ES2711499T3 - Análisis de células biológicas únicas - Google Patents

Abstract

Un método para el análisis de células biológicas individuales, que comprenden las etapas: a) aplicar las células a una placa de soporte mediante centrifugación suave, realización de un frotis o sedimentación; b) registrar una imagen de las células aplicadas por medios ópticos y determinar las coordenadas de posición de las células a partir de la imagen; c) cubrir la placa de soporte con una capa de cristales del material matriz depositando y secando un vaho de solución matriz después de lo cual las células ya no son visibles; d) adquirir espectros de masas individuales de al menos una proporción de las células individuales utilizando las coordenadas de posición, con ionización de los constituyentes celulares por desorción por láser asistido por matriz; y e) evaluar los espectros de masas para determinar los tipos, estados u otros rasgos característicos de las células individuales.

Description

DESCRIPCION

Analisis de celulas biologicas unicas

La invencion se refiere al analisis del tipo, estado u otros rasgos distintivos de las celulas individuals de fluidos corporales, frotis o tejidos.

La invencion comprende las etapas de depositar las celulas, con una minima superposicion posible, sobre un soporte de muestra para espectrometna de masas, determinar las coordenadas de las celulas, cubrir el soporte de muestra con una capa de pequenos cristales de una sustancia matriz, colocar las celulas, dentro de un espectrometro de masas, segun sus coordenadas conocidas con un dispositivo de movimiento dentro de la posicion del foco del laser, adquirir espectros de masas de las celulas individuales con ionizacion de los componentes celulares por desorcion por laser asistida por matriz, y usar los espectros de masas para un analisis del tipo, estado u otros rasgos distintivos de las celulas.

Tecnica anterior

La formacion de imagenes por el analisis por espectrometna de masas de secciones histologicas finas u otras muestras planas con ionizacion de las moleculas de interes usando la desorcion por laser asistida por matriz (MALDI) ha experimentado recientemente un incremento excepcional en popularidad. En general, el metodo se usa para medir las distribuciones de protemas espedficas que, o bien solas o en combinacion con otras protemas, pueden servir como biomarcadores para la visualizacion de diversos organos y, sobre todo, para caracterizar los estados de estres o enfermedad de las regiones individuales de la muestra plana. Actualmente otro metodo no puede caracterizar estos estados de estres o enfermedad de manera tan fiable y rapida. Un metodo de este tipo se describe en la solicitud de patente DE 102004037512.7 (D. Suckau et al., GB 2418773 A, US-2006-0006315-A1). La solicitud de patente GB 2422052 A describe la formacion de imagenes de portaobjetos de tejido y celulas unicas por tanto microscopfa de masas optica como MALDI. Se puede conservar una correlacion entre las imagenes ionicas espedficas y los rasgos histologicos observados por microscopia optica.

En estos procesos, generalmente se aplican secciones finas a portaobjetos de especimen especiales, cuya transparencia permite la observacion microscopica y los cuales estan provistos de una capa conductiva de manera que despues, en el espectrometro de masas, pueden proporcionar un potencial definido para la aceleracion de los iones generados en el mismo.

La muestra plana sobre el portaobjetos de especimen se debe cubrir con una capa de pequenos cristales de la matriz de un modo especial para asegurarse que las protemas y tambien otras sustancias de interes se puedan ionizar eficazmente. Un metodo de cubrimiento particularmente favorable se describe en la solicitud de patente DE 10 2006 059 695.1 (M. Schurenberg, GB 2 446 251 A, US 2008/0142703 A1). Este metodo de pulverizacion o nebulizacion esta opticamente controlado, consiguiendo de ese modo un cobertura reproducible densa con una capa de cristales de la matriz entre 20 y 50 micras de grosor. Las moleculas proteicas, en particular, se sacan de la muestra a la superficie de la capa. En combinacion con perfiles del rayo laser especiales, la capa matriz sorprendentemente, y al contrario de lo que se ha crefdo anteriormente, demuestra una sensibilidad muy alta, de manera que se pueden analizar las protemas mas importantes de incluso regiones muy pequenas de la seccion histologica fina. El entendimiento convencional era que solamente un ion analito se formana a partir de 10.000 moleculas de analito. Sin embargo, por razones que aun no se han entendido, la produccion de iones proteicos a partir de la capa de cristales finos de la matriz parecen ser mayor que este en un factor de al menos 100, y posiblemente 1.000, cuando se usan perfiles del rayo laser especiales.

