagttaaagc atcgtgtagt gtttttctta gtccgttacg taggtaggaa    13620
          tctgatgtaa tggttgttgg tattttgtca ccattcattt ttatctggtt gttctcaagt    13680
          tcggttacga gatccatttg tctatctagt tcaacttgga aaatcaacgt atcagtcggg    13740
          cggcctcgct tatcaaccac caatttcata ttgctgtaag tgtttaaatc tttacttatt    13800
          ggtttcaaaa cccattggtt aagcctttta aactcatggt agttattttc aagcattaac    13860
          atgaacttaa attcatcaag gctaatctct atatttgcct tgtgagtttt cttttgtgtt    13920
          agttctttta ataaccactc ataaatcctc atagagtatt tgttttcaaa agacttaaca    13980
          tgttccagat tatattttat gaattttttt aactggaaaa gataaggcaa tatctcttca    14040
          ctaaaaacta attctaattt ttcgcttgag aacttggcat agtttgtcca ctggaaaatc    14100
          tcaaagcctt taaccaaagg attcctgatt tccacagttc tcgtcatcag ctctctggtt    14160
          gctttagcta atacaccata agcattttcc ctactgatgt tcatcatctg agcgtattgg    14220
          ttataagtga acgataccgt ccgttctttc cttgtagggt tttcaatcgt ggggttgagt    14280
          agtgccacac agcataaaat tagcttggtt tcatgctccg ttaagtcata gcgactaatc    14340
          gctagttcat ttgctttgaa aacaactaat tcagacatac atctcaattg gtctaggtga    14400
          ttttaatcac tataccaatt gagatgggct agtcaatgat aattactagt ccttttcctt    14460
          tgagttgtgg gtatctgtaa attctgctag acctttgctg gaaaacttgt aaattctgct    14520
          agaccctctg taaattccgc tagacctttg tgtgtttttt ttgtttatat tcaagtggtt    14580
          ataatttata gaataaagaa agaataaaaa aagataaaaa gaatagatcc cagccctgtg    14640
          tataactcac tactttagtc agttccgcag tattacaaaa ggatgtcgca aacgctgttt    14700
          gctcctctac aaaacagacc ttaaaaccct aaaggcttaa gtagcaccct cgcaagctcg    14760
          gttgcggccg caatcgggca aatcgctgaa tattcctttt gtctccgacc atcaggcacc    14820
          tgagtcgctg tctttttcgt gacattcagt tcgctgcgct cacggctctg gcagtgaatg    14880
          ggggtaaatg gcactacagg cgccttttat ggattcatgc aaggaaacta cccataatac    14940
          aagaaaagcc cgtcacgggc ttctcagggc gttttatggc gggtctgcta tgtggtgcta    15000
          tctgactttt tgctgttcag cagttcctgc cctctgattt tccagtctga ccacttcgga    15060
          ttatcccgtg acaggtcatt cagactggct aatgcaccca gtaaggcagc ggtatcatca    15120
          acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta    15180
          tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa    15240
          agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc    15300
          tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact    15360
          acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc    15420
          tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg                          15460
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          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  150]]>
          ccacctgacg tctaagaaac cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc       60
          acgaggcaga atttcagata aaaaaaatcc ttagctttcg ctaaggatga tttctggaat      120
          tcgcggccgc atctagagtc tcgagttgac agctagctca gtcctaggta taatgctagc      180
          ctcgaggaaa gaggagaaag gtctcaatgc gtaaaggcga agagctgttc actggtgtcg      240
          tccctattct ggtggaactg gatggtgatg tcaacggtca taagttttcc gtgcgtggcg      300
          agggtgaagg tgacgcaact aatggtaaac tgacgctgaa gttcatctgt actactggta      360
          aactgccggt accttggccg actctggtaa cgacgctgac ttatggtgtt cagtgctttg      420
          ctcgttatcc ggaccatatg aagcagcatg acttcttcaa gtccgccatg ccggaaggct      480
          atgtgcagga acgcacgatt tcctttaagg atgacggcac gtacaaaacg cgtgcggaag      540
          tgaaatttga aggcgatacc ctggtaaacc gcattgagct gaaaggcatt gactttaaag      600
          aagacggcaa tatcctgggc cataagctgg aatacaattt taacagccac aatgtttaca      660
          tcaccgccga taaacaaaaa aatggcatta aagcgaattt taaaattcgc cacaacgtgg      720
          aggatggcag cgtgcagctg gctgatcact accagcaaaa cactccaatc ggtgatggtc      780
          ctgttctgct gccagacaat cactatctga gcacgcaaag cgttctgtct aaagatccga      840
          acgagaaacg cgatcatatg gttctgctgg agttcgtaac cgcagcgggc atcgcgcatg      900
          gtatggatga actgtacaga tgataacgct gatagtgcta gtgtagatcg ctactagagc      960
          caggcatcaa ataaaacgaa aggctcagtc gaaagactgg gcctttcgtt ttatctgttg     1020
          tttgtcggtg aacgctctct actagagtca cactggctca ccttcgggtg ggcctttctg     1080
          cgtttatata ctagaagcgg ccgctgcagg aattcaaaaa aagcaccgac tcggtgccac     1140
          tttttcaagt tgataacgga ctagccttat tttaacttgc tatttctagc tctaaaacgg     1200
          agacgagcgt ctccactagt attataccta ggactgagct agctgtcaag gatccagcat     1260
          atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgctcttcc     1320
          gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct     1380
          cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg     1440
          tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc     1500
          cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga     1560
          aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct     1620
          cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg     1680
          gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag     1740
          ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat     1800
          cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac     1860
          aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac     1920
          tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc     1980
          ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt     2040
          tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc     2100
          ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg     2160
          agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca     2220
          atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca     2280
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          agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct     2520
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          aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg     2940
          cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca     3000
          cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga     3060
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          <![CDATA[<223>  合成]]>
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          gaattccgga tgagcattca tcaggcgggc aagaatgtga ataaaggccg gataaaactt       60
          gtgcttattt ttctttacgg tctttaaaaa ggccgtaata tccagctgaa cggtctggtt      120
          ataggtacat tgagcaactg actgaaatgc ctcaaaatgt tctttacgat gccattggga      180
          tatatcaacg gtggtatatc cagtgatttt tttctccatt ttagcttcct tagctcctga      240
          aaatctcgat aactcaaaaa atacgcccgg tagtgatctt atttcattat ggtgaaagtt      300
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          ttattcggga tcctcgctca ctgactcgct acgctcggtc gttcgactgc ggcgagcgga      480
          aatggcttac gaacggggcg gagatttcct ggaagatgcc aggaagatac ttaacaggga      540
          agtgagaggg ccgcggcaaa gccgtttttc cataggctcc gcccccctga caagcatcac      600
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          tttccccctg gcggctccct cgtgcgctct cctgttcctg cctttcggtt taccggtgtc      720
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          agccatcaca aacggcatga tgaacctgaa tcgccagcgg catcagcacc ttgtcgcctt     1440
          gcgtataata tttgcccatg gtgaaaacgg gggcgaagaa gttgtccata ttggccacgt     1500
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          gggaaacggg ataatctgag                                                   20
          <![CDATA[<210>  167]]>
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          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  167]]>
          gtgaatacaa cgctgtttcg atggccggtt cgtgtctact atgaagatac cgatgccggt       60
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          aaaatgacgg tggaatatta cgcacctgcg cggctcgacg atatgctcga aatacagact      240
          gaaataacat caatgcgtgg cacctctttg gttttcacgc aacgtattgt caacgccgag      300
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          cctcgtgcgc ttcccaagtc tattgtcgcg gagtttaagc agtga                      405
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          gccatggcca gagcgcgtgg acgaggtcgt cgcgatctca agtccgaaat caacattgta       60
          ccgttgctgg acgtactgct ggtgctgttg ctgatcttta tggcgacagc gcccatcatc      120
          acccagagcg tggaggtcga tctgccagac gctactgaat cacaggcggt gagcagtaac      180
          gataatccgc cagtgattgt tgaagtgtct ggtattggtc agtacaccgt ggtggttgag      240
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          ataattaaag cactgaactt gttacatagt gcgggtgtga aatcggttgg tttaatgacg      420
          cagcctatct aaacatctgc gtttcccttg cttgaaagag agcgggtaac aggcgaacag      480
          tttttggaaa ccgaga                                                      496
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          gcatcgtgcc aatagccatg cgccggaagc cgtagtggaa ggggcgtcgc gtgcgatgcg       60
          tatttccatg aatcgtgaac ttgaaaatct ggaaacgcac attcctttcc tcggtacggt      120
          tggctccatc agcccgtata ttggtctgtt tggtacggtc tgggggatca tgcacgcctt      180
          tatcgccctc ggggcggtaa aacaagcaac actgcaaatg gttgcgcccg gtatcgcaga      240
          agcgttgatt gcgacggcaa ttggtttgtt cgccgcaatt ccggcggtaa tggcttataa      300
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          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  171]]>
          acatctgcgt ttcccttgct tgaaagagag cgggtaacag gcgaacagtt tttggaaacc       60
          gagagtgtca aaggcaaccg aacaaaacga caagctcaag cgggcgataa ttatttcagc      120
          agtgctgcat gtcatcttat ttgcggcgct gatctggagt tcgttcgatg agaatataga      180
          agcttcagcc ggaggcggcg gtggttcgtc catcgacgct gtcatggttg attcaggtgc      240
          ggtagttgaa cagtacaaac gtatgcaaag ccaggaatca agcgcgaagc gttctgatga      300
          gcagcgcaag atgaaggagc agcaggctgc tgaagaactg cgtgagaaac aagcggctga      360
          acaggaacgc ctgaagcaac ttgagaaaga gcggttagcg gctcaggagc agaaaaagca      420
          ggctgaagaa gccgcaaaac aggccgagtt aaagcagaag caagcggaag aggc            474
          <![CDATA[<210>  172]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  172]]>
          agaactgcgt gagaaacaag                                                   20
