-
Gebiet der Erfindung
-
Die
Anmeldung betrifft zellbasiertes, kinetisches Screening.
-
Hintergrund
der Erfindung
-
Kinetische
Assays werden durchgeführt,
indem Messungen bei einer Reihe von Zeitpunkten durchgeführt werden,
um die Veränderung
einer Probe zu messen. Die Messungen zu einem beliebigen Zeitpunkt könnten auch
für einen
nicht-kinetischen
Assay verwendet werden, welcher hier als ein Assay mit festem Endpunkt
bezeichnet wird. Assays mit festen Endpunkten sind für Proben
ausreichend, die wenig oder keine Veränderung über die Dauer des Assays erfahren.
Wenn sich die Probe über
die Zeit verändert,
werden kinetische Messungen notwendig, um diese Veränderungen
zu messen. Mathematische Beschreibungen der Trends der verschiedenen
Zellparameter über
die Zeit stellen kinetische Merkmale dar, die sich von den Messungen,
wie sie in Assays mit festem Endpunkt berechnet werden, unterscheiden.
-
Die
kinetischen Assays werden auf derselben Probe über die Zeit durchgeführt und
unterscheiden sich von den üblichen
Experimenten, welche eine Annäherung
der kinetischen Merkmale bei Assays mit festem Endpunkt auf unterschiedliche
Teile einer Probe durchführen.
Wenn z.B. die Probe eine Zellpopulation ist, die eine Anzahl von ähnlichen
individuellen Zellen umfasst, können
Veränderungen
bei der Population über
die Zeit gemessen werden, indem Teile der Probe mit einer Reihe
von Assays mit festem Endpunkt untersucht werden. Diese Verfahrensweise
wird üblicherweise
in biochemischen oder immunhistochemischen Assays verwendet, bei
denen die Proben während
des Assays unbrauchbar (d.h. fixiert) oder zerstört werden. Eine Reihe von Assays
mit festem Endpunkt führen
Messungen auf individuellen Zellen durch, aber die bestimmten individuellen
Zellen in jeder Population unterscheiden sich bei jedem Assay mit
festem Endpunkt und können nicht
auf der Zellebene miteinander in Relation gesetzt werden. Eine Reihe
von Assays mit festem Endpunkt liefern nur dann kinetische Informationen,
wenn vorausgesetzt wird, dass die durchschnittlichen Messungen der
Population von einem Teil zu einem anderen Teil der Probe in Relation
gesetzt werden und die individuellen Zellen in der Population als Äquivalent
vorausgesetzt werden.
-
Die
Verfahrensweise mit einem festen Endpunkt reicht nicht aus, wenn
die Zellen in der Probe nicht äquivalent
sind oder wenn die Veränderungen über die
Zeit auf einer Zell-zu-Zell-Basis in Relation gesetzt werden müssen. Messungen
von physiologisch relevanten Zellen sind heterogen, was die übliche Variabilität des Zellverhaltens
in einem lebenden Tier widerspiegelt. Die Heterogenität umfasst
oft wichtige Informationen über die
Physiologie von Zellen in deren Lebendzustand und biologisch relevante
Messungen müssen
die Variabilität
der Probe einschließen
und dürfen
diese nicht ausschließen.
Lebende Zellen, die sich unabhängig
voneinander verändern,
müssen
zu mehreren Zeiten gemessen werden und die Messungen müssen über die
Zeit auf einer Zell-zu-Zell-Basis korreliert werden.
-
Ein
richtiger kinetischer Assay behandelt Probleme, indem Messungen
von einzelnen Zellen über
die Zeit korreliert werden. Im Allgemeinen werden die Zellen anhand
ihrer Position und durch andere Kennzeichen identifiziert, um eine Kontinuität der biologischen
Messung auf Zellebene zu jeder Zeit sicherzustellen. Ein typisches
Problem, das überwunden
werden muss, ist die Unsicherheit bezüglich der Position der Zellen,
die auf die Bewegung der Zellen oder des Messinstruments zurückzuführen ist.
Die Fähigkeit,
Zellen über
die Zeit zu identifizieren, ermöglicht
es dem Benutzer die Variabilität
der Probe und das Verhalten der Subpopulation zu messen und zu bewerten.
Die Antwort einer ganzen Population einer Probe ist oft auf die
Aktivität
von lediglich einer Subpopulation von Zellen zurückzuführen. Eine genaue kinetische
Messung der Subpopulationen beinhaltet einen größeren Informationsgehalt bezüglich der
physiologischen oder pharmakologischen Antwort einer biologische
Probe. Zellbasierte kinetische Messungen ermöglichen auch mehrere Messungen
derselben Probe (multiparametrische Assays), welche auf der Zellebene
korreliert werden, zusammenhängende
Messungen von unterschiedlichen zellulären Funktionen und Mechanismen
und liefern daher ein besseres mechanistisches Verständnis von
Zellen und Arzneimitteln, welche diese beeinflussen.
-
Deshalb
werden Verfahren zum Verfolgen individueller Zellen während eines
kinetischen Zell-Screening-Asssays auf dem Gebiet benötigt.
-
Zusammenfassung
der Erfindung
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Software zum Verfolgen
individueller Zellen während eines
kinetischen Zell-Screening-Assays, umfassend:
- a)
Bereitstellen von Zellen, die mindestens ein erstes, mit Lumineszenz
markiertes Reportermolekül
besitzen, das von einer Zellstruktur berichtet;
- b) Erhalten eines Strukturabbilds von lumineszierenden Signalen
von dem mindestens ersten, mit Lumineszenz markierten Reportermolekül in den
Zellen in einem Bildfeld;
- c) Erstellen einer Strukturmaske für individuelle Zellen in dem
Bildfeld;
- d) Definieren eines Referenzpunkts von jeder Strukturmaske;
- e) Festsetzen einer Zellidentifikation zu dem jedem Referenzpunkt
in dem Bildfeld;
- f) Wiederholen der Schritte b) bis e) bei einem zweiten Zeitpunkt;
- g) Korrelieren der Zellidentifikation zwischen dem ersten Zeitpunkt
und dem zweiten Zeitpunkt durch Berechnen eines Abstands zwischen
den Referenzpunkten in dem Bildfeld bei dem ersten Zeitpunkt und
den Referenzpunkten in dem Bildfeld bei dem zweiten Zeitpunkt und
- h) Definieren einer Übereinstimmung
der Zellidentifikation durch Identifizieren von Referenzpunkten
in dem Bildfeld bei dem ersten Zeitpunkt und den Referenzpunkten
in dem Bildfeld bei dem zweiten Zeitpunkt, die am nächsten zusammen
sind.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
werden die Schritte f) bis h) mit einer gewünschten Anzahl von Zeitpunkten
wiederholt, wobei das Bestimmen des Abstands zwischen den Referenzpunkten
durch Bestimmen eines Abstands zwischen den Referenzpunkten in aufeinander
folgenden Zeitpunkten durchgeführt
wird und wobei das Definieren der nächsten Übereinstimmung der Zellidentifikation
durch Definieren der nächsten Übereinstimmung
der Zellidentifikation in aufeinander folgenden Zeitpunkten durchgeführt wird.
-
Weitere
bevorzugte Ausführungsformen
umfassen das Festlegen einer Qualitätskennzahl zu der Übereinstimmung
der Zellidentifikation, basierend auf einem Abstand, der für eine zweite
nächste Übereinstimmung
der Zellidentifikation bestimmt wurde, und wobei eine Übereinstimmung
der Zellidentifikation abgewiesen wird, wenn die Qualitätskennzahl
unterhalb einer Benutzer-definierten Schwelle für eine Qualitätskennzahl ist.
-
Eine
weitere bevorzugte Ausführungsform
umfasst das Vergleichen weiterer Merkmale der individuellen Zellen
zwischen aufeinander folgenden Zeitpunkten, um eine Zellidentifikation
zu ermöglichen.
-
Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
-
1 zeigt
ein Flussdiagramm, das eine Ausführungsform
des Verfahrens zum Verfolgen individueller Zellen während eines
kinetischen Zell-Screening-Assays zeigt.
-
Detaillierte
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
-
In
kinetischen Assays können
sich die Zellen umherbewegen, in das Feld eintreten oder es verlassen, wachsen,
schrumpfen oder sich teilen; einzelne Zellen können sich ineinander bewegen
oder den Kontakt untereinander lösen.
Bei der Bestimmung von Merkmalen von individuellen Zellen über die
Zeit ist es bevorzugt, eine korrekte Identifikation von individuellen
Zellen von Zeitpunkt zu Zeitpunkt zu optimieren. Damit wird nach dem
Sammeln der Daten für
einen gegenwärtigen
Zeitpunkt eine zweite Zellidentifikation gegen eine Zellidentifikation,
die für
den ersten Zeitpunkt in dem kinetischen Scan für die Vertiefung erhalten wurde,
abgeglichen. Dies stellt sicher, dass die kinetischen Daten mit
der richtigen Zelle für
alle Zeitpunkte des kinetischen Scans korreliert werden. Nach dem
Erhalten der Daten bezüglich
der Zelle, des Felds, der Vertiefung und der Plattenebene für den aktuellen
Zeitpunkt werden die kinetischen Daten mit beliebigen früheren kinetischen
Daten integriert, um die kinetischen Merkmale für die individuellen Zellen
zu bilden, aus denen die dazugehörigen Feld-basierten,
Vertiefungs-basierten und/oder Platten-basierten kinetischen Merkmale
für einen
beliebigen erwünschten
Zell-Screening-Assay abgeleitet werden können.
