CN102216768A

CN102216768A - Lcms技术及其应用

Info

Publication number: CN102216768A
Application number: CN2009801446271A
Authority: CN
Inventors: C·A·C·M·范埃尔斯; E·C·瑟图特; A·P·J·M·德容; H·D·迈林
Original assignee: STAAT DER NEDERLANDEN VERT DOO
Current assignee: STAAT DER NEDERLANDEN VERT DOO
Priority date: 2008-09-09
Filing date: 2009-09-09
Publication date: 2011-10-12
Also published as: JP2012502296A; US20110186731A1; MX2011002567A; IL211657A0; NZ591617A; RU2011113852A; AU2009292304A2; ZA201101824B; KR20110084182A; AU2009292304A1; WO2010030178A1; BRPI0918460A2; EP2324347A1; CA2736479A1

Abstract

本发明涉及改良的LCMS技术及其在选择性鉴别和鉴定免疫原性病原体相关表位的方法中的应用以及在疫苗开发中的应用。一种桥连T细胞表位知识缺口的方式是应用新的平台技术“免疫蛋白质组学”，以通过提取的肽样品的纳级质谱分析直接评估在抗原呈递细胞表面的表位展示。这是唯一的方法学，其可提供对于表位特征的无偏倚的见解，如源自病原体衍生的蛋白质的T细胞表位的精确的分子性质、多样性、丰度、动力学及PTM。因此，这个平台技术和免疫蛋白质组学应成为疫苗学的固有一部分。

Description

LCMS技术及其应用

发明领域

本发明涉及改良的LCMS技术及其在选择性鉴别和鉴定免疫原性表位的方法中的应用，以及其在疫苗开发中的应用。

发明背景

免疫系统T细胞对免疫原性病原体相关表位的特异性受体介导的识别是针对感染性疾病的保护性免疫性的基础。在足够刺激条件下的初始识别之后，这种表位驱动特异性T细胞的克隆群的扩增、分化和维持。在感染期间，这些T细胞群解除(disarm)及消除病原体。之后，所述T细胞群经历强力收缩，但是一小部分得以维持以在再次遭遇特定抗原时发起快速记忆应答。这个观点在疫苗开发中采用。针对感染性疾病的疫苗应使免疫系统暴露于源于相关病原体的表位以诱导保护水平的特异性记忆T细胞产生。

病原体相关T细胞表位是来自病原体编码的蛋白质的小蛋白质片段，在细胞内加工为抗原呈递细胞(后文称作APC)细胞表面的主要组织相容性复合体(后文称作MHC)分子的配体之后暴露。对于与MHC分子对肽表位的切除、存活、竞争和最终呈递相关的过程和酶的了解还非常少。两种类型的MHC分子参与使表位呈递至两种功能性类型的T细胞。MHC I型分子使表位呈递至CD8⁺T细胞，而MHC II型分子使表位呈递至CD4⁺T细胞。

为了设计未来的疫苗，我们需要关于T细胞表位的新的想法。尤其对于显示出高可变表面抗原的病原体或者对于(重新)出现的病原体，保护性T表位及其抗原仍然是难以分辨的。

本发明人认识到现有技术中现行疫苗学中的主要惯有观念(major conventions)造成了关于病原体相关表位的两种可区别类型MHC I型ligandome和MHC II型ligandome的知识缺口(knowledge gap)。

首先，基于基因组的抗原揭示(反向疫苗学)已经使其进入疫苗学且有希望向我们揭示全部病原体蛋白质组。借助于免疫信息学，通过in silico预示了表面结构如主要细菌毒力因子和病毒表面抗原，其可以是候选保护性抗原。反向疫苗学方法需要在实验动物中的重组抗原表达技术和免疫原性研究。这种方法的确已经成功选择有希望的疫苗候选物，作为基于PorA的脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)血清群B疫苗(Masignani et al.2002)的备选物。尽管利用反向疫苗学方法，但是对于表位的知识缺口仍存在：(i)当免疫优势T细胞抗原是病原体的内部蛋白质时，反向疫苗学将不能揭示该免疫优势T细胞抗原；以及(ii)动物中的免疫原性也许不能预示人体中的免疫原性和免疫优势。

其次，基于在高通量MHC结合和T细胞测定中使用来自候选蛋白质的合成肽的集合、算法推测的表位或者甚至整个蛋白质组作为重叠合成肽的传统T细胞表位鉴别方法已经产生了对于相当大数目T细胞表位包括病原体相关表位的认识。然而，本发明人认为这种方法也受限制：这些常规方法否认细胞内天然加工的作用、与存活相反的破坏、表位的选择和竞争以及表位特征(如T细胞表位在感染期间及对于不同细胞类型的初级序列、多样性、准确的分子长度和长度多态性、丰度、天然变异以及最后，动力学)对于免疫原性的重要性。T细胞表位也通常被认为是初级基因序列的真实的in silico可预测的翻译。然而，越来越多的迹象表明与仅是基于in silico蛋白质组学的预期相比，初级蛋白质序列的多种类型的翻译后修饰(在后文称作PTM)包括磷酸化、糖基化、脱酰胺化、甲基化和剪接以及基因组的异读框翻译可导致更多样化的免疫学相关表位集合(Temmerman et al.2004，Engelhard etal.2006)。

此外，本发明人认识到如上文“其次”段落中所述鉴别T细胞表位的技术依赖于分离自个体的周围血单个核细胞(PBMC)的体外应答，所述个体对于感兴趣的病原体已经变得免疫，且通常在先前的感染中存活下来。典型地，当病原体是罕见或者新出现的时，这些个体是非常缺乏的。因此，关于出现的感染性疾病的表位鉴别应基于不依赖于使用来自先前感染的个体的PBMC的新技术。

进一步地，本发明人认识到病原体相关MHC I型和MHC II型表位配体(所谓的ligandome)的鉴别存在技术难题，需要最大限度的定量和定性灵敏性。一些实验室的开拓性工作已经示出质谱分析组合液相层析(LCMS)是目前最有效的分析工具，提供对于这些类型ligandome的公正认识(Hunt et al.1992)。然而，目前的方法不能达到足够的免疫学和技术灵敏性和选择性以获得对于表位特征的公正认识，如源自病原体衍生蛋白质的免疫原性表位的准确序列、多样性、丰度、PTM和动力学。在疫苗学中仍需要“免疫蛋白质组学”以桥连对于病原体相关表位的知识缺口。只有在那时我们才能识别真正的免疫原性和保护性表位以及了解病原体可能逃避其特异性识别的策略。然而，不显著改良方法学则不能认识到迄今为止已知的表位冰山表面下隐藏着什么。

MHC表位分析是非常有挑战性的。APC上的MHC分子呈递大浓度范围的大量不同的肽表位。所述系统的灵敏性应足以检测病原体相关表位，甚至当在含有10⁷-10⁸个细胞的APC细胞培养物的提取物中以一个拷贝/细胞表达时，等于在全部回收时在柱上10-100attomole的肽量。所述系统的选择性应足以在几十万其它不相关MHC表位中鉴别这种个体表位。

本申请揭示了在柱技术学中关于综合表位挖掘(comprehensive epitope mining)的灵敏性、覆盖范围和动力学范围的改良。因此，本发明的目的是提供新平台技术，其以灵敏性、选择性和简便方式可在单一分析表位样品中鉴别由保护性T细胞识别为MHC I型和II型配体的免疫原性病原体相关表位。

本发明人认识到这个目的通过组合三个发现结果得以解决：(i)改良的高灵敏性和有力平台LCMS技术，以检测和鉴别高度复杂的肽混合物中微量的未知肽，组合(ii)特制的体外免疫学实验设计，以相关方式从其来源蛋白质中释放每种类型的免疫原性病原体相关表位及释入单一溶液中，以及(iii)(任选存在的)应用抗原的选择性化学或者物理修饰，以便于样品中相关病原体相关表位的快速和明确识别和鉴别。

液相层析-质谱分析(LCMS)装置从US 2002/146349中获知，所述文献以其全部内容援引加入本文，特别是关于所述装置方面的内容。

LCMS装置的目的

样品中待分析物(在本文是指肽)的层析分离通过使用液相层析(LC)柱实现。优选地，该柱的内径和长度如下所述：

(i)获得最高的可能灵敏性，组合

(ii)最大的分离效率。

本发明的一个目的是提供改良的装备了纳级柱(nanoscale column)的LCMS装置。在本申请中，改良了LCMS装置的不同方面。提供了改良的LCMS平台。所述改良的LCMS平台经证实与现有LCMS平台相比能进行更详细的分析。

本发明的另一目的是使得可以明显延长总分析时间。

发明描述

本发明的一方面涉及液相层析质谱分析(LCMS)装置。本发明提供了使用LCMS装置的改良的分析方法。本发明进一步提供了生产其部件的改良的方法。

本发明另一方面涉及层析方法，特别是二维液相层析法。

本发明再一方面涉及无盐二维高效纳级液相层析分离技术。

本发明再一方面涉及纳级液相层析柱以及用于液相层析应用、特别是液相层析质谱分析中的这种层析柱的制备。

本发明另一方面涉及电喷射离子化(ESI)发射器(emitter)，及生产与液相层析柱联合使用的发射器的方法，所述发射器优选与电喷射离子化质谱分析(LC-ESI/MS)偶联。

本发明另一方面涉及连接纳级LC柱的连接和方法。

本发明再一方面涉及纳级液相层析柱中进行(零死体积(zero-dead volume))连接的连接和方法。在一个实施方案中，提供了窄径(narrow bore)(毛细管)纳级液相层析柱。

本发明另一方面涉及本发明LCMS装置在鉴别表位的方法中的应用。

本发明另一方面涉及鉴别表位的方法，其中所述方法包括如下步骤：a)制备包含MHC I型和MHC II型表位(ligandome)至少之一的样品，其中所述表位已经被加工并被抗原呈递细胞呈递；b)在本发明的LCMS装置中分析在步骤a)中获得的样品。

本发明一方面涉及产生包含根据本发明方法鉴别的表位的组合物的方法，其中所述方法包括包含所述表位的分子的化学合成与重组表达至少之一。

在一个其它方面中，本发明涉及通过使用本发明的LCMS装置和/或本发明的表位鉴别方法可获得的表位。

本发明另一方面涉及根据本发明鉴别的表位的应用或者包含所述表位的组合物的应用。所述表位或者包含所述表位的组合物用于生产预防和/或治疗由携带这种表位的病原体所致疾病的疫苗，或者用于评估哺乳动物的免疫状况。

本发明的所有这些方面均在下文论述。

LCMS装置

在一个实施方案中，所述LCMS装置包含柱，优选纳级柱以进行层析。LCMS装置包含液相层析(LC)柱，所述LC柱被排列并构造成以纳升/分钟(nl/min)范围的流速运行。这种纳级柱使得层柱有高分离效率，可以改良在质谱分析仪(MS)的分析。

由于质谱分析是作为鉴别肽的强有力的技术出现的，纳级液相层析结合质谱分析是目前鉴别MHC-呈递肽的首要可选择方法，因为这是能提供在低attomole量的各个肽的序列信息的一种技术。然而，本发明实施方案的应用非仅限于LCMS应用。

通常，LCMS装置的实施方案包含混合泵装置，其具有泵，优选高压液相层析(HPLC)泵，在一个实施方案中以便利方式组合分流装置以非常精确的方式产生混合溶剂系统、分析柱及质谱分析仪所需的低流速。

所述LCMS装置进一步具有电喷射离子化(ESI)单元，其包含发射器、涂层及专用电喷射离子化源。所述LCMS装置包含连接元件以连接各个毛细管管材(tubing)。优选的实施方案在下文详细论述。

液相层析

物理地，液相层析(LC)在柱中进行，例如圆柱样结构的柱，在其内部具有含有材料的空间(腔)。使用的柱材料和洗脱液通常决定层析的类型。在腔中保持的材料被称作为静止相。在优选的实施方案中，将样品溶解于流动相中。样品和流动相流经静止相，在此分离待分析物，然后进行测量或者分析。在随后的步骤中可以进行进一步分离。

在优选的实施方案中及在LCMS装置设置的优选实施方案中，在对样品进行分级分离之后，通过质谱分析鉴别各个肽。基于质谱分析产生的质量(Mw)和结构信息(氨基酸序列)可以鉴别所述肽。

LCMS分析

本发明的目的可以通过对蛋白酶解消化的蛋白质进行多维LCMS/MS分析而实现，其中强阳离子交换(Strong Cation eXchange，SCX)分级分离与反相(Reversed Phase，RP)分离联合使用。组合这些分析技术以提高分离效率和分析的动力学范围。

在一个实施方案中，提供了在线多维LC方法，其使用阴离子-和阳离子交换颗粒的混合床进行第一分离维。

捕获柱

在一个实施方案中，所述LCMS装置包含固相提取(SPE)捕获柱或者位于分析或分离柱上游的捕获柱。在捕获柱中，可以使用强阳离子交换(SCX)或者弱阴离子交换(WAX)树脂或者SCX与WAX树脂的混合床。这组成了LCMS/MS分析的一维。第二维可以在下游分析柱中通过C18反相(RP)层析加入。此外，捕获柱可以相对快速将相对大体积样品上样(转移)进纳级LC柱中。因此，捕获柱的内径应与分析柱的内径相称。

在一个实施方案中，将包含肽(平均至少一种肽)的样品导入捕获柱中。优选地，如随后在本文鉴别，包含表位的肽被鉴别。在一个实施方案中随后将溶剂注入捕获柱中，这将结合的肽从捕获柱中转移进反相C18分析柱。

在一个实施方案中，阴离子-阳离子交换(ACE)固相捕获柱包含强阳离子与弱阴离子树脂的混合物。这种混合床从Motoyama(Motoyama et al.2007)获知，其中乙酸铵用于回收结合的肽。

现有技术的一个问题是用于回收结合的分析物的阳离子盐包括乙酸铵的应用不利地影响第二维中在线反相纳级LC系统的性能。

根据本发明的另一方面，在第一维中结合的分析物的回收可以通过无盐方式实现。无盐溶液的应用防止了下游反相树脂恶化。

优选地，转移或者洗脱溶剂是无盐溶剂。优选地，蚁酸(甲酸)用作转移溶剂。换句话说，甲酸用于洗脱结合的肽。尽管在文献中已知甲酸的洗脱强度对于从离子交换树脂中回收肽而言太低，但是在实验中令人惊奇地发现甲酸可以用作转移溶剂。对于这个令人惊奇的作用的解释可在包含具有晶体结构的交联分子的较多或者较少开放结构的硅石颗粒上WAX树脂的结构中发现，其中甲酸的COO^-基团可以渗入并置换结合的分析物(肽)。

在一个实施方案中，盐酸(HCl)用于这个目的，但这是次优选的。

在LCMS装置或者运行这种装置的方法的实施方案中，通过捕获柱加入一定量(例如10μl)的甲酸和与二甲亚砜的增加强度(浓度)的等摩尔混合物。离开ACE捕获柱的肽被重新捕获在反相柱转换系统的C18反相捕获柱上。

LC分析柱

样品中待分析物(在本文是指肽)的层析分离通过使用LC分析柱实现。在一个实施方案中，所述柱的长度为至少50cm，优选至少75cm，更优选至少85cm，甚至更优选至少90cm。柱的长度对于LC柱的性能是一个重要参数，特别是对于柱的分离效率而言。

在一个实施方案中，安装内径低于70μm、优选低于55μm及在一个实施方案中低于50μm的用5μm C18颗粒填充的至少75cm、例如90cm分析柱对HLA-A2洗脱样品进行深度分析。样品以4-h梯度运行。质谱分析仪被程序化为每个循环进行1次MS和3次连续CAD MS/MS扫描。

在一个实施方案中，使用熔融二氧化硅柱。在优选的实施方案中，使用熔融二氧化硅毛细管柱。所述柱包含进行液相层析的填料。本发明提供了填充柱的合适方法。

在一个实施方案中，所述LCMS装置包含纳级柱。在一个实施方案中，这种柱可包含熔融二氧化硅(毛细管)管材，其具有外半径和内半径，内半径相应于延伸经过熔融二氧化硅的腔。优选所述纳级管材的外径在150-1400μm范围内。所述管材的外径优选在200-800μm范围内。

所述柱的内径低于75μm，优选低于55μm，更优选低于50μm，甚至更优选低于30μm，更优选低于26μm。较小的内径将改良LCMS装置的灵敏性和分离效率。所述内腔优选直径在5-100μm范围内，更优选在16-70μm内，甚至更优选的实施方案中在18-50μm内。这种毛细管管材可用于5-50nl/分钟、更优选10-30nl/分钟范围内的流速。

LC分析柱的生产

根据本发明的一个方面，提供了生产LC柱的方法，所述柱包含具有内径为至多55μm的内腔的长度为至少45cm、优选至少75cm的柱，在所述柱的一端使其熔为玻璃料(preparing a frit)并将合适的液相层析固相材料填充在柱中，其中液相层析固相材料以在低粘度溶剂中的浆液形式提供。在优选的实施方案中，低粘度溶剂是在20℃粘度为0.32cP的丙酮。

LC分析柱的填充

根据本发明的另一方面，提供了生产LC分析柱的方法，所述分析柱包含长度为至少45cm、优选至少75cm的具有内径至多为55μm的内腔的柱，在柱的一端熔成玻璃料并将合适的液相层析固相材料填充在所述柱中，其中在填充期间对所述柱进行振动或者超声处理。在一个实施方案中，对所述柱进行超声处理。

现有技术的一个已知问题是“长”LC分析柱的填充速度。

在一个实施方案中，本发明的改良的填充方法包括在填充期间振动所述柱，优选使用超声振动。

在一个实施方案中，在填充期间进行超声振动。优选地，进入所述柱的浆液被振动。这改良了填充效率并防止填充床中空隙/孔洞的形成。

根据本发明另一方面，非粘性溶剂如丙酮与填充柱的方法组合使用。在优选的实施方案中，所述非粘性溶剂与浆液组合使用。优选地使用粘性至少比异丙醇小2倍的溶剂。

在一个特异的实施方案中，熔融二氧化硅柱的熔为玻璃料的末端(fritted end)被置于超声浴中(例如Branson 200)。在再一个实施方案中，所述超声处理仅在固相颗粒冲入熔融二氧化硅柱中之后进行。