          <![CDATA[<210>  173]]>
          <![CDATA[<211>  496]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  173]]>
          gccatggcca gagcgcgtgg acgaggtcgt cgcgatctca agtccgaaat caacattgta       60
          ccgttgctgg acgtactgct ggtgctgttg ctgatcttta tggcgacagc gcccatcatc      120
          acccagagcg tggaggtcga tctgccagac gctactgaat cacaggcggt gagcagtaac      180
          gataatccgc cagtgattgt tgaagtgtct ggtattggtc agtacaccgt ggtggttgag      240
          aaagatcgtc tggagcgttt accaccagag caggtggtgg cggaagtgtc cagccgtttc      300
          aaggccaacc cgaaaacggt ctttctgatc ggtggcgcaa aagatgtgcc ttacgatgaa      360
          ataattaaag cactgaactt gttacatagt gcgggtgtga aatcggttgg tttaatgacg      420
          cagcctatct aaacatctgc gtttcccttg cttgaaagag agcgggtaac aggcgaacag      480
          tttttggaaa ccgaga                                                      496
          <![CDATA[<210>  174]]>
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          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  174]]>
          tcgcgatgtt gactgttccg acggtcaaca tcaggcaccg gttgccacgg ggttctggta       60
          gttttgtgta ttttagtttg ttaacattct gctaaattat cgtgggccat cggtccagat      120
          aagggagata tgatgaagca ggcattacga gtagcatttg gttttctcat actgtgggca      180
          tcagttctgc atgctgaagt ccgcattgtg atcgacagcg gtgtagattc cggtcgtcct      240
          attggtgttg ttcctttcca gtgggcgggg cctggtgcgg cacctgaaga tattggcggc      300
          atcgttgctg ctgacttgcg taacagcggt aaatttaatc cgttagatcg tgctcgtttg      360
          ccacagcagc cgggtagtgc gcaggaagta caaccagctg catggtccgc gctgggcatt      420
          gacgctgtgg ttgtcggtca ggtcactccg aatccggatg gttcttacaa tgttgcttat      480
          caacttgttg acactggcgg                                                  500
          <![CDATA[<210>  175]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  175]]>
          agtcaccgta gaaggtcacg                                                   20
          <![CDATA[<210>  176]]>
          <![CDATA[<211>  473]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  176]]>
          tggtcgcagt aacaataccg aaccgacctg gttcccggac agccagaacc tggcatttac       60
          ttctgaccag gccggtcgtc cgcaggttta taaagtgaat atcaacggcg gtgcgccaca      120
          acgtattacc tgggaaggtt cgcagaacca ggatgcggat gtcagcagcg acggtaaatt      180
          tatggtaatg gtcagctcca acggtgggca gcagcacatt gccaaacaag atctggcaac      240
          gggaggcgta caagttctgt cgtccacgtt cctggatgaa acgccaagtc tggcacctaa      300
          cggcactatg gtaatctaca gctcttctca ggggatggga tccgtgctga atttggtttc      360
          tacagatggg cgtttcaaag cgcgtcttcc ggcaactgat ggacaggtca aattccctgc      420
          ctggtcgccg tatctgtgat aataattaat tgaatagtaa aggaatcatt gaa             473
          <![CDATA[<210>  177]]>
          <![CDATA[<211>  471]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  177]]>
          gagaattgca tgagcagtaa cttcagacat caactattga gtctgtcgtt actggttggt       60
          atagcggccc cctgggccgc ttttgctcag gcaccaatca gtagtgtcgg ctcaggctcg      120
          gtcgaagacc gcgtcactca acttgagcgt atttctaatg ctcacagcca gcttttaacc      180
          caactccagc aacaactctc tgataatcaa tccgatattg attccctgcg tggtcagatt      240
          caggaaaatc agtatcaact gaatcaggtc gtggagcggc aaaagcagat cctgttgcag      300
          atcgacagcc tcagcagcgg tggtgcagcg gcgcaatcaa ccagcggcga tcaaagcggt      360
          gtggcggcat caacgacgcc gacagctgat gctggtactg cgaatgctgg cgcgccggtg      420
          aaaagcggtg atgcaaacac ggattacaat gcagctattg cgctggtgca g               471
          <![CDATA[<210>  178]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  178]]>
          acgttcaggc tgctaaagat                                                   20
          <![CDATA[<210>  179]]>
          <![CDATA[<211>  482]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  179]]>
          aatacttccc ggatgccacc atcctggcac tgaccaccaa cgaaaaaacg gctcaccagt       60
          tagtactgag caaaggtgtt gtgccgcagc tggttaaaga gatcacatct actgatgact      120
          tctaccgtct gggtaaagaa ctggctctgc agagcggtct ggcacacaaa ggtgatgtcg      180
          tagttatggt ttctggtgca ctggtaccga gcggcactac taacaccgca tctgttcacg      240
          tcctgtaata ttgcttttgt gaattaattt gtatatcgaa gcgccctgat gggcgctttt      300
          tttatttaat cgataaccag aagcaataaa aaatcaaatc ggatttcact atataatctc      360
          actttatcta agatgaatcc gatggaagca tcctgttttc tctcaatttt tttatctaaa      420
          acccagcgtt cgatgcttct ttgagcgaac gatcaaaaat aagtgccttc ccatcaaaaa      480
          aa                                                                     482
          <![CDATA[<210>  180]]>
          <![CDATA[<211>  438]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  180]]>
          cctgtgaagt gaaaaatggc gcacattgtg cgccattttt ttgcctgcta tttaccgcta       60
          ctgcgtcgcg cgtaacatat tcccttgctc tggttcccca ttctgcgctg actctactga      120
          aggcgcattg ctggctgcgg gagttgctcc actgctcacc gcaaccggat accctgcccg      180
          acgatacaac gctttatcga ctaacttctg atctacagcc ttattgtctt taaattgcgt      240
          aaagcctgct ggcagcgtgt acggcattgt ctgaacgttc tgctgttctt ctgccgatag      300