Cuando se usan perfiles del rayo laser especialmente formados, tales como aquellos presentados en la solicitud de patente DE 102004044 196 A1 (A. Hase et al., GB 2421 352 A, US 7.235.781 B2), el analisis de las protemas se puede restringir a regiones con un diametro de solamente aproximadamente cinco micras. El perfil del rayo laser consiste principalmente en uno o mas puntos del rayo laser, cada uno con un diametro de solamente cinco micras o menos. Debido a la ligera difusion lateral cuando se aplica la capa matriz, la resolucion espacial cuando se mide la distribucion de las moleculas en las muestras planas es normalmente de aproximadamente 20 micras, lo cual es perfectamente adecuado para la mayona de las aplicaciones.

Para obtener una medicion de buena calidad, con alta sensibilidad y buena precision en la medicion de la concentracion, no es suficiente, sin embargo, registrar un espectro unico basado en un unico pulso de laser. Mas bien, se anaden entre 20 y 500 espectros individuales para formar un espectro suma. Cuando, a continuacion, se usa el termino “espectro de masas”, es este espectro suma el que siempre se supone. Si se aprovecha completamente la resolucion espacial tomando las mediciones con una espaciamiento de cuadncula de 20 micras, esto significa que 250.000 espectros de masas, compuestos de muchos millones de espectros individuales, se registraran por cada centimetro cuadrado de seccion fina. Si la velocidad de registro es un espectro de masas por segundo en base a, por ejemplo, 200 espectros individuales registrados a 200 Hz, este proceso tomara aproximadamente 70 horas por centfmetro cuadrado.

Por supuesto, tambien se pueden elegir resoluciones espaciales inferiores; para secciones transversales tomadas por los cuerpos de, por ejemplo, ratones o ratas, espaciamientos de cuadncula de entre 200 y 500 micras permiten una distribucion muy buena de sustancias analito a traves de los organos individuales y espacios intermedios a medir. En la presente memoria solamente 2.500 o 400 espectros de masas respectivamente necesitan ser registrados por centimetro cuadrado; no obstante, estos aun pueden comprender entre cien mil y un millon de espectros individuales. En este caso de nuevo, la capacidad de registrar el espectro individual a una alta frecuencia, preferentemente mas de 1.000 espectros individuales por segundo, es deseable. Sin embargo, estos espectros individuales no se deben tomar desde un punto unico para evitar el sobrecalentamiento de la capa matriz en este sitio. Por lo tanto, es conveniente variar continuamente las coordenadas de registro y, en casos particularmente cnticos, bajar la tasa de registro a, por ejemplo, solamente 200 espectros individuales por segundo.

Sin embargo, no es solo de interes el analisis por espectrometna de masas del estado de los tejidos de partes de secciones histologicas finas, sino tambien el analisis de las celulas individuales de frotis, fluidos corporales o tejidos. Los analisis pueden estar dirigidos a la determinacion del tipo de celulas, o se pueden orientar hacia el estres, enfermedad o infeccion de las celulas individuales. Incluso es interesante la determinacion sencilla de rasgos distintivos, y las razones para los rasgos distintivos no tienen que ser aun conocidas.

Para dicho analisis, las celulas, si no estan ya distribuidas en fluidos corporales, se deben dispersar, separar unas de otras, en un lfquido. El equipo esta comercialmente disponible espedficamente para preparar las celulas a partir de lfquidos sobre portaobjetos de especimen. En la presente memoria, las celulas se aplican a una region pequena del portaobjetos de especimen, por ejemplo un centfmetro cuadrado, mediante centrifugacion suave; se aplanan sin ser danadas, y ocupan un espacio con un diametro de aproximadamente 20 micras. Las celulas de tejidos tales como medula osea tambien se pueden distribuir en lfquidos y, a continuacion, se aplican a portaobjetos de especimen, usando procedimientos especiales. Si el numero de celulas en el lfquido es bastante pequeno, habra muy pocas superposiciones, y el especialista en medicina sera capaz de observar las celulas individualmente bajo un microscopio. Un “numero bastante pequeno” de celulas en la presente memoria significa desde unos pocos cientos hasta un maximo de aproximadamente 10.000 celulas por centfmetro cuadrado. El optimo para el porcentaje mas bajo posible de superposiciones es alrededor de 3.000 celulas por centimetro cuadrado.

El proposito de dicho analisis es con frecuencia determinar la presencia de unas pocas celulas anormales, celulas tumorales por ejemplo, entre un gran numero de celulas normales; esto es una tarea laboriosa y muy agotadora si el especialista en medicina tiene que examinar las celulas visualmente. Para muchos de estos casos, los metodos de tincion o bien no se conocen o con frecuencia no proporcionan contraste muy alto; la deteccion visual de celulas tumorales esta afectada por un gran numero de influencias subjetivas y es diffcil de conseguir un analisis objetivo. Por lo tanto, se requieren metodos automatizables para esta tarea.