在一个实施方案中，浆液含有至少150mg悬浮在1ml丙酮中的反相颗粒。在填充期间丙酮相对于异丙醇通过柱的线速度等于令人惊讶的7±1倍。

电喷射离子化(ESI)和发射器制造

在一个实施方案中，所述LCMS装置包含用于液相层析的发射器，偶联至具有用于电喷射端头(tip)的电喷射离子化质谱分析(LC-ESI/MS)。所述端头是还包含涂层及电喷射离子化源的电喷射离子化单元的一部分，优选被构造并设置为电喷射从分析柱接受的纳升流速(nanolitre flow rate)。

已知发射器的问题是金层特别是靠近端头末端的金层的破坏，其可导致脉动喷射(pulsating spray)。本发明的目的是改善发射器，特别是允许更长的LCMS-ESI运行。

优选地，端头/发射器包括一次涂层(primary coating)，优选是导电涂层，优选是贵金属如金涂层。二次涂层被用作保护层。在一个实施方案中，二次涂层是导电碳基涂层。在另一个实施方案中，硅基涂层用作二次涂层。在另一个实施方案中，使用导电聚合物涂层。

优选地，发射器由管材形成，优选熔融二氧化硅毛细管管材。在一个实施方案中，发射器内径至多55μm，优选至多30μm。

在本发明的一个实施方案中，提供了一种形成发射器的方法。所述方法包括加热管材并拉伸以形成具有减小的内半径的端头。这种减小的内半径进一步增强LCMS分析的性能。根据一个方面，本发明提供了制造这种改良的发射器的方法。制造用于LCMS装备中的改良的端头的方法包括用导电碳基涂料涂覆端头特别是端头末端的步骤。靠近其锥形末端的端头内径优选在大约2-30μm范围，更优选3-10μm。在一个实施方案中，形成的发射器/端头在锥形末端的发射器内径为至多10μm。

在一个实施方案中，在两端拉伸管材并在中间部分加热。在加热期间，在中间部分的玻璃变软，变得拉长，最终折断。在这个实施方案中形成两个锥形发射器。

在一个实施方案中，拉长的端头用贵金属如金涂覆。之后，切割端头，优选靠近锥形(拉长/拉伸的)末端切割以形成减小的内直径的出口。

在一个实施方案中，发射器整体形成在分析柱末端。这防止了分析柱末端与发射器上游末端之间的连接。

根据一个方面，提供了用于纳级流(nanoscale flow)的发射器，其包含用于接受样品例如来自液相层析柱的样品的上游末端及用于电喷射所述样品的锥形末端，所述发射器是电喷射离子化单元的一部分，所述发射器从熔融二氧化硅形成并且具有小于55μm的内径，其中所述发射器的锥形末端具有金的导电一次涂层及二次导电碳基涂层。

另外，本发明提供了用于纳级流的发射器，其包含用于接受样品例如来自液相层析柱的样品的上游末端及用于电喷射所述样品的锥形末端，所述发射器是电喷射离子化单元的一部分，所述发射器从熔融二氧化硅形成并且具有至多55μm的内径，其中所述发射器的锥形末端具有包含硅合金或导电聚合物的涂层。

T-连接器

在纳级LCMS装置中，关键的是避免流路中的死体积，即空隙(void)，因为具有与流路的内径相当大小的死体积对带(峰)宽有很大影响。由于分散所致峰加宽对于系统的灵敏性和动力学范围均有有害作用。

在一个实施方案中，提供了一种改良的连接元件，其至少显著降低LCMS装置的流路中死体积的存在。

因此，本发明提供了连接元件，其包含内体积，所述内体积横截面直径通常等于待安装管材的外径。

管材的对接(butt connection)

本发明的一个方面涉及提供能经受高压(＞4x10⁴kPa)的纳级柱的对接方法。

在本发明的一个实施方案中，用金刚石切割器切割待连接管材的末端，获得垂直于管材长度方向的“直切口(straight cut)”。这种直切口使得管材末端在连接元件内接合(abutment)并且至少降低当流动相从上游柱冲到下游柱入口时死体积的存在。在末端具有直刀口(straight edges)的管材连接通常称为对接。直切口避免了形成毛边(burr)或鳍状物(fin)。

尽管管材的末端是接合的，但是这种对接不是完全或者紧密闭合的并且可发生泄露。在三向连接元件实施方案中，泄露体积可以到达连接元件的第三个连接组合装置。

尽管本发明将用特异实施方案进行描述，但是显然本发明不限于所示实施方案。更特别地，所示实施方案显示了LCMS技术的应用。然而，本发明不限于在LCMS中应用。尽管本发明将用特异实施方案进行解释，但是本发明不限于本文公开的明确特征，也包含任何暗示特征或等同特征。尽管特异权利要求附于本申请，本申请的公开不由权利要求限制，而是包含所有暗示和明显特征，并且随后的分案申请可以涉及这些特征的任意组合。

本领域技术人员了解本发明实施方案可以组合。除非明确说明，任何本文公开的实施方案均可以与另一个公开的实施方案的特征(的一部分)组合。

本发明稍后参照附图更详细描述。

在整个申请中，表述LCMS装置可以与LCMS平台技术或LCMS设备互换使用。

LCMS装置的应用

在另一方面，提供了本发明前述方面所述装置在鉴别表位中的应用。

本领域技术人员知道什么是表位。简而言之，表位是蛋白质片段，优选是肽。通常，对于MHC I型配体，表位长度大约是8-10个氨基酸，对于MHC II型配体，表位长度大约是11-34、优选14-16个氨基酸，但是也可以预期其它长度的肽。这种肽可以进一步通过PTM改变(Engelhard et al.2004)。任何表位均可以潜在地用本发明的LCMS装置鉴别。在一个优选的实施方案中，MHC I型T细胞表位被鉴别。在另一个优选的实施方案中，MHC II型T细胞表位被鉴别。本领域技术人员理解用单个样品可以鉴别若干表位。还可以在单个样品中鉴别多个MHC I型和II型T细胞表位。

MHC I型表位

在第一个优选实施方案中，T细胞表位是MHC I型表位。如本领域技术人员已知及在背景中解释的，MHC I型表位是由APC呈递在MHC I型分子上以激活CD8⁺T细胞的表位。MHC I型表位优选源自或者衍生自在哺乳动物细胞内表达的蛋白质，优选衍生自在胞内感染期间的病毒。MHC I型表位也可以源自其它非自身蛋白质，其可以是被加工并被APC呈递在MHC I型分子中的细菌蛋白。优选地，这些蛋白质衍生自可适应胞内生活方式的细菌，即它们可以进入哺乳动物APC，优选人类APC。MHC I型表位还可以源自非自身细菌或病毒蛋白质，其可以由APC从细胞外环境摄取并且可以经交叉呈递到达MHC I型加工区室。另外，MHC I型表位也可以源自宿主蛋白质，其表达是从头诱导的或者由APC的细胞内感染而上调，因此是感染或病原体相关的。

可以使用一些策略用本发明的LCMS装置鉴别MHC I型表位。对于病毒病原体，首先需要选择需要对其鉴别MHC I型表位的病毒。优选的病毒包括但非限于能在所述哺乳动物中诱导病症或疾病的任何病毒。优选哺乳动物是人类。可鉴别MHC I型表位的人类病毒包括：逆转录病毒科，如人免疫缺陷病毒(HIV)；风疹病毒；副粘病毒科，如副流感病毒，麻疹病毒，腮腺炎病毒，呼吸道合胞病毒，人间质肺炎病毒；正粘病毒科，如流感病毒；黄病毒科，如黄热病毒，登革热病毒，丙型肝炎病毒(HCV)，日本脑炎表达(JEV)，蜱传脑炎病毒，St.Louis脑炎病毒或者西尼罗病毒；疱疹病毒科，如单纯疱疹病毒，巨细胞病毒，Epstein-Barr病毒；本雅病毒科(Bunyaviridae)；沙粒病毒科(Arenaviridae)；汉坦病毒科(Hantaviridae)，如Hantaan；冠状病毒科；乳多空病毒科，如人乳头瘤病毒；弹状病毒科(Rhabdoviridae)，如狂犬病病毒。冠状病毒科如人冠状病毒；甲病毒科(Alphaviridae)，动脉炎病毒科(Arteriviridae)，丝状病毒科(filoviridae)如埃博拉病毒，沙粒病毒科，痘病毒科如天花病毒及非洲猪瘟病毒。麻疹病毒、流感病毒和呼吸道合胞病毒在实验部分被作为例子。

下一步是制备包含来自选择的病毒的MHC I型表位的混合物，将这个混合物或者样品提供给上述LCMS装置以鉴别所述MHC I型表位。可以使用若干策略鉴别MHC I型表位。在这个优选实施方案(MHC I型表位)中，包含MHC I型表位的混合物优选衍生自包含所述表位的细胞。因此，如果待鉴别的MHC I型表位源自或者衍生自病毒，本领域技术人员首先要用所述病毒感染哺乳动物细胞以获得所述混合物。这可以用本领域技术人员已知技术进行并且已在作为例子的麻疹或者流感病毒的实验中充分描述。优选地，使用APC待被感染。APC可以衍生自细胞系或者分离自哺乳动物优选人。专门APC的分离和鉴别方法。优选使用的APC是人DC，更优选是人单核细胞衍生的树突细胞(MDDC)，如实验部分所述。APC优选在合适培养基中培养若干天(大约4-6天)，所述培养基任选补加给定营养素。APC随后用选择的病毒根据已知技术感染。根据病毒的性质，本领域技术人员知道采用哪种感染方案。在感染后，收获APC，洗涤，计数并任选地沉淀和冷冻直至进一步分析。作为对照，可以使用未感染的APC。根据实验设计，人们可以在至少两个平行培养物中培养APC，其一用选择的病毒感染。所述平行培养物之间的唯一其它差异是感染的培养物在50％稳定同位素标记的氨基酸如¹³C₆-L-亮氨酸和/或¹³C₅，¹⁵N₁-L-甲硫氨酸和/或¹³C₅，¹⁵N₁-L-缬氨酸和50％它们天然氨基酸对应物L-亮氨酸、L-甲硫氨酸和L-缬氨酸存在下实现。可以选择其它氨基酸用于标记，优选代表与实验的HLA背景相关的MHC锚残基的氨基酸。在洗脱一种MHC I型表位组合物之前使用感染的和对照APC的1∶1混合物(细胞/细胞)会差异影响病毒感染相关的相对于正常未改变的自身表位的同位素离子簇。这会使得稍后更好鉴别病毒感染相关的MHC I型表位。

根据实验设计，人们可以选择使用来自特异HLA背景的APC。例如，如果人们使用来自HLA-A*0201背景的APC，人们将鉴别特异存在于这个环境中的表位。我们还可以选择平行使用来自不同HLA背景的APC以鉴别可能存在于若干背景环境中的表位。在1∶1混合APC(细胞/细胞)之后，可以在进行进一步表位分析之前冷冻细胞混合物。

当进行分析时，如果是冷冻的，融化APC。APC随后裂解用于根据已知技术溶解MHC I型分子。优选的方法类似于在MHC II型表位章节描述的方法。更优选的方法也在实验部分描述。适于下载到用于鉴别洗脱的组合物中存在的每个表位的本发明装置中的包含MHC I型表位的组合物或样品的制备物类似于被下载到本发明装置中的包含MHC II型表位的组合物的制备物。

下载合适的组合物到本发明装置中及分析获得的结果导致MHC I型表位鉴别是根据本领域技术人员已知并且在实施例中解释的技术进行的。

这个方法允许鉴别已知感染哺乳动物的给定病毒的潜在地任何MHC I型表位。其还洞察给定MHC I型表位的相对丰度。其还可以洞察表位的其它特征，包括表位的长度变化，由存在包含在洗脱的组合物中的多个长度变体所反映，以及表位的翻译后修饰(PTM)，或者在给定HLA环境中呈递的蛋白质或者表位多态性的作用。这个技术是强有力的并且对于开发功能疫苗是需要的。如果选择的病毒是已知自身适应现存治疗相当快的病毒，本发明的优选实施方案是鉴别衍生自一种病毒的至少2个毒株的共享MHC I型表位，优选地在这个优选实施方案中，病毒是流感病毒。

MHC II型表位

在另一优选的实施方案中，T细胞表位是MHC II型表位。在本发明的一个优选应用中，在抗原脉冲实验中保温包含表位来源与APC的混合物及随后将包含已经加工及由APC呈递的表位的样品输送至本文所述装置之后鉴别MHC II型表位。优选表位来源是表位的来源蛋白质。

正如技术人员所已知且在背景中阐述，MHC II型表位是由APC呈递在MHC II型分子上以激活CD4⁺T细胞的表位。本文所用的MHC II型表位优选源自或者衍生自非自身蛋白质。非自身蛋白质优选是来自如后文所述鉴别的病原体的蛋白质，所述蛋白质对于可以由所述病原体感染的哺乳动物是非自身蛋白质。可以使用本发明的LCMS装置使用一些策略鉴别病原体相关的MHC II型表位。首先，需要选择针对其需要鉴别MHC II型表位的病原体。优选的病原体包括但不限于能在哺乳动物中诱导病症或疾病的哺乳动物的任何病原体。优选所述哺乳动物是人。可以对其鉴别MHC II型表位的人病原体包括原核生物或者真核生物细胞。优选地，原核生物是细菌。优选的细菌包括螺杆菌属(Helicobacter)，如幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)，奈瑟氏球菌属(Neisseria)，嗜血菌属(Haemophilus)如流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)，博德特氏菌属(Bordetella)，衣原体属(Chlamydia)，链球菌属(Streptococcus)如肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，弧菌属(Vibrio)如霍乱弧菌(Vibrio cholera)，以及革兰氏阴性肠病原体包括如沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)和埃希氏菌属(Escherichia)，以及导致炭疽、麻风、结核、白喉、Lyme病、梅毒、伤寒、淋病和Q热的细菌。优选的细菌属于博德特氏菌属或者奈瑟氏球菌属种。更优选的博德特氏菌属菌种包括百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、副百日咳博德特氏菌(Bordetella parapertussis)或者支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)。更优选的奈瑟氏球菌属菌种包括脑膜炎奈瑟氏球菌。病原体可以是寄生物，例如原生动物，如牛巴贝虫(Babesia bovis)、疟原虫属(Plasmodium)、利什曼原虫属(Leishmania spp)、鼠弓形虫(Toxoplasma gondii)，及锥虫属(Trypanosoma)，如克鲁斯锥虫(Trypanosoma cruzi)。优选的真核生物包括真菌。更优选的真菌是酵母或者丝状真菌。举例的优选的酵母属于假丝酵母属(Candida)。优选的真菌包括曲霉属(Aspergillus sp.)、白色假丝酵母(Candida albicans)、隐球酵母属(Cryptococcus)如新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)以及荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)。病原体也可以是如后文定义的病毒病原体。在这种情况中，当是指病原体细胞时，优选是指病毒感染的细胞。

下一步骤是制备包含来自选择的病原体的一或多个的MHC II型表位的一种来源蛋白质或者多种来源蛋白质的混合物，在抗原脉冲实验中将这个混合物与APC保温并将包含已经加工及由APC呈递的一或多个表位的样品输送至本文先前所述LCMS装置以鉴别所述MHC II型表位。根据实验的目的和/或技术人员所具有的选择的病原体的知识和/或根据病原体的性质可以使用一些类型的一或多种来源蛋白质的混合物。

在优选的实施方案中，所述混合物衍生自细胞或者包含细胞。更优选地，上下文中的细胞是病原体细胞。优选的病原体已经在本文鉴别。衍生自病原体细胞的混合物优选是衍生自全细胞制备物的混合物。当对所述病原体细胞未知或已知极少几个表位或者针对所述病原体应鉴别其他表位或者来自未知病原体蛋白质的表位时，这个更优选的实施方案(使用衍生自全细胞制备物的混合物)通常更具吸引力。当已知或未知病原体相关表位与来自病原体的其它已知或未知表位相比应被鉴别为优势加工和呈递的时，这个更优选的实施方案也是具有吸引力的。当在单个分析样品中应包含全部病原体相关的MHC II型ligandome(其类似于哺乳动物APC优选人APC对于完全和复杂的病原体蛋白质组的体内加工和呈递的结果)时，这个更优选的实施方案具有吸引力。简而言之，为了制备这种混合物，将病原体细胞在两个平行培养的合适培养基中培养，优选直至静止相。两个平行培养物之间的唯一不同是一个培养物在存在¹⁴N(天然氮同位素)条件下实现，而另一个在存在¹⁵N稳定同位素条件下实现。在抗原脉冲实验中使用¹⁴N-和¹⁵N-标记的病原体细胞1∶1的混合物与APC优选产生等拷贝数的轻(¹⁴N)和重(¹⁵N)形式的表位。这样可便于随后在LCMS装置中识别病原体相关的MHC II型表位。根据病原体，技术人员已知可以使用哪种合适的培养基以及其可以怎样任选补加额外的营养物。通常，当病原体细胞达到静止相时，对其进行热失活。静止相优选是指优选使用光密度测量法未检测出细胞的额外生长。所述光密度优选在590nm测量。随后，病原体细胞可以在生理缓冲液如PBS中浓缩以获得具有合适光密度(OD)、优选在0.6-1之间的全细胞制备物。

在另一优选的实施方案中，所述混合物包含细胞的蛋白质或者衍生自细胞的蛋白质，优选病原体细胞的蛋白质。病原体细胞已经在本文定义。优选的蛋白质是P.69 Pertactin，其是得自百日咳博德特氏菌的蛋白质。当已知得自病原体的蛋白质是免疫原性的及需要鉴别新的、改良的或者优势表位时，典型使用这种类型的混合物。蛋白质优选存在于纯化的制备物中。纯化的制备物优选是指所述制备物包含或者由至少80％、至少85％、至少90％的所述蛋白质组成，或者至少95％、或者至少98％、或者至少99％(w/w)。蛋白质可以从病原体直接纯化，或者其编码基因可以克隆进表达所述蛋白质的另一宿主中。这种宿主的优选实例是大肠杆菌(E.coli)，如本文实验部分所述。获得蛋白质的方式不限于本发明中的特定方式，只要所述制备物的纯度如本文定义即可。为了获得所述蛋白质，将病原体在如先前段落中所述的合适条件下培养。在宿主细胞的情况中，所述蛋白质的表达可以通过加入诱导剂诱导。优选地，对于大肠杆菌，使用IPTG作为诱导剂。如果所述蛋白质在细胞内表达，则在培养结束时使用本领域技术人员已知的去污剂使所述病原体或者宿主细胞裂解。随后制备包含所述蛋白质的细胞溶质细胞提取物。所述蛋白质随后从所述细胞溶质提取物中纯化。在大肠杆菌的情况中，所述蛋白质可以存在于包涵体中。存在于包涵体中的蛋白质的纯化为本领域技术人员已知且可以如实施例中所述进行。随后，蛋白质制备物可以在生理缓冲液如PBS中浓缩或者稀释或者可以进一步纯化以获得具有合适浓度蛋白质、优选0.3-2.5mg/ml的蛋白质制备物。