          tggtcgatgt acttcaacat aacgcatccc gttaggttcc acggaatatt tcaccggttc      360
          gttgatcact ttcaccggtg ttcccgtccg cacgctggag aataaagctt taatatccgg      420
          tgcattcatg cgaataca                                                    438
          <![CDATA[<210>  181]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  181]]>
          caaaccgttc ctctacaccg                                                   20
          <![CDATA[<210>  182]]>
          <![CDATA[<211>  417]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  182]]>
          gacagccagg ccatttgctc ccgctcaccg agggacatcg acgggcgtgg aaatgaccgc       60
          tgtaatgtgc gactggcggg aaacgccaac ataatgtgat gacgctgcgg cagttcacga      120
          ctccacggta acaacgtgtt agccagccgc tgcacatcaa caatccgccc atctttgata      180
          atgtcgttct ccagtggcaa ccgccaccag cggtgcaata agcattcttt tgcgctccgc      240
          acgatagcaa ccgctaccgc ttcttgctgt tgtaaatgca aaccaatttg ccagttctta      300
          aatgccattg tgatgatctc cttatcaccc gtcactctga cgggtatatc aatgcgtctg      360
          gcttgccttt atactaccgc gcgtttgttt ataaactgcc caaatgaaac taaatgg         417
          <![CDATA[<210>  183]]>
          <![CDATA[<211>  460]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  183]]>
          ttaaaaaggc gcttcggcgc ctttttcagt ttgctgacaa agtgcacttg tttatgccag       60
          atgcgggtga acgcgttatc cggccaacaa aaaattgaaa attcaataaa ttgcaggaac      120
          ttcgtaagcc tgataagcgt tgtgcatcag gcaaacttca cgcatttaca ctcgcccctg      180
          ccctttcaac cattcgcgca cgaggaacag cgcgctgaca ttacgcgctt cgttgaagtc      240
          aggggcttcc agcaaatcca tcatatgcgc cagcggccag cgcacctgtg gtagcggctc      300
          tggctcatcg ccttccagtg attccgggta gagatcttgc gctaccacga tattcatttt      360
          gctggaaaag taagacggtg ccatgctgag cttcttcaaa aaagtcagat cgttcgcacc      420
          aaatccaacc tcttctttta gctcgcggtt agcggcttca                            460
          <![CDATA[<210>  184]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  184]]>
          cctgggactc atggccggat                                                   20
          <![CDATA[<210>  185]]>
          <![CDATA[<211>  516]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  185]]>
          cccagccctt gtcgatgccg cgttcaggct agcttcgttc aaatccatta aagatatcag       60
          actactctca ggtacgtgag taaggtaaaa cccagttcca acgccaatat ccagatggtt      120
          gttacctaaa tgttccagaa agtgtggaag aaggtgttcc tttgtaggac atccccatgc      180
          aagccgattt gatactccca aaacccacca gtcataaagc tttagggtaa gtggtgtgta      240
          aattttagcc ccatcatctg tgtttttttt cattagtttc accgtgttat agttttattt      300
          gtgaattaaa tcaattatag agatgaatta caaggggtta aatgatgcca cggcataacg      360
          aatttgaata tattgggtct tgtgttgcgg taagaggtta cacgccagga cgcaggttaa      420
          atgcttacaa tattagggga tattgtttgc ttttaacggt aaacaaattc cccggggcta      480
          tacaatacca ccggggagaa aatctattta acgttg                                516
          <![CDATA[<210>  186]]>
          <![CDATA[<211>  623]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  186]]>
          aaaaggtctc cattcaatcg ttttaatgat tgagtatgta ttttttatat ctaacttaat       60
          gagtcaattg tatattgccc cactgtttat attttgttta acattgaatt tttgtcacaa      120
          tgcgctgtca gttttttagt ttaattgtct gtttgtgttt tgtattgtgg ttttatgggc      180
          taattatttt tttctttgtg gagtttttat ctattcaagt gccatgcctt tagatgcata      240
          ttagcgataa tagcatgagg tttatcctca attgctgtgt tttttagtat aaaaaagagg      300
          aacaaaactg agacacataa ggcctcgcaa tggcttgcaa ggttttacat attttgaggt      360
          ggtggaacgt gtgaacgcag agatggcgcg gtaatttgtt gatttaaaat gtcgttcttg      420
          gagtttctaa gtcgtgggct acaggttcga atcctgcagg gcgagccatt tcctcgccat      480
          ttatttgttc ccttttacaa attacaccat cactttgttg tcgcggtttt gctaaataat      540
          tggaacacgt cagacgaata aaatgaaaac agaaattctg ctaaacaatt catcttgcca      600
          ggattttgat taggaaagtg aaa                                              623
          <![CDATA[<210>  187]]>
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          <![CDATA[<400>  196]]>
          000
          <![CDATA[<210>  197]]>
          <![CDATA[<400>  197]]>
          000
          <![CDATA[<210>  198]]>
          <![CDATA[<400>  198]]>
          000
          <![CDATA[<210>  199]]>
          <![CDATA[<400>  199]]>
          000
          <![CDATA[<210>  200]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  200]]>
          tgtgtcgtcg ttaactcgcc                                                   20
          <![CDATA[<210>  201]]>
          <![CDATA[<211>  409]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  201]]>
          gccgcgcacg ctgatttttt atgaatctac ccaccgtctg ttagatagcc tggaagatat       60
          cgttgcggta ttaggcgaat cccgttacgt ggttctggcg cgtgagctaa ccaaaacctg      120
          ggaaaccatt cacggcgcgc ccgttggcga gctgctggcg tgggtaaaag aagatgaaaa      180
          ccgtcgcaaa ggcgaaatgg tgctgattgt cgaaggccat aaagcgcagg aaaatgactt      240
          gcctgctgat gccctgcgca cgctggcgct gctacaggca gaactgccgc tgaaaaaagc      300