Las areas de tejido con celulas anormales, celulas tumorales por ejemplo, en secciones finas pueden, en principio, ser reconocidas como tales en base a sus espectros de masas, aunque estas regiones de tejido normalmente se mezclan con una gran proporcion, con frecuencia hasta 80%, de las celulas sanas. Una solucion obvia es cubrir el portaobjetos de especimen, al cual se han aplicado las celulas, con material matriz, del mismo modo que las secciones finas y, a continuacion, escanearlo en un espectrometro de masas sobre un patron de cuadncula para obtener espectros de masas de las celulas individuales. Si todas las celulas individuales, sin excepcion, son para ser analizadas, el espaciamiento de cuadncula debe ser denso, teniendo una afinacion de como maximo 20 micras. Un area de un centimetro cuadrado, esto conduce al numero, mencionado anteriormente, de 250.000 espectros de masa, incorporando millones de espectros de masas, y al tiempo, tambien mencionado anteriormente, de 70 horas, aunque puedan haber solamente aproximadamente 1.000 a 10.000 celulas sobre la superficie. La gran mayona de los espectros de masas estan vados.

Los metodos de esta clase son solamente posibles si se usan laseres de estado solido. Los laseres de nitrogeno en su mayona usados hasta ahora tienen un tiempo de vida de solamente aproximadamente un millon de pulsos de laser. Los laseres de estado solido tienen un tiempo de vida considerablemente mayor, pero requieren de medidas de formacion de rayo especiales, las cuales pueden, sin embargo, estar disenadas de un modo que es ventajoso al analisis. Los espectros de masas que funcionan con laseres de estado solido ya estan comercialmente disponibles. Cuando en la presente memoria se refiere al “estado de las celulas”, esto se debena entender en el sentido de un estres, un cambio patologico, una infeccion u otro cambio desde un estado metabolico normal del mismo tipo de celula. Como ya se ha explicado, las celulas tumorales son de particular significancia para este metodo; el tejido tumoroso se puede distinguir claramente del tejido sano por espectrometna de masas. En terminos generales, debe ser posible reconocer el estado a partir del patron de concentraciones de sustancia que se pueden detectar en la celula por espectrometna de masas. Las sustancias pueden ser peptidos o protemas que se subexpresan o sobreexpresan, para crear un patron caractenstico. Sin embargo, tambien pueden ser modificaciones postraduccion de protemas o productos de descomposicion (metabolitos), o acumulaciones de otras sustancias, tales como lfpidos en el tejido.

Objetivo de la invencion

El objetivo de la invencion es analizar el tipo y el estado de las celulas individuals con un maximo grado posible de automatizacion.

Breve descripcion de la invencion

La invencion aprovecha el reconocimiento sorprendente de que las celulas individuals pueden en realidad ser analizadas por espectrometna de masas. Usando las medidas anteriormente descritas, la sensibilidad de la deteccion por espectrometna de masas se puede incrementar a un punto en el que los espectros de masas evaluables se pueden obtener a partir de mas de 108 moleculas proteicas en una celula, con aproximadamente 107 moleculas para la protema mas comun y solamente aproximadamente 105 moleculas para una protema a un Kmite deseado de deteccion.

La invencion comprende las etapas segun la reivindicacion 1.

Los espectros de masas de las celulas individuales en diferente estados difieren mas claramente unos de otros que los espectros de masas de regiones de tejido en secciones finas, puesto que estas ultimas en general contienen espectros mezclados. Por tanto, los espectros de masas de celulas tumorosas aisladas y de individuo sano difieren incluso mas profundamente que las regiones de tejido equivalentes en secciones finas.

A traves de la formacion favorable del rayo, el tiempo de registro para 3.000 espectros suma de 3.000 celulas, a una tasa de registro de solamente 200 espectros unicos por segundo, se puede mantener a 20 minutos; a tasa de pulso de laser mayores, los tiempos son incluso mas cortos.