在另一优选的实施方案中，混合物衍生自细胞区室或者包含细胞区室，优选病原体细胞。病原体细胞已经在本文定义。优选的区室是小泡，更优选是脑膜炎奈瑟氏球菌的外膜小泡(Outer Membrane Vesicle，OMV)。当已知得自病原体的小泡是所述病原体的免疫原性实体及需要鉴别新的、改良或者优势表位时，典型使用这种类型的混合物。细胞区室优选存在于纯化的区室制备物中，如前文段落中针对蛋白质所阐述。纯化的区室制备物优选是指所述制备物包含或者由至少5％的已知存在于这种制备物中的一种代表性蛋白质组成。所述制备物优选包含或者由至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少85％、至少90％或者至少95％、或者至少98％、或者至少99％(w/w)组成。来自脑膜炎奈瑟氏球菌的OMV中存在的代表性蛋白质的实例是外膜蛋白质孔蛋白A(PorA)。区室优选直接纯化自病原体。获得区室的方式不限于本发明中特定方式，只要满足包含所述区室的制备物的纯度要求即可。为了获得所述区室制备物，将病原体在如前两个段落中所述合适条件下培养。根据选择的区室的性质，技术人员将已知怎样将其从培养的病原体细胞分离及任选纯化。制备包含OMV的制备物的一个优选方式在实施例中描述。随后，可以将所述区室制备物在生理缓冲液如PBS中浓缩或者稀释或者可以进一步纯化以获得具有合适浓度的代表所述区室的蛋白质的纯化的区室制备物。例如，如果使用来自脑膜炎奈瑟氏球菌的OMV作为所述区室，则纯化的区室应优选含有1.2-2.4mg/ml的主要代表性外膜蛋白质孔蛋白A(PorA)。

在本发明中可以使用包含MHC II型表位来源的任何其它混合物。优选地，这种来源是蛋白质来源。也可以使用包含病毒表位来源的混合物。优选的病毒在后文定义。包含病毒表位来源的混合物优选是包含病毒蛋白质的混合物或者衍生自其中或者是病毒蛋白质的来源，优选复制性病毒生物体。当应鉴别诱导CD4⁺T细胞的病毒相关的MHC II型表位时，这个优选的实施方案通常是具有吸引力的。

与制备包含MHC II型表位来源的混合物同时，也制备包含来自已知是选择的病原体的潜在靶位的哺乳动物的APC的制备物。优选地，APC得自人。技术人员已知怎样从人分离APC。这通常是使用人全血进行梯度离心技术进行，优选使用白细胞除去法暗黄覆盖层(leukapheresis buffy coat)的梯度离心进行。APC的性质优选通过流式细胞计量术核实，使用特异于APC标记的特异性抗体进行。优选使用的APC是人DC，更优选人单核细胞衍生的树突细胞(MDDC)，如实验部分所述。根据实验设计，可以选择使用来自特定HLA背景的APC。例如，如果使用来自HLA-DR1背景的APC，则将鉴别在这种环境中特异性呈递的表位。我们也可以选择平行使用来自不同HLA背景的APC以鉴别在几个背景环境中呈递的表位。也可以使用其它细胞类型如APC，优选来自免疫系统的专门APC，如B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞和除了MDDC之外的树突细胞世系。其它哺乳动物细胞类型也可以用作APC以鉴别在所述细胞的抗原加工和呈递背景环境中特异性产生的或者疾病状态相关的表位。在此，APC优选随后在合适的培养基中培养几天(大约4-6天)，所述培养基中可以补加营养物。在培养结束时，将包含一或多个表位的等量的¹⁴N和¹⁵N来源的1∶1混合物(全细胞或者细胞的蛋白质或区室)与APC在合适培养基中保温1-2天，所述培养基可以进一步补加。补加物可以是佐剂。优选的佐剂是LPS(脂多糖)。更优选地，LPS来自S.abortis equi。这是所谓的抗原脉冲实验。在保温结束时，收获APC、洗涤并计数。在进行进一步表位分析之前将其冷冻。

当将要进行分析时，如果APC是冷冻状态则将其解冻。随后根据已知技术对APC进行裂解以使MHC II型分子溶解。如实施例所述，优选的裂解缓冲液包含1％CHAPS，是缓冲的及补加了蛋白酶抑制剂。如实施例所述，离心后获得的上清随后可以在一些CNBr-激活的、TRIS-封闭的琼脂糖柱上纯化以获得包含一或多种表位的洗脱组合物。洗脱组合物可以通过膜滤进一步纯化、浓缩并在合适组合物或者样品中重建，下载进本发明的装置中以鉴别洗脱组合物中存在的每种表位。

根据技术人员已知的及在实施例中阐述的技术，将合适的组合物或样品下载入本发明的装置中，根据获得的分析结果鉴别MHC II型表位。

这种方法可以鉴别哺乳动物指定病原体的潜在的任何MHC II型表位。其还提供了对于指定MHC II型表位的相对丰度的认知。其也提供了对于表位的其它特征的认知，包括由洗脱组合物中包含的多个长度变体的存在而反映出的表位长度变异以及表位的翻译后修饰(PTM)，或者在指定HLA环境中蛋白质或者表位多态性(例如在脑膜炎奈瑟氏球菌的区域4中大量证实)对于呈递的作用。这个技术是强力的且是开发功能疫苗所需的。

鉴别的表位及其应用

另一方面，本发明提供了使用本文所述任何方法可获得的表位。优选的表位已经在本文鉴别(见实验数据中表1-8所示，SEQ ID NO：1-153)。实施例中鉴别的每个SEQ ID NO均代表鉴别的表位。在括号内指定的每个鉴别的表位的相邻残基优选不认为是该表位的一部分。优选每个SEQ ID NO包括本文指定的任何PTM。

麻疹病毒的优选表位在表1和2中鉴别，选自SEQ ID NO：1-45。更优选的表位选自SEQ ID NO：7-45，任选组合SEQ ID NO：1-6中至少一个。

与流感病毒感染相关的优选表位在表3中鉴别，选自SEQ ID NO：46-49和SEQ ID NO：52-58。

百日咳博德特氏菌的优选表位在表4和5中鉴别，选自SEQ ID NO：59-72。

脑膜炎奈瑟氏球菌的优选表位在表6、7和8中鉴别，选自SEQ ID NO：73-153。优选的表位衍生自PorA蛋白，孔蛋白A血清亚型P1.5-2，10或者孔蛋白A血清亚型P1.7-2，4。PorA蛋白可以再分为8个区域(见表6)：

-区域1相应于PorA蛋白、优选孔蛋白A血清亚型P1.5-2，10或者孔蛋白A血清亚型P1.7-2，4的前20个氨基酸，

-区域2相应于氨基酸39-59，

-区域3相应于氨基酸91-111，

-区域4相应于氨基酸131-168，

-区域5相应于氨基酸191-224，

-区域6相应于氨基酸292-306，

-区域7相应于氨基酸318-349，

-区域8相应于氨基酸349-372。

在优选的实施方案中，使用如下所述一或多个PorA表位：区域4内包含的PorA表位，和/或区域5内包含的PorA表位和/或区域6内包含的PorA表位，任选地组合区域1和/或2和/或3和/或7和/或8内包含的PorA表位。每个区域内包含的优选表位在表6中示出：

-区域1内包含的优选的表位由SEQ ID NO：73-76表示，

-区域2内包含的优选的表位由SEQ ID NO：77-79表示，

-区域3内包含的优选的表位由SEQ ID NO：80-91表示，

-区域4内包含的优选的表位由SEQ ID NO：92-95表示，

-区域5内包含的优选的表位由SEQ ID NO：96-99表示，

-区域6内包含的优选的表位由SEQ ID NO：100表示，

-区域7内包含的优选的表位由SEQ ID NO：101表示，

-区域8内包含的优选的表位由SEQ ID NO：102-110表示。

在更优选的实施方案中，PorA表位选自SEQ ID NO：92-95，任选地组合至少一种其它鉴别的PorA表位。

表7鉴别了从其它(非-PorA)蛋白质中鉴别的脑膜炎奈瑟氏球菌起源表位，由SEQ ID NO：111-134表示。因此，在优选的实施方案中，脑膜炎奈瑟氏球菌起源表位选自SEQ ID NO：111-134。

在更优选的实施方案中，如上述鉴别的Por A表位与从表7所示另一蛋白质中鉴别的脑膜炎奈瑟氏球菌起源表位组合使用。最优选地，PorA表位选自SEQ ID NO：92-95，组合SEQ ID NO：111-134中至少一个。

表8鉴别了从PorA和非-PorA蛋白质中鉴别的脑膜炎奈瑟氏球菌起源表位，由SEQ ID NO：135-153表示。因此，在优选的实施方案中，脑膜炎奈瑟氏球菌起源表位选自SEQ ID NO：135-153。

在更优选的实施方案中，如上述鉴别的脑膜炎奈瑟氏球菌表位与表8所示脑膜炎奈瑟氏球菌起源表位组合使用。最优选地，PorA表位选自SEQ ID NO：92-95，组合SEQ ID NO：135-153中至少一个。

表3、4和5中示出的每个表位以及表2、6、7和8所示其它表位的大部分均被认为是新的，其加强了本发明LCMS装置的唯一性。

任何这些表位均是掺入针对其所源自或者衍生自其中的病原体或者病毒的疫苗中的潜在候选物。因此，本发明还涉及包含在本文鉴别的表位的组合物，以生产预防和/或治疗由携带这个表位的病原体导致的疾病的疫苗。应理解本发明涵盖了包含如本文鉴别的一个指定病原体的1、2、3、4、5、6、7、8、9或者更多个表位的组合物。任选地，已知表位可以与本文鉴别的表位组合。

如本文定义，表位通过具有的一定长度而鉴别。包含所述表位的组合物优选不限于一定的长度。所述组合物可包含衍生自如本文定义的病原体的肽，所述肽包含鉴别的表位，优选具有在天然加工和呈递之后鉴别的特征，包括PTM。组合物也可以包含这样的多肽，所述多肽包含鉴别的表位作为核心序列以及两侧具有有利于在体内给予后呈递所述表位的氨基酸序列。组合物也可包含这样的多肽，所述多肽包含多个鉴别的表位及侧翼序列。然而，优选表位在由这种组合物在体内输送之后，对于MHC I型表位长度为8-12个氨基酸，或者对于MHC II型表位长度为11-34个氨基酸，优选14-16个氨基酸。所述氨基酸序列优选完全或者部分衍生自如本文定义的病原体表达的蛋白质。因此，在优选的实施方案中，包含如本文鉴别的表位的肽用于作为疫苗的组合物中。包含MHC I型表位的肽的长度可以是8-20个氨基酸或者更长。包含MHC II型表位的肽的长度可以是8-40个氨基酸或者更长。包含MHC I型或II型表位的所述肽可包含一个表位及来自天然病原体蛋白的另外侧翼序列或者非源自天然病原体蛋白的另外侧翼序列。

肽因此可由鉴别的表位组成，包含鉴别的表位，包含多个鉴别的表位或者具有与本文鉴别的表位序列之一具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或者100％相同性的氨基酸序列，以及其中优选这个肽不是源自如本文定义的病原体的天然氨基酸序列。优选地，肽通过其与鉴别的序列之一的相同性及具有如本文先前鉴别的长度而定义。相同性通过在排列两个序列以保证获得最大相同氨基酸数目之后确定两个序列之间相同氨基酸的数目而计算。

本发明进一步涵盖了包含如本文鉴别的表位的组合物可以是指在本文针对其已经鉴别了一或多个表位的病原体的天然蛋白质用作疫苗。当病原体的新的天然蛋白质在本文鉴别为具有至少一个表位时这是优选的。或者，可以使用所述天然蛋白质的部分。在本发明中，“部分”是指所述成熟蛋白质序列的氨基酸数目的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在实验数据中(见表2，4-8-)，鉴别了一些病原体特异性蛋白质。这些表中鉴别的每一蛋白质或者其部分均可用于组合物中，作为针对相应病原体的疫苗。

用于本发明中所述组合物的(多)肽可以是简单合成的。另一组合物可包含编码多肽的遗传(DNA)密码，所述多肽包含以其最佳形式的一或多个鉴别的表位。本领域目前已知产生所述(多)肽或者所述DNA的许多方法。

本发明因此进一步涉及包含如本文先前定义的本发明表位的组合物。所述组合物优选是药物组合物，及优选用作疫苗。疫苗可以用于哺乳动物的免疫(产生免疫应答)或者接种。组合物可进一步包含佐剂。佐剂在本文被定义为包括这样的任何物质或化合物，当其与表位组合使用时使哺乳动物、优选使人免疫，刺激免疫系统，从而激发、增强或者促进针对所述表位的免疫应答，优选不产生对于佐剂自身的特异性免疫应答。优选的佐剂使针对指定表位的免疫应答与在相同但不存在所述佐剂的条件下针对所述表位产生的免疫应答相比增强至少1.5、2、2.5、5、10或者20倍。本领域可获得在一组动物或人体中确定超过相应对照组的由佐剂产生的针对指定表位的免疫应答的统计学平均增强的检测方法。所述佐剂优选能增强针对至少两个不同表位的免疫应答。本发明的佐剂通常是这样的化合物，其对于哺乳动物是外源的，从而排除了哺乳动物内源的免疫刺激性化合物，如白细胞介素、干扰素及其它激素。

在进一步优选的实施方案中，药物组合物进一步包含药物可接受的载体。所述药物组合物可进一步包含药物可接受的稳定剂、渗透剂、缓冲剂、分散剂等。药物组合物的优选形式依赖于指定的给予模式和治疗应用。所述药物载体可以是适于将活性成分即表位以及任选佐剂输送至患者的任何相容的无毒性物质。对于鼻内输送的药物可接受的载体例如是水、缓冲盐水溶液、甘油、聚山梨醇酯20、cremophor EL以及辛酸/癸酸甘油酯的水溶液混合物，且可以缓冲以提供中性pH环境。胃肠外输送的药物可接受的载体例如是无菌缓冲的0.9％NaCl或者5％葡萄糖溶液，任选补加20％白蛋白。胃肠外给予的制备物必须是无菌的。胃肠外给予所述活性成分是根据已知方法进行，例如通过皮下、静脉内、腹膜内、肌内、动脉内或者病灶内(intralesional)、鼻内、皮内注射或者灌注或者口服途径。本发明的组合物优选通过推注形式给予。肌内注射的典型药物组合物被制成含有例如1-10ml磷酸盐缓冲盐水和1-100μg、优选15-45μg本发明的表位。对于口服给予，活性成分可以在液体剂型中给予，如酏剂、糖浆和悬浮液。口服给予的液体剂型可含有色素和调味剂以增加患者接受性。制备可通过胃肠外、口服或者鼻内给予的组合物的方法为本领域熟知且在多种资料中更详细描述，包括例如在Remington′s Pharmaceutical Science(15th ed.，Mack Publishing，Easton，PA，1980)中描述(在此以其全部内容援引加入本文)。

本发明表位的其它应用

另一方面，本发明提供了本发明表位在评估哺乳动物免疫状况中的进一步应用。在这个方面中，包含病原体表位的混合物可以与来自所述哺乳动物的APC或者T细胞在体外保温，使用本领域技术人员已知技术进行。评估哺乳动物免疫状况优选是指评估所述哺乳动物是否已经感染指定的病原体或者评估给予的疫苗是否仍保护所述哺乳动物免于未来感染所述病原体。优选地，表位可以使用本文所述任何方法获得。优选的表位和包含所述表位的优选的组合物已经在本文鉴别。所述T细胞激活或者与APC相关的表位的加工和识别的检测可表明所述哺乳动物仍被保护免于所述病原体感染。特异性针对所述表位的T细胞的激活可以在增殖测定中评估或者通过细胞因子或由这些T细胞产生的其它效应分子的增加而评估。每种这些方法均为本领域技术人员已知。所述应用也被命名为体外“保护相关性(CoP)”。

在本文及权利要求书中，动词“包含”以其非限制性含义使用，是指包括该词后面的项目，但是不排除未特别提及的项目。此外，动词“由……组成”可以由“基本上由……组成”代替，是指如本文定义的产物或者组合物除了特别指出的成分之外还可包含另外的成分，所述另外的成分不改变本发明的特有特性。此外，以不定冠词“一个”提及某元件时，不排除存在一个以上所述元件的可能性，除非特别明确限定有且仅有一个所述元件情况。不定冠词“一个”因此通常是指“至少一个”。

