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Die
Erfindung bezieht sich auf die Untersuchung einzelner Zellen aus Körperflüssigkeiten,
Abstrichen oder Geweben in Bezug auf Art, Zustand oder andere Unterscheidungsmerkmale.
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Die
Erfindung besteht darin, die Zellen möglichst ohne Überlappung
auf einem massenspektrometrischen Probenträger abzulagern,
die Lagekoordinaten der Zellen zu bestimmen, den Probenträger mit
Kriställchen einer Matrixsubstanz überwachsen zu
lassen, nach Ansteuerung der Lagekoordinaten durch den Bewegungsapparat
eines Massenspektrometers Massenspektren der einzelnen Zellen mit
Ionisierung der Zellbestandteile durch matrixunterstützte
Laserdesorption aufzunehmen und die Massenspektren für
die Untersuchung der Art, des Zustands oder anderer Unterscheidungsmerkmale
der Zellen zu verwenden.
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Stand der Technik
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Die
bildgebende Massenspektrometrie an histologischen Dünnschnitten
oder anderen flächigen Proben mit Ionisierung der interessierenden
Moleküle durch matrixunterstützte Laserdesorption
(MALDI) hat jüngst einen außergewöhnlichen
Aufschwung erlebt. Dabei werden in der Regel Verteilungen bestimmter
Proteine gemessen, die allein oder in Verbindung mit anderen Proteinen
als Biomarker für die Darstellung verschiedener Organe
und vor allem für die Charakterisierung der Stress- oder
Krankheitszustände einzelner Bereiche der flächigen
Probe dienen können. Diese Stress- oder Krankheitszustände können
heute mit keinem anderen Verfahren so sicher und schnell charakterisiert
werden. Ein solches Verfahren ist in der Offenlegungsschrift
DE 10 2004 037 512.7 (D.
Suckau et al.) dargestellt.
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Dünnschnitte
werden dabei in der Regel auf besondere Objektträger aufgebracht,
deren Transparenz eine mikroskopische Beobachtung erlaubt und die
eine leitende Schicht besitzen, um später im Massenspektrometer
ein definiertes Potential für die Beschleunigung der dort
erzeugten Ionen bereitzustellen.
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Die
flächige Probe auf dem Objektträger muss dabei
in besonderer Weise mit einer Schicht aus Matrixkriställchen überschichtet
werden, um eine gute Ionisierbarkeit der Proteine, aber auch anderer interessierender
Substanzen, zu gewährleisten. Ein besonders günstiges
Belegungsverfahren ist in der Offenlegungsschrift
DE 10 2006 059 695.1 (M.
Schürenberg) beschrieben. Dieses Feinsprüh- oder
Benebelungsverfahren führt optisch gesteuert und daher reproduzierbar
zu einer dichten Überdeckung mit einer etwa 20 bis 50 Mikrometer
dicken Schicht von Matrixkriställchen, wobei insbesondere
die Proteinmoleküle aus der Probe mit an die Oberfläche
der Schicht genommen werden. Die Matrixschicht ergibt in Verbindung
mit besonderen Laserstrahlprofilen überraschenderweise
und gegen bisherige Lehre eine sehr hohe Empfindlichkeit, so dass
selbst sehr kleine Bereiche des histologischen Dünnschnitts
einer Analyse der wichtigsten Proteine unterzogen werden können.
Nach herrschender Lehre wird nur ein Analytion aus 10 000 Analytmolekülen
gebildet; die Ausbeute der Schicht an feinen Matrixkriställchen für
Proteinionen liegt aber anscheinend, in Verbindung mit besonderen
Laserstrahlprofilen, aus bisher ungeklärten Gründen
um mindestens einen Faktor 100, möglicherweise einen Faktor
1000 höher.
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Bei
Verwendung besonders geformter Laserstrahlprofile, wie sie beispielsweise
in der Offenlegungsschrift
DE 10 2004 044 196 A1 (A. Hase et al.) dargelegt
sind, können die Analysen der Proteine auf einen Bezirk
von nur etwa fünf Mikrometer Durchmesser eingeschränkt
werden. Das Laserstrahlprofil besteht im Wesentlichen aus einer
oder mehrerer Laserstrahlspitzen mit nur je fünf Mikrometer
Durchmesser oder weniger. Die Ortsauflösung bei der Messung
der Verteilungen von Molekülen in den flächigen Proben
liegt wegen leichter lateraler Diffusion beim Aufbringen der Matrixbeschichtung
meist bei etwas höheren Werten von etwa 20 Mikrometern,
was für die meisten Anwendungen völlig ausreicht.