-
Verfahren
zum Abstimmen einer Zellidentifikation über verschiedene Zeitpunkte
sind hilfreich, um sicherzustellen, dass jede vorhandene Zelle dieselbe
Identifikation von Bild zu Bild in der Bilderserie aufweist.
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Software zum Verfolgen
individueller Zellen während eines
kinetischen Zell-Screening-Assays, umfassend:
- a)
Bereitstellen von Zellen, die mindestens ein erstes, mit Lumineszenz
markiertes Reportermolekül
besitzen, das von einer Zellstruktur berichtet;
- b) Erhalten eines Strukturabbilds von lumineszierenden Signalen
von dem mindestens ersten, mit Lumineszenz markierten Reportermolekül in den
Zellen in einem Bildfeld;
- c) Erstellen einer Strukturmaske für individuelle Zellen in dem
Bildfeld;
- d) Definieren eines Referenzpunkts von jeder Strukturmaske;
- e) Festsetzen einer Zellidentifikation zu jedem Referenzpunkt
in dem Bildfeld;
- f) Wiederholen der Schritte b) bis e) bei einem zweiten Zeitpunkt;
- g) Korrelieren der Zellidentifikation zwischen dem ersten Zeitpunkt
und dem zweiten Zeitpunkt durch Berechnen eines Abstands zwischen
den Referenzpunkten in dem Bildfeld bei dem ersten Zeitpunkt und
den Referenzpunkten in dem Bildfeld bei dem zweiten Zeitpunkt und
- h) Definieren einer Übereinstimmung
der Zellidentifikation durch Identifizieren von Referenzpunkten
in dem Bildfeld bei dem ersten Zeitpunkt und den Referenzpunkten
in dem Bildfeld bei dem zweiten Zeitpunkt, die am nächsten zusammen
sind.
-
Wie
hier verwendet, bezeichnet der Ausruck „Abbild" eine digitale Darstellung der optisch
detektierbaren Signale von dem mindestens ersten, optisch detektierbaren
Reportermolekül
und benötigt
keine spezifische Anordnung oder Anzeige der digitalen Darstellung.
Abbilder sind paketweise Informationen, die sich von der Probe ableiten
und die auf verschiedene Arten entsprechend dem Bedarf des Beobachters
organisiert sind. In bevorzugten Ausführungsformen werden gut bekannte
Formate von solchen „Abbildern" eingesetzt, einschließlich, aber
nicht beschränkt
auf DIB, TIFF, BMP, Bildelement-(Pixel)-Maps, dreidimensionale Raumanordnungen,
zweidimensionale Oberflächen-
oder Querschnittsanordnungen, eindimensionale Abbildungen eines
Linien-Scans, Zeitspuren eines Oszilloskops, rechtwinklige Anordnungen
von ganzen Zahlen, Angaben über
die Pixelintensität,
hexagonale Gitter von ganzen Zahlen, Gleitpunkt-Pixel und planare,
kompakte oder Bayer-Muster-Anordnungen von multispektralen Pixel-Anordnungen.
In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform werden Bildelement-(Pixel)-Feldabbildungen
verwendet, z. B. solche, die durch optische Kameras erzeugt werden,
wo eine räumliche
Lokalisierung in einer Ebene (X, Y) innerhalb der Probe durch eine räumliche
Lokalisierung innerhalb des Feldes (x, y) dargestellt wird und die
lumineszierende Probenintensität (I)
wird durch die Signal-Amplitude oder -Wert (i) bei jedem Pixel dargestellt.
-
Das
Bildfeld (FOV) stellt die abgebildete Fläche dar. Sie ist äquivalent
zur Bildgröße. Die
Abmessung des Bildfelds kann entweder in Mikrometer auf der Skala
der Probenfläche
oder in Pixel der Bildgröße ausgedrückt werden.
Die Fläche
der Zellprobe ist im Allgemeinen größer als das Bildfeld und entspricht
in etwa dem eines Mediums oder eines hochauflösenden Abbilds einer Platte
mit 96 oder 384 Vertiefungen.
-
Wie
hier verwendet, bezeichnet ein „optisch detektierbares Reportermolekül" ein Reportermolekül, das Licht
emittieren, reflektieren oder absorbieren kann und umfasst, ist
aber nicht beschränkt
auf fluoreszierende, lumineszierende und chemilumineszierende Reportermoleküle. In einer
bevorzugten Ausführungsform wird
ein fluoreszierendes Reportermolekül verwendet.
-
Die
Zellstruktur, über
die durch das optisch detektierbare Reportermolekül berichtet
wird, kann eine beliebige detektierbare Zellstruktur sein, einschließlich Zellkerne,
intrazelluläre
Organellen, zytosolische Marker und Plasmamembran-Marker. Im einfachsten
Fall liegt die Zellstruktur als eine einzelne Einheit in der Zelle vor,
wie z.B. der Zellkern.
-
Wie
hier verwendet, „berichtet" das Reportermolekül über die
Zellstruktur durch Prozesse, welche entweder die direkte oder indirekte
Bindung an die Zellstruktur einschließen, aber nicht darauf beschränkt sind, und
indem es in die Zellstruktur eingeschlossen oder darin enthalten
ist.
-
Wie
hier verwendet, bezeichnet der „Referenzpunkt" einen einzelnen
Punkt, der relativ zu der Zellstruktur definiert ist, einschließlich, aber
nicht beschränkt
auf ein Zentrum der Zellstruktur, ein Zentrum der Masse der Zellstruktur,
der Schwerpunkt (definiert als ein geometrisches Zentrum) der Zellstruktur
oder durch Zeichnen eines Rahmens um die Zellstruktur, wobei der
Punkt z. B. definiert sein kann als Durchschnitt von beliebigen
zwei Diagonalen innerhalb des Rahmens. In einer bevorzugten Ausführungsform
wird der Schwerpunkt der Zellstruktur verwendet.
-
Die
Bilder werden von dem mindestens ersten optisch detektierbaren Reportermolekül gesammelt
und die Bilder können
gegebenenfalls vorbearbeitet sein (Kontrast-korrigiert und geglättet). Für die Bilder
wird dann eine Schwelle gesetzt (bevorzugt unter Verwendung eines
automatischen Schwellenwertverfahrens), um eine Strukturmaske zu
erstellen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Zellstruktur
ein Zellkern, wobei das Strukturabbild ein nukleäres Abbild ist und wobei die
Strukturmaske eine nukleäre
Maske ist. Wie hier verwendet, bezeichnet der Ausdruck „Maske" eine verarbeitete
Version des Abbilds der Zellstruktur, um Löcher zu Pillen. Die Erzeugung
einer Maske umfasst bevorzugt das Setzen eines Schwellenwertes für das Abbild,
um relevante Bildbestandteile mit Werten (Position, Intensität) über den
Background außerhalb
der Strukturen von Interesse auszuwählen.
-
Wie
hier verwendet, werden die folgenden Begriffe wie unten definiert:
-
Eine
Zelle, welche sich vollständig
innerhalb des Bildfeldes befindet („FOV; Field of View") wird als eine „FOV-Zelle" bezeichnet. Das
sind die Zellen, welche analysiert werden können.
-
Eine
Zelle, welche sich vollständig
außerhalb
des Bildfeldes befindet, wird als eine „Nicht-FOV-Zelle" bezeichnet. Diese
Zellen werden nicht analysiert.
-
Eine
Randzelle bezeichnet eine Zelle, welche den Rand des Bildfeldes
berührt.
Die meisten Merkmalsmessungen dieser Zellen würden unvollständig oder
fehlerhaft sein und deshalb werden randständige Zellen vorzugsweise nicht
gezählt.
Jedoch kann eine Randzelle als ein Zwischenstadium angesehen werden,
welches, wenn erwünscht,
verfolgt werden kann.
-
Ein
Austreten ist definiert als eine Zelle, die in ihrer Gesamtheit
den Bildbereich von einer beliebigen Richtung verlässt. Die
Zelle muss vollständig
außerhalb
des Bildbereichs sein, um als ausgetreten angesehen zu werden.
-
Zellen,
die in Bewegung sind, können
jederzeit in den Bildbereich ein- und austreten. Ein Eintreten ist definiert
als eine Zelle, die in ihrer Gesamtheit von einer beliebigen Richtung
in den Bildbereich eintritt. Die Zelle muss sich vollständig innerhalb
des Bildbereiches befinden, um als eingetreten angesehen zu werden,
da sie ansonsten eine unvollständige
Randzelle darstellen würde,
die im Allgemeinen nicht analysiert wird.
-
Das
Eintreten und Austreten trägt
zur Komplexität
des Verfolgens bei, da sie eine komplexere Handhabung von den Zellen
benötigen,
welche im gesamten Verlauf des gesamten Films vorhanden sind. Wenn alle
Zellen zu allen Zeitpunkten vorhanden sind, würde diese Handhabung eine einfache
Anordnung sein, welche durch eine Analyse des ersten Zeitpunkts
bewerkstelligt werden kann. Wenn die Zellen zu bestimmten Zeitpunkten
nicht vorhanden sind, wird eine Analyse der vollständigen Bilderserie
benötigt,
um dessen Bestand und die aufwändigere
Datenverwaltung aufzubauen.
-
Ein
Erzeugungsereignis wird als eine Zelle definiert, die „aus dem
Blauen" irgendwo
in dem Bildfeld, nicht aber am Rand erscheint. Zum Beispiel kann
eine Zelle nicht genug Markierungsintensität aufweisen, um zuerst nachgewiesen
zu werden, aber während
des Verlaufs der Bilderserie eine Antwort zeigte und sichtbar wurde.