本说明书中引用的所有专利和参考文献均以全部内容援引加入本文。

如下实施例只是例证本发明的目的，而无以任何方式限制本发明范围之意。

附图描述

图1是在第一个实施方案中LCMS装备的示意图。

图2是在第二个实施方案中在LCMS装备中用于电喷射的发射器及其与与电喷射组合使用的分析柱装配的横截面图。

图3a-3d示出根据第二个实施方案制备端头(tip)的方法示意图。

图4示出第三个实施方案的连接元件的横截面图。

图5示出填充分析柱的方法中一个步骤的横截面图。

图6示出填充分析柱的方法中的第二个步骤。

图7示出在第七个实施方案中捕获柱的示意图。

图8是由MHC I型或者MHC II型分子呈递的T细胞表位的分配(allocation)的质谱识别模式的示意图。

图9示出复杂样品分析中LCMS技术的组合改良的用途。

图10示出在复杂样品分析中高质量纳级LC技术的结果。

图11示出来自人MDDC的MHC ligandome的LCMS分析结果。

图12示出使用稳定同位素标记定向LCMS鉴别病毒感染相关的上调的MHC I型自身表位的结果。

图13示出使用稳定同位素定向LCMS鉴别复杂病原体全细胞制备物中病原体衍生的MHC II型配体的结果。

图14示出使用稳定同位素定向LCMS鉴别单一重组表达的蛋白质中病原体衍生的MHC II型配体的结果。

图15示出使用稳定同位素定向LCMS鉴别细菌膜制备物中病原体衍生的MHC II型配体的结果。

图16示出使用稳定同位素鉴别具有预料之外PTM的MHC II型表位的结果。

图17示出人MB71.5T细胞对于P1.5-2，10和P1.7-2，4“区域4”表位的差异识别。

图1-7的详细描述

图1示意性示出LCMS装备1的视图。在左侧示意性示出注射器阀2。阀2可以与连接泵优选混合泵的电源3连接。所述阀还连接包含注射环路(loop)5的环路4。注射器阀可以进一步连接废弃物出口6和7及连接下一个阀的出口8，所述下一个阀更具体地是在图1右侧示意性示出的所谓Deans阀10。所述阀的构造是使得液流的一部分分流到出口8。

Deans阀10用于转换(switching)、分流及指导柱流进入分析柱11及最终进入质谱分析仪12。Deans阀使用简单的6端口转换阀远程实现分流。柱头压(column head pressure)通过限流器(restrictor)13的尺寸而产生。Deans阀进一步连接塞子14、15和废弃物16、17。

在一个实施方案中，LCMS装置包括纳级泵装置。所述泵装置包括泵并且能够输送nl/min范围的流速给持续变化的二元溶剂。在另一个实施方案中，使用常规高压液相层析(HPLC)泵。

泵、优选HPLC泵或者二元泵或四元泵，应该能够：

(i)以给定柱流速输送线性和未延迟梯度或者精确梯度流(以精确及良好限定的比率混合至少两种溶剂)，

(ii)固相提取阱应该不负面影响(总体)分离效率；及

(iii)在ESI界面的峰加宽应该不存在或者最小。非线性及延迟梯度可以由以相比于泵滞留体积(Vm)太低的流速(F)运行泵而导致。

在一个实施方案中，纳级LC泵用于本发明的LCMS装置中。然而，它们很昂贵并且在非常低流速即低于30nl/min不能产生精确稳定的梯度。

在一个实施方案中，所述泵装置包括与分流装置组合的泵优选HPLC泵，作为方便的方式以非常精确方式产生希望的混合溶剂系统的低流速。所述系统基于先前为气相层析中所谓cutting而开发的远程转换机制，并且被称为Deans转换。在一个实施方案中使用6端口转换阀(称为Deans阀)以远程方式实现柱流分流和引导。希望的柱头压产生自置于捕获柱上游的限流器的尺寸(长度、内径)和泵的初级出口流速。可以使用T连接器连接所述限流器和后续下游柱。

纳级HPLC系统包括溶剂真空脱气装置，溶剂混合泵、优选四元混合泵、更优选高压混合二元泵，能注射至少10μl样品体积的自动取样器。优选地，所有连接管材具有小于105μm、优选小于55μm、更优选小于30μm的内径。所述管材由未去活化熔融二氧化硅制成。

Deans阀10的分流及引导系统的一部分是位于两个三向连接器20，21之间的捕获柱19。所述捕获柱包括静止相床，包含大小至多5μm的颗粒，所述静止相床的尺寸为长度5mm、优选至少10mm、更优选至少20mm，内直大约50μm。

在一个实施方案中，LCMS装置包括位于分析柱11上游的固相提取(SPE)捕获柱或捕获柱19。捕获柱可以与Deans阀10平行放置，其在文献中也已知为Vented Column或V-柱(Licklider et al.2002)。捕获柱能使得相对快上样(转移)相对大样品体积进入纳级LC柱。捕获柱19的内径应该与分析或分离柱11的内径相称。

具有大内径(ID)的捕获柱19的使用导致捕获的化合物由于流动相的线速度下降到远低于大约1mm/s的最佳值而以相对宽条带转移到分析柱11。捕获柱19中的流动相的线速度与柱/捕获ID比率平方成比例，或者对于与以1mm/s线速度运行的50μm ID分析柱11组合的300μm ID和100μmID捕获柱19而言分别是0.03和0.25mm/s。另外，大ID捕获柱19导致显著延迟，因为捕获柱19和连接管材的空体积在洗脱过程可开始之前应该已经通过柱。

在一个实施方案中，分析柱11可以包括静止相床，其包含大小至多3μm的颗粒，所述静止相床的尺寸为长度25cm、优选至少50cm、更优选至少95cm，内径大约25μm。这个柱的末端与导电纳米喷射端头或者发射器对接，一个例子示于图2(具有大约25μm的内径并且包含渐缩为在端头的锥形末端内径为3.5μm的熔融二氧化硅管材)，根据本发明具有金-碳涂层。具有这种分析柱11的LCMS装备可以以大约30nl/min的流速运行。高度推荐在分析肽样品之前检验层析系统。

在一个实施方案中，使用串联质谱仪12。质谱仪能以至少10000FWHM的质量分辨率运行。质谱应该以谱连续模式(profile continue mode)以至少0.9秒/扫描的扫描速率获得。质量测定的精确度应该是100ppm或更好。

样品组分可以基于分析物的一些物理、化学或者其它特异性质如它们的分子大小、极性、电荷等分离。在一些实施方案中，几种方法(几种类型的层析)例如大小排阻层析、离子相互作用或者离子交换层析、特异分子相互作用(例如抗体-抗原)等组合在一起。若干这种层析方法也可以用于分级分离样品。

通过采用SCX层析作为第一维，其垂直于用作第二维的反相层析，分离效率显著增加。在二维LCMS(2D-LC/MS)中的最佳表现在离线操作模式中获得，因为其提供了在独立优化两个分离系统中的最高自由度，并且其排除了有关分离效率的任何危害。SCX层析对于除去可能仍存在于肽样品中并且可能在肽洗脱期间有干扰作用的任何残余去污剂或缓冲液成分是重要的。这些化合物可以从SCX柱中在空体积中洗脱，因此将出现在通常不含肽的最早级分中。

LC柱的分离效率可以表示为在单次运行中可分离的组分数目(即峰值容量)。柱分离效率是柱长度(L)和塔板高度(plate height，H)的商。

根据Van Deemter(Van Deemter et al.1956)，理论塔板高度(H)成比例地依赖于静止相颗粒的颗粒大小(d_p)。塔板计数的另一个参数是流动相流速，其是具有最佳线速度(接近1mm/s)的组合的线性和双曲线函数。在一个实施方案中，柱头压被控制以使得流动相具有大约这个值的线性速度。

LCMS装备是本领域技术人员已知的，并且他了解各种替代装备是可能的这一事实。图1示出的装备仅仅是许多可能装备之一的例子。

图2示出发射器30的端头，发射器30是示意性示出的电喷射离子化单元500的一部分。由虚线示出的单元500包括电源501连接502至发射器30，特别是连接至涂层。

发射器30用连接器32连接至分析柱31的末端。连接器32仅示意性示出。图2示出连接至柱31的末端33的发射器30的横截面。在该特异实施方案中，发射器30和柱末端33之间的连接是对接。在再一个实施方案中，使用金刚石切割器制备柱31的远端末端33和发射器30的近端末端34以使得在柱和端头之间有合适的对接。柱31的外径36优选在200-800μm范围。管材可包括熔融二氧化硅。在熔融二氧化硅管材中，形成内腔37，其具有内径38，优选在大约10μm至大约200μm范围，更优选在15μm和50μm之间。

发射器30包括连接至柱末端33的近端末端34和具有锥形形状的远端末端39。锥形末端39具有减小的外径和减小的内径。

在图3a-3d中，提供了制备发射器30的端头的方法的例子。在图3a所示第一步中，例如使用丁烷火炬(butane torch)44(至少部分)除去熔融二氧化硅管材43的涂层42。在接下来的步骤中，熔融二氧化硅43的加热末端46(通过图3b示意性示出的手段)在方向45拉伸，导致发射器30在所述方向被拉伸或者拉长。管材被挤压，减小内腔并最终闭合其。然后在所述熔融二氧化硅管材外表面上提供涂层47，使电流导电到达其锥形末端46以允许电喷射操作。端头靠近其锥形末端46的内径41优选在大约2-30μm、更优选3-10μm范围。较小的内径将进一步增加后续质谱分析的灵敏性。

在图3c中，示出上面提到的涂层施加于端头上。在一个实施方案中，包括贵金属如金的第一涂层施加到端头46上。然而，已经示出金涂层在电喷射期间恶化并且不能长期提供连续的电传导。替代或者额外地，碳基传导性涂层被施加于端头46上。这个涂层可以通过喷射过程施加于端头上。在一个实施方案中，用气溶胶或者蒸气沉积法沉积碳。碳颗粒可以悬浮于异丙醇中。

在根据本发明的一个实施方案中，施加涂层的步骤可以重复一次或一次以上。在一个实施方案中，多个涂层被施加于每个上面。

优选地使用涂层组合涂覆端头。在一个实施方案中，首先施加金涂层然后是碳基传导性涂层。在再一个实施方案中，首先施加金涂层，然后所述金涂层被一层碳基传导性涂层覆盖。所述一层碳基传导性涂层通过制备悬浮于1ml异丙醇中的50mg的Leit-C^TM碳颗粒并且将其喷射在发射器上(即在端头上)而施加。Leit-C-plast^TM是具有高电导率和永久可塑性的粘合剂并且可得自Electron Microscopy Sciences(EMS)，Hatford，UK。

在一个实施方案中，传导性氧化抗性材料被用作在端头锥形末端金涂层上面的进一步的涂层。在一个实施方案中，使用碳基传导性涂层。

在另一个实施方案中，使用硅合金。

在再一个实施方案中，导电聚合物被用作本发明的涂层或者用作额外涂层。

所述额外涂层可以粘附于金涂层。所述额外涂层提供保护。在一个实施方案中，涂层被喷射在发射器的锥形末端上。在另一个实施方案中，氧化抗性涂层施加于锥形末端上。合适的溶剂如异丙醇用于喷射。在另一个实施方案中，待喷射在发射器锥形末端上的浆液含有在1ml异丙醇中的30-70mg、在一个优选的实施方案中45-55mg的传导性碳胶合物(cement)。

在图3d中所示的后续步骤中，发射器30的闭合末端48用切割器49例如金刚石切割器除去。切割导致发射器30具有减小的内径的锥形末端39。挤压管材43及在管材43的自由末端施加拉力的组合效果产生内径的平稳减小。

在一个实施方案中，用于熔融二氧化硅管材的连接器用于连接捕获柱和/或分析柱的各自部分。在LCMS装备中，使用三向连接器或者T-连接器连接柱或阀。在现有技术中，使用Upchurch

三向连接器(在现有技术中已知为through-hole union，来自Upchurch Scientific，Oak Harbor，WA)。优选地，具有外径和内径、内径限定一个腔的由熔融二氧化硅组成的管材用这种连接器连接。在一个优选的实施方案中连接器是through-hole连接器。

在一个实施方案中，LCMS装置包括具有25μm内径的纳级柱。在使用肽的应用中，这些肽以具有典型地1纳升或更少体积的浓缩条带迁移通过这种柱。

在另一个实施方案中，提供了缺乏死体积的用于纳级管材的连接器，它们优选地适于在超过400巴(即4x10⁴kPa)压力下使用。

在一个实施方案中，连接器是适应的Upchurch through-hole T-连接器。

在一个实施方案中，T-连接器包括至少一个、可能两个卡套(ferrule)、优选三个卡套。管材、特别是微毛细(microcapillary)纳级柱可以被接纳在卡套的腔内。这使得管材装备在连接元件的内体积中。卡套腔是合适大小的。卡套腔是通过腔(through cavity)，具有通常等于或接近于待接纳在卡套腔中的管材的外径的内径。卡套腔与插入管材的管材的外径具有摩擦性接触。

与连接器组合的卡套用于将管材的腔与连接元件的腔对准(align)。连接元件包括用于安装卡套的接纳腔(receiving cavity)，其中安装腔(fitting cavity)和卡套配合并且是可断开的。在连接状态，卡套将具有内腔的管材相对于连接元件内腔定位。优选地，连接元件包括两个卡套安装腔组合。在目前Upchurch设计中，连接器的内体积包括死体积。

相对目前Upchurch设计，内腔被扩大很多。这与本领域技术人员的已知技能是相反的。

图4示出图1装备1的三向连接或转换元件20，21的细节。该图不是按比例的。更特异地，所示元件的直径比率不限于所示比率。

三向连接元件20包括3个卡套51-53。所述卡套是适合在三向连接器20的三个末端的接纳腔中的物体。在一个实施方案中，所述三个卡套具有不同大小。适合的卡套可以由于其形状基本上相应于腔的形状而在腔中自身对准。更特异地，在所示实施方案中，所述卡套可以具有相应于腔的圆锥形式的圆锥形式。自身对准将使得卡套的接纳腔进入相对于连接元件20的预定位置。

卡套51-53可包括腔。管材54-56的外径和腔的内径相适合以使得卡套在其腔中接纳任何管材54-56。

卡套51-53示出在连接状态，接纳在连接元件20，21的相应腔中。提供了帽(cap)57-59，所述的帽包括固定系统(未示出细节)以将帽57-59固定到连接器上并由此固定卡套51-53的位置。在一个实施方案中，固定系统包括锁闭系统(locking system)，例如螺钉样连接(screwlike connection)。固定系统还可以构造并设置用于固定和夹紧卡套51-53在连接状态，导致夹紧力施加在管材54-56的外径上。这导致管材54-56被锁定在它们各自位置。

连接元件20、卡套51-53和帽57-59可以用各种制造技术制造，特别是通过注塑制造。

管材54，56在这样的状态，其中它们被接纳在卡套中，卡套连接至连接元件，基本上对准。这意味着管材54，56的内腔也基本上对准。

在另一个实施方案中，连接元件的内体积、优选连接器的T-body的内体积与用于接纳管材的卡套的腔对准。在这种修改的连接元件中，优选其中连接元件的内体(inner body)的一部分已经通过钻进除去的Upchurch元件，现在提供了一种连接元件，其使得管材对准连接元件的两个各自横向末端并且管材的位置是它们的末端对接在连接元件内，连接元件位于连接器优选三向连接器的内腔中。

在所示实施方案中，熔融二氧化硅54，56的末端60，61已用金刚石切割器切割以得到直切口，使得管材54，56与连接状态的卡套51，53对接。这防止在连接元件20本体内存在死体积。

尽管是对接连接，来自管材54，56内的液体仍可以通过对接末端泄露，使得液体穿过管材55。

在另一个实施方案中，连接元件包括固定元件用于将卡套相对于连接元件固定。在一个实施方案中，固定装置包括夹紧装置。在一个实施方案中，夹紧卡套会导致夹紧管材在被接纳在卡套中的位置。构造和设置固定装置以固定管材以及卡套在相应位置。

在再一个实施方案中，两个管材连接在三向连接器中，其中连接元件的入口和出口呈一直线，第三个连接器垂直于这条直线连接。管材呈对接位置，这个对接连接不是必须在连接管材的精确正中，因为第三个连接器具有连接通道，泄露体积由于在液相层析中使用的高压能够到达这个连接通道。

图5和图6显示压力容器或bomb 70。bomb 70可以含有层析颗粒的悬浮液，优选含有悬浮的层析静止相的小瓶。

在一个实施方案中，管材被加热，例如通过将管材置于温度编程烘箱中加热。优选使用编程温度。在一个实施方案中，初始温度设为30℃，持续5分钟，随后在15分钟内增加至100℃，这个温度保持5小时。随后，玻璃料和管材被冷却至环境温度。之后，硬化的玻璃料和熔融二氧化硅被冷却至室温。接着，用熔融二氧化硅切割器修剪所形成的陶瓷玻璃料至长度大约为1-2mm。优选使用直切口。

在另一个实施方案中，通过填充柱而制造和提供纳级LC柱。填充柱的方法包括在熔融二氧化硅(FS)管材中制备保留颗粒的玻璃料(a particle retaining frit)。切割所述管材以具有希望的长度。在一特异实施方案中，提供了比率为90/10(v/v)的硅酸钾溶液(本文也称为KASIL)与甲酰胺的混合物。剧烈振荡所述混合物。在一个实施方案中，使用涡旋混合物例如10秒涡旋。优选地在其后立即将熔融二氧化硅浸入这个混合物一段短时间(不是关键的，例如1秒)以使得一段几厘米长的所述混合物被吸入管材中。

在一个实施方案中，填充LC分析柱包括将被提供有玻璃料的熔融二氧化硅管材装配在压力容器(bomb)中。所述压力容器可以含有希望颗粒的浆液。优选地，使用卡套将所述的管材装配到所述压力容器。优选地，使用本发明的连接部件将管材连接在压力容器中。

优选地，使用振动元件(vibrating element)74使整个柱振动。在本发明方法的一个实施方案中，在柱长度上的至少两个位置振动柱。在一个实施方案中，使用至少两个频率优选超声频率进行振动。

在特异的实施方案中，熔融二氧化硅柱的熔成玻璃料的末端被置于超声浴(例如Branson 200)中。在再一个实施方案中，仅在固相颗粒被冲入熔融二氧化硅柱中之后进行超声处理。

在填充柱的方法的一个实施方案中，使用高度浓缩(稠)的浆液。使用浆液是填充窄(25μm ID)且长柱的最方便方式。

在一个实施方案中，浆液含有至少150mg悬浮于1ml丙酮中的反相颗粒。在填充期间丙酮相对于异丙醇通过柱的线性速度是令人惊讶的7±1倍。

在制造填充柱的另一个特异实施方案中，熔成玻璃料的FS管材通过具有0.5mm孔的卡套放置于(frit up)压力容器中希望颗粒的浆液中。卡套与所述容器连接。接下来，装配在例如氦气缸上的减压器的第二级压力被调节为大约50巴并例如通过开启阀(例如Swagelok SS-41GSX2阀)而将所述压力施加于bomb。