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Für
eine gute Messung mit hoher Empfindlichkeit und guter Genauigkeit
für die Konzentrationsmessung genügt aber nicht
die Aufnahme eines Einzelspektrums, das auf einem einzelnen Laserschuss beruht,
es sind vielmehr zwischen 20 und 500 Einzelspektren zu einem Summenspektrum
zu addieren. Wenn im Folgenden der Begriff „Massenspektrum" verwendet
wird, wird darunter immer dieses Summenspektrum verstanden. Bei
voller Ausschöpfung der Ortsauflösung durch einen
Rasterabstand der Messungen von 20 Mikrometern bedeutet das, dass pro
Quadratzentimeter Dünnschnitt 250 000 Massenspektren aufzunehmen
sind, die aus vielen Millionen Einzelspektren zusammengesetzt werden
müssen. Beträgt die Aufnahmegeschwindigkeit ein
Massenspektrum pro Sekunde, beispielsweise durch 200 Einzelspektren,
die mit 200 Hertz aufgenommen werden, so dauert dieses Verfahren
etwa 70 Stunden pro Quadratzentimeter.
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Selbstredend
können auch geringere Ortsauflösungen gewählt
werden, so können beispielsweise für Körperquerschnitte
von Mäusen oder Ratten mit Rasterabständen von
200 bis 500 Mikrometer sehr gute Verteilungen der Analytsubstanzen
auf die einzelnen Organe und Organzwischenräume gemessen
werden, wobei nur 2500 bzw. 400 Massenspektren pro Quadratzentimeter
aufzunehmen sind, die aber immer noch Hunderttausend bis eine Million Einzelspektren
umfassen können. Es ist auch in diesem Falle eine hohe
Frequenz der Spektrenaufnahme mit möglichst mehr als 1000
Einzelspektren pro Sekunde wünschenswert, wobei jedoch
diese Einzelspektren nicht von einem einzelnen Punkt genommen werden
dürfen, um eine Überhitzung der Matrixschicht
an dieser Stelle zu vermeiden. Es ist daher zweckmäßig,
die Aufnahmekoordinaten ständig zu variieren und in besonders
kritischen Fällen Aufnahmerate herabzusetzen, beispielsweise
nur 200 Einzelspektren pro Sekunde aufzunehmen.
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Nun
sind aber nicht nur massenspektrometrische Untersuchungen der Gewebezustände
von Bereichen histologischer Dünnschnitte interessant, sondern
auch Untersuchungen einzelner Zellen aus Abstrichen, aus Körperflüssigkeiten
oder aus Geweben. Die Untersuchungen können sich auf die
Feststellung der Art der Zellen richten, aber auch auf den Stress-,
Krankheits- oder Infektionszustand der einzelnen Zellen. Auch die
einfache Feststellung von Unterscheidungsmerkmalen ist interessant,
wobei die Gründe für die Unterscheidungsmerkmale
nicht einmal bekannt sein müssen.
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Für
diese Untersuchungen sind die Zellen, soweit sie nicht bereits in
Körperflüssigkeiten verteilt vorliegen, in voneinander
getrennter Form in eine Flüssigkeit zu bringen. Es sind
Apparaturen für besondere Präparation der Zellen
aus Flüssigkeiten auf Objektträger im Handel.
Dabei werden die Zellen durch sachtes Zentrifugieren auf einen kleinen
Bereich des Objektträgers aufgebracht, beispielsweise auf
einen Quadratzentimeter, wobei sie ohne Zerstörung flach
gepresst werden und einen Durchmesser von etwa 20 Mikrometer annehmen.
Auch die Zellen aus Geweben, beispielsweise aus Knochenmark, können
durch besondere Verfahren in Flüssigkeiten verteilt und
dann auf Objektträger aufgebracht werden. Sind genügend
wenig Zellen in der Flüssig keit, so treten nur wenige Überlappungen
auf, so dass der Mediziner die Zellen unter dem Mikroskop einzeln
betrachten kann. „Genügend wenig" Zellen heißt
hier etwa einige Hundert bis maximal etwa 10 000 Zellen pro Quadratzentimeter.
Das Optimum für möglichst prozentual wenige Überlappungen
liegt bei etwa 3000 Zellen pro Quadratzentimeter.
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Das
analytische Ziel einer solchen Untersuchung liegt sehr häufig
darin, das Vorkommen von einigen wenigen entarteten, beispielsweise
tumorösen, Zellen unter viele normalen Zellen festzustellen;
bei visueller Inspektion durch den Mediziner eine mühsame
und sehr ermüdende Aufgabe. Färbemethoden sind
nicht für alle diese Fälle bekannt und häufig
auch nicht sehr kontrastreich; die visuelle Erkennung tumoröser
Zellen unterliegt vielen subjektiven Einflüssen und ist
kaum objektivierbar. Es wird daher nach automatisierbaren Verfahren
für diese Aufgabe gesucht.