Las celulas se pueden cualquiera aplicar a la placa de soporte mediante centrifugacion suave, los dispositivos para dicho proposito estan comercialmente disponibles. Los portaobjetos de especimen especialmente preparados se pueden usar, por ejemplo, como placa de soporte. Las celulas se pueden aplicar alternativamente haciendo un frotis o por sedimentacion. Para determinar las coordenadas de posicion, los registros microscopicos o las fotos por contacto digitales segun la tecnica anterior son particularmente adecuadas; en la presente memoria de nuevo, los dispositivos tecnicos simples estan en el mercado. El contraste se puede destacar por tincion, o en el caso de los registros microscopicos, por iluminacion de campo oscuro o contraste de fase. Las tecnicas de tincion y los agentes que no interfieren con MALDI son conocidos. Los programas de analisis de imagen para este proposito pueden determinar no solamente las coordenadas de posicion de los centros celulares, sino tambien otros parametros tales como diametro o parametros de superposicion. Los programas de evaluacion de imagen incluso pueden diferenciar ente relativamente pocas celulas de interes y una gran mayona de otras celulas, o bien por tamano, color o forma, para acelerar el proceso de diagnostico. Los dispositivos comerciales estan disponibles para aplicar la capa matriz; sin embargo, dependiendo de los metodos usados, los dispositivos dan diferentes sensibilidades como resultado producciones de ionizacion distintos. Los espectrometros de masas MALDI tambien estan comercialmente disponibles los cuales ofrecen suficiente precision para el movimiento del portaobjetos de especimen y tambien una velocidad bastante alta para registrar los espectros de masas.

Los programas adecuados tambien estan disponibles para determinar el estado de las celulas y otros rasgos distintivos en base a los datos espectrales. El estado finalmente se puede leer a partir de un valor de estado o vector de estado sobre una escala de estado unidimensional o multidimensional; el calculo del valor o vector de estado se basa en la presencia o ausencia de las senales para protemas individuales, y a partir de las relaciones de intensidad entre las senales. El calculo de un valor de estado puede emplear expresiones bastantes complicadas que implican las intensidades de senal I(m), en donde I representa la intensidad y m la masa de los iones asociados con esa senal.

El metodo por el cual se calcula el valor de estado se puede especificar como una formula parametrizada, pero por otra lado se puede usar un analisis matematico-estadfstico de generacion de clase, con o sin instruccion inicial (programas de ensenanza supervisados o no supervisados). Los valores de estado o vectores de estado se pueden usar para representar los estados en color falso sobre una imagen microscopica.

Breve descripcion de las ilustraciones

La Figura 1 muestra un detalle de una placa de soporte con celulas que se han aplicado mediante centrifugacion suave. Cada una de las celulas aplanadas, casi circulares, tiene un nucleo localizado cerca del centro de la celula. En esta figura, las celulas tienen una forma muy uniforme, en otros casos, las celulas pueden tener formas, colores o tamanos bastantes diferentes.

Las mejores realizaciones

La invencion puede estar dirigida principalmente a la determinacion del tipo o la identidad de las celulas, que significa el tipo de organo o tejido del cual viene. Los espectros de masas de las celulas normalmente revelan su origen, lo cual con frecuencia se pueden limitar muy precisamente a una subregion particular u organulo de un organo.

Ademas, la invencion pueden servir para determinar el estado de una celula individual, causado por una edad de crecimiento particular, nutriente, estres qmmico o tisico, degeneracion por una enfermedad, o infeccion. El estres qmmico, por ejemplo, se puede generar por farmacos, y el estres tisico por el efecto de la temperature o la radiacion; ambas pueden conducir a dano celular importante.

La invencion se puede usar para investigar un gran numero de celulas individuales para diferencias conocidas o desconocidas, todavfa previamente no descubiertas, entre diferentes clases de celula. Las diferencias entre las clases se pueden identificar automaticamente por programas estadfsticos en base a diversos rasgos que aparecen en los espectros de masas. Las diferencias en estos rasgos se pueden atribuir a diversas subespecies de las celulas de un tejido u organo, a diferencias en su funcion, o a otras diferencias en el estado celular, tal como aquellas resultantes de diferente dieta o estres.

Los tipos de celulas y muchos de sus estados y otras caracteristicas se reflejan en la composicion cuantitativa, o incluso cualitativa, de las sustancias en el interior de las celulas, de manera que en casi todos los casos estas diferencias se pueden detectar en los espectros de masas de MALDI.

La invencion es, por ejemplo, de particular importancia para la deteccion automatizada de celulas tumorales, particularmente la deteccion de un numero muy pequeno de celulas tumorales entre una gran mayoria de celulas sanas. Es sorprendente que a partir de los constituyentes de una celula unica, en particular las protemas, la ionizacion por desorcion por laser asistida por matriz puede producir espectros de masas que ofrecen procedimientos de analisis tan eficaces que se puede lograr un tarea de esta naturaleza.

