DE19617011C2 - Matrixkomponentengemisch für die matrixunterstützte Laserdesorption und Ionisierung sowie Verfahren zur Zubereitung eines Matrixkomponentengemisches - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Matrixkomponentengemisch für matrixunterstützte Laserdesorption und Ionisierung großer Analytmoleküle (MALDI) im Vakuum für die Erzeugung von Ionen für die massenspektrometrische Untersuchung der Analytsubstanz, sowie Verfahren zu deren Zubereitung. DOLLAR A Die Erfindung besteht darin, die Matrixsubstanz für die Unterstützung der Desorption aus mindestens zwei verschiedenartigen Komponenten zu bilden, wobei eine Komponente eine Substanz sein soll, die einerseits sehr adsorptiv, aber andererseits thermolytisch in kleine Moleküle zersetzbar ist. Eine weitere Komponente übernimmt die Protonierung der Analytmoleküle. Besonders geeignet ist eine dünne Schicht aus Nitrozellulose (korrekter: Zellulosenitrat), in der eine protonierende Substanz eingebettet ist. Die in Wasser unlösliche Schicht adsorbiert die großen Analytmoleküle aus wässeriger Lösung an ihrer Oberfläche.

Description

Die Erfindung betrifft ein Matrixkomponentengemisch für matrixunterstützte Laserdesorption und Ionisierung großer Analytmoleküle (MALDI) im Vakuum für die Erzeugung von Ionen für die massenspektrometrische Untersuchung der Analytsubstanz sowie ein Verfahren zu dessen Zubereitung.

Das Verfahren der massenspektrometrischen Untersuchungen von großmolekularen Analyt­ substanzen mit Ionisierung durch laserinduzierte Desorption besteht darin, den Probenträger mit oberflächlich aufgebrachter Analytsubstanz einem Lichtpuls aus einem Laser auszusetzen, der auf die Probenoberfläche fokussiert wird. Dieser Lichtpuls erzeugt Ionen der Analytmole­ küle, die dann mit ionenoptischen Mitteln der massenspektrometrischen Analyse zugeführt werden. Es finden dabei insbesondere Flugzeitmassenspektrometer, aber auch ionenspeichern­ de Massenspektrometer, wie Hochfrequenz-Quadrupol-Ionenfallen (häufig einfach "Ionen­ fallen" genannt) oder Ionen-Zyklotron-Resonanz-Massenspektrometer ("ICR-Spektrometer"), Anwendung.

Ein naheliegender Stand der Technik ist in US 5,118,937 A (Hillenkamp, Karas und Gieß­ mann) gegeben, in dem Biomoleküle mit Laserwellenlängen oberhalb von 300 Nanometer be­ strahlt werden, weil die Biomoleküle in diesem Bereich der Wellenlängen praktisch keine Ab­ sorption zeigen.

Für den besonderen Fall der Flugzeitmassenspektrometrie wird der Probenträger konstant auf eine Hochspannung zwischen 6 und 30 Kilovolt gelegt, dem in einer Entfernung von 10 bis 20 Millimetern eine Grundelektrode auf Erdpotential gegenüberliegt. Ein Laserpuls von typi­ scherweise etwa 4 Nanosekunden Dauer übernimmt die Ionisierung. Die Ionen werden durch das elektrische Feld zur Grundelektrode hin beschleunigt und erhalten dabei alle die gleiche kinetische Energie. Jenseits der Grundelektrode befindet sich die feldfreie Flugstrecke des Flugzeitmassenspektrometers. Am Ende der Flugstrecke werden die ankommenden Ionen de­ tektiert, aus ihrer Flugzeit lässt sich - bei gleicher kinetischer Energie - ihre Masse bestimmen.

Bei Verwendung von ionenspeichernden Massenspektrometern wie Quadrupol-Ionenfallen oder ICR-Spektrometern werden die desorptiv erzeugten Ionen mit ionenoptischen Mitteln in die Speicherzellen der Massenspektrometer überführt und dort massenspektrometrisch unter­ sucht.