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Gewebebereiche
mit entarteten, beispielsweise tumorösen Zellen in Dünnschnitten
können grundsätzlich anhand ihrer Massenspektren
als solche erkannt werden, obwohl diese Gewebebereiche meist noch
mit größeren Anteilen, häufig bis zu
80 Prozent, gesunder Zellen durchmischt sind. So liegt es nahe,
die Objektträger mit den aufgebrachten Zellen genauso wie
Dünnschnitte mit Matrixmaterial zu überschichten
und dann im Massenspektrometer durch ein Rasterverfahren abzutasten,
um Massenspektren der einzelnen Zellen zu erhalten. Um auf diese
Weise die einzelnen Zellen ausnahmslos alle der Analyse zuzuführen,
muss die Abtastung dicht sein, mit einem Rasterabstand von höchstens
20 Mikrometern. Das führt bei einem Quadratzentimeter Fläche
zu der oben erwähnten Zahl von 250 000 Massenspektren mit
Millionen von Einzelspektren und der oben erwähnten Zeit
von 70 Stunden, obwohl sich auf der Fläche nur etwa 1000
bis 10 000 Zellen befinden mögen. Die überwiegende
Anzahl der Massenspektren ist leer.
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Solche
Verfahren sind überhaupt nur bei Verwendung von Festkörperlasern
möglich. Die meist bisher verwendeten Stickstoff-Laser
haben Lebensdauern von nur etwa einer Million Laserschüssen. Die
Festkörperlaser haben eine wesentlich höhere Standfestigkeit;
bedürfen aber besonderer Maßnahmen für
die Strahlformung, die aber auch zum Vorteil der Analytik ausgeführt
sein können. Es sind bereits Massenspektrometer im Handel,
die mit Festkörperlasern arbeiten.
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Unter
dem Begriff „Zustand der Zellen" soll hier der Zustand
in Bezug auf einen Stress, eine krankhafte Veränderung,
einen infektiösen Befall oder eine sonstige Veränderung
gegenüber einem Normalzustand der gleichen Art von Zellen
verstanden werden. Wie schon erwähnt, sind bei diesem Verfahren
Tumorzellen von besonderer Bedeutung; tumoröses Gewebe
lässt sich massenspektrometrisch deutlich von gesundem
Gewebe unterscheiden. Ganz allgemein muss sich der Zustand als Konzentrationsmuster
von Substanzen, die massenspektrometrisch in dieser Zelle nachgewiesen
werden können, zu erkennen geben. Die Substanzen können
dabei Peptide oder Proteine sein, die unter- oder überexprimiert
sind und so ein charakteristisches Muster bilden, sie können
aber auch posttranslationale Modifikationen von Proteinen sein,
oder Abbauprodukte (Metabolite), oder Ansammlungen sonstiger Substanzen
wie beispielsweise Lipide im Gewebe.
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Aufgabe der Erfindung
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Es
ist die Aufgabe der Erfindung, einzelne Zellen möglichst
automatisiert auf Art oder Zustand zu untersuchen.
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Kurze Beschreibung der Erfindung
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Die
Erfindung macht von der überraschenden Erkenntnis Gebrauch,
dass sich tatsächlich einzelne Zellen massenspektrometrisch
untersuchen lassen. Durch die eingangs geschilderten Maßnahmen
lässt sich die Empfindlichkeit des massenspektrometrischen
Nachweises so weit steigern, dass aus den nur etwa 108 Molekülen
einer Zelle, mit etwa 107 Molekülen
für das häufigste Protein und nur etwa 105 Molekülen für ein Protein
an einer gewünschten Nachweisgrenze, auswertbare Massenspektren
gewinnen lassen.
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Die
Erfindung besteht darin, die zu untersuchenden Zellen möglichst
ohne Überlappung auf einer Trägerplatte abzulagern,
die Lagekoordinaten der Zellen zu bestimmen, die Trägerplatte
mit Matrixkriställchen zu überdecken, durch Ansteuerung
der Lagekoordinaten der einzelnen Zellen Massenspektren aufzunehmen
und die Massenspektren für die Untersuchung der Zellen
zu verwenden. Die Untersuchung kann sich auf Art, Zustand oder andere
Unterscheidungsmerkmale der Zellen richten, wobei der Zustand durch
Stress, Krankheit oder Infektion erzeugt sein kann.
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Die
Massenspektren der Einzelzellen verschiedener Zellzustände
unterscheiden sich dabei deutlicher voneinander als die Massenspektren
von Gewebegebieten in Dünnschnitten, weil letztere meist
Mischspektren enthalten. So unterscheiden sich Massenspektren aus
isolierten tumorösen und gesunden Einzelzellen noch deutlicher
als entsprechende Gewebebereiche in Dünnschnitten.