一旦柱准备好，则用双目镜(25x)目视检查填充紧密性。在使用前，用HPLC泵以250巴压力用乙腈/水(85/15，v/v)加0.1M乙酸冲洗柱。

优选柱在使用前测试。可以检查柱的背压(巴/cm)。将一插套(内径0.4mm)置于柱的熔成玻璃料的末端。测量插套中弯月面的位移(mm)1分钟。体积根据如下得出：

流速(nl/min)＝位移(mm)x100(nl/mm)。

读出泵的压力并计算横过柱的标准化压降(P_b，巴/cm柱长度)：

P_b＝[时间/体积]x[(ID/50)²x125]xP/L

其中“时间”是以分钟表示的流量计量时间，“体积”是以nl表示的收集的体积，“ID”是以μm表示的柱内径，“P”是以巴表示的流量计量期间柱头压，“L”是以cm表示的柱长度。

提供了熔融二氧化硅管材71，在管材71的一个末端形成多孔陶瓷玻璃料72。另一末端连接于高压容器70。所述高压将部分悬浮颗粒带入腔。在颗粒流动进入腔期间，可以使用超声振动元件74振动柱或者柱71的部分以防止在颗粒中形成空体积。在一个实施方案中，振动元件74置于靠近柱中的材料阻塞的位置。

当发生下游阻塞时，柱可以被提起来到浆液外(但仍在容器中)并且冲出液体至干燥。随后，将FS放回浆液中，重新开始填充过程直至获得希望的床长度。

图7示意性示出待与本发明的实施方案之一组合使用的液相层析应用的二维。作为第一维，使用强阳离子交换(SCX)及在示出的实施方案中使用SCX与弱阴离子交换(WAX)树脂的混合床。如Motoyama所述的(Motoyama et al.2007)阴离子和阳离子交换颗粒的混合床是优选的。

第二维可以是所示出的C18反相(RP)层析。

SCX和反相层析的相容性差，特别是结合使用阳离子溶剂、缓冲液或者介质时。根据本发明的一个实施方案，使用溶剂介质81如甲酸或者盐酸(HCl)。尽管这些介质的洗脱强度较低，但是特别是甲酸显示出回收结合在阴离子-阳离子交换(ACE)树脂上的肽的高效率。

在一个实施方案中，蛋白酶解消化的蛋白质的多维LCMS/MS分析，其中SCX分级分离与RP分离结合使用。这些分析技术联用以增加分离效率和分析的动力学范围。在一个实施方案中，提供了在线多维LC方法，其使用阴离子和阳离子交换颗粒的混合床作为第一分离维。

在一个实施方案中，使用根据Motoyama(Motoyama et al.2007)的混合离子交换床。

在LCMS装置的一个实施方案中，样品以在线方式分级分离。优选地，在LCMS装置中构造并设置二维层析。优选地所述分离机制的至少一种使用样品组分的疏水性质。在再一个实施方案中，所用的分离机制的至少一种是SCX，其优选用于分级分离HLA-DR洗脱样品。

在一个实施方案中，使用正交分级分离。在一个优选实施方案中使用SCX分级分离。在一个组合装备中，总分析时间可以容易地增加典型15倍。SCX维可以以在线及离线方式使用。

SCX树脂包含颗粒表面具有强负电基团的颗粒，使得结合带正电分子。SCX树脂能够保持(保留/结合)带正电肽。

通常，结合分子通过用增加强度的合适阳离子盐水溶液的(连续/非连续)梯度冲洗树脂来置换/洗脱而释放/回收。因为梯度，仅松散结合的分子会比强结合分子走得更快。这导致复杂样品的希望的分离。

第二维可以是反相层析。在一个实施方案中，第二个分离步骤优选包括C18 RP层析。在一个实施方案中，LCMS装置的C18反相包括混合阴离子和阳离子交换固相提取捕获柱。

SCX和RP分离之间的正交性是由于SCX使用静电相互作用保留肽这一事实。在实践中，SCX肽分离中的保留是静电(主要)和疏水(次要)相互作用的组合，后者由磺酰基聚合物主链的疏水性质产生。这种“混合模式”性质已被认识到是SCX可以分离具有相同净电荷的结构相似肽的原因之一。

离子交换(IEX)和RP分离之间的正交性是基于静电相互作用和疏水性。在实践中，IEX肽分离中的保留是静电(主要)和疏水(次要)相互作用的组合，后者由与在二氧化硅颗粒表面性质的硅烷醇基的疏水相互作用产生。这种“混合模式”性质已被认识到是IEX可以分离具有相同净电荷的结构相似肽的原因之一。

优选地，LCMS方法包括使用弱阴离子交换(Poly WAX LP^TM，The Nest Group，Inc.45 Valley Road Southborough，MA 01772-1323，本文也称为WAX)分级分离的步骤。在一个优选实施方案中，WAX颗粒包括一层交联涂层，所述涂层包含正阳离子颗粒。更优选地，WAX颗粒包括与线性聚乙烯亚胺交联的基于二氧化硅的材料。

LCMS装置优选包括ACE固相提取柱作为回收结合的肽的第一维。

在一个实施方案中，SCX中的肽洗脱可以用挥发性有机盐如醋酸铵实现。在醋酸中的醋酸铵已被提议为用于从ACE柱分离肽的合适溶剂介质。

图8是用于由MHC I型或MHC II型分子呈递的T细胞表位的分配的质谱识别模式示意图。上图：MHC I型相关肽通过它们的二项式质谱同位素分布而鉴定，所述分布是由于掺入天然和同位素标记的氨基酸残基(在感染期间以等摩尔量存在于培养基中)所致。自身肽的上调程度可以基于天然表位的单一同位素质量(m)和单标记表位的单一同位素质量(m+Δ)的强度比率而计算。对于从头合成的蛋白质和病原体来源的蛋白质，理论同位素模式将显示精确的二项式分布。含有至多2个标记的氨基酸残基的表位的理论同位素分布模式在上图中给出，上图为：自身肽的未改变的表达及上调5倍、20倍和100倍的表达以及针对从头合成的上调的自身肽或者感染后的病毒肽。下图：源自病原体的MHC II型相关肽可以无疑义地与自身肽区分，基于实验方法II中描述的其特征性质谱双峰。

图9示出来自衍生自MV感染的WH细胞的未分级分离的HLA-A2 ligandome的LCMS基峰离子示踪，所述示踪采用如实验方法I所述的标准LCMS技术后获得(上图)以及采用平台LCMS技术后获得(下图)。

图10示出高质量纳级LC技术在复杂样品分析中的应用。使用不同梯度谱在90cm长C18柱(50μm ID，d_f＝5μm)上分离胰蛋白酶化肽，所述梯度谱范围为2％/min有机改性剂乙腈(上图)增加至6.7％乙腈/小时(中间图)及至4％乙腈/小时(下图)。半最大峰宽(peak-width-at-half-maximum)(FWHM)从3增加至大约30秒。峰容量从陡梯度中的大约300(上图)增加至缓梯度中的大约900(下图)。增加工作循环(作为运行时间百分比的洗脱窗)和MS源中化合物的扩大存在使得可以对低丰度肽进行深入的数据依赖性多级LCMS分析(即肽挖掘(peptide mining))。

对于图11，来自人MDDC的复杂MHC II型ligandome在分别用3-μm和5-μm C18颗粒填充的25-μm ID柱(图A，基峰离子示踪)和50-μm ID柱(图B，基峰离子示踪)上用相同梯度斜率分析。固相参数确定在MHC II型ligandome分析中的LCMS性能。25-μm ID柱显示在灵敏性和峰分辨率方面显著改善的LCMS性能。图C和D详细示出分别在25-μm ID和50-μm ID柱上这个样品中两个同重肽(即不相同的肽序列，但是具有相同的质量[M+2H]²⁺＝615.4Da)的LC性能差异。

对于图12，对分离自在用流感病毒感染后的人MDDC的HLA-A2 ligandome以及如实验方法I(方法C)所述使用稳定同位素标记的氨基酸进行LCMS分析。上图显示通过几乎二项式分布的同位素模式示出的带2电荷的上调的表位。三个标记残基掺入表位中。在m/z 573.3Da(下图)获得的这个肽的MS/MS谱揭示肽序列(基于y-型离子系列及精确质量测定)为VVSEVDIAKAD。这个特定实验已在感染期间用亮氨酸(L)、缬氨酸(V)和甲硫氨酸(M)作为培养基中的标记残基进行。这个肽中的三个标记残基全部是缬氨酸(V)。这个表位的上调程度可以基于在m/z 573.306Da的天然表位的单一同位素质量m与在m/z 576.313Da的单一标记的异构体的单一同位素质量[m+3]的质谱强度比率而计算(见实验方法I)。对于这个特定表位，由于流感病毒感染导致的上调程度等于16。

对于图13，对分离自如实验方法II(方法D)所述用¹⁴N-和¹⁵N-标记的百日咳博德特氏菌全细胞制备物脉冲后的人MDDC的HLA-DR2 ligandome进行LCMS分析。上图显示ESI质谱，含有在m/z 788.94Da和797.42Da的带2电荷的质谱双峰。插图示出去卷积(deconvoluted)质谱，表示含有17个氮原子的候选百日咳博德特氏菌肽。所述MS谱符合使用稳定同位素方法的细菌来源表位正分配(positive allocation)的一般标准(见文字)。下图显示在m/z 788.94Da的这个肽的去卷积MS/MS谱，揭示推定的周质蛋白(登录号CAE43606)来源肽AAFIALYPNSQLAPT序列(b-型离子系列)。

对于图14，对分离自如实验方法II(方法E)所述用¹⁴N-和¹⁵N-标记的百日咳博德特氏菌rP.69 Prn1脉冲后的各种人MDDC的异质混合物的HLA-DR ligandome进行LCMS分析。上图显示ESI质谱，含有在m/z 770.43Da和780.39Da的带2电荷的质谱双峰。插图示出去卷积质谱，表示含有20个氮原子的候选rP.69 Prn1来源肽。所述MS谱符合使用质量标记辅助方法rP.69 Prn1来源表位正分配的一般标准(见文字)。下图显示在m/z 770.43Da这个肽的去卷积MS/MS谱，揭示rP.69 Prn1来源肽LRDTNVTAVPASGAPA序列(b-型离子系列)。

对于图15，对分离自如实验方法II(方法F)所述用不同的¹⁴N-和¹⁵N-标记的脑膜炎奈瑟氏球菌OMV制备物脉冲后的人MDDC的HLA-DR1/P1.7-2，4和HLA-DR2/P1.5-2，10 ligandome进行LCMS分析。在图A的HLA-DR1/P1.7-2，4样品及图B的HLA-DR2/P1.5-2，10样品的ligandome中通过检索算法均检测到谱双峰。MS测序鉴别了P1.7-2，4衍生的表位SPDFSGFSGSVQFVPIQNSK(图B)及其P1.5-2，10同系物SPEFSGFSGSVQFVPAQNSK(图D)。在这些表位的第3位和第16位的残基是菌株特异性的。所述LCMS谱符合使用质量标记辅助方法(实验方法II)的细菌来源表位的一般标准。另外，在每个表位中所含的氮原子数可以从LCMS谱中推导出。在图A中所述带2电荷质谱双峰(Δ＝12Da)和在图B中所述带3电荷质谱双峰(Δ＝8.0Da)之间的质量差异显示每个表位含有24个N原子。事实上，两个鉴别的表位均符合这些数据。

对于图16，对分离自如实验方法II(方法F)所述用¹⁴N-和¹⁵N-标记的脑膜炎奈瑟氏球菌P1.7-2，4OMV制备物脉冲后的人MDDC的HLA-DR1 ligandome进行LCMS分析。作为代表区域8的一组长度变体之一，鉴别了脑膜炎奈瑟氏球菌P.1-7-2，4来源表位IGNYTQINAASVGL(图A和C)。在这个天然表位的1％丰度，检测到一个带2电荷质谱双峰，代表不规则P1.7-2，4衍生表位，其显示出与天然表位的令人惊讶的相似性，除了C末端氨基酸残基仅+1Da不同。IGNYTQINAASVG-[+114Da](图B和D)(注意该不规则表位中所含的病原体衍生的氮原子数根据其离子对推导是18，与天然表位的17不同)。结果，非天然表位(D)的完整y-型离子系列与天然表位(C)相比位移+1Da，而b-型离子系列保持未变。所述双峰的重离子和轻离子的集合y-和b-型离子系列表明这个非天然表位是病原体衍生蛋白质的蛋白质剪切事件及随后同一个P1.7-2，4分子的不同片段的分子内连接的结果，导致产生剪接的MHC II型配体。

图17示出人MB71.5 T细胞对P1.5-2，10和P1.7-2，4‘区域4’表位的差异识别。A：MB71.5T细胞，在用重组P1.5-2，10蛋白体外再刺激(2x)来自供体MB71的PBMC后产生，在用合成肽PEFSGFSGSVQFVPAQNS(S011-24)和SGSVQFVPAQNSKSAYTP(S011-25)脉冲的自体PBMC存在下增殖，但是用PDFSGFSGSVQFVPIQNS(S004.29)或SGSVQFVPIQNSKSAYTP(S004.30)不增殖。B：MB71.5T细胞仅识别在“区域4″序列的C末端部分表达丙氨酸(A)的PorA变体，即P1.5-2，10，P1.5-1，2-2和P1.22，14，但是不识别在该位置表达异亮氨酸(I)的变体，即P1.7-2，4，P1.7，16和P1.19，15(见结果部分文字)。

实施例

实验方法I：MHC I型ligandome

麻疹病毒、流感病毒和呼吸道合胞病毒

将Edmonston B株系的噬斑纯化的麻疹病毒(后文称作MV)在Vero细胞中生长。流感病毒(A/Wisconsin/67/2005株)在MDCK1细胞中生长。噬斑纯化的呼吸道合胞病毒(RSV-A2 no.VR-1302，ATTC)在hep-2细胞中生长。

人B细胞系WH和MB02及人单核细胞衍生的树突细胞

将表达HLA-A*0201的EBV转化的B细胞系WH和表达HLA-A*0201，-B*0701的EBV转化的B细胞系MB-02在补加抗生素和5％胎牛血清(后文称作FBS，Harlan，USA)的RPMI 1640培养基中培养。

人单核细胞衍生的树突细胞(后文称作MDDC)根据Sallusto(Sallusto et al.1994)所述程序进行培养。简而言之，通过对从HLA-A*0201，-B*0701纯合血液供体中知情同意获得白细胞除去法暗黄覆盖层的lymphoprep(Axis-shield，Norway)进行密度离心新鲜分离1×10⁹PBMC。将PBMC以5x10⁶/ml密度种植在湿化保温仪中的150-mm组织培养皿(Corning Costar，USA)中在37℃、5％CO₂条件下培养2小时，所述培养皿中具有补加抗生素(GibcoBRL，USA)和1％FBS的Iscove’s Modified Dulbecco’s培养基(GibcoBRL，USA)。在除去未粘附的级分之后，将粘附细胞在含有抗生素、1％FBS、500U/ml重组人GM-CSF(PeproTech，USA)和250U/ml重组人IL-4(Strathman Biotech，Deutschland)的培养基中进一步培养6天。在第3天更换培养基和生长因子。在第6天，MDDC准备好进行病毒感染。在病毒感染之前和之后，将1％等份的MDDC通过流式细胞计量术鉴定，以证实MDDC的纯度以及成熟(数据未示出)。

肽合成

使用SYRO II同时多个肽合成仪(MultiSyntech GmbH，Witten，Germany)通过固相FMOC化学制备合成的肽标准物。所述合成的肽的纯度和性质通过反相高效液相层析(HPLC)评估。

实验方法A、A’、B、C和C’使得人细胞批次表达病毒感染相关的MHCI型ligandome。

在方法A中，使用10⁷组织培养感染剂量₅₀/ml MV原种在含有抗生素和1％FBS的RPMI 1640培养基中感染2×10⁹WH细胞的B细胞批次2小时，感染复数(后文称作m.o.i.)为0.5。之后，洗涤细胞并生长40小时以使得MV相关的MHC I型ligandome表达。制备2×10⁹未处理的WH细胞的另一细胞批次，在标准培养基中培养之后表达对照MHC I型ligandome。在分别制备和分析MHC I型ligandome之前收获这两个细胞批次，洗涤、计数、沉淀、速冻及贮存在-70℃。

相似地，在方法A’中，使用10⁸组织培养感染剂量₅₀/ml流感病毒原种在含有抗生素和1％FBS的RPMI 1640培养基中感染3.5x10⁸MB-02细胞的B细胞批次1小时，感染复数(后文称作m.o.i.)为5。之后，洗涤细胞并使其生长另外9小时以使得流感病毒相关MHC I型ligandome表达。在制备和分析MHC I型ligandome之前，收获该细胞批次，洗涤、计数、沉淀、速冻及贮存在-70℃。

在方法B中，10⁷组织培养感染剂量₅₀/ml MV用于在含有抗生素和1％FBS的RPMI-1640培养基中感染1.5×10⁹WH细胞的B细胞批次2小时，m.o.i.为0.5。随后将这些细胞保温40小时以使得病毒感染相关的MHC I型ligandome在RPMI-1640培养基中表达，所述培养基中无L-亮氨酸和L-甲硫氨酸(Invitrogen)，补加5％FBS，而且对于50％标准浓度的L-亮氨酸和L-甲硫氨酸补加稳定同位素标记的氨基酸¹³C₆-L-亮氨酸和¹³C₅，¹⁵N₁-L-甲硫氨酸(每个氨基酸与其未标记的轻同位素相比质量增加6Da；Cambridge Isotope Laboratories)，对于另外50％补加未标记的氨基酸L-亮氨酸和L-甲硫氨酸(Sigma-Aldrich)。这些氨基酸是HLA-A2配体的主要锚残基。含有5％FBS和100％未标记的氨基酸的RPMI-1640培养基用于制备另一批次1.5×10⁹未感染的WH细胞。在制备和分析MHC I型ligandome之前，收获这两个细胞批次，洗涤、计数、以1∶1细胞比率混合，然后沉淀为一个单一细胞批次、速冻及贮存在-70℃。