Wenn eine Zelle am Rand erscheint, würde dies ein Eintreten darstellen.
Ein Zerstörungsereignis
ist definiert als eine Zelle, die aus dem Bildbereich verschwindet,
sich aber nicht im Sinne eines Austretens herausbewegt. Zum Beispiel
kann eine Zelle absterben oder auf irgendeine Weise ihren Markierungsmarker
verlieren.
-
Es
gibt drei allgemeine Ausführungsformen
der Verfahren und Software zum Verfolgen individueller Zellen während eines
kinetischen erfindungsgemäßen Zell-Screening-Assays.
Jedes Verfahren stellt eine Alternative zu dem Grundverfahren dar,
wobei jedes eine zusätzlichere
Verbesserung bezüglich
der Rückweisung
von weniger Zellen und eine größere Robustheit
beinhaltet.
-
1. Einfaches Annäherungsverfahren
-
In
einer Ausführungsform
umfasst das Bestimmen einer Übereinstimmung
einer Zellidentifikation das Identifizieren von Referenzpunkten
in dem Bildfeld bei einem ersten Zeitpunkt und Referenzpunkten in
dem Bildfeld bei einem zweiten Zeitpunkt, welche am nächsten zusammen
sind, und das Festlegen der geeigneten Zellidentifikation auf die
Zelle des späteren
Zeitpunkts in der Bilderserie. Dies sollte dann erfolgreich sein, wenn
sich die meisten oder alle Zellen langsam bewegen (unter Berücksichtigung
der Bildfrequenz). Beliebige andere Daten, welche benötigt werden,
um den Vergleich bei aufeinander folgenden Zeitpunkten in der Bilderserie
durchzuführen,
werden gespeichert, einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf die Referenzpunkte von allen Zellen des unmittelbar davorliegenden
Zeitpunkts, und die Zell-ID, welche für jede dieser Zellen festgelegt worden
ist (ID-Zuordnungstabelle). In einer bevorzugten Ausführungsform
wird die Übereinstimmung
der Zellidentifikation zurückgewiesen,
wenn sie unterhalb einer benutzerdefinierten Schwelle für eine Übereinstimmung
der Zellidentifikation fällt.
Zum Beispiel kann der Benutzer eine maximale annehmbare Distanz
bestimmen, so dass sich die Zellen zwischen den Zeitpunkten bewegen
können
(d.h. eine maximale Bewegungsrate) oder es kann ein Schwellwert
gesetzt werden, um relevante Bildbestandteile mit Werten (Position,
Intensität) oberhalb
des Hintergrunds und außerhalb
der Strukturen von Interesse auszuwählen.
-
Die
aufeinander folgenden Sätze
von Referenzpunkten werden vorzugsweise wie folgt in Übereinstimmung
gebracht. Für
jede Zelle wird in dem aktuellen Satz der Abstand zu jedem Referenzpunkt
und dem unmittelbar davor liegenden Zeitpunkt bestimmt. Es werden
die zwei am nächsten
vorhergehenden Zellen bestimmt. Die am nächsten vorhergehende Zelle
wird als aktuelle Zelle festgelegt und eine Qualitätskennzahl (zwischen
0 und 10) wird der Übereinstimmung
zugeordnet, welche erhöht,
da sich der relative Abstand der zweitbesten Übereinstimmung sich erhöht. In einer
bevorzugten Ausführungsform
wird die Qualitätskennzahl gemäß der Formel
berechnet: Qualität = 100 * (zweitbester Abstand – bester
Abstand) / zweitbester Abstand
-
Diese
wird vorzugsweise verwendet, wenn die Strecken, in denen sich die
Zellen bewegen, kurz genug sind, damit es zu keiner Verwechslung
kommt, welche Zelle sich wohin bewegt. Der Grad der Übereinstimmung
wird berechnet, um dies abzuschätzen.
Der Grad der Übereinstimmung
beträgt
100%, wenn es keine Verwechslung gibt und 0%, wenn eine gleiche
Chance besteht, dass die Zelle eine Nachbarzelle hätte sein können. In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
wird eine Übereinstimmung
der Zellidentifikation zurückgewiesen,
wenn die Qualitätskennzahl
unterhalb einer benutzerdefinierten Schwelle für eine Qualitätskennzahl
ist. Die Schwelle auf verschiedene Arten definiert sein, wie jene,
die oben beschrieben sind, oder falls eine spezifische experimentelle Situation
für die
Zellen gegeben ist, kann der Benutzer die Wahrscheinlichkeit, dass
die Zellen entstehen oder zerstört
werden, vorhersagen und die angemessene Qualitätskennzahl für die Übereinstimmung
kann dementsprechend gesetzt werden. Zum Beispiel kann die Schwelle
für einen
annehmbaren Grad der Übereinstimmungszahl
niedriger gesetzt werden, wenn der Benutzer keine Entstehungs- und Zerstörungsereignisse
erwartet. Zellen/Artefakte werden von der Analyse ausgeschlossen,
wenn sie sich nicht einheitlich einer Zell-ID zuordnen lassen können.
-
2. Minimierung des Gesamtabstandes
-
Wenn
das einfache Annäherungsverfahren
in unklare Übereinstimmungen
resultiert (z.B. niedrige Qualitätskennzahlen
aufgrund von zwei gleich entfernten Zellen), kann genauso eine globale Übereinstimmung
durchgeführt
werden. Somit umfasst in einer weiteren Ausführungsform das Verfahren weiter
das Bestimmen einer Gesamtsumme aller Abstände oder Abstände im Quadrat
für alle
möglichen Übereinstimmungen
der Zellidentifikation in aufeinander folgenden Zeitpunkten, wobei
eine kleinste Gesamtsumme aller Abstände oder Abstände im Quadrat
als eine nächste
Gruppe von Übereinstimmungen
der Zell-Identifikation definiert ist.
-
Es
wird eine Matrix von Abständen
von jeder aktuellen und jeder vorhergehenden Zelle berechnet. Jede
mögliche
Permutation der Zellen [es gibt N! Permutationen] wird durch Summierung
der Abstände
(oder der Quadrate der Abstände)
für alle
ihre Paare berechnet, wobei die niedrigste Gesamtsumme die beste Übereinstimmung
der Zellidentifikation darstellt. In einer weiteren bevorzugten
Ausführungsform
kann der Berechnungsaufwand durch eine Vor-Paarung vermindert werden
(unter Verwendung des einfachen Annäherungsverfahrens) von beliebigen Übereinstimmungen
mit Qualitätskennzahlen,
die sich oberhalb einer vorher festgesetzten Schwelle befinden und
indem die Zellen in diesen Vorpaarungen von dem globalen Übereinstimmungsprozess
ausgeschlossen werden. Diese letzte Anpassung funktioniert sehr
gut, wenn die Zellen in der Bewegungshäufigkeit stark variieren. Alternativ
kann das Verfahren den Berechnungsaufwand verringern, indem die
Zellen bei der Vorpaarung von dem globalen Übereinstimmungsprozess ausgeschlossen
werden, die unterhalb einer benutzerdefinierten Schwelle liegen.
-
In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
umfassen die Verfahren weiter das Festsetzen einer Qualitätskennzahl
zu der Übereinstimmung
der Zellidentifikation, basierend auf einer Summe von Abständen oder
Abständen
im Quadrat, bestimmt für
eine zweite nächste Übereinstimmung
der Zellidentifikation und wobei eine Übereinstimmung der Zellidentifikation
abgewiesen wird, wenn die Qualitätskennzahl
niedriger als eine benutzerdefinierte Schwelle für eine Qualitätskennzahl
ist.
-
3. Minimierung des Gesamtabstandes
und Merkmalsübereinstimmung
-
In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
kann das Definieren der Zellidentifikation weiter das Vergleichen
anderer charakteristischer Merkmale der individuellen Zellen zwischen
aufeinander folgenden Zeitpunkten umfassen, um Zellen zu identifizieren
und die Messungen für
jede vorgeschlagene Übereinstimmung
zu vergleichen. Auf individuellen Zellen angewendet ist dies ein
Weg, um individuelle Unklarheiten effizient zu lösen. Als Teil eines komplizierteren
Verfahrens (z.B. als Nachfolge des Minimierungsverfahrens des Gesamtabstandes)
sind die Merkmalssätze
Bestandteil einer Matrix mit besseren Daten, die mit den Vektoren für den vorhergehenden
Zeitpunkt verglichen wird und minimiert die berücksichtigte Summe der Abstände (oder
Abstände
im Quadrat) als Messung der Übereinstimmung.
Die Matrix würde
dann besser als eine Konfusionsmatrix bezeichnet werden, in der
jede Position eine zusammengesetzte Anzahl darstellt, welche den Abstand
+ jeden anderen Wert der Zellmerkmalsübereinstimmung enthält.
-
Grad der Zellübereinstimmung
-
Im
Gegensatz zur Messung einer Qualitätskennzahl, die auf dem einfachen
Annäherungsverfahren basiert,
basiert eine Qualitätskennzahl
für das
Minimierungsverfahren des Gesamtabstandes und der Merkmalsübereinstimmung
weiter auf dem Übereinstimmungsgrad,
der auf ein oder mehrere einer beliebigen Anzahl von Zellmerkmalen
basiert, einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf a) tatsächlich
verfügbare
Merkmale der Zelle oder der subzellulären Strukturen, wie Fluoreszenzintensität, Zellfläche, Zellform,
etc. und/oder b) zusätzlich
erzeugte Merkmale der Zelle, wie exogene Tags (d.h. Tags, die mit
der Zelle verbunden sind, mit dem Ziel der Zellverfolgung), wie
z.B. „Strichcode-Markierungen" (unten diskutiert).