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Durch
eine günstige Strahlprofilierung kann die Aufnahmezeit
für 3000 Summenspektren der 3000 Zellen bei einer Aufnahmerate
von nur 200 Einzelspektren pro Sekunde auf 20 Minuten eingeschränkt
werden; bei höheren Laserpulsraten auf noch kürzere
Zeiten.
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Die
Zellen können durch sachtes Zentrifugieren auf die Trägerplatte
aufgebracht werden, wofür es kommerziell vertriebene Geräte
gibt. Als Trägerplatte kann beispielsweise ein besonders
präparierter Objektträger verwendet werden. Die
Zellen können aber auch durch andere Techniken, beispielsweise
durch einfachen Abstrich, aufgebracht werden. Für die Bestimmung
der Lagekoordinaten eignen sich besonders mikroskopische Aufnahmen
oder digitale Kontaktabzüge entsprechend dem Stand der Technik;
auch hier gibt es einfache technische Geräte im Handel.
Der Kontrast lässt sich durch Anfärben, bei mikroskopischer
Aufnahme auch durch Dunkelfeldbeleuchtung oder Phasenkontrast erhöhen.
Es sind Färbungstechniken und -mittel bekannt, die bei MALDI
nicht stören. Bildauswertungsprogramme können
für den vorliegenden Zweck neben den Mittelpunktskoordinaten
der Zellen auch andere Parameter wie Durchmesser und Überlappungsparameter
bestimmen. Für das Aufbringen der Matrixschicht gibt es
ebenfalls kommerzielle Geräte, wobei die Geräte
aber je nach verwendeten Verfahren verschiedene Empfindlichkeiten
durch verschiedene Ionisierungsausbeuten ergeben. Es sind weiterhin
MALDI-Massenspektrometer kommerziell erhältlich, die eine
genügende Genauigkeit für die Bewegung des Probenträgers
und genügend Geschwindigkeit für die Aufnahme
der Massenspektren bieten.
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Für
die Bestimmung des Zustands der Zellen und anderer Unterscheidungsmerkmale
aus den Spektrendaten gibt es ebenfalls geeignete Programme. Der
Zustand lässt sich schlussendlich durch einen Zustandswert
oder Zustandsvektor auf einer ein- oder mehrdimensionalen Zustandsskala
ablesen; die Berechnung des Zustandswertes oder Zustandsvektors
stützt sich auf das Vorkommen oder Nichtvorkommen der Signale
für einzelne Proteine und aus den Intensitätsverhalt nissen
der Signale zueinander. Dabei können für die Berechnung
eines Zustandswertes durchaus komplizierte Ausdrücke aus
den Signalstärken I(m) verwendet werden, wobei I die Intensität
und m die Masse der Ionen dieses Signals bedeutet.
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Die
Art der Berechnung des Zustandswertes kann als parametrisierte Formel
vorgegeben sein, es kann aber auch eine Klassen bildende mathematisch-statistische
Analyse mit oder ohne anfängliche Unterweisung eingesetzt
werden (Supervised or unsupervised learning programs). Zustandswerte
oder Zustandsvektoren können zur Falschfarbendarstellung
der Zustände auf einem mikroskopischen Abbild verwendet
werden.
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Kurze Beschreibung der Abbildungen
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1 zeigt
einen Ausschnitt aus einer Trägerplatte mit Zellen, die
durch mildes Zentrifugieren aufgebracht wurden. Jede der platt gedrückten,
fast runden Zellen trägt einen Zellkern, der sich jeweils etwa
in der Mitte der Zelle befindet.
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Beste Ausführungsformen
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Zum
ersten bezieht sich die Erfindung auf die Bestimmung der Art oder
Identität der Zellen, also der Zugehörigkeit zu
einem Organ oder einem Gewebe. Die Massenspektren der Zellen verraten
in der Regel die Herkunft der Zellen, also das Organ oder das Gewebe,
dem die Zelle entstammt, wobei häufig sehr fein die Herkunft
aus bestimmten Organbereichen festgestellt werden kann.
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Zum
zweiten dient die Erfindung der Feststellung des Zustands einzelner
Zellen, wobei der Zustand durch einen besonderen chemischen oder
physikalischen Stress, durch krankhafte Entartung oder durch Infektion
einer bestimmten Art von Zellen hervorgerufen sein kann. Chemischer
Stress kann zum Beispiel durch Pharmaka, physikalischer Stress durch
Temperatur- oder Strahlungseinwirkung erzeugt werden, beide können
zu starker Schädigung der Zelle führen.