La invencion basicamente consiste en analizar individualmente un gran numero de celulas biologicas, comprendiendo las siguientes etapas:

a) aplicar las celulas a una placa de soporte;

b) determinar las coordenadas de posicion de las celulas;

c) aplicar una capa de cristales del material matriz

d) adquirir los espectros de masas individuales de al menos una proporcion de las celulas individuales utilizando las coordenadas de posicion, con ionizacion de los constituyentes celulares por desorcion por laser asistida por matriz; y e) evaluar los espectros de masas para determinar el tipo, estado u otros rasgos caracteristicos de las celulas. En la etapa a) las celulas se aplican, tan aisladas como sea posible unas de otras, a una placa de soporte tal como un portaobjetos de especimen que tambien se puede usar como un soporte de muestra para espectrometria de masas. Para proporcionar un potencial electrico definido en los espectrometros de masas, la superficie de la placa de soporte deberia ser electricamente conductiva. Pero la placa de soporte no tiene que ser transparente; otras placas de soporte, tales como las placas de metal, se pueden usar, siempre que sea posible conseguir imagenes suficientemente buenas de las celulas aplicadas.

Las celulas se pueden aplicar en la etapa a) usando un metodo tal como centrifugacion moderada de un lfquido; directamente del fluido corporal, por ejemplo. En esta fase es necesario asegurarse de que no mas de aproximadamente 10.000 celulas se aplican a cada centimetre cuadrado para mantener el numero de superposiciones pequeno. Una figura de alrededor de 3.000 celulas por centimetre cuadrado es favorable, pero tambien hay otras aplicaciones diagnosticas utiles o de investigacion en las que se aplican solamente aproximadamente cien o menos celulas. Las celulas pueden estar ya contenidas en el fluido cuando se separan del cuerpo, o se pueden anadir al fluido como celulas de tejido separadas, como en el caso de las celulas de biopsias de medula osea. Las celulas de tejido se pueden separar disolviendo los enlaces intercelulares, por ejemplo, por separacion enzimatica. Ademas, las celulas se pueden seleccionar usando un clasificador celular, aunque esto no es necesario. La centrifugacion suave aplana las celulas sobre el soporte sin danarlas; asf adoptan una forma casi circular con un diametro de aproximadamente 10 a 25 micras, con el nucleo celular casi exactamente en el centro de la celula. A continuacion, las celulas aplicadas normalmente se secan, como resultado de lo cual se unen firmemente a la placa de soporte.

En la etapa a) las celulas tambien se pueden aplicar usando otros metodos tales como la realizacion de un frotis, sedimentacion sencilla de un fluido con posterior decantacion y secado, o por microdiseccion asistida por laser. En la presente memoria tambien, el secado causa que las celulas inicialmente perdidas se encojan, aplanen y adhieran al soporte.

Una vez que las celulas se han aplicado a la placa de soporte, se pueden observar con medios opticos, tales como un microscopio. En la Figura 1 se muestra una foto esquematica de celulas muy uniformes sobre un soporte de muestra; sin embargo, las celulas no podnan ser asf de uniformes en otros casos. Se pueden aplicar colorantes para aumentar el contraste; se sabe que los agentes de tincion no interfieren con los registros de espectrometria de masas tomados con MALDI. Un microscopio con iluminacion de campo oscuro, la cual muestra las celulas brillantes frente a un fondo oscuro, es particularmente favorable. Las imagenes digitales se pueden producir por fotogratia microscopica, o tomar por contacto directo en dispositivos relativamente sencillos; preferiblemente se debena alcanzar una resolucion de aproximadamente dos micras. Dichas imagenes digitales se pueden emplear para determinar las coordenadas de posicion de las celulas.

Los programas de ordenador evaluadores de imagenes son conocidos y ampliamente usados. Se pueden usar para determinar el centro de las celulas circulares asf como otros parametros tales como el diametro, no circularidad, y el grado y direccion de la superposicion. Las coordenadas de posicion y algun otro parametro asociado se almacenan en un listado informatizado, el cual mas tarde se usa como la base para la medir los espectros de masas. Las coordenadas de posicion se refieren a puntos de marcacion especiales sobre la placa de soporte, los cuales tambien se pueden detectar durante la posterior medicion por espectrometna de masas.

La evaluacion de imagenes tambien se puede usar para buscar, seleccionar y marcar subgrupos particularmente de interes de celulas entre grandes numeros de celulas “normales”, si estas son visualmente reconocibles. La marcacion de las celulas de interes puede acortar considerablemente el analisis por espectrometna de masas. La seleccion se puede referir al tamano, forma o color de las celulas, posiblemente despues de la tincion. Un ejemplo puede ser la seleccion del subgrupo de un tipo particular de leucocitos tenibles en sangre que consiste principalmente en una mayona aplastante de eritrocitos.