Der Algorithmus ist so entworfen, dass er mit einem beliebigen Satz
und mit einer beliebigen Anzahl von Merkmalen, welche sich bei unterschiedlichen
Assays, Zelltypen, etc. unterscheiden können, funktioniert.
-
Während die
Analyse der Zellmerkmale bei der Bestimmung einer Qualitätskennzahl
in das einfache Annäherungsverfahren
eingebaut werden kann (z.B. durchgeführt für mögliche zu analysierende Übereinstimmungen
der Zellidentifikation) ist es bevorzugt, Übereinstimmungen der Zellidentifikation über das
einfache Annäherungsverfahren „vorzupaaren" und eine Merkmalsanalyse
nur soweit notwendig bei jenen Übereinstimmungen
der Zellidentifikation durchzuführen,
die bei Verwendung des einfachen Annäherungsverfahrens unklar sind.
-
Da
die Zelle ihre Form und andere Zellmerkmale über die Zeit verändern kann,
ist die Qualitätskennzahl
niemals absolut vollständig.
Umgekehrt können
unterschiedliche Zellen ähnliche
Zellmerkmale besitzen und können
somit eine relativ hohe Punktzahl bei der Qualitätskennzahl erzielen. Jedes
Zellmerkmal kann einen unterschiedlichen Verteilungswert gegenüber der Übereinstimmungsaufgabe
haben. Zellmerkmale, die eine größere Variation
zwischen den Zellen aufweisen, wie eine Einheitsidentifizierung
(nukleäre
Struktur, Intensität
oder Position bezüglich
anderer Zellstrukturen, wie der perinukleäre Golgi-Apparat) sind vorzugsweise stärker gewichtet
als jene, die eine geringere Variation zwischen den Zellen aufweisen,
wie die Position des Referenzpunkts von ganzen Zellen im Vergleich
zu einem Referenzpunkt des Zellkerns. Diese bevorzugte Ausführungsform
umfasst dementsprechend einen Gewichtungsfaktor für jedes
Zellmerkmal um die Qualitätskennzahl
zu berechnen. In einer Ausführungsform
stellt ein Benutzer diese Gewichtungsfaktoren zur Verfügung. In
einer anderen Ausführungsform
wird der Gewichtungsfaktor von Lernsätzen und durch Anwendung einer
Bayes-Klassifizierung
oder einer anderen Technik berechnet.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird die Qualitätskennzahl
bestimmt, indem als erstes deren Reziprokwert berechnet wird, d.h.
der Abstand zwischen den Zellen. Diese „fehlende Übereinstimmung" (vorzugsweise gewichtet)
stellt die Summe der Abstände
zwischen den Zellmerkmalen dar. In einer bevorzugten Ausführungsform
wird die fehlende Übereinstimmung
(MisMatch) zwischen einer Zelle 1 und einer Zelle 2 wie folgt dargestellt:
MisMatch = Σ {Wa + DIFF(Fa1, Fa2)}wobei
| „a" | jedes
verwendete Zellmerkmal ist |
| Wa | der
Gewichtungsfaktor für
das Merkmal a ist |
| Fa1 | das
berechnete Merkmal a für
die Zelle 1 ist |
-
DIFF(Fa1 Fa2) die Differenzfunktion
zwischen einem Zellmerkmal a berechnet für eine Zelle 1 und einem Zellmerkmal
a berechnet für
eine Zelle 2 ist.
-
Die
DIFF()-Funktion kann z.B. definiert sein als: DIFF(x,
y) = ABS(x–y);
(wobei „ABS" die „absolute
Anzahl" bedeutet)oder DIFF(x, y) = (x – y) + (x – Y)
-
Das
Quadrat des Abstandes verhilft, die Funktion „steiler" zu machen.
-
Zum
Beispiel kann eines oder mehrere der folgenden Zellmerkmale festgesetzt
werden:
- a) Zellgröße
- b) durchschnittliche Zellfluoreszenzintensität und
- c) Zell-P2A oder Formfaktor
-
Für diese
Merkmale wird der Gewichtungsfaktor (Wa, Wb bzw. Wc) vorzugsweise
auf 1.0 gesetzt. Zum Beispiel kann die Gewichtung für jedes
Zellmerkmal durch Verwendung eines Gewichtungsfaktors, der ein Bruchteil
zwischen 0 und 1 ist, verringert werden, während die Gewichtung von jedem
Zellmerkmal unter Verwendung eines Gewichtungsfaktors, der größer als
1 ist, erhöht
wird. Die Anordnung der Gewichtungsfaktoren wird als ein Input des
Algorithmus' angegeben,
so dass er leicht, je nach Bedarf, angepasst werden kann.
-
Die
Qualitätskennzahl
stellt einfach den Reziprokwert der fehlenden Übereinstimmung (MisMatch) dar: Qualitätskennzahl
= 1/MisMatch
-
Für eine „vollständige Übereinstimmung" beträgt der MisMatch
null und damit wäre
die Qualitätskennzahl
unendlich hoch.
-
Mögliche Beschränkungen
der Qualitätskennzahl
-
In
einigen Fällen
können
die Zellen zu wenig gemustert sein, um unterscheidungskräftige Zellmerkmale
aus ihnen ableiten zu können.
Zum Beispiel können
sie alle ein kugelförmiges
Aussehen ohne eine Struktur haben. Eine Möglichkeit dieses Problem zu
vermindern ist es, so viel wie möglich
eindeutige Zellmerkmale zu untersuchen. Zum Beispiel können mehrere
Fluoreszenzkanäle
analysiert werden um weitere Zellmerkmale zu erzeugen, beispielsweise
durch das Markieren mehrerer Strukturen, wie den Zellkern und Golgi-Apparat. Im
Allgemeinen umfassen die erwünschten
Eigenschaften von Zellmerkmalen zum Identifizieren von Zellen die Unterscheidung
von benachbarten Zellen und Konstanz über die Zeit.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird ein „Strichcodierungs-" Schema ausgeführt, um
noch mehr den Zellen zugeordnete ausgeprägte Merkmale zu erhalten. Im
Allgemeinen umfassen die erwünschten
Eigenschaften von Strichcodierungsteilen zum Identifizieren von
Zellen die Unterscheidung untereinander, die Unterscheidung von
Zelle zu Zelle und eine Konstanz über die Zeit. Teile für „Strichcodierungs" -zellen sind als Mischformen
von variierender Intensität,
Farbe und Größe verfügbar (z.
B. fluoreszierende Kügelchen
von unterschiedlicher Größe und Intensität von Bangs
Labs oder Sätze
von multispektralen Quantenflecken, die innerhalb der Kügelchen
enthalten sind), so dass die meisten Zellen mit einem Teil oder
einem Satz von Teilen, welche eindeutige Merkmale aufweisen, assoziiert
sein können,
und dadurch zu den eindeutigen Zellmerkmalen gezählt werden können. Strichkodierungsteile
können
innerhalb der Zelle durch Zufallsverteilung an Zellen und natürliche Phagozytose
der Teilchen enthalten sein. Alternative Verfahren können eingesetzt
werden, um die Ausbeute von markierten Teilchen und die Einheitlichkeit
der Markierung zu erhöhen,
einschließlich
einer physikalischen Abbildung oder Injektion von Teilchen oder
durch Hinterlegen von Zellen in geordneten Reihen von Strichcodierungsteilen
die auf Substraten hinterlegt wurden um die Anzahl und Verteilung
der Teilchen, die an Zellen abgeliefert werden, zu kontrollieren.
Strichcodierungsteile müssen
nicht auf einer perfekten eins-zu-eins Basis mit den Zellen assoziiert
sein um für
eine Zellidentifikation wertvoll zu sein. Die hier beschriebenen
Verfahren sind fehlertolerant und eine unvollständige Strichcodierung trägt auch
zur Zellidentifikation bei, selbst wenn die Strichcodes nicht in
jeder Zelle enthalten sind oder wenn die Strichcodes manchmal innerhalb
des Bildes wiederholt werden. Strichcodeteile können sichtbar mit Zellen assoziiert
sein, z. B. durch deren Nähe
zu einem markierten Zellkern oder einer anderen Zellstruktur oder
indem sie innerhalb der Zellperipherie enthalten sind. In diesen
Fällen
werden die „Strichcodierungs-Merkmale" so wie jedes andere
Zellmerkmal in der oben genannten Gleichung der Qualitätskennzahl
behandelt. In bevorzugten Fällen
ist eine Verteilung, Eigentümlichkeit
und Universalität
der Strichcodierungsteile ausreichend und es werden keine unterstützenden
biologischen Strukturen benötigt
um Teilchen mit eindeutigen Zellen zu assoziieren. Wenn die Strichcodierungstechnik
eine sehr hohe Qualität
bezüglich
einer Mehrheit von Zellen, die eine eindeutige Strichcodierung enthalten,
aufweist, kann der Gewichtungsfaktor für das Zellmerkmal der Strichcodierung
sehr hoch sein was eine Markierung von endogenen Zellstrukturen überflüssig macht.
Ein weniger strenges Strichcodierungsschema ergibt einen niedrigeren Gewichtungsfaktor
und trägt
einfach zu einem Teil zum Prozess des Anpassens bei.
-
In
anderen Fällen
können
die Zellen ihre Form und Zellmerkmale während sie von Zeitpunkt zu
Zeitpunkt abgebildet werden so oft ändern, dass eine Identifikation
zu verschiedenen Zeitpunkten für
dieselbe Zelle schwierig ist. Dieses Problem wird durch ein ausreichend
oft wiederholtes Abtasten (erhöhte
Abtastrate) vermindert, um sicherzustellen, dass die Variabilität über die
Zeit geringer ist als die Variabilität zwischen den Zellen.