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Zum
dritten kann die Erfindung für Untersuchungen vieler einzelner
Zellen auf bekannte oder unbekannte, bisher nicht entdeckte Unterschiede zwischen
verschiedenen, nicht zu selten besetzten Klassen von Zellen eingesetzt
werden. Die Unterschiede zwischen den Klassen können anhand
unterschiedlicher Merkmale, die sich in den Massenspektren zeigen,
durch statistische Programme automatisch festgestellt werden. Diese
Merkmalsunterschiede mögen auf verschiedene Unterarten
der Zellen eines Gewebes oder Organs, auf Unterschiede ihrer Funktion
oder auf andere Unterschiede, beispielsweise Unterschiede durch
verschiedene Ernährung, zurückzuführen
sein.
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Die
Arten der Zellen, viele ihrer Zustände und andere Merkmale
spiegeln sich in der quantitativen oder sogar qualitativen Zusammensetzung
der Substanzen im Inneren der Zellen wieder, so dass die Unterschiede
in aller Regel durch MALDI-Massenspektren bestimmbar sind.
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Die
Erfindung ist beispielsweise dann von besonderer Bedeutung, wenn
es um das automatisierte Auffinden von Tumorzellen geht, insbesondere um
das Auffinden sehr weniger Tumorzellen in einer überwältigenden
Mehrheit von gesunden Zellen. Es ist dabei überraschend,
dass aus den Bestandteilen einer einzigen Zelle, insbesondere aus
den Proteinen, durch eine Ionisierung vermittelst der matrixunterstützten
Laserdesorption so gut auswertbare Massenspektren gewonnen werden
können, dass eine solche Aufgabe lösbar wird.
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Das
Grundschema der Erfindung besteht in einer Untersuchung vieler einzelner
biologischen Zellen in folgenden Schritten:
- a)
Aufbringen der Zellen auf eine Trägerplatte,
- b) Bestimmung der Lagekoordinaten der Zellen,
- c) Aufbringen einer Kristallschicht aus Matrixmaterial,
- d) Aufnahme von Massenspektren von mindestens einem Teil der
Zellen unter Verwendung der Lagekoordinaten, mit einer Ionisierung
der Zellbestandteile durch matrixunterstützter Laserdesorption
und
- e) Auswertung der Massenspektren in Bezug auf Art, Zustand oder
andere Unterscheidungsmerkmale der Zellen.
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Die
Zellen werden in Schritt a) möglichst isoliert voneinander
auf eine geeignete Trägerplatte aufgebracht, beispielsweise
einen Objektträger, der sich auch als massenspektrometrischer
Probenträger verwenden lässt. Die Oberfläche
der Trägerplatte kann zur Erzeugung eines definierten elektrischen Potentials
im Massenspektrometer elektrisch leitend sein. Es muss die Trägerplatte
aber nicht unbedingt transparent sein, es können auch andere,
beispielsweise metallische Trägerplatten verwendet werden, soweit
es möglich ist, genügend gute Abbilder der aufgebrachten
Zellen zu erzeugen.
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Die
Zellen können in Schritt a) beispielsweise durch moderates
Zentrifugieren aus einer Flüssigkeit, beispielsweise direkt
aus einer Körperflüssigkeit, aufgebracht werden.
Dabei ist darauf zu achten, dass nicht mehr als etwa 10 000 Zellen
pro Quadratzentimeter aufgebracht werden, um die Anzahl von Überlappungen
klein zu halten. Günstig ist eine Zahl von etwa 3000 Zellen
pro Quadratzentimeter, aber es gibt auch sinnvolle diagnostische
oder erforschende Anwendungen, bei denen nur etwa hundert oder weniger
Zellen aufgebracht werden. Die Zellen können bereits in
der Flüssigkeit bei der Entnahme aus dem Körper
enthalten sein, aber auch erst als voneinander getrennte Gewebezellen
in die Flüssigkeit eingebracht werden, beispielsweise Zellen
von Biopsien aus dem Knochenmark. Die Zellen aus Geweben können
durch Lösen der interzellulären Bindungen, beispielsweise
durch enzymatisches Trennen, vereinzelt werden. Die Zellen können
des weiteren mit einem Zellsortierer ausgewählt werden
oder auch nicht. Das milde Zentrifugieren drückt die Zellen
platt auf den Träger, ohne sie zu zerstören; sie
nehmen dabei eine fast kreisrunde Form mit einem Durchmesser von
etwa 15 bis 25 Mikrometer an, mit dem Zellkern fast genau in der
Mitte der Zelle. Die aufgebrachten Zellen werden in der Regel anschließend getrocknet,
wodurch sie fest an die Trägerplatte gebunden werden.