          ggcggcgctg gccgcagaaa ttcacggcgt gaagaaaaat gcgctgtata agtatgcgct      360
          ggagcagcag ggagagtgat tacaggcgtc gcagcaggaa tagcgctac                  409
          <![CDATA[<210>  202]]>
          <![CDATA[<211>  405]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  202]]>
          tcacgcatgt gaaatggtta tgcagccata aaaatgaagc cgggatagcg gtggagactt       60
          tagccgtgag aaaacgttct gtcgcatcct gttttccttc gccagtcacc agtaacaaaa      120
          cttcgcgggc attgagaata tccttcaggc ctaaggtgat cccacgagtc acgggacggt      180
          ccgcggtttt taacatctca tgttgctgtg ttctggcatc aagttgactg atatggcagg      240
          ctggttgcag gctttctccc ggttcgttca gcccaagatg accgtttttc cccaatccga      300
          gaacgcataa atccagaccg cctttgcgcg caatcaggtt cgttacccgt tcgcactctg      360
          tctcatttat ctcttcggag cgaaagctga tgagctggtc ttcac                      405
          <![CDATA[<210>  203]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  203]]>
          cgctttttga aaatacgcaa                                                   20
          <![CDATA[<210>  204]]>
          <![CDATA[<211>  477]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  204]]>
          accagccgag attcaacagg ttgttgcccg tcaggcgacc aatcaaaaac tccattgaga       60
          tgtagttaac atgtcgctga ttcgccactg gcttggcgaa tggctgagca cgcagcattt      120
          cggccagtgc ttcgctcact gccagccacc actggcgagg agtcatttca gccgcagaat      180
          ttaagccata acgctgccac tgacgtgaaa gcgcttcctg aaattgctta tcgttaaaaa      240
          taggttgtga cataggagtt ccacttttct tagattttca acacaacgtt atcgctagtt      300
          tgccaggctc gatgttgacc ttcctcatcc tgcgggggat taggcaggga ggagttgcgg      360
          ggatgagcaa ggaaatgtga tctcgaccac ttaaagctag tgcaatccac aggattagca      420
          gcaaatcaat gccataccgc gcagaaaatc tgtatctaag tgcaaaaaat ggccgtt         477
          <![CDATA[<210>  205]]>
          <![CDATA[<211>  456]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  205]]>
          cgtattttca aaaagcggaa ggtaactcta taaattaagt aaaggagtga aacagtttca       60
          caagtaaaat atcaagtgtg ctccatctca ttcttaatag atttattaag atcatctttt      120
          tagatggcac tttcatcaga aatgaagaag aaacccttgc ttaaatgaaa ctgatgaaca      180
          taaggaaaat accgtacaac ccagtattca cgctggatca gcgtcgtttt aggtgagttg      240
          ttaataaaca tttggaattg tgacacagtg caaattcaga cacataaaaa aacgtcatcg      300
          cttgcattag aaaggtttct ggccgacctt ataaccatta attacgaagc gcaaaaaaaa      360
          taatatttcc tcattttcca cagtgaagtg attaactatg ctgattccgt caaaattaag      420
          tcgtccggtt cgactcgacc ataccgtggt tcgtga                                456
          <![CDATA[<210>  206]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  206]]>
          ccgtgacgtt atccgcacca                                                   20
          <![CDATA[<210>  207]]>
          <![CDATA[<211>  357]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  207]]>
          acgatgacct gatgcgtccg gacttcaaca acgatgacta cgctattgct tgctgcgtaa       60
          gcccgatgat cgttggtaaa caaatgcagt tcttcggtgc gcgtgcaaac ctggcgaaaa      120
          ccatgctgta cgcaatcaac ggcggcgttg acgaaaaact gaaaatgcag gttggtccga      180
          agtctgaacc gatcaaaggc gatgtcctga actatgatga agtgatggag cgcatggatc      240
          acttcatgga ctggctggct aaacagtaca tcactgcact gaacatcatc cactacatgc      300
          acgacaagta cagctacgaa gcctctctga tggcgctgca cgaccgtgac gttatcc         357
          <![CDATA[<210>  208]]>
          <![CDATA[<211>  442]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  208]]>
          gtgacgctat cccgactcag tctgttctga ccatcacttc taacgttgtg tatggtaaga       60
          aaactggtaa caccccagac ggtcgtcgtg ctggcgcgcc gttcggaccg ggtgctaacc      120
          cgatgcacgg tcgtgaccag aaaggtgctg tagcgtctct gacttccgtt gctaaactgc      180
          cgtttgctta cgctaaagat ggtatctcct acaccttctc tatcgttccg aacgcactgg      240
          gtaaagacga cgaagttcgt aagaccaacc tggctggtct gatggatggt tacttccacc      300
          acgaagcatc catcgaaggt ggtcagcacc tgaacgttaa cgtgatgaac cgtgaaatgc      360
          tgctcgacgc gatggaaaac ccggaaaaat atccgcagct gaccatccgt gtatctggct      420
          acgcagtacg tttcaactcg ct                                               442
          <![CDATA[<210>  209]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  209]]>
          gttatcgtga tgcgcattct                                                   20
          <![CDATA[<210>  210]]>
          <![CDATA[<211>  457]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  210]]>
          ttccgcagcc agcgattatc gcgccgcagc gcaacgcatt ctgccgccgt tcctgttcca       60
          ctatatggat gggggggcat attctgaata cacgctgcgc cgcaacgtgg aagatttgtc      120
          agaagtggcg ctgcgccagc gtattctgaa aaacatgtct gacttaagcc tggaaacgac      180
          gctgtttaat gagaaattgt cgatgccggt ggcgctaggt ccggtaggtt tgtgtggcat      240
          gtatgcgcga cgcggcgaag ttcaggctgc caaagcagca gatgcgcatg gcattccgtt      300
          tactctctcg acggtttccg tttgcccgat tgaagaagtg gctccggcta tcaaacgtcc      360
          gatgtggttc cagctttatg tgctgcgcga tcgcggcttt atgcgtaacg ccctggagcg      420