-
Die
Abtastrate bezeichnet die Anzahl der Bilderfassungen pro Minute.
Eine nicht ausreichende Abtastrate reduziert die Fähigkeit,
effektiv Zellen zu verfolgen oder schnelle zelluläre Ereignisse
zu messen. Eine zu hohe Abtastrate kann die Zellen aufgrund von
Phototoxizität
beschädigen.
Eine optimale Abtastrate wird daher von verschiedenen Faktoren abhängen, einschließlich Zellbewegung,
Zelldichte, dem zu analysierenden zellulären Ereignis und den Wahrscheinlichkeiten
des Eintretens (dem Bewegen in das Bildfeld), Austreten (dem Verlassen
des Bildfelds) und Kollisionen mit anderen Zellen. Zum Beispiel
können
sehr schnelle Calziumveränderungen
eine schnellere Abtastrate als es in den meisten Assays benötigt wird
erforderlich machen, um dem Anspruch an das Verfolgen gerecht zu
werden. Im Allgemeinen stellt eine optimale Abtastrate die Minimumrate
dar, welche benötigt
wird, um ein Signal mit einer beliebigen Präzision zu rekonstruieren (d.h.
die Nyquist-Abtastrate). Ein Weg, um diese Rate herauszufinden,
ist es, sich das Fourier-Spektrum des ursprünglichen Signals anzuschauen
und den Teil der häufigsten
Rate zu finden. Die Nyquist-Abtastrate entspricht dem Zweifachen
dieser Rate. Eine Abtastung unterhalb der Nyquist-Rate kann keine Rekonstruktion
der Teile mit höherer
Rate des Signals ermöglichen
und kann Artefakte, die auf einem Alias-Effekt beruhen, erzeugen.
-
Es
ist auch wünschenswert,
die „Ausbeute" des kinetischen
Assays zu optimieren. Die Ausbeute kann als absolute Zellzahl ausgedrückt werden,
welche freie Bahn haben (d.h. keine Kollisionen), oder als der Prozentsatz
dieser Zellen im Vergleich zu den Gesamtzellen. Die Wahrscheinlichkeit
einer freien Bahn ist die Wahrscheinlichkeit einer Zelle, nicht
an irgendwelchen Kollisionen beteiligt zu sein und während der
vollständigen
Bilderfassung nicht das Bildfeld zu betreten oder zu verlassen.
Diese Wahrscheinlichkeit wird geringer werden, je länger kinetische
Daten angefordert werden, da eine ausreichende Zellbewegung unter
Umständen alle
Zellen kollidieren oder aus dem Bildbereich bewegen lassen kann,
und sie ist abhängig
von der Zellbewegung und der Zelldichte.
-
Wenn
eine bestimmte Zelldichte (d.h. Anzahl von Zellen pro Quadratfläche) gegeben
ist, kann ein Benutzer den durchschnittlichen Abstand zwischen den
Zellen berechnen. Wenn ein Bildbereich eine extrem hohe Zelldichte
aufweist, hat er das Potential einer hohen Ausbeute, aber wahrscheinlich
werden alle Zellen innerhalb der ersten paar Bilderfassungen kollidieren
und so die Ausbeute auf null reduzieren. Somit ist es nützlich,
eine optimale Zelldichte zu bestimmen, um eine optimale Ausbeute
für einen
gegeben Satz von Zellverhaltensparametern zu erzeugen. Die optimale
Zelldichte wird basierend auf all den verschiedenen, hier diskutierten
Faktoren variieren und wird somit bevorzugt experimentell oder durch
Computer-Simulation bestimmt. Zum Beispiel wird die optimale experimentelle
Zelldichte von der zu messenden biologischen Funktion der Zellen
und von dem statistischen Fehler, der für eine Messung der Probe erwünscht ist,
abhängen.
-
Eine
optimale Zelldichte, die für
die biologischen Variablen berücksichtigt
wird, beträgt
zwischen 10 und 50% Konfluenz.
-
Der
durchschnittliche Abstand zwischen den Zellen muss eventuell in
Bezug auf die Zellkonfluenz (z.B. Prozentsatz von Zellen, welche
andere Zellen berühren)
oder Zellanhäufungen
korrigiert werden. Bei einer durchschnittlichen Schätzung der
Zellbewegungsgeschwindigkeit, können
wir die maximale Abtastrate so setzen werden, dass sie dem „Nyquist"-Kriterium genügt. Die
Geschwindigkeit der Zellbewegung wird vorzugsweise als eine pro
Zeitpunkt bei der Bilderfassung zurückgelegte durchschnittliche
Strecke ausgedrückt.
Eine Zellbewegung kann auch durch Definieren ihrer Geschwindigkeit
und das Beibehalten einer Richtung (direkte Bewegung) durch einen
Diffusionskoeffizienten (Brownian-Bewegung) und/oder durch Definieren
eines Affinitätsfaktors,
der die Wirkung von sich nahe befindlichen Zellen auf die Bewegung
einer Zelle widerspiegelt beschrieben werden.
-
Gleitender Durchschnitt
der Qualitätskennzahl
-
Die
Qualitätskennzahl
kann über
mehrere Zeitpunkte gemittelt werden und zu einem späteren Zeitpunkt
als eine durchschnittliche Qualitätskennzahl eingesetzt werden.
Dieser „gleitende
Durchschnitt" wird
Teil des Merkmalvektors, der für
jede Zelle zu jedem Zeitpunkt berechnet wird. Bei diesem Weg wird
er während der
Analyse von jeder Bilderfassung weiter gesetzt, ohne dass man die
gesamte Bilderfassungsreihe erfassen muss.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird dies zum Zeitpunkt t wie folgt definiert: Durchschnittliche
Qualitätskennzahlt = (1 – k) · durchschnittliche
Qualitätskennzahl
(t–1)
+ k · Qualitätskennzahlt,wobei
k eine Konstante ist, um den Gewichtungsfaktor dieses geometrischen
Mittels zu definieren. Der Wert von k kann experimentell durch Bereitstellung
der besten Annäherung
mit den tatsächlichen
Daten einer Probe, bei der eine Zellidentifikation vorbestimmt ist,
bestimmt werden. Die Wahl von k hängt von der Abtastrate relativ
zu der Menge der Veränderung
in den Zellen ab und von dem gewünschten
Ausmaß der
Abschwächung des
Merkmals über
die Zeit. Ein Wert von k in der Nähe von 1 wird eine geringe
oder keine Abschwächung durchmachen,
während
ein Wert in der Nähe
von null eine starke Abschwächung
durchmachen wird. Der Wert der durchschnittlichen Qualitätskennzahl
wird mit einem Wert gesetzt, der die Erwartung zu Beginn der Bilderfassungsreihe
widerspiegelt. Das Verfahren benötigt
keine Kontroll- oder tatsächliche
Daten, sondern es werden die Parameter, die verwendet werden, um
das Verfahren für eine
spezifische biologische Probe zu kalibrieren, vorzugsweise experimentell
von Kontrolldaten abgeleitet, welche mit der experimentellen Probe
bei den Messungen, die für
die Zellidentifikation verwendet werden, übereinstimmen. Zum Beispiel
können
Kontrollexperimente ausgeführt
werden, oder es kann eine vernünftige
Erwartung für
diesen Wert gegeben werden.
-
4. Verringerung der Konfusionsmatrix
-
Der
Rechenaufwand für
das Gesamtabstands- & Merkmalsübereinstimmungs-Minimierungsverfahren und
für eine
vollständige
Konfusionsmatrix kann ziemlich hoch sein und wird schnell mit der
Anzahl von Zellen größer. Daher
wird in einer bevorzugten Ausführungsform
primär
das berechnungsmäßig weniger
aufwändige einfache
Annäherungsverfahren
verwendet und nur diejenigen Übereinstimmungen
der Zellidentifikation, die unklar sind, werden, soweit notwendig,
einer Konfusionsmatrixanalyse unterworfen.
-
Die
Strategie sieht wie folgt aus:
- a) Versuch einer
Anpassung von Zellen basierend auf einer einfachen Annäherung
- b) Identifizierung von Problemfeldern, in denen eine einfache
Annäherung
nicht funktioniert
- c) Berechnung von Konfusionsmatrices für diese Felder – für einen
beschränkten
Satz von Zellen
- d) Lösen
der Konfusionsmatrices für
die Problemfelder Beispiele Bestimmen, wann das einfache Annäherungsverfahren
nicht ausreichend ist
-
Wie
in der zuvor beschriebenen Version beschrieben, können wir
zwei Beispiele in Erwägung
ziehen. Dann fahren wir mit der Strategie fort, um das richtige
Verfahren für
diese Tätigkeit
festzulegen.
-
1. Sehr einfacher Fall
-
Drei
Zellen (a, b und c), jede bewegt sich ein bißchen nach rechts und wird
dann zu A, B und C in dem nächsten
Zeitpunkt:
-
-
//Programm-Output ...
-
Test
1 ... 3 Zellen bewegen sich nach rechts
-
-
-
-
2. Der schwierigere Fall
-
Drei
Zellen, jede bewegt sich ein bißchen
nach rechts. Dies klingt ähnlich
wie in #1, aber nun macht die Annäherung der neuen Orte die Situation
verwirrend:
-
-
Diese
Situation ist beinahe dieselbe wie in dem einfachen Beispiel, aber
stellt ein Hauptverfolgungsproblem dar. Zum Beispiel: A und C sind
näher an
b als an a oder c. Unter Verwendung des einfachen Annäherungsverfahrens
werden die folgenden Ergebnisse enthalten:
a ist verloren,
b bewegte sich nach A oder C, B ist eine „neue Zelle" und c bewegte sich
nach A.