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Es
können die Zellen in Schritt a) aber auch durch andere
Verfahren aufgebracht werden, so durch Abstriche, durch einfaches
Absedimentieren einer Flüssigkeit mit anschließendem
Abgießen und Trocknen, oder durch laserunterstützte
Mikrodissektion. Durch das Trocknen werden die zunächst
lose aufliegenden Zellen ebenfalls flach auf den Träger angeheftet
und eingeschrumpft.
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Sind
die Zellen auf die Trägerplatte aufgebracht, so können
sie mit optischen Mitteln, so etwa mit einem Mikroskop, betrachtet
werden. Ein schematisches Abbild ist in 1 gezeigt.
Zur Erhöhung des Kontrasts können Einfärbungen
vorgenommen werden; es sind Färbemittel bekannt, die die
massenspektrometrische Aufnahme durch MALDI nicht stören.
Besonders günstig ist ein Mikroskop mit Dunkelfeldbeleuchtung,
die die Zellen hell vor dunklem Hintergrund zeigen. Durch mikroskopische
Aufnahmen, aber auch durch direkte Kontaktabzüge in relativ
ein fachen Geräten, können digitale Bilder erzeugt
werden, wobei möglichst eine Auflösung von etwa
zwei Mikrometer erreicht werden soll. Diese digitalen Bilder können
für die Bestimmung der Lagekoordinaten der Zellen herangezogen
werden.
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Bildverarbeitende
Computerprogramme sind bekannt und weit verbreitet. Mit ihnen können
die Mittelpunkte der kreisförmigen Zellen bestimmt werden, aber
auch andere Parameter, wie beispielsweise Durchmesser, Unrundheit, Überlappungsstärke
und Überlappungsrichtung. Die Lagekoordinaten und zugehörigen
Parameter werden in einer computergeführten Liste abgelegt,
die später als Grundlage für die Messung der Massenspektren
dient. Die Lagekoordinaten werden auf besondere Markierungspunkte auf
der Trägerplatte bezogen, die später auch bei
der massenspektrometrischen Messung erkannt werden können.
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Ist
die Liste der Lagekoordinaten erstellt, so kann die Trägerplatte
mit den aufgebrachten Zellen in Schritt c) in geeigneter Weise mit
der Schicht von Matrixkriställchen überzogen werden.
Ein günstiges Verfahren ist in der oben bereits zitierten
Offenlegungsschrift
DE
10 2006 059 695.1 (M. Schürenberg) beschrieben.
Dabei werden stoßweise voneinander isolierte Nebeltröpfchen
aus Matrixlösung auf der Trägerplatte abgesetzt,
aus denen sich beim Trocknen feinste Matrixkriställchen
bilden, die jeweils fast bis zur Trocknung gebracht werden. Der
Vorgang wird durch die Messung von Streulicht gesteuert. Durch das
wiederholte schichtweise Aufbringen jeweils voneinander getrennter
Nebeltröpfchen werden Proteine aus den Zellen extrahiert
und allem Anschein nach in sehr gereinigter Form an die Oberfläche
der Kristallschicht transportiert, so dass sich im MALDI-Verfahren
eine Ionisierung mit extrem hoher Ausbeute an Proteinionen ergibt.
Die Trägerplatte gleicht schließlich einer fein
bereiften Landschaft, die Zellen sind nicht mehr sichtbar. Die Dicke
der Schicht richtet sich nach dem Optimum der Ionisierungsausbeute,
sie ist erstaunlicherweise mit etwa 20 bis 50 Mikrometer relativ
dick. Die laterale Verschmierung der Proteine durch Querdiffusion
ist relativ gering und beträgt weniger als 15 Mikrometer.
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Die
massenspektrometrische Messung der Proteinprofile geschieht vorzugsweise
im Vakuum der Massenspektrometer, obwohl es auch einigermaßen
erfolgreiche Versuche gibt, die Ionen außerhalb des Massenspektrometers
in Umgebungsgas durch MALDI zu erzeugen. MALDI-Flugzeitmassenspektrometer
sind meist mit genügend präzisen Bewegungsvorrichtungen
für die Trägerplatten ausgestattet.
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Die
einzelnen Zellen, deren Lagekoordinaten bekannt sind, werden durch
den Bewegungsapparat der Ionenquelle des Massenspektrometers in
den Fokuspunkt des fest montierten UV-Pulslasers gefahren. Dabei
kann eine Auswahl getroffen werden: entweder werden nur die vollständig
voneinander isolierten Zellen vermessen, oder auch die Zellen, die sich
nicht stärker als mit einem bestimmten Schwellenwert überlappen.