          agcaaaagcc gcgggttgtt cgacgctggt tttcacc                               457
          <![CDATA[<210>  211]]>
          <![CDATA[<211>  441]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  211]]>
          atccgcgatt tctgggatgg cccgatggtg atcaaaggga tcctcgatcc ggaagatgcg       60
          cgcgatgcag tacgttttgg tgctgatgga attgtggttt ctaaccacgg tggccgccag      120
          ttagatggcg tactctcttc tgctcgtgca ctgcctgcta ttgcggatgc ggtgaaaggt      180
          gatatcgcca ttctggcgga tagcggaata cgtaacgggc ttgatgtcgt gcgtatgatt      240
          gcgctcggtg ccgacaccgt actgctgggt cgtgctttcc tgtatgcact ggcaacagcg      300
          ggccaggcgg gtgtagctaa tctgctaaat ctgatcgaaa aagagatgaa agtggcgatg      360
          acgctgactg gcgcgaaatc gattagcgaa attacgcaag attcgctggt gcaggggctg      420
          ggtaaagagt tgcctgcggc a                                                441
          <![CDATA[<210>  212]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  212]]>
          taacacccag cccgatgccc                                                   20
          <![CDATA[<210>  213]]>
          <![CDATA[<211>  357]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  213]]>
          ttctgcatag caggtgaggc aaatgagatt tattcgccac tacccagtat ggatgagatc       60
          tgaaaaaggg agaggaaaat tgcccggtag ccttcactac cgggcgcagg cttagatgga      120
          ggtacggcgg tagtcgcggt attcggcgtg ccagaaatta tcatcaatgg cctgttgcag      180
          agcttcggca gacgttttca ccgccacgcc ttgctgctgc gccattttgc caaccgcaaa      240
          ggcaattgcg cgggagactt tctgaatatc tttcagttcc ggcagtacca gaccttcgcc      300
          gttcaggacc agcggcgaat actgagcaag catttcactt gccgacatca gcatctc         357
          <![CDATA[<210>  214]]>
          <![CDATA[<211>  544]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  214]]>
          gagattttcg cgcttctgca ccagtttggt ctggaaaggc agcaggttcg gcatcttgtc       60
          ggtcagcagg ccaaagcgat cgaccataaa gactttctgc cgcgccgctt cctcgcttaa      120
          tccttcgcgc tgggtctggg cgatgatcat ttcggcaatg ccgcatcccg ctgaacctgc      180
          gccaaggaag acgatttttt tctcgcttaa ctgaccacct gccgcgcggc tggctgcgat      240
          cagtgtgccg actgttaccg ccgcggtgcc ctgaatgtca tcgttaaaag aacaaatttc      300
          attgcgatag cggttaagta acggcatcgc atttttttgt gcgaagtctt caaactgcaa      360
          cagtacgtcc ggccagcgtt gtttcacagc ctggataaat tcatcaacaa attcatagta      420
          ttcgtcgtca gtgatacgcg gattacgcca gcccatatac agcggatcgt taagcagctg      480
          ttggttgttg gtgccgacat ccagcaccac cggaagggta taggccggac tgatgccgcc      540
          acag                                                                   544
          

Claims (111)

1. 一種治療或預防有需要的個體的癌症的方法，其包括： 向所述個體施用有效量的Amuc_1100或表現所述Amuc_1100的經基因工程改造的宿主細胞以及有效量的免疫檢查點調節劑。
2. 一種改善接受免疫檢查點調節劑的治療的個體中癌症的治療反應的方法，其包括： 向所述個體施用有效量的Amuc_1100或表現所述Amuc_1100的經基因工程改造的宿主細胞，任選地與有效量的免疫檢查點調節劑一起施用。
3. 一種在個體中誘導或改善腸道免疫性的方法，其包括： 向所述個體施用有效量的Amuc_1100或表現所述Amuc_1100的經基因工程改造的宿主細胞以及有效量的免疫檢查點調節劑。
4. 一種在接受抗癌治療並且表現出腸道免疫性降低的個體中改善癌症治療反應的方法，其包括： 向所述個體施用有效量的Amuc_1100或表現所述Amuc_1100的經基因工程改造的宿主細胞。
5. 根據請求項1到4中任一項所述的方法，其中所述Amuc_1100為天然存在的Amuc_1100或其功能等效物。
6. 根據請求項5所述的方法，其中所述功能等效物保持至少部分調節腸道免疫性和/或活化toll樣受體2（TLR2）的活性。
7. 根據請求項5或6所述的方法，其中所述功能等效物包含所述天然存在的Amuc_1100的突變體、片段、融合物、衍生物、提高其穩定性的等效物或其任何組合。
8. 根據前述請求項中任一項所述的方法，其中所述Amuc_1100包含選自由SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3組成的群組的胺基酸序列，或具有與前述胺基酸序列的至少80%序列一致性且仍保持調節腸道免疫性和/或活化toll樣受體2（TLR2）的實質活性的胺基酸序列。
9. 根據請求項8所述的方法，其中所述Amuc_1100在選自由以下組成的群組的位置處包含一個或多個突變：R36、S37、L39、D40、K41、K42、I43、K48、E49、K51、S52、R62、S63、K70、E71、L72、N73、R74、Y75、A76、K77、A78、Y86、K87、P88、F89、L90、A91、F103、Q104、K108、T109、F110、R111、D112、K119、K120、K121、N122、L124、I125、W131、L132、G133、F134、Q135、Y137、S138、L150、G151、F152、E153、L154、K155、A156、L160、V161、K163、L164、A165、L169、S170、K171、F172、I173、K174、V175、Y176、R177、W200、T201、L205、E206、F209、Q210、R213、E214、L217、K218、A219、M220、N221、Y229、L230、R237、I238、R242、M243、M244、P245、K255、P256、L268、T269、K287、P288、Y289、M290、K292、E293、F296、V297、F306、N307、K310和A311，其中編號相對於SEQ ID NO: 1。
10. 根據請求項9所述的方法，其中所述Amuc_1100在選自由以下組成的群組的位置處包含一個或多個突變：S37、V175、Y289和F296，其中編號相對於SEQ ID NO: 1。
11. 根據請求項10所述的方法，其中所述Amuc_1100包含Y289A突變。
12. 根據前述請求項中任一項所述的方法，其中所述免疫檢查點調節劑為針對免疫檢查點分子的抗體或其抗原結合片段或化合物。
13. 根據請求項12所述的方法，其中所述免疫檢查點調節劑包含一個或多個選自由以下組成的群組的免疫刺激檢查點的活化劑：CD2、CD3、CD7、CD16、CD27、CD30、CD70、CD83、CD28、CD80（B7-1）、CD86（B7-2）、CD40、CD40L（CD154）、CD47、CD122、CD137、CD137L、OX40（CD134）、OX40L（CD252）、NKG2C、4-1BB、LIGHT、PVRIG、SLAMF7、HVEM、BAFFR、ICAM-1、2B4、LFA-1、GITR、ICOS（CD278）、ICOSLG（CD275）和其任何組合。
14. 根據請求項12所述的方法，其中所述免疫檢查點調節劑包含一個或多個選自由以下組成的群組的免疫抑制檢查點的抑制劑：LAG3（CD223）、A2AR、B7-H3（CD276）、B7-H4（VTCN1）、BTLA（CD272）、BTLA、CD160、CTLA-4（CD152）、IDO1、IDO2、TDO、KIR、LAIR-1、NOX2、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、VISTA、SIGLEC-7（CD328）、TIGIT、PVR（CD155）、TGFβ、SIGLEC9（CD329）和其任何組合。
15. 根據請求項12或14所述的方法，其中所述免疫檢查點調節劑為一個或多個免疫抑制檢查點的抑制劑，較佳地抑制或減少PD-1與其配體中的任一種之間的相互作用的抗體或其抗原結合片段或化合物。
16. 根據前述請求項中任一項所述的方法，其中所述個體已表現出對所述免疫檢查點調節劑的低反應或抗藥性。
17. 根據請求項16所述的方法，其中所述個體經測定對所述免疫檢查點調節劑具有原發性（ de novo）耐藥或獲得性耐藥。
18. 根據前述請求項中任一項所述的方法，其中所述個體是癌症患者，其中所述癌症選自由以下組成的群組：結腸直腸癌、乳癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、前列腺癌、腎癌、子宮頸癌、骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、甲狀腺癌、子宮內膜癌、子宮癌、膀胱癌、神經內分泌癌、頭頸癌、肝癌、鼻咽癌、睾丸癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、黑色素瘤、基底細胞癌、皮膚癌、鱗狀細胞皮膚癌、隆凸性皮膚纖維肉瘤、梅克爾細胞癌（Merkel cell carcinoma）、成膠質細胞瘤、神經膠質瘤、肉瘤和間皮瘤。