-
Diese
Situation benötigt
eine komplexere Annäherungsmatrix
und einen kompetitiven Übereinstimmungsteil
des Algorithmus, um eine beste globale Anpassung für alle beteiligten
Zellen hervorzubringen. Der Algorithmus kann dies verfolgen unter
Verwendung der Abstandsminimierungsfunktion des Algorithmus (siehe unten).
-
// Programmoutput ...
-
Test
4 ... 3 Zellen bewegen sich nach rechts, aber sind zu nah beisammen
für eine
einfache Übereinstimmung Vorhergehendes
Bild
Einfaches
Annäherungsverfahren
Fehlgeschlagenes
einfaches Annäherungsverfahren Nun
genauere Betrachtungsweise der Abstandsmatrix Abstandsmatrix
| Übereinstimmungspermutation | berechnete
Gewichtung des Gesamtabstands |
| 0 1
2 | |
| | |
| | |
| 0 1
2 | 20,00
+ 20,00 + 20,00 = 60,0 |
| 0 2
1 | 20,00
+ 5,00 + 40,31 = 65,31 |
| 1 0
2 | 45,00
+ 5,00 + 20,00 = 75,0 |
| 1 2
0 | 45,00
+ 5,00 + 15,81 = 65,81 |
| 2 1
0 | 25,50
+ 20,00 + 15,81 = 61,31 |
| 2
0 1 | 25,50
+ 5,00 40,31 = 75,81 |
Somit ist 0 1 2 die beste Annäherungssequenz
-
Gesamtabstandsminimierungsverfahren Neues
Bild
-
Wie konnten wir wissen,
ob wir es mit einem Beispiel 2 anstatt mit 1 zu tun haben?
-
Wenn
es eine Vielzahl von nahen Objekten in dem Feld gibt, könnte man
einfach annehmen, dass das einfache Annäherungsverfahren an dessen
Grenzen stößt.
-
Zweitens
könnten
Erzeugungs- und Zerstörungs-Ereignisse
das Vorkommen eines „Alias"-Effekts nahelegen.
Es könnte
schwierig sein, zwischen Erzeugungs- und Eintretungsereignissen zu unterscheiden, wenn
die Probenfrequenz zu niedrig ist, um eine genaue Bewertung vornehmen
zu können.
Bei einer niedrigen Probenfrequenz könnte eine Zelle, die plötzlich in
der Nähe
des Rands erscheint, eine Neubildung sein oder könnte sich einfach schnell als
ein Eintretungsereignis hineinbewegt haben. Dasselbe gilt für Zerstörungs- und Austretungsereignisse.
Es ist anzumerken, dass ein Eintreten auch vorkommen kann, wenn
eine Zelle den Bildbereich „von
oben" betritt. Dies
bedeutet, dass eine Zelle oberhalb der Feldtiefe fließt und in
dem Bildbereich landet. Die meisten beobachteten Erzeugungs- und
Zerstörungsereignisse
werden durch Artefakte verursacht, wie ein Fokus- oder ein Signal-zu-Hintergrund-Problem.
Wenn das Problem in einem nachfolgenden Zeitpunkt korrigiert wird,
wird dieselbe Zelle als ein Erzeugungsereignis auftauchen.
-
-
Die
einfache Schlussfolgerung würde
sein:
a ist zerstört,
b bewegt sich nach A und B ist eine Neuentstehung.
-
Zusätzlich zu
den Erzeugungs- und Zerstörungsanhaltspunkten
kann man einen Durchschnitts-Wert der zuletzt zurückgelegten
Strecke verwenden, um einen „Einflussbereich" zu definieren.
-
Zuletzt zurückgelegte
Strecke
-
Um
den Bewegungsgrad, der von einer individuellen Zelle erwartet wird
zu bestimmen, kann die zurückgelegte
Strecke von dem vorhergehenden Zeitpunkt aufgezeichnet werden. Obwohl
ein zurückliegendes Verhalten
keinen wirklichen Hinweis liefert, wie sich die Zelle im Verlauf
bewegen wird, ist dieser Hinweis besser als überhaupt kein Hinweis.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird dies zum Zeitpunkt t wie folgt definiert: Zuletzt
zurückgelegte
Strecke = SQRT (posx(t–2) – posx(t–1))2 + (posy(t–2) – posy(t–1))2)
-
Dieser
Wert muss mit einem Wert gesetzt werden, der zu Beginn des Bildaufzeichnungssatzes
die Erwartung widerspiegelt. Zum Beispiel können Kontrollexperimente ausgeführt werden
oder es kann eine angemessene Erwartung für diesen Wert gegeben werden.
-
Gleitender Durchschnitt
der zuletzt zurückgelegten
Strecke
-
Da
die Bewegung einer Zelle zu schwanken scheint, ist es bevorzugt,
ein paar Zeitpunkte zu mitteln statt einen einzelnen Zeitpunkt zu
verwenden. Somit umfasst eine weitere bevorzugte Ausführungsform
das Weiterführen
eines gleitenden Durchschnitts einer zurückgelegten Strecke zu jedem
neuen Zeitpunkt.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist dies zum Zeitpunkt t wie folgt definiert: Durchschnittliche
zuletzt zurückgelegte
Strecke t = (1 – k) · zuletzt
zurückgelegte
Strecle(t–1) +
k · zurückgelegte Strecke
-
Wobei
k konstant ist, um den Gewichtungsfaktor für dieses geometrische Mittel
zu definieren. Die Wahl von k hängt
von der Probenrate relativ zu der Menge der Veränderung der Zellen und von
dem gewünschten Abschwächungsgrad
des Merkmals über
die Zeit ab. Ein Wert von k in der Nähe von 1 bedeutet eine geringe oder
keine Abschwächung,
während
ein Wert in der Nähe
von null eine sehr hohe Abschwächung
bedeutet. Der durchschnittliche Wert der zuletzt zurückgelegten
Strecke muss mit einem Wert gesetzt werden, der eine Erwartung zum
Zeitpunkt des Bilderfassungssatzes widerspiegelt. Zum Beispiel können Kontrollexperimente durchgeführt werden
oder es kann eine angemessene Erwartung für diesen Wert gegeben sein.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst das Identifizieren von Zellen oder Gruppen von Zellen, welche
eine Analyse anhand der Konfusionsmatrix benötigen:
- 1.
Ermitteln der längsten
durchschnittlichen Strecke der letzten Bewegung aller Zellen in
diesem Feld. Dies ist ein guter Hinweis bezüglich der Beweglichkeit dieser
Zellen. Diese Anzahl kann mit einem Sicherheitsfaktor multipliziert
werden, z.B. mit 1,3, um z.B. eine 30% höhere Beweglichkeit als zuvor
beobachtet, gewährleisten.
Der einzige Aufwand, diese Zahl zu erhöhen, ist die Berechnungszeit.
- 2. Berechnen eines Einflussbereichs unter Verwendung dieser
erhöhten
durchschnittlichen Zahl der zuletzt zurückgelegten Strecke für jede Zelle.
Die Absicht ist es, einen genügend
großen
Bereich zu erzeugen, um sicherzustellen, dass keine falsche Neuerscheinungs-
und Zerstörungsereignisse
erzeugt werden. Jedoch ist dieser Bereich klein genug (d.h. vorzugsweise
10 Zellen oder weniger), so dass die Konfusionsmatrix von allen
Zellen innerhalb des Einflussbereichs nicht so groß wird,
dass sie rechenmäßig zu aufwändig wird.
- 3. Verschmelzen von Bereichen durch Ausweitung bei Überlappung.
Wenn z.B. zwei räumlich
getrennte Haufen von Zellen sich nur eine Zelle teilen, welche nahe
genug ist, um Teil eines solchen Haufens zu sein, müssen nur
diese Haufen in eine verschmolzen werden.
- 4. Die Bereiche resultieren in Gruppen von Zellen, welche „etwas
miteinander zu tun haben können". Sie stellen nicht
mehr wirkliche Bereiche zu dieser Zeit dar, sondern lediglich eine
Liste von Zell-ID. Wenn sich zu einer Zeit mehr als ein Objekt in
einem Bereich befindet, kann davon ausgegangen werden, dass das einfache
Annäherungsverfahren
nicht angemessen ist und dass die komplexeren Übereinstimmungsverfahren eingesetzt
werden.
-
Konfusionsmatrix
-
Wenn
der vorherige Schritt den Bedarf einer komplexen Übereinstimmung
notwendig macht, kann eine Konfusionsmatrix berechnet werden. In
einer Ausführungsform
wird die Konfusionsmatrix mit kleinen Gruppen von Zellen durchgeführt, vorzugsweise
weniger als 20 Zellen und bevorzugter 15 Zellen oder weniger.
-
Zum
Beispiel wird ein wie unten beschriebener Vektor erzeugt, wenn drei
Zellen in der Gruppe vorhanden sind:
wobei MM
1,2 der
MisMatch der Zelle 1 im Vergleich zur Zelle 2 ist, etc. Der berechnete
Abstand zwischen den Zellen kann zu den MM-Matrixelementen an diesem
Punkt hinzugefügt
werden und in derselben Berechnung als ein weiteres Übereinstimmungsmerkmal
verwendet werden.