在方法C中，使用7×10⁷噬斑形成单位/ml流感病毒感染2.2×10⁷HLA-A*0201纯合MDDC细胞批次4小时，m.o.i.为2。随后将这些细胞保温40小时，使得病毒感染相关的MHC I型ligandome在RPMI-1640培养基中表达，所述培养基中无L-亮氨酸、L-甲硫氨酸和L-缬氨酸(Invitrogen)，补加5％FBS，而且对于50％标准浓度的L-亮氨酸、L-甲硫氨酸和L-缬氨酸补加稳定同位素标记的氨基酸¹³C₆-L-亮氨酸、¹³C₅，¹⁵N₁-L-甲硫氨酸和¹³C₅，¹⁵N₁-L-缬氨酸(每个氨基酸与其未标记的轻同位素相比质量增加6Da；Cambridge Isotope Laboratories)，对于另外50％补加未标记的氨基酸L-亮氨酸、L-甲硫氨酸和L-缬氨酸(Sigma-Aldrich)。制备另一2.2×10⁷HLA-A*0201纯合MDDC细胞批次，在标准培养基中培养之后表达对照MHC I型ligandome。在制备和分析MHC I型ligandome之前，收获这两个批次细胞，洗涤、计数、以1∶1细胞比率混合，然后沉淀为一个单一细胞批次、速冻并贮存在-70℃。

相似地，在方法C’中，使用噬斑纯化的呼吸道合胞病毒感染2.5×10⁷HLA-A*0201，-B*0701纯合MDDC细胞批次3小时，m.o.i.为5。随后将这些细胞保温48小时，使得病毒感染相关的MHC I型ligandome在完全RPMI-1640培养基中表达。在制备和分析MHC I型ligandome之前，收获细胞批次、洗涤、计数、沉淀、速冻并贮存在-70℃。

MHC I型ligandome的分离

将根据实验方法A、A’、B、C或者C’生长的细胞批次解冻及裂解，以使MHC I型分子溶解，随后分离病毒感染相关的MHC I型ligandome。简而言之，将细胞在含有1％CHAPS(Roche)和蛋白酶抑制剂的pH＝8.0的TRIS-HCl缓冲液中裂解。离心后，将上清相继经过三个CNBr-激活的TRIS-封闭的琼脂糖柱：第一个非免疫球蛋白结合的柱(即预清除柱(preclear)1)、第二个结合正常小鼠免疫球蛋白(即预清除柱2)以及第三个结合特异于人MHC I型分子的特异性小鼠抗体(即清除柱)。在一个实例中，使用与HLA-A2分子(克隆BB7.2)反应的小鼠抗体；在另一个实例中，使用与HLA-B分子(克隆B1.23.2)反应的小鼠抗体。保留在清除柱上的MHC I型分子及相关的肽用10％(v/v)乙酸洗脱，并经过10-kDa分子量截断值滤膜。使用真空离心使滤物浓缩为±10μl，随后在5％甲酸和5％二甲亚砜中重建至终体积为100μl，在-70℃温度下贮存直至进行分析。将所述肽混合物掺加已知量的两种合成的肽标准物(血管紧张素-III和催产素，Sigma-Aldrich，St Louis，MO，USA)以校准在随后的样品处理期间的样品损耗。

标准LCMS技术

通过纳流(nanoflow)液相层析结合电喷射离子化质谱分析(后文称作LCMS)分析肽样品。将代表±10⁹B-细胞或者1-2×10⁷MDDC的等份肽样品加样于标准纳流LC柱转换系统C18前置柱中，通过标准MicroTee管状元件相继连接20-cm长分析柱，所述分析柱内径(后文称作ID)为50μm，充填5-μm C18颗粒。使用的流动相是线性梯度，流速为125nl/分钟的乙腈，在55分钟内从仅100％A(水+0.1-M乙酸)至在A中仅60％乙腈+0.1-M乙酸。柱端头用金涂层，柱头压为150bar。在质谱分析仪(Q-TOF，Waters Corp.)上以每秒“质量与电荷比率”(后文称作m/z)记录质谱，至少10,000半峰全宽(Full Width at Half Maximum)(后文称作FWHM)的分辨超过300-1,500Da(MS分析)。

对于候选病毒感染相关的MHC I型表位的MS测序(MS/MS分析)，主要使用随后的肽样品等份，MS1分析的周期与预选质量或者质谱分析仪中洗脱时间最富集的质量的碰撞诱导断裂的周期交替。MS/MS谱在扫描速度1sec/scan、质量范围50-2,000Da及质量分辨为5,000FWHM的条件下获得。最佳碰撞能量主要依赖于表位的性质和所用质谱仪的类型，且在这些实验中优化。对MS/MS谱的解释通过人工或者使用软件工具解释，例如Mascot(Perkins et al.，1999 at www.matrixscience.com，Matrix Science Ltd.，London UK)、ProteinProspector(www.prospector.ucsf.edu，University of California，San Francisco，CA，USA)、BioWorks^TM(Thermo Scientific，Waltham，MA，USA)和/或ProteinLynx^TM(Waters Corp.，Milford，MA，USA)。

对于鉴别的表位的半定量，相关应答因数通过将鉴别的表位的合成类似物的强度量除以标准肽血管紧张素-III和催产素的平均强度量而计算。这些因数随后用于对在细胞批次中存在的天然表位的数目进行半定量。

候选MV相关的MHC I型配体的鉴别

在方法A中，对比衍生自MV感染的和未感染的WH细胞的MHC I型ligandome中的MS离子示踪，质量对质量。对于此的标准程序是使用在两个样品中均存在的富集肽离子评估在μLC保留时间内发生的微小改变。对仅在感染的WH细胞中出现的肽质量进行测序及半定量。

在方法B和C中，基本质谱信息(由“质量值”和“强度值”定义)从得自MHC I型ligandome的MS谱中提取并用于算法搜索。首先，基于如下各项计算模拟的同位素模式：(i)使用的稳定同位素标记的类型和数目，(ii)这些稳定同位素的天然发生率，(iii)推测的掺入表位中的标记的氨基酸的最大数目，(iv)实验设计以及(v)涉及的离子的电荷状况。每个单独模拟的同位素模式均沿着MS谱的质量轴以数学方式移动。

图8上图示出了在如方法B中方法所述，在使用两种稳定同位素后提取自病毒感染的细胞批次的病毒和自身MHC I型配体的模拟的同位素模式。在两个位置表达例如甲硫氨酸和/或亮氨酸的病毒表位可以通过质量m(50)、m+Δ(100)和m+2Δ(50)的相对比率识别，其中对于带单电荷的离子Δ是6Da，其对于方法B中的标记和细胞混合程序固有的三个同位素变体是典型的(图8，上图，右侧模式)。另外，保持未改变的或者在病毒感染期间被上调的自身表位可以通过它们自己的同位素模式识别(图8，上图，左侧4个模式)。另外，可以计算上调程度，基于单标记异构体(I_[m+Δ])和天然表位(I_m)的单一同位素质量的强度比率，公式为

其中x代表表位内所含的标记氨基酸的最大数。上调至少2倍被认为是与感染显著相关的。因此，同位素模式针对3个标记的氨基酸的使用而被模拟，如方法C。匹配同位素簇被选择作为候选的病毒感染相关的MHC I型配体以用于进一步LCMS/MS分析。

平台LCMS技术

对于病毒感染相关的MHC I型ligandome的“肽挖掘”，修改LCMS系统的一些独立参数以获得灵敏性改良一或多个数量级的平台LCMS技术，由此可以检测例如在成批的10⁷-10⁸个细胞中以单拷贝/细胞存在的MHC I型表位。

所述平台LCMC技术组成为标准纳流LC柱转换系统C18前置柱，通过修饰的MicroTee管状元件相继连接于长度≥90cm的分析柱，所述分析柱ID为25μm，致密填充了3μm C18颗粒。使用的流动相是平缓线性梯度，流速为30nl/分钟的乙腈，在240分钟内从在A(水+0.1M乙酸)中8％乙腈+0.1M乙酸至在A中28％乙腈。柱端头用碳涂层，柱头压≥400bar。如标准LCMS技术所述进行表位的MS谱解释、随后的MS/MS分析以及半定量。

使用肽样品分析平台LCMS技术的优越性，所述肽样品得自在方法A中描述的MV感染的WH B-细胞批次，得自在方法A’中描述的流感病毒感染的MB-02 B细胞-批次，以及得自在方法C’中描述的RSV-感染的MDDC细胞批次(如后文示出)。

结果：MHC I型ligandome

标准LCMS技术可以鉴别有限数目的HLA-A2-结合的MV表位

在MV感染后如所述从人WH细胞获得MHC I型配体以通过标准LCMS技术鉴别MV相关的MHC I型表位。研究两个HLA-A2 ligandome样品，一个通过方法A分析(减法分析)，一个HLA-A2 ligandome样品通过方法B分析(同位素标记)。在每种方法中，可以检测三个候选的病毒相关的MHC I型表位，在MS/MS测序之后证实其是MV表位(表1)。如所公布的，标准LCMS技术使得可以鉴别共4个不同的表位，含有超优势(supradominant)MV-C_84-92表位，发现其以＞100,000拷贝/细胞表达。

对比实施例：平台LCMS技术可以鉴别10-15倍更多的MV表位

尽管标准LCMS技术能支持在复杂的MHC I型ligandome样品中以亚飞摩尔范围在几千个化学相似的自身表位中鉴别和鉴定一些、可能是最富集的病毒表位，但是有迹象表明现有技术存在关于重要的其它次优势病毒表位的知识缺口。

我们探讨了如果在该技术的LC部分进行严格修饰将产生使得可以检测和鉴定次优势MHC I型配体的平台LCMS技术。图9示出了对于一个单一MV感染相关的MHC I型样品(如在方法A中制备)的级分的典型LCMS峰性能，使用标准LCMS技术(上图)或者含有如在方法中所述的一些组合的独立修饰的平台LCMS技术(下图)。下图LCMS运行的在线数据依赖性LCMS/MS测序(平台技术)可以鉴别39个MV衍生的HLA-A2配体，代表31个不同表位(表2)。这些天然呈递的表位中的26个表位是新的MV表位，3个是使用标准LCMS技术已经鉴别的表位(表1)，2个尽管新鉴别是量化的天然HLA-A2配体，但是在文献中描述为是小鼠和人MV CD8⁺T细胞表位(Neumeister et al.1998，Nanan et al.1995)。因此，通过对标准LCMS方法的平台修改可以鉴别出至少10倍以上的表位。

通过平台LCMS技术从其它病毒中进行MHC I型ligandome表位挖掘的其它实例

为了进一步分析其优越性，使用平台LCMS技术分析如方法A’和C’所述从其它病毒感染的细胞批次中制备的MHC I型ligandome。鉴别6个病毒MHC I型表位，其通过标准LCMS技术不可检测：4个表位涉及流感病毒感染，2个表位涉及RSV感染(表2)。

平台LCMS技术对MHC I型ligandome的表位挖掘是通过对LC方法进行一些独立改良而实现

为了体会所述方法中一个修饰对于峰性能和肽挖掘的作用，在单独的支持性实验中研究梯度倾斜度组合长柱的作用以及C18颗粒大小组合柱ID的影响。如图10所示，使用复杂胰蛋白酶化蛋白消化物，应用更平缓和扩展的梯度斜率组合90cm长柱可以增加层析中肽的峰容量及扩展峰宽。这使得允许在MS来源中大量存在化合物，便于低丰度肽的综合数据依赖性多级MS/MS分析(肽挖掘)。正如所期望的，当使用充填在较小ID(25μm)的柱中的3-μm C18颗粒时获得LCMS系统的4倍的较高灵敏性，使用充填在50-μm ID柱中的3-μm C18颗粒则相反(图11，上组)。出人预料地，分离效率也由较小ID柱改良(图11，下组)。

平台LCMS分析可以鉴别MV表位的特有特征

MHC I型配体的除了序列信息和多样性之外的重要特征是表位的长度变化、丰度和可能的PTM。表2示出了在MV衍生的HLA-A2配体中发现的5个不同长度的肽：8-聚体(n＝2)，9-聚体(n＝21)，10-聚体(n＝9)，11-聚体(n＝5)及12-聚体(n＝2)。因此，9-聚体是最普遍的，根据半定量数据，分别呈现26％和18％的MV-衍生的HLA-A2 ligandome的两个最富集的肽种类均是9-聚体。从先前的研究中已知是超优势表位的KLWESPQEI(表1)在这个分析中未充分呈现。这是预期的，因为仅含有这个特殊表位的小HPLC级分为其它研究目的而从样品中选择性除去。从7个表位中，鉴别共有相同核心表位的2或3个长度变体(表2)。

此外，来自大结构蛋白的表位RAN*VSLEEL、来自融合糖蛋白F0前体的KLMPN*ITLL以及来自血凝素糖蛋白的LSVDLSpPTV(表2)是翻译后修饰的表位，不可如此从翻译的基因组中推导。这种修饰在关于病毒MHCI型表位的文献中未描述。

病毒感染相关的上调的MHC I型自身表位的鉴别

如图8所示，不仅病毒特异性表位、而且从头诱导或者上调的自身表位通过组合使用同位素标记与MHC I型分离和LCMS技术也可以被检测。流感病毒感染相关的HLA-A2 ligandome分离自人MDDC，如方法C所述，并且进行标准LCMS技术。查找匹配应用三个标记的氨基酸的上调的肽的模拟同位素模式的同位素簇。图12例证了具有3个同位素标记的氨基酸的同位素簇的实例。所述表位被鉴别为VVSEVDIAKAD，衍生自人干扰素诱导的GTP-结合蛋白Mx1(登录号P20591)。在流感病毒感染后鉴别出6个其它上调的自身表位(表3)。尽管已经报道其它自身表位是在病毒感染后上调的天然存在的MHC I型配体，但是本发明中鉴别的表位是新的表位且能与流感病毒感染特异性相关。

实验方法II：MHC II型ligandome

百日咳博德特氏菌的生长及全细胞制备物的产生

百日咳博德特氏菌菌株509在天然的含有¹⁴N的基本Bioexpress细胞生长培养基中或者在98％-富集的¹⁵N-稳定同位素标记的基本Bioexpress细胞生长培养基(Cambridge Isotope Laboratories，USA)中生长至静止期，两个培养基均含有过滤的0.15％乳酸(Fluka，Switzerland)及18.6mM NaOH。生长后，¹⁴N-和¹⁵N-标记的细菌培养物通过在56℃保温30分钟而热失活，并通过在2000g离心20分钟并将沉淀置于1/5体积PBS中而在PBS中浓缩5倍。¹⁴N-和¹⁵N-标记的全细胞制备物的光密度在590nm测量，为进行抗原呈递细胞的抗原脉冲，基于这些OD₅₉₀值制备这些制备物的1∶1混合物。

从百日咳博德特氏菌制备重组P.69 Pertactin

含有编码百日咳博德特氏菌P.69 Pertactin野生型变体P.69 Prn1(登录号AJ011091)的胞外结构域的质粒pPRN1(Hijnen et al.2005)的大肠杆菌菌株BL21-Codonplus(DE3)-RP(Stratagene，la Jolla，CA)在天然的¹⁴N标记的基本Bioexpress细胞生长培养基中或者在98原子％富集的¹⁵N-标记的基本Bioexpress细胞生长培养基(Cambridge Isotope Laboratories，USA)中在250rpm下于37℃生长，直至OD₅₉₀达到0.6-0.8。随后，培养物用1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导，并再保温4小时。诱导的¹⁴N-和¹⁵N-标记的细菌通过在4℃5000g离心10分钟收集，随后用Bug Buster试剂(Novagen，Darmstadt，Germany)裂解。细胞裂解物用每克湿细胞糊用5,000U溶菌酶和125U benzonase核酸酶处理。离心收集包涵体并用1∶10稀释的Bug Buster试剂洗涤3次。纯化的¹⁴N-和¹⁵N-标记的包涵体溶解在6M盐酸胍(GuHCl)，10mM苯甲脒，1mM EDTA，100mM NaCl和50mM Tris·HCl pH＝8.8中。¹⁴N-和¹⁵N-标记的rP.69 Prn1蛋白质的重折叠通过快速50倍稀释进不含GuHCl的相同缓冲液中起始。在4℃对1mM EDTA，100mM NaCl和50mM Tris·HCl pH＝8.8过夜透析过程中使蛋白质充分重折叠。随后，用50kDa分子量截断值的透析膜(Spectrum Laboratories，Rancho Dominguez，CA)，重折叠的蛋白质对50mM Tris·HCl pH＝8.8透析2次。蛋白质在具有50-kDa截断值的Amicon Ultra-15浓缩器(Millipore，Billerica，MA)上浓缩。最后向1mg/ml浓缩蛋白质中加入2μg蛋白酶抑制剂(Roche，Penzberg，Germany)。为进行人MDDC的抗原脉冲，基于在Bicinchoninic Acid(以下称为BCA)蛋白质测定(Pierce Protein Research Products，Rockford，USA)中测量的蛋白质含量，制备¹⁴N-和¹⁵N-标记的rP.69 Prn1蛋白的1∶1蛋白质/蛋白质混合物。

脑膜炎奈瑟氏球菌等基因菌株在基本培养基中的生长及OMV制备

脑膜炎奈瑟氏球菌H44/76的两个分别表达可变主要外膜蛋白孔蛋白A(以下称为PorA)的血清亚型P1.5-2，10或P1.7-2，4的class 3^-，class 4^-等基因菌株(Peeter et al.1996)在天然的含有¹⁴N的基本Bioexpress细胞生长培养基中或者在98％富集的¹⁵N-标记的基本Bioexpress细胞生长培养基(Cambridge Isotope Laboratories，USA)中生长至静止期。从这些培养物制备¹⁴N-和¹⁵N-标记的外膜小泡(以下称为OMV)批次，并根据Claassen(Claassen et al.1996)所述鉴定。为进行人MDDC的抗原脉冲，基于在BCA蛋白质测定(Pierce Protein Research Products，Rockford，USA)中测量的蛋白质含量制备¹⁴N-和¹⁵N-标记的OMV批次的1∶1蛋白质/蛋白质混合物。