19. 根據前述請求項中任一項所述的方法，其中所述Amuc_1100或表現所述Amuc_1100的經基因工程改造的宿主細胞的施用是透過口服施用。
20. 根據前述請求項中任一項所述的方法，其中所述Amuc_1100或表現所述Amuc_1100的經基因工程改造的宿主細胞的施用在所述免疫檢查點調節劑之前、之後或與其同時進行。
21. 根據前述請求項中任一項所述的方法，其中所述宿主細胞包含益生微生物體或非病原性微生物體。
22. 根據前述請求項中任一項所述的方法，其中所述宿主細胞包含外源性表現卡匣，所述外源性表現卡匣包含編碼可操作地連接於訊號肽的Amuc_1100的核苷酸序列，任選地，所述經基因工程改造的宿主細胞從1×10 ⁹CFU（菌落形成單位）的所述經基因工程改造的宿主細胞分泌至少10 ng Amuc_1100。
23. 一種包含外源性表現卡匣的經基因工程改造的宿主細胞，所述外源性表現卡匣包含編碼可操作地連接於訊號肽的Amuc_1100的核苷酸序列，任選地，所述經基因工程改造的宿主細胞從1×10 ⁹CFU的所述經基因工程改造的宿主細胞分泌至少10 ng Amuc_1100。
24. 根據請求項23所述的經基因工程改造的宿主細胞，其中所述宿主細胞包含益生微生物體或非病原性微生物體。
25. 根據請求項23或24所述的經基因工程改造的宿主細胞，其中所述外源性表現卡匣整合於所述經基因工程改造的宿主細胞的質體中。
26. 根據請求項23或24所述的經基因工程改造的宿主細胞，其中所述外源性表現卡匣整合於所述經基因工程改造的宿主細胞的基因組中。
27. 根據請求項23到26中任一項所述的經基因工程改造的宿主細胞，其中所述外源性表現卡匣包含編碼可操作地連接於訊號肽的Amuc_1100的核苷酸序列，其中所述訊號肽可操作地連接於所述Amuc_1100的N端。
28. 根據請求項27所述的經基因工程改造的宿主細胞，其中所述訊號肽包含選自由SEQ ID NO: 76到82和其具有至少80%序列一致性的同源序列組成的群組的胺基酸序列。
29. 根據請求項23到28中任一項所述的經基因工程改造的宿主細胞，其中所述訊號肽可以透過存在於所述宿主細胞中的分泌系統加工。
30. 根據請求項29所述的經基因工程改造的宿主細胞，其中所述分泌系統對於所述宿主細胞是原生或非原生的系統。
31. 根據請求項30所述的經基因工程改造的宿主細胞，其中所述宿主細胞為益生細菌。
32. 根據請求項31所述的經基因工程改造的宿主細胞，其中所述分泌系統經工程改造和/或優化以使得至少一種外膜蛋白編碼基因被刪除、失活或抑制。
33. 根據請求項32所述的經基因工程改造的宿主細胞，其中所述外膜蛋白選自由以下組成的群組：OmpC、OmpA、OmpF、OmpT、pldA、pagP、tolA、Pal、To1B、degS、mrcA和lpp。
34. 根據請求項31到33中任一項所述的經基因工程改造的宿主細胞，其中所述分泌系統經工程改造以使得至少一種伴侶蛋白編碼基因被擴增、過表現或活化。
35. 根據請求項34所述的經基因工程改造的宿主細胞，其中所述伴侶蛋白選自由以下組成的群組：dsbA、dsbC、dnaK、dnaJ、grpE、groES、groEL、tig、fkpA、surA、skp、PpiD和DegP。
36. 根據請求項23到35中任一項所述的經基因工程改造的宿主細胞，其中所述表現卡匣進一步包含一個或多個調節元件，所述調節元件包含一個或多個選自由以下組成的群組的元件：啟動子、核糖體結合位點（RBS）、順反子、終止子和其任何組合。
37. 根據請求項36所述的經基因工程改造的宿主細胞，其中所述啟動子為組成型啟動子或誘導型啟動子。
38. 根據請求項36所述的經基因工程改造的宿主細胞，其中所述啟動子為內源啟動子或外源啟動子。
39. 根據請求項37所述的經基因工程改造的宿主細胞，其中所述組成型啟動子包含選自由SEQ ID NO: 14到54和其具有至少80%序列一致性的同源序列組成的群組的核苷酸序列。
40. 根據請求項39所述的經基因工程改造的宿主細胞，其中所述組成型啟動子包含SEQ ID NO: 15。
41. 根據請求項37所述的經基因工程改造的宿主細胞，其中所述誘導型啟動子包含選自由SEQ ID NO: 55到58和其具有至少80%序列一致性的同源序列組成的群組的核苷酸序列。
42. 根據請求項41所述的經基因工程改造的宿主細胞，其中所述誘導型啟動子包含SEQ ID NO: 58。
43. 根據請求項36所述的經基因工程改造的宿主細胞，其中所述RBS包含選自由SEQ ID NO: 70到73和其具有至少80%序列一致性的同源序列組成的群組的核苷酸序列。
44. 根據請求項36所述的經基因工程改造的宿主細胞，其中所述順反子包含選自由SEQ ID NO: 66到69和其具有至少80%序列一致性的同源序列組成的群組的核苷酸序列。
45. 根據請求項36所述的經基因工程改造的宿主細胞，其中所述終止子為T7終止子，較佳地，所述終止子為rrnB_T1_T7Te終止子，更較佳地，所述終止子包含如SEQ ID NO: 74所示的核苷酸序列。
46. 根據請求項23到45中任一項所述的經基因工程改造的宿主細胞，其進一步包含營養缺陷相關基因中的至少一個失活或缺失。
47. 根據請求項46所述的經基因工程改造的宿主細胞，其中所述營養缺陷相關基因選自由以下組成的群組：thyA、cysE、glnA、ilvD、leuB、lysA、serA、metA、glyA、hisB、ilvA、pheA、proA、thrC、trpC、tyrA、uraA、dapF、flhD、metB、metC、proAB、yhbV、yagG、hemB、secD、secF、ribD、ribE、thiL、dxs、ispA、dnaX、adk、hemH、IpxH、cysS、fold、rplT、infC、thrS、nadE、gapA、yeaZ、aspS、argS、pgsA、yeflA、metG、folE、yejM、gyrA、nrdA、nrdB、folC、accD、fabB、gltX、ligA、zipA、dapE、dapA、der、hisS、ispG、suhB、tadA、acpS、era、rnc、fisB、eno、pyrG、chpR、Igt、ft＞aA、pgk、yqgD、metK、yqgF、plsC、ygiT、pare、ribB、cca、ygjD、tdcF、yraL、yihA、ftsN、murl、murB、birA、secE、nusG、rplJ、rplL、rpoB、rpoC、ubiA、plsB、lexA、dnaB、ssb、alsK、groS、psd、orn、yjeE、rpsR、chpS、ppa、valS、yjgP、yjgQ、dnaC、ribF、IspA、ispH、dapB、folA、imp、yabQ、flsL、flsl、murE、murF、mraY、murD、ftsW、murG、murC、ftsQ、ftsA、ftsZ、IpxC、secM、secA、can、folK、hemL、yadR、dapD、map、rpsB、in/B、nusA、ftsH、obgE、rpmA、rplU、ispB、murA、yrbB、yrbK、yhbN、rpsl、rplM、degS、mreD、mreC、mreB、accB、accC、yrdC、def、fint、rplQ、rpoA、rpsD、rpsK、rpsM、entD、mrdB、mrdA、nadD、hlepB、rpoE、pssA、yfiO、rplS、trmD、rpsP、ffh、grpE、yfjB、csrA、ispF、ispD、rplW、rplD、rplC、rpsJ、fusA、rpsG、rpsL、trpS、yr/F、asd、rpoH、ftsX、ftsE、ftsY、frr、dxr、ispU、rfaK、kdtA、coaD、rpmB、djp、dut、gmk、spot、gyrB、dnaN、dnaA、rpmH、rnpA、yidC、tnaB、glmS、glmU、wzyE、hemD、hemC、yigP、ubiB、ubiD、hemG、secY、rplO、rpmD、rpsE、rplR、rplF、rpsH、rpsN、rplE、rplX、rplN、rpsQ、rpmC、rplP、rpsC、rplV、rpsS、rplB、cdsA、yaeL、yaeT、lpxD、fabZ、IpxA、IpxB、dnaE、accA、tilS、proS、yafF、tsf、pyrH、olA、rlpB、leuS、Int、glnS、fldA、cydA、in/A、cydC、ftsK、lolA、serS、rpsA、msbA、IpxK、kdsB、mukF、mukE、mukB、asnS、fabA、mviN、rne、yceQ、fabD、fabG、acpP、tmk、holB、lolC、lolD、lolE、purB、ymflC、minE、mind、pth、rsA、ispE、lolB、hemA、prfA、prmC、kdsA、topA、ribA、fabi、racR、dicA、yd B、tyrS、ribC、ydiL、pheT、pheS、yhhQ、bcsB、glyQ、yibJ和gpsA。
48. 根據請求項23到47中任一項所述的經基因工程改造的宿主細胞，其中所述宿主細胞是一種或多種選自由以下組成的群組的物質的營養缺陷體：尿嘧啶、白胺酸、組織胺酸、色胺酸、賴胺酸、甲硫胺酸、腺嘌呤和非天然存在的胺基酸。
49. 根據請求項48所述的經基因工程改造的宿主細胞，其中所述非天然存在的胺基酸選自由以下組成的群組：l-4,4ʹ-聯苯丙胺酸、對乙醯基-l-苯丙胺酸、對碘-l-苯丙胺酸和對疊氮基-l-苯丙胺酸。
50. 根據請求項23到49中任一項所述的經基因工程改造的宿主細胞，其中所述宿主細胞包含別構調控的轉錄因子，所述轉錄因子能夠檢測調節所述轉錄因子的活性的環境中的訊號，其中不存在所述訊號將引起細胞死亡。
51. 根據請求項24到50中任一項所述的經基因工程改造的宿主細胞，其中所述益生微生物體為益生細菌或益生酵母。
52. 根據請求項51所述的經基因工程改造的宿主細胞，其中所述益生細菌選自由以下組成的群組：擬桿菌（ Bacteroides）、雙歧桿菌（ Bifidobacterium）、梭菌（ Clostridium）、埃希氏菌（ Escherichia）、乳桿菌（ Lactobacillus）和乳球菌（ Lactococcus），任選地，所述益生細菌屬於埃希氏菌屬，並且任選地，所述益生細菌屬於物種大腸桿菌（ Escherichia coli）的菌株 Nissle 1917（ EcN）。
53. 根據請求項51所述的經基因工程改造的宿主細胞，其中所述益生酵母選自由以下組成的群組：釀酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae）、產朊假絲酵母（ Candida utilis）、乳酸克魯維酵母（ Kluyveromyces lactis）和卡氏酵母（ Saccharomyces carlsbergensis）。
54. 根據請求項23到53中任一項所述的經基因工程改造的宿主細胞，其中所述Amuc_1100為天然存在的Amuc_1100或其功能等效物。
55. 根據請求項54所述的經基因工程改造的宿主細胞，其中所述功能等效物保持至少部分調節腸道免疫性和/或活化toll樣受體2（TLR2）的活性。
56. 根據請求項54或55所述的經基因工程改造的宿主細胞，其中所述功能等效物包含所述天然存在的Amuc_1100的突變體、片段、融合物、衍生物、提高其穩定性的等效物或其任何組合。
57. 根據請求項23到56中任一項所述的經基因工程改造的宿主細胞，其中所述Amuc_1100包含選自由SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3組成的群組的胺基酸序列，或具有與前述胺基酸序列的至少80%序列一致性且仍保持調節腸道免疫性和/或活化toll樣受體2（TLR2）的實質活性的胺基酸序列。