-
Tatsächliche Eintretungs-/Austretungs-
und Neubildungs-/Zerstörungs-Ereignisse
-
Bei
Verwendung der oben genannten Matrix wird immer eine Übereinstimmung
erzeugt werden, selbst wenn es Eintretungs-/Austretungs- und Neubildungs/Zerstörungs-Ereignisse
gibt.
-
Es
ist bevorzugt, dass es eine Grenze gibt, bei der eine Übereinstimmung
zurückgewiesen
wird und bei der bei diesem Punkt ein Neubildungs- und/oder ein
Zerstörungsereignis
vorliegt. Die durchschnittliche Qualitätskennzahl kann für diesen
Zweck verwendet werden. Diese Zahl kann durch einen Bewilligungsfaktor multipliziert
werden, um einen Schwellenwert hervorzubringen. Der „Bewilligungsfaktor" wird vorzugsweise
ermittelt durch den Abgleich der Wahrscheinlichkeit eines Neubildungs-/Zerstörungsereignisses
mit der Performance der Verfolgungspräzision. Die Schwelle kann auch
extern gesetzt werden, wenn ausreichende Lern-Datensätze, von
spezifischen für
die Zelltypen und -assays, erzeugt worden sind, mit denen eine geeignete
Schwelle etabliert wird.
-
Reduktion der
Konfusionsmatrix
-
Es
kann schwierig werden, die Konfusionsmatrix zu lösen, wenn die Zahl von Zellen
in einem Konfusionshaufen größer als
ungefähr
10–20
Zellen beträgt.
Die Anzahl der Permutationen, die ermittelt werden müssen, ist
proportional zur Fakultät
der Anzahl von Zellen in dem Haufen. Dies kann vermieden werden, indem
der maximale angemessene Abstand zwischen den Zellen niedrig genug
gesetzt wird und durch Verwendung einer zur Herstellung geeigneten
Probenrate basierend auf vorhergehenden Testdaten und dem Festsetzen
neuer Standards und Assay-Parameter. Die Verwendung dieses „Matrixreduktionsverfahrens" ermöglicht den
Umgang mit größeren Konfusionsmatrizes
von z.B. 20–40
Zellen bei einem Bruchteil der Berechnungszeit.
-
Alternativ
kann die Effizienz des Lösens
der Konfusionsmatrix erhöht
werden unter Verwendung der Abstandsmatrix, um die Konfusionsmatrixelemente „vorzumustern". Dieses Verfahren
beinhaltet das Ausschließen
von Übereinstimmungen
der Zellidentifikation mit einer Qualitätskennzahl bei oder oberhalb
einer benutzerdefinierten Schwelle für Qualitätskennzahlen (wie bestimmt
durch die Abstandsmatrix) von der Konfusionsmatrix.
-
Die
hier beschriebenen Zellverfolgungsverfahren liefern Informationen
bezüglich
der Kontinuität
der Zellidentifikation von Zeitpunkt zu Zeitpunkt in einem kinetischen
Zell-Screening-Assay. Um die Informationen in einen Zell-Screening-Assay(s) zu integrieren,
werden die Ergebnisse von den Zellverfolgungsverfahren bevorzugt
verwaltet, so dass Zell- und Vertiefungsmerkmale, und kinetische
Output-Merkmale mit den richtigen Zellen assoziiert werden können. Das
Beziehen von Output-Merkmalen eines Assays auf die Zellübereinstimmung
benötigt
eine zusätzliche
Datenverwaltung. Die optimale Berechnung von kinetischen Merkmalen (Zell-basierend
oder Vertiefungs-basierend) hängt
von einem Zelldaten-Verwaltungsalgorithmus (1) ab, der
in Verbindung mit dem Zellverfolgungsmodul arbeitet. Die Datenverwaltung
dient drei wichtigen Zwecken: (1) um die Liste der Output-Merkmale
und der Zell-ID untereinander dynamisch in Beziehung zu setzen;
(2) um eine Modifikation der Output-Daten eines Assays durch die
Ergebnisse der Zellverfolgung zu ermöglichen; (3) um das richtige
Sortieren der Datensätze,
die von mehreren Bildern gewonnen wurden, zu ermöglichen. Zum Beispiel können Assay-Daten
für ungültige Zellen ausgeschlossen
werden. Zellen können
als ungültig markiert
werden, wenn sie z.B. bei einigen Zeitpunkten vorhanden und bei
anderen Zeitpunkten nicht vorhanden sind.
-
Zu
jedem Zeitpunkt müssen
die Zelldaten entsprechend der aktuellen Zell-ID (kinetische Zell-ID)
neu angeordnet werden, so dass die kinetischen Zelldaten berechnet
werden können.
Dann müssen
die kinetischen Daten mit der Zell-ID für die zu berechnenden Vertiefungsstatistiken
wieder neu abgeglichen werden. Statistiken können von allen Zellen in einer
Vertiefung oder nur von zu Ende verfolgten Zellen, in Abhängigkeit von
den Bedürfnissen
des Benutzers erzeugt werden. Der Algorithmus der Datenverwaltung
beinhaltet die Verfolgung von allen neu identifizierten Zellen (bei
jedem aktuellen Zeitpunkt) und ermöglicht damit dem Benutzer das
Zeitintervall (Startzeitpunkt und Endzeitpunkt), in dem jede Zelle
verfolgt worden ist, zu bestimmen. Dies wiederum macht es möglich, die
Zellen zu markieren, welche die ganze Zeit vollständig von
dem Beginn des Experiments bis zu dessen Ende verfolgt worden sind.
Die Fähigkeit,
die Zellen auszuwählen,
die bestimmte Zell-ID-Kriterien erfüllen, ist für die Erstellung von optimalen
kinetischen Daten auf der Zellebene äußerst wertvoll. Während die
durchschnittlichen Daten einer Population minimal durch den Verlust
oder den Gewinn von ein paar Zellen beeinflusst sein können, können die
kinetischen Daten auf der Zellebene dramatisch durch eine Falschidentifikation
beeinflusst werden oder durch Zellen, die während des gesamten Experiments
nicht nachweisbar sind. In einem weiteren Aspekt umfasst die vorliegende
Erfindung ein Computer-lesbares Speichermedium, umfassend ein Programm,
das einen Satz von Instruktionen enthält, um ein Zell-Screening-System zu
veranlassen, Prozeduren zum Verfolgen individueller Zellen während eines
kinetischen Zell-Screening-Assays
auszuführen,
wobei die Prozeduren die verschiedenen erfindungsgemäßen Verfahrensschritte
umfassen. Das Computer-lesbare Speichermedium umfasst, ist aber
nicht beschränkt
auf magnetische Disketten, optische Disketten, organische Speicher
und jedes andere flüchtige
(z.B. Random Access Memory („RAM") oder nicht-flüchtige (z.B.
Read-Only memory („ROM")) Massenspeichersystem,
das von der CPU lesbar ist. Das Computerlesbare Medium schließt das Kooperieren
eines zusammengeschalteten Computerlesbaren Mediums ein, welches
ausschließlich
auf dem Verarbeitungssystem vorhanden ist oder auf mehreren zusammmengeschalteten
Verarbeitungssystemen, die sich lokal oder entfernt vom Verarbeitungssystem
angeordnet sein können,
verteilt sein kann.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst das Zell-Screening-System ein optisches Fluoreszenzsystem
mit einer Plattform, die angepasst ist, um Zellen zu tragen, und
ein Mittel zur Bewegung der Plattform, eine Digitalkamera, eine
Lichtquelle zum Empfangen und Verarbeiten der digitalen Daten von
der Digitalkamera und ein Computermittel zum Empfangen und Verarbeiten
der digitalen Daten von der Digitalkamera. Dieser Aspekt der Erfindung
umfasst Programme, die das Zell-Screening-System anweisen, die Organisation des/der
zellulären
Bestandteile) von Interesse in individuellen Zellen unter Verwendung
der hier offenbarten Verfahren festzulegen.
-
Die
erfindungsgemäßen Verfahren
können
in Verbindung mit jedem beliebigen zellbasierten Screening-Assay
verwendet werden, einschließlich
multiparametrischer Assays, die sich die kinetischen Analysen zu
Nutzen machen. Eine Reihe von biologisch wichtigen Metaboliten,
regulatorischen Molekülen
und Organellen (wie jene, die in Tabelle I gezeigt sind) können mit
Fluorophoren gefärbt
werden und die Aktivität
oder Konzentrationen können
durch Messungen der Intensitätsänderungen über die
Zeit bestimmt werden. Die Mehrheit dieser Indikatoren benötigt intakte,
lebende Zellen, die sich über
die Zeit inhärent
verändern.
Deshalb werden einzelne zelluläre
kinetische Intensitätsmessungen
für Informationen
mit hohem Gehalt von diesen Indikatoren benötigt. Die meisten der kleinen
Molekülindikatoren,
die in Tabelle I aufgelistet sind (einschließlich Marken-Indikatoren) sind
von Molecular Probes erhältlich.
-
-
-
Ligandenbindung
-
Liganden
für zelluläre Oberflächen-Rezeptoren
binden spezifische extrazelluläre
Liganden. Einige natürliche
Liganden induzieren eine molekulare Funktion, während andere, exogene Moleküle, wie
Arzneimittel Teile in subzelluläre
Kompartimente binden und eine Biomolekülfunktion modulieren. Liganden,
die fluoreszierend markiert sind, können auf eine Bindung an die
Zelle beobachtet werden. Eine fluoreszierende EGF-Bindung an den
Rezeptor des epidermalen Wachstumsfaktors findet innerhalb weniger
Minuten statt und aktiviert den Rezeptor. Nach der Oberflächenbindung
internalisiert der EGF-Rezeptorkomplex in endosomale Kompartimente,
was eine Herunterregulation und ein Abbruch des Signals anzeigt.