Bei sich überlappenden Zellen können sich durch
die Querdiffusion der Proteinmoleküle leicht Mischspektren
ergeben, die möglicherweise keine eindeutigen Aussagen
zulassen. Bei überlappenden Zellen können die
Zellen dezentral so angefahren werden, dass Mischspektren nach Möglichkeit
vermieden werden. Bei sehr großen Zellen erweist es sich
als günstig, nicht das Zentrum der Zelle anzufahren, da
hier in der überwiegenden Anzahl der Fälle der
Zellkern sitzt, dessen Erhebung die Proteine der Zelle verdrängt.
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Es
werden für die Ionisierung UV-Pulslaser mit Laserpulsdauern
von 0,1 bis 10 Nanosekunden verwendet, wobei kurze Laserpulse vorzuziehen sind,
da sie die Ausbeute an Ionen erhöhen. Durch besondere
Optiken lassen sich Laserfokusdurchmesser von 5 Mikrometer und weniger
erzeugen, wobei sich wahlweise entweder einzelne oder auch mehrere
synchron auftretende Fokuspunkte erzeugen lassen. Für die
vorliegende Aufgabe ist es beispielsweise günstig, drei
oder vier Fokuspunkte in dreieckiger oder quadratischer Anordnung
mit Mittelpunkts-Abständen von etwa 10 Mikrometer voneinander
zu verwenden, da mit der Anzahl von Fokuspunkten die absolute Anzahl
der jeweils gebildeten Ionen steigt. Es sollten aber wiederum nicht
mehr Fokuspunkte sein, da sonst die Ausrichtung auf eine einzige
Zelle nicht mehr möglich ist. Von Schuss zu Schuss sollten
die Laserfokuspunkte jeweils etwas verschoben werden, um kein Schmelzen
der Matrixkristalle zu erzeugen. Dabei soll eine Bewegungsart generiert
werden, die möglichst die Fläche der Zelle in
aufeinander folgenden Laserschüssen gleichmäßig überstreicht,
beispielsweise eine kreisende Zykloidenbewegung.
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Durch
vier Fokuspunkte kann die Anzahl von Einzelspektren, die zur Erzeugung
eines gut auswertbaren Massenspektrums notwendig sind, auf etwa
50 Spektren reduziert werden. Mit einer Laserpulsrate von 200 Hertz
lassen sich somit pro Sekunde etwa drei Massenspektren aufnehmen,
die zu drei Zellen gehören, wobei die Verfahrzeiten der
Trägerplatte eingerechnet sind. Sind auf einer Trägerplatte 3000
Zellen aufgebracht, so sind etwa 20 Minuten notwendig, um Massenspektren
aller Zellen aufzunehmen. Das sind sehr annehmbare Zeiten, die einen
routinemäßigen Einsatz des Verfahrens empfehlen.
Diese Zeiten können mit einer visuellen Inspektion konkurrieren,
zumal das Verfahren weniger ermüdet. Das Verfahren ist
vor allem objektiver und vollkommen reproduzierbar. Die Irrtumswahrscheinlichkeit
für eine falsche Bestimmung ist erheblich herabgesetzt.
Es gibt für die Beurteilung keine Ermessensspielräume
mehr.
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Für
die Auswertung der Massenspektren sind Programme entwickelt worden,
die bisher für bildgebende Massenspektrometrie an Gewebedünnschnitten
eingesetzt wurden. Diese Programme entsprechen also dem Stande der
Technik und sind dem Fachmann bekannt. Sie sind beispielsweise in
der Lage, durch die Werteskala der Zustandswerte oder, bei mehrdimensionaler
Auswertung der Zustandsvektoren, bestimmte Zustände der
Zellen eines Gewebes zu charakterisieren, wobei die Zustandswerte als
mathematische Ausdrücke berechnet werden, die aus den Signalen
I(m) in beliebiger Weise zusammengesetzt sein können. Die
Zustandswerte können eindimensional oder als Zustandsvektoren
auch mehrdimensional sein, es ist damit eine Zuordnung zu verschiedenen
Arten- und Zustandsklassen möglich. Die günstigste
Form der mathematischen Ausdrücke zur Berechnung der Zustandswerte
kann durch eine mathematisch-statistische Analyse von Massenspektren
gewonnen werden, die aus genau charakterisierten Zellen verschiedener
Arten oder Zustände gewonnen wurden.
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Die
Programme zur Auswertung der Massenspektren können aber
auch durch mathematisch-statistische Programme, die selbständig
Klassen anhand verschiedener Unterscheidungsmerkmalen ermitteln
können, solche Klassen bestimmende Ausdrücke für
die Unterscheidungsmerkmale berechnen zu lassen. Dabei kann man
Klassen vorgeben, zum Beispiel durch Markierung der betreffenden Zellen
im digital angezeigten Bild („supervised learning programs").