Una vez que se ha creado el listado de las coordenadas de posicion, la placa de soporte, con las celulas aplicadas a ella, se cubre de un modo apropiado en la etapa c) con una capa de cristales pequenos de la matriz. El metodo se describe en la solicitud de patente DE 102006 059695.1 (M. Schurenberg), citada anteriormente. En la presente memoria, las nubes de gotas de vaho separadas de la solucion matriz se depositan sobre la placa de soporte, a partir de lo cual se forman cristales de la matriz extremadamente finos durante el proceso de secado, y cada capa se seca casi completamente. El proceso se controla midiendo la luz de dispersion. La aplicacion repetida de las capas de gotas de vaho separadas causa que las protemas se extraigan de las celulas y, asf parece, se transportan en una forma muy purificada a la superficie de la capa de cristal, como resultado de lo cual la ionizacion en el proceso de MALDI produce una produccion extremadamente alta de iones proteicos. Al final, la placa de soporte parece similar a un paisaje cubierto con escarcha fina; las celulas ya no son visibles. El grosor de la capa depende de la produccion de ionizacion optima y, sorprendentemente, es relativamente gruesa, a aproximadamente 20 a 50 micras. La difusion lateral de las protemas es relativamente baja, siendo menos de 15 micras.

La medicion por espectrometna de masas de los perfiles proteicos se lleva a cabo favorablemente en el vado del espectrometro de masas, aunque los ensayos razonablemente exitosos han generado iones fuera del espectrometro de masas en el gas ambiente que usa MALDI. Loa espectrometros de masas con tiempo de vuelo MALDI en vado estan normalmente equipados con dispositivos de movimiento suficientemente precisos para las placas de soporte. Las celulas individuales, cuyas coordenadas de posicion son conocidas, se mueven por el dispositivo de movimiento de la fuente de iones del espectrometro de masas a la localizacion del foco del laser de UV pulsado firmemente montado. Se puede realizar una eleccion entre solamente medir las celulas completamente aisladas o tambien medir las celulas que se superponen por no mas de un umbral dado. En el caso de celulas que se superponen, la difusion lateral de las moleculas proteicas facilmente pueden dar como resultado espectros mezclados, los cuales no pueden administrar ningun descubrimiento concluyente. Cuando las celulas se superponen, es posible acercar las celulas de manera descentralizada de tal modo que se eviten esos espectros mezclados tanto como sea posible. Con celulas muy grandes se ha mostrado favorable para evitar el movimiento al centro de la celula, ya que este es donde el nucleo se localiza en la gran mayona de los casos; las senales del nucleo puede enmascarar las protemas de la celula.

Los laseres UV pulsados con duraciones de pulso de entre 0,1 y 10 nanosegundos se usan para la ionizacion. Los pulsos de laser cortos por debajo de un nanosegundo son preferidos debido a que incrementan la produccion ionica. Las lentes especiales permiten diametros del foco del laser de 5 micras o menos; tambien es posible generar o bien uno o varios puntos focales que se dan simultaneamente. Para la presente tarea es, por ejemplo, favorable usar tres o cuatro puntos focales dispuestos como un triangulo o cuadrado, con sus puntos centro aproximadamente 10 micras aparte, puesto que el numero absoluto de iones formados se aumenta con el numero de puntos focales. Por otro lado, no se debenan usar mas puntos focales que este ya que luego ya no es posible apuntar a una unica celula. Cada uno de los puntos focales del laser se debenan mover un poco desde un pulso al proximo, de manera que no se mezcle el conglomerado de cristales de la matriz. Los cristales de la matriz tienen diametros de casi una micra. Se debena generar un tipo de movimiento que preferiblemente barra el area de la celula uniformemente en pulsos de laser consecutivos, por ejemplo, un movimiento cicloidal circulante.

El uso de cuatro puntos focales permite que el numero de espectros individuales necesario para generar un espectro de masas bien evaluable se reduzca a alrededor de 50 disparos de laser. A una tasa de pulso de laser de 200 Hz, por lo tanto, es posible registrar aproximadamente tres espectros de masas, que pertenecen a tres celulas, cada segundo, incluyendo los tiempos de transito de la placa de soporte de muestra. Por lo tanto, si 3.000 celulas se aplican a una placa de soporte, se requieren aproximadamente 20 minutos para registrar los espectros de masas de todas las celulas. Estos son tiempos muy aceptables que hacen que la aplicacion rutinaria del metodo valga la pena recomendar. Los tiempos como este pueden competir con la inspeccion visual, ademas de lo cual el metodo es menos agotador. Sobre todo, el metodo es mas objetivo y es enteramente reproducible. La probabilidad de una falsa determinacion se reduce significativamente. Ya no hay ninguna cuestion de decisiones intencionadas.