Für die Ionisierung von großen Analytmolekülen durch die weithin bekannte matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI = matrix assisted laser desorption and ionization), die in den vergan­ genen Jahren eine große Verbreitung gefunden hat, werden die großen Moleküle der Analyt­ substanz auf dem Probenträger in eine Schicht winziger Kristalle einer niedermolekularen Mat­ rixsubstanz eingelagert. Der Laserlichtpuls verdampft praktisch momentan eine geringe Menge der Matrixsubstanz. Die Dampfwolke nimmt zunächst praktisch den gleichen Raum ein wie die Festsubstanz, steht also unter hohem Druck. Auch die großen Analytmoleküle werden in die zunächst winzige Dampfwolke überführt. Bei der Bildung der Dampfwolke wird ein geringer Teil der Moleküle, und zwar sowohl der Matrix- wie auch der großen Analytmoleküle, ioni­ siert. Anschließend dehnt sich die Dampfwolke in einem adiabatischen und isentropischen Pro­ zess ähnlich einer Explosion in das umgebende Vakuum aus. Solange während der Ausdeh­ nung der Dampfwolke noch Kontakt der Moleküle untereinander besteht, findet durch Ionen- Molekül-Reaktionen eine fortgesetzte Ionisierung der großen Analytmoleküle auf Kosten der kleineren Matrixionen statt.

Die ins Vakuum expandierende Dampfwolke beschleunigt durch ihre adiabatische Ausdehnung nicht nur die Moleküle und Ionen der Matrixsubstanz, sondern durch viskose Mitnahme auch die Moleküle und Ionen der Analytsubstanz. Dehnt sich die Wolke in einem Raum aus, der frei von elektrischen Feldern ist, so erreichen die Ionen mittlere Geschwindigkeiten von etwa 700 Metern pro Sekunde; die Geschwindigkeiten sind dabei weitgehend unabhängig von der Masse der Ionen, haben aber eine große Geschwindigkeitsstreuung, die von etwa 200 bis zu 2000 Metern pro Sekunde reicht. Es ist anzunehmen, dass auch die neutralen Moleküle diese Ge­ schwindigkeiten besitzen.

Die große Streuung der Anfangsgeschwindigkeiten bei laserinduzierter Ionisierung beeinträch­ tigt und begrenzt die Massenauflösung der Flugzeitmassenspektrometer; es gibt jedoch eine einfache Methode, die Ionen wieder zeitlich zu fokussieren und damit das Auflösungsvermögen zu verbessern. Das Prinzip dieser Methode ist einfach: Die Ionen der Wolke werden zunächst für eine kurze Zeit in einem feldfreien Raum ohne jede elektrische Beschleunigung fliegen ge­ lassen. Die schnelleren Ionen entfernen sich dabei weiter von der Probenträgerelektrode als die langsamen, aus der Geschwindigkeitsverteilung der Ionen ergibt sich eine Ortsverteilung. Erst dann wird plötzlich die Beschleunigung der Ionen durch ein homogenes Beschleunigungsfeld, also einem Feld mit linear abfallendem Beschleunigungspotential, eingeschaltet. Die schnelleren Ionen befinden sich dann weiter von der Probenträgerelektrode entfernt, somit auf einem etwas geringeren Anfangspotential für die Beschleunigung, das ihnen eine etwas geringere Endge­ schwindigkeit für die Driftstrecke des Flugzeitspektrometers vermittelt als den zu Beginn lang­ sameren Ionen. Bei richtiger Wahl der Zeitverzögerung für den Einsatz der Beschleunigung ("time lag") können die zu Beginn langsameren, aber nach Beschleunigung schnelleren Ionen die zu Beginn schnelleren, aber nach Beschleunigung langsameren Ionen genau am Detektor wieder einholen. Es werden somit Ionen gleicher Masse am Ort des Detektors in bezug auf die Flugzeit in erster Ordnung fokussiert.

Für die anderen genannten Arten der Massenspektrometrie ist die Streuung der Anfangsener­ gien ebenfalls schädlich, da sie den Einfangprozess der Ionen in den Speicherzellen erschwert. Hier ist noch keine Methode zur Verbesserung des Einfangs durch Homogenisierung der An­ fangsenergien bekannt.