Andere Programme bilden die Klassen selbständig („unsupervised
learning programs", „Cluster-Analysis"). Auch diese Verfahren
gehören zum Stand der Technik.
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Es
wird hier häufig unter dem Begriff „Massenspektrum"
ein Proteinprofil verstanden. Dazu ist anzumerken, dass es sich
auch um Profile von Substanzen handeln kann, die nicht Proteine
sind, oder neben den Proteinen auch andere Substanzen enthalten.
Sehr häufig treten beispielsweise Lipide auf, die ebenfalls
im Ruf stehen, charakteristische Muster für tumoröses
Material zu liefern. Die Begriffe „Proteinprofil" und „Proteine
der Zelle" sollen daher stets so verstanden werden, dass auch andere
Substanzen eingeschlossen sein können.
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Die
Bestimmung des Zustands von Einzelzellen ist aber nicht nur auf
das Auffinden von tumorösen Zellen beschränkt.
So können auch infizierte Zellen gefunden werden, beispielsweise
durch Viren, Chlamydien oder Rikettsien infizierte Zellen. Auch abgestorbene
Zellen können erkannt werden, häufig kann sogar
der Grund für ihren Zelltod gefunden werden.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren erlaubt es, einzelne
Zellen auf ihre Art, Herkunft oder Zustand zu untersuchen, wobei
die wichtigsten nachgesuchten Zustände krankhafte oder
infektiöse Entartungen sind, allen voran tumorartige Entartungen. Der
Vorteil liegt in der objektiven Beurteilung ohne die üblichen
subjektiven Ermessungsspielräume. Tumoröse Zellen
sind in aller Regel sehr klar anhand ihrer Massenspektren zu erkennen,
noch klarer, als das bisher schon für Gewebebereiche in
Dünnschnitten der Fall ist, da die Gewebegebiete in Dünnschichten immer
auch gesunde Zellen enthalten und daher Mischspektren liefern.
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Dieses
Verfahren bietet aber noch einen weiteren Ausblick: Es lassen sich
die Objektträger mit den aufgebrachten Zellen vorsichtig
mit Lösungsmittel waschen, um die Schicht aus Matrixkriställchen
zu entfernen. Es ist dann, trotz der zwischenzeitlichen Aufnahme
der Massenspektren, wieder praktisch der Originalzustand hergestellt.
Die Verletzung der Zellen und die Extraktion eines Teils der Bestandteile
ist praktisch nicht festzustellen. Dieses Präparat kann jetzt
durch beliebige Färbemethoden eingefärbt werden
und steht dann für visuelle Kontrollen, aber auch für
Lehr- oder Lernzwecke zur Verfügung. Die visuellen Kontrollen
können jetzt mit Kenntnis der massenspektrometrischen Untersuchungen
vorgenommen werden. Es kann insbesondere auch gelernt werden, wie
sich verschiedene Zustände visuell darstellen.
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Eine
Aufnahme dieses Bildes kann, wie auch die ursprüngliche
Aufnahme der Zellen für die Bestimmung der Lagekoordinaten,
mit einem Bild aus Falschfarben überlagert werden, das
die Arten oder Zustande der Zellen wiedergibt, wie es für
Dünnschnitte üblich ist. Insbesondere können
die Zellen des nachträglich oder ursprünglich
gewonnenen Abbildes mit arten- oder zustandsbezogenen Falschfarben
eingefärbt werden, wodurch die Arten oder Zustände
der Zellen sichtbar werden. Diese Abbilder können insbesondere
sehr eindrucksvoll auf Computer-Bildschirmen dargestellt werden,
beispielsweise auf dem Bildschirm desjenigen Computers, der auch die
Berechnung der Arten- oder Zustandszugehörigkeit berechnet.
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Das
Verfahren hat die Kraft, sich zu einem Standardverfahren für
die Untersuchung von Einzelzellen zu entwickeln.
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Das
hier geschilderte Verfahren kann vom einschlägigen Fachmann
in Kenntnis der Erfindung in vielfältiger Weise abgeändert
werden. Einige dieser Abänderungen sind bereits oben geschildert;
es gibt aber durchaus weitere Variationen, die auf der grundlegenden
Basis der isolierten Abscheidung und der Bestimmung der Lagekoordinaten
die gewünschten informationsreichen Massenspektren für
einzelne Zellen für die Identifizierung ihrer Art oder
ihres Zustands erzeugen können. Diese abgewandelten Verfahren
sollen hier in dieser Erfindung mit eingeschlossen sein.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
-
- - DE 102004037512
A [0003]
- - DE 102006059695 A [0005, 0035]
- - DE 102004044196 A1 [0006]