在基本培养基中病原体衍生的蛋白质的表达和标记

为进行全细胞百日咳博德特氏菌制备物的蛋白质分析，从¹⁴N-和¹⁵N-标记的全细胞百日咳博德特氏菌制备物的小等份制备膜复合物。细菌细胞批次在7000g离心(15分钟，10℃)，沉淀重悬于10mM Tris·HCl pH＝8.0中。这些悬浮液在冰上超声处理以破坏细胞膜，在6500g离心(10分钟，10℃)，收集上清。离心膜片段(40000g，1小时)并置于10mM Tris·HCl pH＝8.0中的1％十二烷基肌氨酸钠(sarcosyl)中。膜复合物进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(以下称为SDS-PAGE)，之后蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上。膜用抗已知毒力因子丝状血凝素(1∶500，克隆31E5)，P.69 Pertactin(1∶50，克隆Pem4)，百日咳毒素亚基1(1∶1,000，克隆151C1)，百日咳毒素亚基4(1∶100，克隆1-227)和Fimbriae 2(1∶1,000，克隆21E7)的单克隆抗体探查(western印迹)，所有单克隆抗体均来自荷兰Netherlands Vaccine Institute。之后，膜与碱性磷酸酶标记的抗小鼠IgG(1∶5,000；SBA，UK)保温，用即用AP缀合物底物试剂盒(Biorad，USA)检测信号。

同位素标记效率用P.69 Pertactin作为代表性蛋白质例子研究。在SDS-PAGE上分离蛋白质后，¹⁴N-和¹⁵N-标记的69-kDa条带从凝胶上切下。将¹⁴N-和¹⁵N-标记的P.69 Pertactin及其胰蛋白酶消化物分别进行LCMS(P.69 Pertactin)和LCMS/MS(消化物)。

¹⁴N-和¹⁵N-标记的rP.69 Pertactin制备物中蛋白质的完整性及¹⁴N-和¹⁵N-OMV制备物中PorA的完整性以及蛋白质及胰蛋白酶消化物的同位素标记效率用上述针对百日咳博德特氏菌膜复合物所述相似技术(SDS-PAGE，western印迹，LCMS和LCMS/MS)评估，特别是通过分别靶向P.69 Pertactin和PorA进行。对PorA，在western印迹中使用血清亚型特异性单克隆抗体。

实验方法D、E和F导致表达病原体相关MHC II型ligandome的人MDDC 批次

在方法D中，人MDDC根据有小改变的实验方法I中所述程序进行培养。在此，用白细胞除去法暗黄覆盖层分离1x10⁹PBMC，所述暗黄覆盖层经知情同意得自HLA-DR2纯合血液供体。在第6天，仍未成熟的MDDC用终浓度为OD₅₉₀＝0.028的¹⁴N-和¹⁵N-标记的全细胞百日咳博德特氏菌制备物的1∶1混合物脉冲。在第8天，收集全细胞百日咳博德特氏菌脉冲的MDDC，在PBS中洗涤并计数。沉淀20x10⁶MDDC，冷冻，在-80℃储存直至肽分离和分析。在全细胞百日咳博德特氏菌脉冲之前和之后的小等份(1％)MDDC经流式细胞术鉴定以验证MDDC纯度及成熟(未示出)。

在方法E中，如上，人MDDC根据有小改变的实验方法I中所述程序进行制备。在此，经知情同意得自代表HLA-DR分型的异质群体的9个不同血库供体的PBMC分别培养(3x10⁸PBMC/供体)以生长MDDC。在第6天，仍未成熟的MDDC用最终蛋白质浓度为10μg/ml的¹⁴N-和¹⁵N-标记的rP.69 Pertactin制备物的1∶1混合物在20ng/ml来自S.abortis equi的LPS的存在下脉冲。在第8天，收获rP.69 Pertactin-脉冲的MDDC(n＝9)，在PBS中洗涤，合并并且计数。然后沉淀70x10⁶合并的MDDC，冷冻并储存在-80℃直至肽分离和分析。在百日咳博德特氏菌rP.69 Pertactin脉冲之前和之后的小等份(1％)MDDC经流式细胞术鉴定以验证MDDC纯度及成熟(未示出)。

在方法F中，如上，人MDDC根据有小改变的实验方法I中所述程序进行制备。在此，经知情同意得自HLA-DR1纯合供体及经知情同意得自HLA-DR2纯合供体的PBMC被分别培养(2x10⁹PBMC/供体)以生长MDDC。在第6天，每个MDDC批次分成两个等份并用最终蛋白质浓度为25μg/ml的¹⁴N-和¹⁵N-标记的P1.7-2，4OMV的1∶1混合物或者¹⁴N-和¹⁵N-标记的P1.5-2，10OMV的1∶1混合物在20ng/ml来自S.abortis equi的LPS的存在下脉冲。在第8天，收获4种不同的OMV脉冲的MDDC批次，在PBS中洗涤，计数，沉淀，冷冻并储存在-80℃直至各个肽分离和分析。在OMV脉冲之前和之后的小等份(1％)的每种MDDC批次经流式细胞术鉴定以验证MDDC纯度及成熟(未示出)。

肽合成

合成肽标准品经固相FMOC化学使用SYRO II同时多个肽合成仪(MultiSyntech GmbH，Witten，Germany)制备。合成的肽的纯度和性质经反相高效液相层析(HPLC)评估。

MHC II型ligandome的分离

根据方法D、E和F制备的MDDC批次解冻并裂解以溶解MHC II型分子，随后根据实验方法I所述的MHC I型ligandome分离经如下小改变而经免疫化学分离病原体相关的MHC II型ligandome。在清除步骤中，使用特异于人HLA-DR分子的小鼠抗体(克隆B8.11.2)，用10％乙酸从清除柱洗脱后，HLA-DR分子和缔合肽通过10-kDa分子量截断值膜滤器，滤过物加热15分钟至70℃。MHC II型ligandome的浓缩、重建、掺加(spiking)和储存均类似于实验方法I中针对MHC I型ligandome所述的程序。

平台LCMS分析

肽样品经本文上面所述的优化的纳流液相层析结合电喷射离子化-质谱分析(平台LCMS)进行分析。代表1-2x10⁷MDDC的肽样品等份上样到C18前置柱，其经修改的MicroTee管状元件顺序连接25-cm长分析柱，所述分析柱具有25-μm ID，用3-μm C18颗粒致密填充。所用流动相是流速为30μl/min乙腈+0.1-M乙酸的平缓线性梯度，在45分钟内从100％A(水+0.1-M乙酸)至在A中的60％乙腈+0.1-M乙酸。柱端头用金和碳涂覆，柱头压＞250巴。以1秒/扫描的扫描速率记录质谱，质量范围为300-1,500Da，质量分辨率至少为10,000FWHM(MS分析)。

对于候选病原体相关MHC II型表位的MS测序(MS/MS分析)，多数使用肽样品的第二个等份，MS1分析循环与预选择质量或者在洗脱进质谱仪时最丰富的质量上的碰撞诱导断裂的循环交替。以1秒/扫描的扫描速率获得MS/MS谱，质量范围为50-2,000Da，质量分辨率为5,000FWHM。最佳碰撞能量主要取决于表位的性质和所用质谱仪的类型，并且在这些实验中被优化。MS/MS谱的解释手工进行或者使用软件工具，例如Mascot(Perkins et al.1999.，www.matrixscience.com，Matrix Science Ltd.，London UK)，ProteinProspector(www.prospector.ucsf.edu，Univ.of California，San Francisco，CA，USA)，Bio Works^TM(Thermo Scientific，Waltham，MA，USA)和/或ProteinLynx^TM(Waters Corp.，Milford，MA，USA)。

为量化鉴别的表位，通过鉴别的表位的合成类似物的强度量除以标准肽血管紧张素III和催产素的强度量的平均值而计算相对应答因数。这些因数随后用于细胞批次中存在的天然表位数的半量化。

在线2-维平台LCMS分析

通过在线2维纳级液相层析结合电喷射离子化-质谱分析(2D-LCMS)分析肽。代表1-2x10⁷MDDC的肽样品等份被上样到包含以干颗粒重量为2-3比率混合的弱阴离子交换颗粒(例如Poly WAX LP^TM，得自PolyLC，Columbia，MD，USA)和强阳离子交换颗粒(例如PolySULFOETHYL Aspartamide^TM，得自PolyLC，Columbia，MD，USA)混合物的前置柱中。这种混合的阴离子-阳离子交换(ACE)静止相以浆液填充在熔融二氧化硅管材中并夹心在两个C18颗粒(例如Reprosil-Pur

C18-AQ，5μm颗粒大小，

孔径，得自Dr.Maisch，Germany)床长度之间。前置柱床的每个部分的长度是20mm，前置柱的内径是50μm。C18-ACE-C18夹心前置柱经修改的MicroTee管状元件连续连接至25μm ID的用3-μm C18颗粒(例如Reprosil-Pur

C18-AQ，3μm颗粒大小，

孔径，得自Dr.Maisch，Germany)致密填充的25cm长分析柱。所用流动相是流速为30μl/min乙腈+0.1-M乙酸，从100％A(水+0.1-M乙酸)至在A中的60％乙腈+0.1-M乙酸的平缓线性梯度。柱端头用金和碳涂覆，柱头压＞250巴。以1秒/扫描的扫描速率记录质谱，质量范围为300-1,500Da，质量分辨率至少为10,000FWHM(MS分析)。进行5个随后的注射、分析分离和MS分析循环，注射等份包含水的含有增加量的甲酸和二甲基亚砜(DMSO)的无盐洗脱溶剂，浓度分别为1nM，1μM，10mM，1M和2M，随后用上述乙腈+0.1-M乙酸的平缓线性梯度和质谱分析条件进行肽的分离和MS分析。

候选病原体相关的MHC II型配体的鉴别

为将病原体衍生的MHC II型配体与自身衍生的配体区分开，从MS谱中提取关键的质谱信息(由“质量值”和“强度值”定义)并用于MHC II型质谱解释算法，检索质谱双峰。为了明确地将质谱双峰归为候选病原体相关的MHC II型配体，5个标准必须满足：

(i)“轻”和“重”表位的单一同位素质量的质量差异(Δm)必须是“轻”表位质量的大约1.2％。这个相对质量差异基于蛋白质和肽中氮原子的平均天然发生率。每个氮原子质量增加1Da导致针对完整肽/蛋白质的1.2％的相对质量增量；

(ii)“轻”和“重”表位的电荷状态(z)必须相等；

(iii)“轻”和“重”表位的强度比必须是大约1；

(iv)“重”表位的质谱模式必须体现98原子％富集的¹⁵N-同位素的掺入，观测为[M^*-1]和[M^*-2]同位素峰(M^*代表含有¹⁵N-同位素均匀掺入的“重”表位的单一同位素质量)；

(v)计算的存在于候选表位中的氮原子数必须是整数。这个数可以通过“轻”和“重”表位的单一同位素质量的绝对质量差异(Δm)乘以这些表位的电荷状态(z)而计算。

图8(下图，右侧谱)示出当使用稳定同位素及满足上述标准时提取自抗原脉冲的MDDC的病原体相关的II型配体的模拟的同位素模式。候选病原体相关的MHC II型配体通过将模拟的同位素模式沿肽洗脱物的MS谱的质量轴数学移动而检索。选择匹配同位素簇用于进一步LCMS/MS分析。

免疫淋巴细胞

知情同意后获得来自Sanquin(Amsterdam)的健康血库供体的外周血(S03.0015-X)。通过在fycoll-hypaque(Pharmacia Biotech，Uppsala Sweden)上离心暗黄覆盖层细胞而分离外周血单个核细胞(PBMC)并新鲜使用或者冷冻保存直至用于实验。PBMC在完全培养基即补加2％人AB血清(Harlan，USA)的AIM-V培养基(GibcoBRL，USA)中培养。雌性spf Balb/c小鼠和C57black/6小鼠购自Harlan并在常规条件下保持。所有实验均经过The Animal Ethics Committee of the NVI批准。各组4只小鼠在第0天和第28天用含有在PBS中的rP1.7-2，4或rP1.5-2，10(1.5μg)的LpxL1佐剂化脂质体或者用如实验方法II所述制备的P1.7-2，4或P1.5-2，10OMV(1.5μg PorA/剂)皮下免疫。在第42天解剖后，通过机械解离器官通过70-μm孔径尼龙滤器获得单个脾细胞和淋巴结细胞悬液。脾细胞悬液中的红细胞用10mM KHCO₃，0.1mM EDTA在4℃裂解2分钟。脾细胞置于完全IMDM-10培养基中，即补加10％FCS(HyClone，USA)和pen/strep/glu(GibcoBRL，USA)的Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium(GibcoBRL，USA)。淋巴结细胞置于补加5％正常小鼠血清(Harlan，USA)和pen/strep/glu的完全IMDM-5培养基中。

PorA肽和蛋白质

如所述制备的具有12个氨基酸重叠的分别跨越整个P1.7-2，4和P1.5-2，10蛋白的重叠合成18聚体肽通过smart pooling集合成16个集合(A至H及1至8)，即由此每个合成肽在两个不同的8肽集合中表现。重组P1.7-2，4和P1.5-2，10蛋白(以下称为rP1.7-2，4和rP1.5-2，10)使用来自所提到的脑膜炎奈瑟氏球菌H44/76的等基因菌株的PorA基因通过现有技术已知的重组蛋白质表达技术获得。

增殖测定

对于P.69 Pertactin特异性人增殖测定，10⁵PBMC在不存在或者存在1或10μM相关肽条件下在完全培养基中以150μl/孔在37℃5％CO₂气氛下保温。对于PorA特异性人增殖测定，10⁵PBMC或2x10⁴MB71.5T细胞在不存在或者存在指示浓度的相关肽、肽集合或PorA rP1.7-2，4，P1.5-2，10，P1.7，16，P1.19，15或P1.22，14条件下在完全培养基中以150μl/孔在37℃5％CO₂气氛下保温。在第4天，取100-μl体积进行细胞因子测定。然后在收获细胞之前18小时将0.5μCi(18.5kBq)³H-胸苷(Amersham，USA)加入培养物中。CPM的确定和结果的计算如针对免疫脾细胞的增殖测定所述进行。结果表示为来自至少一式三份孔的SI±SD。区域4特异性T细胞系MB71.5通过在完整培养基中用0.5μg/ml rP1.5-2，1重复体外再刺激MB71 PBMC而产生。

对于小鼠增殖测定，来自P1.7-2，4或P.15-2，10免疫的Balb/c或C57Black/6小鼠的脾细胞在96孔圆底平板(Greiner)中在存在rPorA或18聚体寡肽或者仅培养基的条件下以1.5x10⁵细胞/150μl在IMDM-10中培养。在第4天，将0.5μCi(18.5kBq)³H-胸苷(Amersham，USA)加入孔中，细胞再培养18小时。收获细胞，³H-胸苷掺入用Wallac 1205β平板液体闪烁计数器确定为每分钟计数(CPM)。结果表示为来自一式三份孔的刺激指数(SI)±SD，计算为在抗原存在下培养物的CPM除以在仅培养基存在下培养物的CPM的商。

结果II：MHC II型ligandome

在基本培养基中的蛋白质表达及 ¹⁴ N和 ¹⁵ N同位素标记的效率

如实验方法II的方法D所述产生的¹⁴N-和¹⁵N-标记的全细胞百日咳博德特氏菌制备物的膜复合物中的细菌蛋白质经SDS-PAGE分离并用Western印迹分析。丝状血凝素(Filamentous Hemagglutinin)、P.69 Pertactin、百日咳毒素亚基1和4以及Fimbriae 2以相似比率在¹⁴N-和¹⁵N-标记的制备物中表达，提示在重同位素标记的培养基中的正常蛋白质表达。提取自¹⁴N-和¹⁵N-P.69 Pertactin条带的蛋白质的LCMS分析证实P.69 Pertactin蛋白的重形式相对于其轻形式的1.2％的质量增量。另外，得自¹⁴N-和¹⁵N-P.69 Pertactin的胰蛋白酶消化产物的MS/MS谱揭示典型的片段化为重和轻氨基酸，证实在遍及P.69 Pertactin蛋白的全序列上的成功的稳定同位素标记。

类似地，对如实验方法II的方法E所述的rP.69 Pertactin以及方法F所述的衍生自脑膜炎奈瑟氏球菌的OMV制备物也评价了蛋白质表达及¹⁴N-和¹⁵N-标记效率。对于rP.69 Pertactin和PorA制备物分别观测到了蛋白质完整性和遍及全蛋白的成功标记。

实验方法D中HLA-DR2-结合的百日咳博德特氏菌表位的鉴别

病原体相关的HLA-DR配体从如实验方法II所述用¹⁴N-和¹⁵N-标记的全细胞百日咳博德特氏菌制备物的1∶1(OD/OD)混合物脉冲的HLA-DR2纯合MDDC提取。用数学检索算法在LCMS谱中检索代表候选百日咳博德特氏菌MHC II型配体的质谱双峰。图13(上图)示出在m/z 788.94Da和797.42Da检测的匹配同位素簇的例子，代表含有17个氮原子的候选表位(图13，插图)。表位的MS/MS谱(图13，下图)揭示出部分序列，鉴别了衍生自百日咳博德特氏菌的推定周质蛋白(登录号CAE43606)的表位。6个其它谱双峰被测序，代表衍生自百日咳博德特氏菌的4个不同蛋白质的4个表位的长度变体(表4)。所述表位用内部标准半量化。

实验方法E中HLA-DR-结合的百日咳博德特氏菌rP.69 Pertactin表位的鉴别

病原体相关的HLA-DR配体从如实验方法II所述用¹⁴N-和¹⁵N-标记的rP.69 Pertactin的1∶1(OD/OD)混合物脉冲的HLA-DR杂合的MDDC的集合批次提取。用数学检索算法在LCMS谱中检索代表候选P.69 Pertactin MHC II型配体的质谱双峰。图14(上图)示出在m/z 770.43Da和780.39Da检测的匹配同位素簇的谱双峰的例子，代表含有20个氮原子的候选表位(图14，插图)。表位的MS/MS谱(图14，下图)揭示出P.69 Prn1(登录号AJ011091)的匹配肽序列LRDTNVTAVPASGAPA的b-型离子系列。总共5个谱双峰被测序，它们代表来自百日咳博德特氏菌P.69 Pertactin的2个表位区域的长度变体(表5)。所述表位用内部标准半量化。