Die Ionisierung durch MALDI ist bisher nicht automatisierbar, weil noch keine gleichmäßige Verdampfung und Ionisierung erreicht werden konnte. Die Kristallschicht der Matrixsubstanz wird gewöhnlich durch Eintrocknen eines Tröpfchens, in dem Matrix und eine geringe Menge des Analyts gleichzeitig gelöst sind, erhalten. Die Schicht gleicht einer wüst gewachsenen Großstadt, in der Areale mit Hochhäusern und solche mit kleinen Villen oder sogar Buden durcheinander angeordnet sind. Es ist daher Stand der Technik, die Schicht der Matrixkristalle mit einer videomikroskopischen Einrichtung zu beobachten, und visuell eine durch Erfahrung vielversprechende Stellen der Kristallschicht auszusuchen. Selbst bei einem solchen visuellen Aussuchen geeigneter Stellen muss man immer noch probieren, bis man eine geeignete Stelle findet, die ein Spektrum genügender Intensität und Massenauflösung liefert. - Nur für wenige Matrixsubstanzen sind andere Verfahren mit glatter Untergrundschicht aus Matrixsubstanz bekannt geworden, die etwas gleichmäßigere Ergebnisse liefern. Diese haben sich aber bisher nicht durchgesetzt, weil diese Matrixsubstanzen nur für ausgesuchte Analytsubstanzen einsetz­ bar sind.

Es ist nämlich bisher nicht einmal vorhersagbar, welcher Analyt mit welcher Matrix erfolgreich zusammengebracht werden kann. Matrixsubstanzen nehmen manche Analytmoleküle nicht in die Kristalle auf, in anderen Fällen sind Matrixsubstanzen nicht für die Ionisierung der Analyt­ moleküle geeignet. Auch hier ist immer wieder Probieren angesagt. Eine Automatisierung braucht aber ein Ionisierungsverfahren, das unabhängig von der Art der Analytsubstanzen re­ gelmäßig zufriedenstellend arbeitet. Ein solches Verfahren wurde bisher noch nicht gefunden.

Es ist die grundsätzliche Aufgabe der Erfindung, das MALDI-Verfahren so abzuwandeln, dass eine automatisierbare Probenvorbereitung und automatisierbare Ionisierung erreicht wird. Im besonderen muss die Probe ohne experimentelle Suche nach der besten Matrixsubstanz auto­ matisch auf den Probenträger aufgebracht werden können. Sie muss ferner blind und ohne Su­ che nach einem optimalen Beschusspunkt der Laserstrahlung ausgesetzt werden können und dabei eine für Spektrenintensität und Massenauflösung optimale Ionenbildung erreichen. Für die Flugzeitmassenspektrometrie soll insbesonders eine gleichmäßige Wolkenbildung erreicht werden, die günstige Voraussetzungen für die verbesserte Fokussierung durch verzögerte Be­ schleunigung schafft. Insgesamt soll das Verfahren eine hohe Ionenausbeute und damit ein ho­ he Empfindlichkeit liefern, um mit eingesetzten Probenmengen von nur wenigen Femtomol arbeiten zu können.

Die Matrixsubstanz muss gegenwärtig folgende vier getrennte Aufgaben gleichzeitig erfüllen, wobei stets nur ein gewisser Kompromiss erreicht werden kann:

• 1. sie muss die Analytmoleküle einzeln (nicht als Cluster) in ihre Kristalle aufnehmen und über das Aufwachsen der Kristalle auf dem Probenträger festhalten;
• 2. sie muss das Licht der Laserstrahlung effektiv absorbieren und so in kürzester Zeit genü­ gend Energie für die momentane Verdampfung aufnehmen;
• 3. während der Verdampfung muss sie eine solch hohe Plasmatemperatur erreichen, dass ein nicht zu kleiner Bruchteil der Moleküle ionisiert vorliegt, andererseits darf die Matrixsub­ stanz nicht - etwa durch Zersetzung - ihre zur Ionisierung befähigenden Eigenschaften verlieren; und
• 4. sie muss dann im anschließenden Ionisierungsprozess die großen Analytmoleküle durch Protonierung ionisieren.