Se han desarrollado programas para evaluar los espectros de masas que hasta ahora se han usado para la formacion de imagenes por espectrometna de masas sobre secciones de tejido finas. Por tanto, estos programas corresponden a la tecnica anterior, y son familiares para los expertos en la tecnica. Por ejemplo, pueden caracterizar ciertos estados de las celulas de un tejido usando la escala de valor de los valores de estado o, en el caso de evaluacion multidimensional, la escala de valor de los vectores de estado; los valores de estado se calculan como expresiones matematicas, las cuales se pueden componer de cualquier medio deseado a partir de las senales I(m). Los valores de estado pueden ser unidimensionales o, como los vectores de estado, tambien pueden ser multidimensionales, lo cual permite la asignacion a diversas clases de tipo y estado. La forma mas favorable de las expresiones matematicas para calcular los valores de estado se pueden obtener de un analisis matematicoestadfstico de espectros de masas obtenidos a partir de celulas precisamente caracterizadas de diferentes tipos o estados.

Los programas para evaluar los espectros de masas tambien pueden usar rutinas matematicas/estadfsticas que son independientemente capaces de determinar las clases en base a diversos rasgos de caracterizacion, calcular las expresiones de generacion de clase para los rasgos distintivos. En la presente memoria es posible especificar las clases, por ejemplo, marcando las celulas de interes sobre la imagen presentada digitalmente (“programas de aprendizaje supervisado”). Otros programas forman clases automaticamente (“programas de aprendizaje no supervisado”, “analisis de conglomerados (“analisis cluster”)”). Estos metodos tambien pertenecen a la tecnica anterior.

El termino “espectro de masas” con frecuencia se usa en la presente memoria para referirse a un perfil proteico. Sin embargo, se debena indicar que los perfiles pueden relacionarse con sustancias que no son protemas, o que incluyen otras sustancias ademas de protemas. Con frecuencia se encuentran lfpidos, por ejemplo, y tambien se sabe que estos proporcionan un patron caractenstico para el material tumoroso. Por lo tanto, los terminos “perfil proteico” y “protemas de la celula”, se debenan siempre entender como que potencialmente incluyen otras sustancias.

Sin embargo, la determinacion del estado de las celulas individuales no esta restringida al descubrimiento de celulas tumorosas. Tambien se pueden encontrar celulas infectadas, tales como aquellas infectadas por virus, Chlamydiae o Rickettsia. Las celulas que han muerto tambien se pueden detectar y en muchos casos es incluso posible determinar la razon de la muerte de la celula.

El metodo segun la invencion permite que se investigue el tipo, origen o estado de una celula individual; los estados mas importantes de interes son anormalidades patologicas o infecciosas, la mayona particularmente anormalidades tipo tumor. La ventaja cae en la valoracion objetiva, no implicando el espacio normal para la opinion subjetiva. Las celulas tumorosas, en casi todos los casos, se pueden detectar muy claramente en base a sus espectros de masas, incluso mas claramente que ha sido hasta ahora el caso para regiones en secciones finas, puesto que estas regiones tambien siempre contienen celulas sanas, y por lo tanto, administran espectros mezclados.

El metodo se abre a otra perspectiva: los portaobjetos de especimen a los cuales se han aplicado las celulas se pueden lavar cuidadosamente con disolvente para separar la capa de cristales de la matriz. A continuacion, a pesar del registro de los espectros de masas que ha tenido lugar mientras tanto, se restaura una condicion muy cercana al original. El dano a las celulas, y la extraccion de parte de sus constituyentes, es practicamente indetectable. Este especimen ya se puede tenir por cualquier metodo de tincion apropiado y, a continuacion, esta disponible para los chequeos visuales, o para propositos de ensenanza o estudio. Los chequeos visuales ya se pueden hacer en el conocimiento de las investigaciones por espectrometna de masas. Es, en particular, posible estudiar la apariencia visual de diferentes estados celulares.

Un registro de esta imagen, como la imagen original de las celulas que se uso para determinar las coordenadas de posicion, se puede cubrir con una imagen en color falso, reflejando los tipos u estados de las celulas, como es habitual para las secciones finas. En particular, las celulas, o bien en la imagen que se ha obtenido despues de la espectrometna de masas o en la imagen original, se pueden colorear con colores falsos segun su tipo o estado, haciendo asf visibles los tipos o estados de las celula. Estas imagenes se pueden, en particular, mostrar muy impresionantemente sobre las pantallas de ordenador, por ejemplo, sobre la pantalla del ordenador que tambien calcula la asignacion de los tipos o estados.