通过用代表表位的合成标准物体外再刺激来自一组健康成年供体的PBMC，我们研究了所述两个百日咳博德特氏菌P.69 Pertactin表位区域在人中的免疫原性。对于包含ASTLWYAESNALSKRLG序列的第二个表位区域，在至少2个供体中观测到免疫识别(表5)，提示这个表位是功能性人表位。

实验方法F中HLA-DR1和2结合的脑膜炎奈瑟氏球菌表位的鉴别

病原体相关的HLA-DR配体从如实验方法II所述用标记的OMV制备物脉冲的4个MDDC批次提取，从而代表下述的HLA-DR等位基因和PorA血清亚型组合：HLA-DR1/P1.7-2，4，HLA-DR2/P1.7-2，4，HLA-DR1/P1.5-2，10，和HLA-DR2/P1.5-2，10。用数学检索算法在LCMS谱中检索代表衍生自P1.7-2，4或P1.5-2，10的候选MHC II型配体的质谱双峰。图15示出谱双峰的两个例子，在HLA-DR1/P1.7-2，4ligandome中，一对[MH₂]²⁺离子在m/z 1065.01Da和1076.47Da被检测到(图A)，在HLA-DR2/P1.5-2，10ligandome中，一对[MH₃]³⁺离子在m/z 701.01Da和708.67Da被检测到(图B)。这两个质谱双峰内的质量增量表示在每个候选表位中存在24个氮原子。在m/z 1065.01Da的[MH₂]²⁺离子和在m/z 701.01Da的[MH₃]³⁺离子的分别MS/MS测序揭示谱匹配PorA同系物表位SPDFSGFSGSVQFVPIQNSK(P1.7-2，4，图C)和SPEFSGFSGSVQFVPAQNSK(P1.5-2，10，图D)。在实验方法II方法F所述制备的4个ligandome中，总共38个谱双峰被鉴定为是来自脑膜炎奈瑟氏球菌PorA的8个表位区域的长度变体、血清亚型变体和/或HLA-DR等位基因特异性配体(表6)。用内部标准半量化所述表位。28个天然存在的表位是新的PorA HLA-DR配体，10个是早先描述的，定位于4个已知表位区域(区域1、3、7和8)。因此，公开了4个新的天然存在的PorA表位区域(区域2、4、5和6)，其中区域2已被报道刺激人CD4⁺T细胞(Wiertz et al.1992)。在所有4个研究的ligandome中，区域8表位是丰富表达的。HLA-DR1/P1.7-2，4ligandome中的质谱双峰的MS测序揭示这个表位区域的2个变体，代表总区域8ligandome的大约1％，含有IGNYTQINAASVG核心序列，但是C末端延长+114Da或+270Da，不与PorA中这个高度保守区域中的表位的天然C末端侧翼残基匹配(图16)。这些变体的¹⁴N-和¹⁵N-标记的对应物的及为此目的制备的合成标准物的LCMS特征揭示所述延长与应该产生自分子内剪接事件的分别具有氨基酸GG(或N)或者GGR(或NR)的核心序列的非正常型延长(non-orthodox elongation)匹配。MHC II型配体的剪接未有描述。作为MHC II型配体的PTM的这个首次证实的剪接是使用稳定同位素结合专门免疫学实验设计和LCMS的直接结果。因此，对于MHC II型配体的PTM现象的未知，与对于MHC I型配体一样，对我们有关T细胞表位的知识是一个现实的威胁，并且需要上述方法来解决。

作为如实验方法中的方法F所述获得的4个ligandome中的质谱双峰的全面LCMS分析的另一个结果，鉴别了24个额外的不是衍生自PorA蛋白的表位。总体上，所述表位代表来自与脑膜炎奈瑟氏球菌OMV制备物相关的13个不同蛋白质的18个表位(的长度变体)(表7)。这个发现揭示了作为潜在T细胞靶的表位区域及它们各自的前体蛋白质。

用在线2维平台LCMS技术进行MHC ligandome的高通量分析

为促进MHC ligandome的高通量分析，衍生自方法F中描述的OMV脉冲的MDDC批次的相同MHC II型肽样品的一半用于在线2维平台LCMS技术。除了早先用平台LCMS分析离线制备的方法F样品的SCX级分鉴别的表位之外，在线2-D应用以快速及节省样品方式获得19个额外的先前未鉴别的源自脑膜炎奈瑟氏球菌PorA和非PorA蛋白的肽表位(表8)。

MHC ligandome是免疫原性和保护作用的(共)相关物((co)correlates)

因此，这个类型的分析不仅揭示了抗原的潜在CD4T细胞表位区域的多样性，而且提供了对它们的相对丰度(其调节免疫原性和T细胞应答的质量和最终的PTM)的深入了解。重要的是，如本实施例所示，所述实验设置与同位素标记和专门LCMS技术一起促进了对病原体抗原变异和人HLA-DR多态性在T细胞免疫性中的作用的研究。多种已知脑膜炎奈瑟氏球菌PorA血清亚型的序列对比揭示微多态性在表6所述天然存在区域中的三个中发生(区域1、4和5)。我们用来自健康成年供体的PBMC和来自免疫Balb/c小鼠和C57black/6小鼠的脾细胞研究了新的微多态性区域4的功能作用。首先，我们询问通过分别用P1.7-2，4或P1.5-2，10重复体外再刺激来自各种供体的PBMC是否会产生分别特异于SPDFSGFSGSVQFVPIQNSK(P1.7-2，4变体，以下称为D/I)或者SPEFSGFSGSVQFVPAQNSK(P1.5-2，10变体，以下称为E/A)的T细胞系。从一个供体产生了一个特异性T细胞系(MB-71.5)，其识别用代表P1.5-2，10表位变体的重叠合成18聚体肽PEFSGFSGSVQFVPAQNS(代码S011-24)和SGSVQFVPAQNSKSAYTP(代码S011-25)而非代表P1.7-2，4对应物的重叠合成18聚体肽PDFSGFSGSVQFVPIQNS(代码S004-29)和SGSVQFVPIQNSKSAYTP(代码S004-30)脉冲的自体抗原呈递细胞(图17A)。当用经P1.5-2，10蛋白脉冲的自体抗原呈递细胞刺激时，MB-71.5 T细胞也增殖(图17B)或者产生细胞因子(未示出)。从5种其它PorA变体，仅P1.5-1，2-2(E/A)和P1.22，14(D/A)变体再刺激MB-71.5 T细胞，而P1.7-2，4(D/I)，P1.7，16(E/I)或P1.19，15(D/I)不能，表明天然加工的“区域4”表位的C-末端半部分中的丙氨酸(A)残基对于T细胞识别是关键的。另外，在任何所测试个体(n＝5)中未能检测到D/I或A/I特异性T细胞。在临床前动物研究中，我们有类似观测：来自用P1.5-1，2-2(一种类似于P1.5-2，10的E/A‘区域4’变体)免疫的Balb/c小鼠的脾细胞应答P1.5-2，10‘区域4’肽S011-24和S011-25，但不应答P1.7-2，4特异性区域4变体S004-29和S004-30(数据未示出)。用P1.7-2，4免疫的小鼠不产生针对区域4的(可测量的)T细胞应答(表9)。另外，衍生自用P1.5-2，10免疫的Balb/c小鼠的T细胞杂交瘤在6种野生型PorA变体存在下具有与人MB-71.5 T细胞相同的反应模式(数据未示出)。另外在C57black/6小鼠中，P1.7-2，4未能诱导针对“区域4”的(可测量的)T细胞应答，而P1.5-1，2-2‘区域4’是免疫原性的。两种PorA同样能引起抗由专门LCMS技术鉴别的另一个表位区域“区域6”的T细胞应答，说明P1.7-2，4不是完全不能作为T细胞抗原(表9)。P1.7-2，4在人中及在小鼠中诱导杀细菌抗体的能力差(参考文献15和16)是疫苗开发中的一个问题。在Balb/c小鼠中，抗“区域4”脾细胞增殖幅度在个体小鼠中与抗P1.5-1，2-2的杀细菌效价水平相关(R＝0,78)。总之，这些免疫原性数据表明“区域4”是PorA的重要功能性T细胞表位。

讨论：MHC I型和II型ligandome

第一次，如平台LCMS技术代表的新组合方法导致改良的LCMS装置，使得可以对以前用标准LCMS技术仅产生有限数目表位的MHC I型和II型肽样品进行表位挖掘。另外，通过平台技术确定了特异性表位特征如长度和长度变化、丰度和PTM。

与使用相关免疫学实验设计和同位素标记一起，平台LCMS技术能够无疑义地以空前高水平的精确度和灵敏性鉴别病原体相关的MHC I型和II型ligandome。

平台LCMS技术与先前使用的(标准)LCMS方法在MHC I型和II型ligandome分析方面通过允许更低的流速、更高的柱头压以及组合所需的更长和更可靠的液体喷射方法而区分。总之，这增强了在MS/MS循环时离子的强度和停留时间，因此增强了LCMS/MS的鉴别性能到达这样的水平，即优势和次优势肽种类可以被可靠地鉴定。

表1：MV感染WH细胞后用标准LCMS鉴别病毒HLA-A2相关表位

^a数值代表每个细胞各个肽的拷贝数

表2：用平台LCMS对肽样品中病毒MHC I类相关表位的表位挖掘

^a对于MV表位，与鉴别的表位相邻的残基在括号中给出。因此，这些残基不是鉴别的表位的一部分。

^b数值代表相对丰度，总计相对丰度是100％。

^c表位的细胞来源

^dSEQ ID NR 7-49是HLA-A*0201相关配体，SEQ ID NR 50-51是HLA-B*0701相关配体。

#使用标准LCMS也可检测的MV表位

##先前描述为小鼠CTL表位的表位(Neumeister et al.1998).

###具有PTM的表位：星号(*)代表特定氨基酸残基的脱酰胺化，而磷酸化位点由“p”表示。

####先前描述为人CTL表位的表位(Nanan et al.1995).

表3：由流感病毒感染诱导的显著上调的MHC I类相关自身配体

表4：在全细菌细胞加工后鉴别的百日咳博德特氏菌衍生的HLA-DR2表位

^a为充分理解，与天然加工和呈递的表位相邻的残基在括号中给出。

^b数值代表每个细胞各个肽的拷贝数

^c登录号

表5：衍生自百日咳博德特氏菌P.69 Prn1的HLA-DR呈递的表位的鉴别

^a为充分理解，与天然加工和呈递的表位相邻的残基在括号中给出.

^b数值代表每个细胞各个肽的拷贝数.

^c由针对代表表位区域的合成肽的特异性体外增殖活性确定的免疫原性

^dnd未测定

表6：与HLA-DR相关的脑膜炎奈瑟氏球菌PorA衍生表位的天然展示

^aR：嵌套表位的PorA区域

^b为充分理解，与天然加工和呈递的表位相邻的残基在括号中给出，(-)代表蛋白质的N末端或C末端。在两个菌株之间的变化残基被标记出(粗体)。残基M_ox代表氧化的甲硫氨酸残基

^c数值代表每个细胞各个肽的拷贝数

表7：脑膜炎奈瑟氏球菌非PorA衍生的HLA-呈递的表位

^a为充分理解，与天然加工和呈递的表位相邻的残基在括号中给出，(-)代表蛋白质的N末端或C末端

^b数值代表每个细胞各个肽的拷贝数

^c登录号

表8：使用在线2维平台LCMS分析的灵敏性及高通量表位挖掘

^a在25％的衍生自OMV脉冲的HLA-DR*1501 MDDC的肽洗脱物中用在线二维版本的平台LCMS分析鉴别的来自P1.5-2，10和FrpB蛋白的额外表位，它们用来自50％的相同肽洗脱物的离线制备的SCX级分未被鉴别。最初鉴别的表位经肽挖掘证实。

^*氧化的甲硫氨酸

表9：Balb/c和C57black/6小鼠中免疫原性PorA表位区域的总结

	P1.7-2，4¹	P1.5-1，2-2¹
			Balb/c小鼠	-(无)²	区域4
C57black/6小鼠	区域6	区域4+区域6

¹各组动物如实验方法II所述用1.5μg所示的掺入到脂质体中的PorA或者OMV免疫。

²在小鼠株系中识别的PorA表位区域

参考文献

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Claims

1.一种分析样品的液相层析-质谱仪装置，其包含泵装置、分析柱、电喷射离子化单元以及质谱仪，其中所述泵装置被构造并设置成用于为分析柱提供纳级流，其中所述分析柱包含进行液相层析的静止相及其中所述分析柱具有低于70μm的内径，其中电喷射离子化单元包含在样品流路中位于所述分析柱下游的电喷射发射器，所述发射器内径低于70μm，其中所述质谱仪位于发射器的下游，其中所述发射器包含锥形末端以喷射样品，所述锥形末端具有传导性第一涂层以及保护性第二涂层。

2.权利要求1的液相层析-质谱仪装置，其中所述分析柱和发射器的内径低于55μm，优选内径为至多55μm。

3.权利要求1或2的液相层析-质谱仪装置，其中所述发射器与所述分析柱整体形成。

4.权利要求1-3任一项的液相层析-质谱仪装置，其中所述保护性第二涂层包含碳，优选传导性碳胶合物。

5.权利要求1-3任一项的液相层析-质谱仪装置，其中所述保护性第二涂层是硅合金或者导电聚合物。

6.权利要求1-5任一项的液相层析-质谱仪装置，其中发射器的锥形末端的内径低于20μm，优选低于10μm。

7.权利要求1-6任一项的液相层析-质谱仪装置，其中所述第一涂层是贵金属，如金。

8.权利要求1-7任一项的液相层析-质谱仪装置，其中所述发射器包含具有第一和第二涂层的熔融二氧化硅。

9.用于纳级流的发射器，其包含接受样品如从液相层析柱接受样品的上游末端以及电喷射样品的第二锥形末端，所述发射器是电喷射离子化单元的一部分，所述发射器由熔融二氧化硅形成，内径至多为55μm，其中发射器的锥形末端具有金传导性第一涂层和第二传导性碳基涂层。

10.权利要求9的发射器，其中所述发射器接近锥形末端的内径至多为10μm。

11.分析样品的液相层析-质谱仪装置，其包含泵装置、分析柱、电喷射离子化单元以及质谱仪，其中所述泵装置被构造并设置成用于为所述分析柱提供纳级流，其中所述分析柱包含进行液相层析的静止相及其中所述分析柱内径低于70μm，其中所述电喷射离子化单元包含在样品流路中位于所述分析柱下游的电喷射发射器，所述发射器内径低于70μm，其中所述质谱仪位于发射器的下游，所述液相层析-质谱仪装置包含至少二维层析，其中第一维包含至少强阳离子交换(SCX)，第二维包含反相层析，其中洗脱溶剂通常是无盐溶液。

12.权利要求11的液相层析-质谱仪装置，其中所述无盐溶液包含乙酸。

13.权利要求11或12的液相层析-质谱仪装置，其中所述无盐溶液包含甲酸。

14.分析样品的液相层析-质谱仪(LCMS)装置，其包含泵装置、分析柱、电喷射离子化单元和质谱仪，其中所述泵装置被构造并设置成用于为分析柱提供纳级流，其中所述分析柱由管状元件形成，所述管状元件具有内径低于70μm的腔，其中进行液相层析的静止相容纳在所述腔内，其中电喷射离子化单元包含在样品流路中位于所述分析柱下游的电喷射发射器，所述发射器内径低于70μm，其中质谱仪位于发射器下游，其中LCMS装置包含连接LCMS装置的至少两个管状元件的连接元件，所述管状元件具有外径和具有内径的腔，其中所述连接元件包含至少两个卡套和至少两个接纳腔以接受卡套，所述卡套具有具有适合接受管材部件的内径的内腔，并且在所述接纳空间中的两个卡套对准所述管状元件，其中所述连接元件包含连接和对准所述卡套内腔的内体积，所述内体积具有的内径适于接受所述管材部件的末端并且在连接状态下允许管材部件末端与所述内体积对接。

15.权利要求14或者权利要求1-13任一项组合权利要求7的液相层析-质谱仪装置，其中所述连接元件包含锁闭系统以锁闭接纳腔中的卡套。

16.权利要求14或15或者权利要求1-13任一项组合权利要求14的液相层析-质谱仪装置，其中内体积和卡套内腔的内径通常等于管材部件的外径。

17.权利要求14-16任一项或者权利要求1-13任一项组合权利要求14的液相层析-质谱仪装置，其中所述连接元件是三向连接元件。

18.权利要求17的液相层析-质谱仪装置，其中三向连接元件的第三个连接形成内体积的出口。

19.生产液相层析柱的方法，包括提供具有内径至多为55μm的内腔、长度为至少45cm的柱，在该柱的一端熔成玻璃料并将合适的液相层析固相材料填充在柱中，其中在填充期间振动所述柱。

20.生产液相层析柱的方法，包括提供具有内径至多为55μm的内腔、长度为至少45cm的柱，在该柱的一端熔成玻璃料并将合适的液相层析固相材料填充在柱中，其中所述液相层析固相材料是在低粘度溶剂中的浆液。

21.权利要求20的方法，其中所述低粘度溶剂是丙酮。

22.权利要求20或21的方法，其中所述低粘度溶剂的粘度至多为0.35cP。

23.权利要求19-22任一项的方法，其中所述内径至多为35μm。

24.权利要求19-23任一项的方法，其中所述柱是熔融二氧化硅柱。

25.权利要求1-8或者11-18任一项的装置在鉴别表位的方法中的应用。

26.鉴别表位的方法，其中所述方法包括如下步骤：

a)制备包含MHC I型和MHC II型表位至少之一的样品，其中所述表位已经被加工并由抗原呈递细胞呈递；及

b)在权利要求1-8或者11-18任一项的装置中分析在步骤a)中获得的样品以鉴定表位。

27.产生包含权利要求25或26中鉴别的表位的组合物的方法，其中所述方法包括化学合成及重组表达包含所述表位的分子中的至少一种。

28.通过权利要求25的应用或者权利要求26的方法可获得的表位。

29.权利要求25或26中所述的表位或者包含所述表位的组合物在生产预防和/或治疗由携带这个表位的病原体所致疾病的疫苗中的应用。

30.权利要求25或26中所述的表位或者包含所述表位的组合物在评估哺乳动物免疫状况中的应用。