Eine Bindung und Internalisierung kann unter Verwendung der erfindungsgemäßen kinetischen
Verfahren nachgewiesen werden.
-
Zell-Lebensfähigkeit
-
Intakte
Plasmamembranen können
durch Einführung
von Indikatoren nachgewiesen werden, welche durch intakte Zellmembranen
hindurchgehen können
und intrazellulär
durch enzymatisches Entfernen der Seitengruppen, die für die Membran-Permeabilität benötigt werden,
eingeschlossen bleiben. Die Farbstoffe bleiben eingeschlossen und
markieren dadurch Zellen, bis die Plasmamembran zerreißt und die
internalisierten Farbstoffe freisetzt. Acetoxymethyl-ester-Derivate
von Calcein funktionieren als Indikator von intakten Zellmembranen
und lebensfähigen
Zellen sehr gut. Eine weitergehende Lebensfähigkeit der Zellen kann in
Zusammenhang mit den erfindungsgemäßen kinetischen Verfahren beobachtet
werden.
-
GFP-Expression
-
Die
erfindungsgemäßen kinetischen
Verfahren können
verwendet werden, um die Expression von Proteinen über die
Zeit zu beobachten. Viele Proteine können fluoreszierend markiert
sein, ohne die Funktion der Herstellung von DNA-Konstrukten des Proteins von Interesse,
welches einen zusätzlichen
Code für
ein grün
fluoreszierendes Protein (GFP) enthält, zu beeinträchtigen.
Diese Bio-Reporter
werden in Zellen exprimiert, um ein mit Fluoreszenz markiertes funktionelles
Protein, herzustellen. Diese Sonden würden nützlich sein als i) ein Zielvalidierungswerkzeug,
mit dem die Spiegel der potentiellen therapeutischen Ziele, die
in kinetisch veränderten
Zellen exprimiert werden, beobachtet werden könnten oder ii) ein Screening-Werkzeug, mit
dem die Wirkungen von Verbindungen auf den Ebenen von GFP-[Promotor
von Interesse]-Fusionsproteinen
beobachtet werden könnten.
Die Antwortzeit liegt im Bereich von Stunden bis Tagen.
-
Stickstoffoxid/reaktive
Sauerstoffspezies
-
Stickstoffoxid
ist ein wichtiges Signalmolekül
in Neuronen und in Endothel-Zellen
und kontrolliert den Gefäßtonus und
die Zellkommunikation. Die Anwendung könnte als ein Screening-Werkzeug
verwendet werden oder als ein Zytotoxizitäts-Werkzeug, um die Erzeugung
von reaktiven Sauerstoffspezies aufzuzeichnen. Diese Moleküle sind
wichtige pharmakologische Ziele für Apoplexie, Alzheimer-Krankheit,
Parkinson-Krankheit und kongestive Herzinsuffizienz. Die Antwortzeit
liegt im Bereich von 1–10
Minuten und könnte
sich somit unter Verwendung der erfindungsgemäßen kinetischen Verfahren entwickeln.
-
Multiple Arzneimittelresistenz
(MDR)
-
Diese
Anwendung kann verwendet werden, um die Aktivität des Zelloberflächentransporters,
P-Glykoprotein, aufzuzeichnen. Dieser ist eine molekulare Pumpe,
welche in der Zytoplasmamembran verankert ist und Antikrebs-Arzneimittel
aus den Zellen pumpt und so eine Zellresistenz gegenüber einer
Vielzahl von therapeutischen Agenzien herstellt. Die Antwortzeit
für diesen
Assay liegt im Bereich von Minuten und könnte sich daher unter Verwendung
der erfindungsgemäßen kinetischen
Verfahren entwickeln. Dieser Assay würde für Antikrebs-Therapien anwendbar
sein.
-
Lysomaler pH
-
Fluoreszein-markierte
Dextrane werden in die Zelle durch Endocytose aufgenommen und gelangen
in lysosomale Kompartimente, in denen die Dextrane abgebaut werden.
Die Intensität
von Fluoreszein ist pH-abhängig
und deshalb ist die Messintensität über die
Zeit ausreichend, um Veränderungen
bei der lysosomalen Aktivität,
die durch Arzneimittel, wie die Proton-Ionophore, Monesin, induziert
wurde, nachzuweisen.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Verwendung der erfindungsgemäßen kinetischen
Verfahren in Verbindung mit einem Zell-Screening-Assay werden Zellen
durch Inkontaktbringen der Zellen mit einem nukleären Marker
unter Verwendung der Information aus dem nukleären Kanal aufgeteilt. Bilder
von dem nukleären
Kanal können
gegebenenfalls vorberarbeitet sein (farbkorrigiert und geglättet) und
es kann eine Schwelle gesetzt werden (unter Verwendung eines automatischen
Schwellensetzverfahrens), wobei eine nukleäre Maske erzeugt wird. Durch
Zeichnen von Linien, die gleich weit zu den Kernrändern entfernt sind
(Wasserscheiden-Verfahren), werden nukleäre Einflussbereiche (nicht-berührende zelluläre Domänenmasken) identifiziert
und die Maske der Domänen
wird erzeugt. Für
jede nukleäre
Maske wird eine erweiterte nukleäre Maske
erzeugt (eine nukleäre
Maske wird ein paar Mal verlängert
in Abhängigkeit
vom Zelltyp- und -größe). Das
logische „AND" der Maske mit entsprechender
zellulärer
Domäne
resultiert in eine Endmaske, welche auf den zweiten Kanal übertragen
wird, um die Fluoreszenzintensität
des relevanten Fluoreszenzmarkers unter der Maske zu messen. Zellkerne
sind maskiert und Zellen werden durch Definieren von Domänen außerhalb jedes
Kerns mit einer Wasserscheiden-Verfahrensweise
aufgeteilt. Kinetische Merkmale werden dann basierend auf den Intensitätsveränderungen
in individuellen Zellen von einer Messung zu der nächsten,
wie oben beschrieben, bestimmt.
-
Durch
Bestimmen der Fluoreszenzintensität, welche durch die Marker
in individuellen Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten ausgesendet
wird, stellt das Verfahren zellbasierte, kinetische Messungen für ein oder mehrere
der folgenden Anwendungen zur Verfügung:
- Dynamische Veränderungen
bei der Intensität über die
Zeit
- Heterogenität
der Intensität
unter Zellen
- Wiederkehrende Schwingungen in der Intensität
- Wellen von Intensitätsveränderungen über verbundene
Zellen
- Subpopulationen von antwortenden Zellen
- Aufeinander folgende Aktivierung von Signalmolekülen
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
stellt das Verfahren eine messbare Antwort von Zellen bereit (d.h.
Prozent von antwortenden Zellen mit einer Intensität oberhalb
eines Schwellenwertes), welche den Wert des vorliegenden Assays über solche
Assays, die lediglich die Rohamplitude der Antwort messen, erhöht. Die Schwelle,
die für
einen bestimmten Parameter verwendet wird, kann für jeden
Zeitpunkt bestimmt werden und der Werte) der Schwellen kann vor
dem Durchmustern als ein Assay-Input-Parameter gesetzt werden oder kann
während
der Datenanalyse zurückgesetzt
werden.
-
In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung wird die kinetische Messung modifiziert, sortiert
und/oder ausgeschlossen in Abhängigkeit
von der Qualitätskennzahl
der Übereinstimmung
der Zellidentifikation für
jede Zelle. Das Sortieren schließt das Poolen von Daten von
allen Zellen aus einer Gruppe ein, so wie schnelle Zellen, Zellen
im 5. Bildsatz, Zellen mit Rot-Markern und Subpopulationen von großen Zellen.
-
In
Falle von Calcium-Assays können
die zu bestimmenden kinetischen Merkmale folgende einschließen, sind
aber nicht beschränkt
darauf: Zell-basierte kinetische Merkmale:
- – Intensität – durchschnittliche
Fluoreszenzintensität
von Zellen, gemittelt über
die Zeit
- – vorstimulatorische
Intensität – Die Grundwertintensität vor der
Stimulation durch einen Agonisten (Durchschnittswert über alle
vorstimulierten Punkte)
- – Spitzenenintensität – Spitzenintensitätswert (höchster Punkt
oder Kurve, die angeglichen ist, um den Umkehrpunkt zu finden)
- – Relativer
Spitzenintensitätswert – Spitzenintensität/vorstimulatorische
Intensität.
- – Zeit
für die
Spitzenintensität
- – Intensität des Plateaus
- – Relative
Intensität
des Plateaus
- – Integrierte
Intensität
der Ca2+-Signalgebung
- – Schwingungsfrequenz
- – Schwingungsfortdauer
- – Schwingungsamplitude
-
Vertiefungsbasierte kinetische
Merkmale
-
- – durchschnittliche
Fluoreszenzintensität
- – durchschnittliche
Grundlinienintensität
- – durchschnittliche
Spitzenintensiät
- – durchschnittliche
relative Spitzenintensität
- – durchschnittliche
Zeit für
die Spitzenintensität
- – durchschnittliche
Intensität
zum Plateau und Asymptote
- – durchschnittliche
relative Intensität
des Plateaus
- – durchschnittliche
integrierte Intensität
der Ca2+-Signalgebung
- – durchschnittliche
Schwingungsfrequenz
- – durchschnittliche
Schwingungsfortdauer
- – durchschnittliche
Schwingungsamplitude
Fehlgeschlagenes einfaches Annäherungsverfahren Nun genauere Betrachtungsweise der Abstandsmatrix Abstandsmatrix