El metodo tiene el potencial de desarrollarse dentro de un procedimiento convencional para el examen de celulas individuales.

El metodo indicado en la presente memoria puede ser modificado de muchos modos por un experto en la tecnica que tiene el conocimiento de la invencion. Algunas de estas modificaciones ya se han indicado anteriormente; sin embargo, ciertamente hay otras variaciones que pueden generar los espectros de masas ricos en informacion deseados para las celulas individuales que se requiere identificar su tipo o su estado sobre la base fundamental de su disposicion separada seguido de la determinacion de las coordenadas de posicion. Estos metodos modificados estan incluidos en la invencion.

Claims (17)

REIVINDICACIONES

1. Un metodo para el analisis de celulas biologicas individuals, que comprenden las etapas:

a) aplicar las celulas a una placa de soporte mediante centrifugacion suave, realizacion de un frotis o sedimentacion; b) registrar una imagen de las celulas aplicadas por medios opticos y determinar las coordenadas de posicion de las celulas a partir de la imagen;

c) cubrir la placa de soporte con una capa de cristales del material matriz depositando y secando un vaho de solucion matriz despues de lo cual las celulas ya no son visibles;

d) adquirir espectros de masas individuales de al menos una proporcion de las celulas individuales utilizando las coordenadas de posicion, con ionizacion de los constituyentes celulares por desorcion por laser asistido por matriz; y e) evaluar los espectros de masas para determinar los tipos, estados u otros rasgos caractensticos de las celulas individuales.

2. Un metodo segun la reivindicacion 1, en donde las placas de soporte son portaobjetos de especimen.

3. Un metodo segun la reivindicacion 1, en donde las celulas sobre la placa de soporte se tinen.

4. Un metodo segun la reivindicacion 1, en donde las coordenadas de posicion determinadas estan relacionadas con las posiciones de referencia que tambien se pueden detectar en el espectrometro de masas.

5. Un metodo segun la reivindicacion 1, en donde la imagen optica se obtiene con un microscopio.

6. Un metodo segun la reivindicacion 5, en donde la iluminacion del campo oscuro o el contraste de fase se usa en el microscopio.

7. Un metodo segun la reivindicacion 1, en donde los subgrupos de celulas se seleccionan de la imagen segun su tamano, forma, o color, y se marcan para el analisis por espectrometna de masas.

8. Un metodo segun la reivindicacion 1, en donde la ionizacion de los constituyentes de una celula se consigue por desorcion por laser asistida por matriz usando un laser de estado solido de U^v pulsado con un perfil de rayo con forma.

9. Un metodo segun la reivindicacion 8, en donde el perfil del rayo contiene un numero de puntos focales finos adyacentes.

10. Un metodo segun la reivindicacion 1, en donde el espectro de masas de una celula consiste en la suma de entre 20 y 500 espectros de masas individualmente adquiridos de la celula.

11. Un metodo segun la reivindicacion 10, en donde un valor de estado o vector de estado que caracteriza el tipo, estado u otros rasgos distintivos de la celula se calcula a partir del espectro de masas de cada celula.

12. Un metodo segun la reivindicacion 1, en donde despues del analisis por espectrometna de masas de alguna o todas las celulas, la capa de cristales de la matriz se separa de la placa de soporte, de manera que las celulas, posiblemente despues de tenirse, estan disponibles para el examen visual en el conocimiento de los resultados de la espectrometna de masas.

13. Un metodo segun la reivindicacion 1, en donde las celulas sobre una imagen de las celulas sobre la placa de soporte se dan por coloracion falsa segun su tipo o estado, haciendo asf visibles los tipos o estados de las celulas.

14. Un metodo segun la reivindicacion 1, en donde el analisis de los espectros de masas en la etapa e) tambien incluye la determinacion de clases celulares coherentes conocidas o anteriormente desconocidas.

15. Un metodo segun una de las reivindicaciones 1 a 14, en donde las celulas biologicas individuales son de un fluido corporal, un frotis o tejido de medula osea proporcionadas como celulas separadas en un fluido.

16. Un metodo segun una de las reivindicaciones 1 a 15, en donde no mas de aproximadamente 10.000 celulas se aplican a la placa de soporte por centimetro cuadrado.

17. Un metodo segun una de las reivindicaciones 1 a 16, en donde las celulas se colocan con un dispositivo de movimiento dentro de la posicion del foco del laser segun sus coordenadas de posicion determinadas.