58. 根據請求項57所述的經基因工程改造的宿主細胞，其中所述Amuc_1100在選自由以下組成的群組的位置處包含一個或多個突變：R36、S37、L39、D40、K41、K42、I43、K48、E49、K51、S52、R62、S63、K70、E71、L72、N73、R74、Y75、A76、K77、A78、Y86、K87、P88、F89、L90、A91、F103、Q104、K108、T109、F110、R111、D112、K119、K120、K121、N122、L124、I125、W131、L132、G133、F134、Q135、Y137、S138、L150、G151、F152、E153、L154、K155、A156、L160、V161、K163、L164、A165、L169、S170、K171、F172、I173、K174、V175、Y176、R177、W200、T201、L205、E206、F209、Q210、R213、E214、L217、K218、A219、M220、N221、Y229、L230、R237、I238、R242、M243、M244、P245、K255、P256、L268、T269、K287、P288、Y289、M290、K292、E293、F296、V297、F306、N307、K310和A311，其中編號相對於SEQ ID NO: 1。
59. 根據請求項58所述的經基因工程改造的宿主細胞，其中所述Amuc_1100在選自由以下組成的群組的位置處包含一個或多個突變：S37、V175、Y289和F296，其中編號相對於SEQ ID NO: 1。
60. 根據請求項59所述的經基因工程改造的宿主細胞，其中所述Amuc_1100包含Y289A突變。
61. 根據請求項23到60中任一項所述的經基因工程改造的宿主細胞，其中所述Amuc_1100包含選自由SEQ ID NO: 1到3組成的群組的胺基酸序列或其具有至少80%序列一致性的同源序列。
62. 一種重組表現卡匣，其包含編碼可操作地連接於訊號肽的Amuc_1100的核苷酸序列和一個或多個調節元件。
63. 根據請求項62所述的重組表現卡匣，其中所述Amuc_1100為天然存在的Amuc_1100或其功能等效物。
64. 根據請求項63所述的重組表現卡匣，其中所述功能等效物保持至少部分調節腸道免疫性和/或活化toll樣受體2（TLR2）的活性。
65. 根據請求項63或64所述的重組表現卡匣，其中所述功能等效物包含所述天然存在的Amuc_1100的突變體、片段、融合物、衍生物、提高其穩定性的等效物或其任何組合。
66. 根據請求項62到65中任一項所述的重組表現卡匣，其中所述Amuc_1100包含選自由SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3組成的群組的胺基酸序列，或具有與前述胺基酸序列的至少80%序列一致性且仍保持調節腸道免疫性和/或活化toll樣受體2（TLR2）的實質活性的胺基酸序列。
67. 根據請求項66所述的重組表現卡匣，其中所述Amuc_1100在選自由以下組成的群組的位置處包含一個或多個突變：R36、S37、L39、D40、K41、K42、I43、K48、E49、K51、S52、R62、S63、K70、E71、L72、N73、R74、Y75、A76、K77、A78、Y86、K87、P88、F89、L90、A91、F103、Q104、K108、T109、F110、R111、D112、K119、K120、K121、N122、L124、I125、W131、L132、G133、F134、Q135、Y137、S138、L150、G151、F152、E153、L154、K155、A156、L160、V161、K163、L164、A165、L169、S170、K171、F172、I173、K174、V175、Y176、R177、W200、T201、L205、E206、F209、Q210、R213、E214、L217、K218、A219、M220、N221、Y229、L230、R237、I238、R242、M243、M244、P245、K255、P256、L268、T269、K287、P288、Y289、M290、K292、E293、F296、V297、F306、N307、K310和A311，其中編號相對於SEQ ID NO: 1。
68. 根據請求項67所述的重組表現卡匣，其中所述Amuc_1100在選自由以下組成的群組的位置處包含一個或多個突變：S37、V175、Y289和F296，其中編號相對於SEQ ID NO: 1。
69. 根據請求項68所述的重組表現卡匣，其中所述Amuc_1100包含Y289A突變。
70. 根據請求項62到69中任一項所述的重組表現卡匣，其中所述表現卡匣包含編碼可操作地連接於訊號肽的Amuc_1100的核苷酸序列，其中所述訊號肽可操作地連接於所述Amuc_1100的N端。
71. 根據請求項70所述的重組表現卡匣，其中所述訊號肽包含選自由SEQ ID NO: 76到82和其具有至少80%序列一致性的同源序列組成的群組的胺基酸序列；較佳地，所述訊號肽為Usp45訊號肽。
72. 根據請求項62到71中任一項所述的重組表現卡匣，其中所述一個或多個調節元件包含一個或多個選自由以下組成的群組的元件：啟動子、核糖體結合位點（RBS）、順反子、終止子和其任何組合。
73. 根據請求項72所述的重組表現卡匣，其中所述啟動子為組成型啟動子或誘導型啟動子。
74. 根據請求項72所述的重組表現卡匣，其中所述啟動子為內源啟動子或外源啟動子。
75. 根據請求項73所述的重組表現卡匣，其中所述組成型啟動子包含選自由SEQ ID NO: 14到54和其具有至少80%序列一致性的同源序列組成的群組的核苷酸序列。
76. 根據請求項75所述的重組表現卡匣，其中所述組成型啟動子包含SEQ ID NO: 15。
77. 根據請求項73所述的重組表現卡匣，其中所述誘導型啟動子包含選自由SEQ ID NO: 55到58和其具有至少80%序列一致性的同源序列組成的群組的核苷酸序列。
78. 根據請求項77所述的重組表現卡匣，其中所述誘導型啟動子包含SEQ ID NO: 58。
79. 根據請求項72所述的重組表現卡匣，其中所述RBS包含選自由SEQ ID NO: 70到73和其具有至少80%序列一致性的同源序列組成的群組的核苷酸序列。
80. 根據請求項72所述的重組表現卡匣，其中所述順反子包含選自由SEQ ID NO: 66到69和其具有至少80%序列一致性的同源序列組成的群組的核苷酸序列。
81. 根據請求項72所述的重組表現卡匣，其中所述終止子為T7終止子；較佳地，所述終止子為rrnB_T1_T7Te終止子，更佳地，所述終止子包含如SEQ ID NO: 74所示的核苷酸序列。
82. 一種組合物，其包含根據請求項23到61中任一項所述的經基因工程改造的宿主細胞和生理學上可接受的載劑。
83. 一種組合物，其包含：a）根據請求項23到61中任一項所述的經基因工程改造的宿主細胞或分離的Amuc_1100；和b）免疫檢查點抑制劑。
84. 根據請求項82或83所述的組合物，其中所述組合物是可食用的。
85. 根據請求項82到84中任一項所述的組合物，其中所述組合物是益生組合物。
86. 一種試劑盒，其包含：a）包含根據請求項23到61中任一項所述的經基因工程改造的宿主細胞或包含分離的Amuc_1100的第一組合物；和b）包含免疫檢查點抑制劑的第二組合物。
87. 根據請求項86所述的試劑盒，其中所述第一組合物是可食用組合物，和/或所述第二組合物進一步包含藥學上可接受的載劑。
88. 根據請求項87所述的試劑盒，其中所述第一組合物是食品增補劑。
89. 根據請求項86所述的試劑盒，其中所述第二組合物適於口服施用或腸胃外施用。
90. 根據請求項83到85中任一項所述的組合物或根據請求項86到89中任一項所述的試劑盒，其中所述免疫檢查點調節劑為針對免疫檢查點分子的抗體或其抗原結合片段或化合物。
91. 根據請求項90所述的組合物或試劑盒，其中所述免疫檢查點調節劑包含一個或多個選自由以下組成的群組的免疫抑制檢查點的活化劑：CD2、CD3、CD7、CD16、CD27、CD30、CD70、CD83、CD28、CD80（B7-1）、CD86（B7-2）、CD40、CD40L（CD154）、CD47、CD122、CD137、CD137L、OX40（CD134）、OX40L（CD252）、NKG2C、4-1BB、LIGHT、PVRIG、SLAMF7、HVEM、BAFFR、ICAM-1、2B4、LFA-1、GITR、ICOS（CD278）、ICOSLG（CD275）和其任何組合。
92. 根據請求項90所述的組合物或試劑盒，其中所述免疫檢查點調節劑包含一個或多個選自由以下組成的群組的免疫抑制檢查點的抑制劑：LAG3（CD223）、A2AR、B7-H3（CD276）、B7-H4（VTCN1）、BTLA（CD272）、BTLA、CD160、CTLA-4（CD152）、IDO1、IDO2、TDO、KIR、LAIR-1、NOX2、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、VISTA、SIGLEC-7（CD328）、TIGIT、PVR（CD155）、TGFβ、SIGLEC9（CD329）和其任何組合。
93. 根據請求項83到85中任一項所述的組合物或根據請求項86到89中任一項所述的試劑盒，其中所述免疫檢查點調節劑為針對PD-L1、PD-L2或PD-1的抗體或其抗原結合片段或化合物。
94. 根據請求項23到61中任一項所述的經基因工程改造的宿主細胞，其用於與免疫檢查點調節劑組合使用。
95. 一種包含根據請求項62到81中任一項所述的重組表現卡匣的核酸運載體，其用於與免疫檢查點調節劑組合使用。
96. 一種包含根據請求項23到61中任一項所述的經基因工程改造的宿主細胞或分離的Amuc_1100的口服組合物，其用於與包含免疫檢查點調節劑的製劑組合使用。
97. 根據請求項96所述的口服組合物，其中所述包含免疫檢查點調節劑的製劑是腸胃外製劑。
98. 根據請求項97所述的口服組合物，其中所述包含免疫檢查點調節劑的製劑是口服製劑。
99. 一種非天然存在的Amuc_1100蛋白，其中所述Amuc_1100蛋白包含Y289A突變，其中編號相對於SEQ ID NO: 1。
100. 一種核酸，其編碼根據請求項99所述的Amuc_1100蛋白。
101. 一種Usp45訊號肽在建構表現載體中的用途，所述表現載體包含編碼目標多肽的多核苷酸，其中所述表現載體適合在大腸桿菌中表現以允許所述目標多肽從所述大腸桿菌中表現和分泌。
102. 一種Usp45訊號肽，用於建構表現載體，所述表現載體包含編碼目標多肽的多核苷酸，其中所述表現載體適合在大腸桿菌中表現以允許所述目標多肽從所述大腸桿菌中表現和分泌。
103. 一種表現載體，其包含編碼可操作地連接至Usp45訊號肽的目標多肽的多核苷酸，其中所述表現載體適合在大腸桿菌中表現以允許所述目標多肽從所述大腸桿菌中表現和分泌。
104. 根據請求項103所述的表現載體，其中所述Usp45訊號肽包含如SEQ ID NO: 59所示的序列。
105. 根據請求項103所述的表現載體，其中所述大腸桿菌是大腸桿菌的共生菌株。
106. 根據請求項105所述的表現載體，其中所述共生菌株是大腸桿菌Nissle 1917菌株。
107. 根據請求項103所述的表現載體，其中所述目標多肽包含Amuc_1100。
108. 根據請求項107所述的表現載體，其中所述Amuc_1100是天然存在的Amuc_1100或其功能等效物。
109. 根據請求項103所述的表現載體，其中所述目標多肽是除Amuc_1100之外的多肽。
110. 一種經基因工程改造的大腸桿菌，其包含外源性表現卡匣，所述外源性表現卡匣包含編碼可操作地連接至Usp45訊號肽的目標多肽的多核苷酸。
111. 根據請求項110所述的經基因工程改造的大腸桿菌，其能夠表現和分泌所述目標多肽。

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