Die erste Komponente kann die Aufgabe der gleichmäßigen Bildung einer Plasmawolke am besten erfüllen, wenn sie sich bei Laserlichtbeschuss explosiv in kleine Moleküle zersetzt. Als besonders vorteilhaft bieten sich hier Sprengstoffe wie beispielsweise Trinitrotoluol (TNT) an, die sich bei Erhitzung durch den Laserstrahl exotherm in die kleinen Moleküle Wasser, Koh­ lenmonoxid, Kohlendioxid, Stickstoff und Wasserstoff zersetzen.

Ein hervorragende Kombination einer hochadsorptiven, polymer strukturierten Substanz mit erwünschtem Sprengstoff-Charakter ist die Nitrozellulose (korrekter: Zellulosenitrat, Kurzzei­ chen nach DIN: CN), deren Explosivität sich darüber hinaus durch den Grad der Nitrierung einstellen lässt. Man spricht bei Stickstoffgehalten zwischen 10,5 und 12,5% von Zellulosedi­ nitrat (Collodiumwolle), bei solchen zwischen 12,5 und 14,14% von Zellulosetrinitraten (Schießbaumwolle). Beide Sorten verpuffen bei Erhitzung, die Verpuffungsheftigkeit nimmt mit höherer Nitrierung zu. Zellulosenitrate bestehen aus etwa 100 bis 3500 teil- bis voll-nitrier­ ten Glukose-Einheiten.

Die Aufgabe der Lichtabsorption kann durch eine Derivatisierung des Zellulosenitrats gelöst werden, wobei absorptive Molekülgruppen in das Zellulosegerüst eingebaut werden. Durch Wahl der Molekülgruppen kann man sich an die Wellenlänge des verwendeten Lasers anpas­ sen. - Es ist aber auch möglich, diese Aufgabe der Lichtabsorption einer dritten Matrixsubstanz zu übertragen. Zellulosenitrat ist hervorragend färbbar, und kann somit für beliebige Wellen­ längen undurchsichtig gemacht werden.

Vorteilhaft wird das Zellulosenitrat in Azeton gelöst als Lackschicht auf den Probenträger auf­ gebracht. Damit wird eine gleichmäßige Schicht erzeugt, die Grundvoraussetzung für die Au­ tomatisierbarkeit der Probenvorbereitung und der Ionisierung ist. Aus Zellulosenitrat werden technisch die Nitrolacke hergestellt. Nitrolacke verwenden meist das weniger nitrierte Zellulo­ sedinitrat als Grundstoff.

Die Zellulosegrundstruktur ist besonders günstig für die oberflächliche Bindung der Analyt­ moleküle wegen ihrer besonders starken Adsorptivität. Da Nitrozellulose nicht in Wasser lös­ bar ist, kann man Proteine, wasserlösliche Polymere und andere großmolekulare Analyt­ substanzen sehr einfach aus wässeriger Lösung auf die Lackschicht aufbringen. Nitrozellulose wird häufig für Blotmembranen verwendet; sie hat gegenüber anderen, meist teureren Blot­ membranen den Nachteil, dass die Analytmoleküle sehr fest, für viele Untersuchungsmethoden zu fest, an der Oberfläche haften. Dieser Nachteil ist im vorliegenden Fall ein Vorteil. Die wäs­ serige Lösung von hochmolekularen Analytsubstanzen wie Proteinen enthält neben den Ana­ lytmolekülen häufig noch stabilisierende Puffersalze und andere für den Ionisierungsprozess schädliche Bestandteile. Die feste Haftung der Analytmoleküle und die Wasserunlöslichkeit der Nitrozellulose ermöglicht ein leichtes und verlustarmes Waschen der aufgebrachten großmole­ kularen Analytsubstanz.

Sprengstoffe mit ihrer exothermen Zersetzung führen auch gleichzeitig zu einer sehr konstan­ ten Wolkenbildung; kleinere Energieunterschiede im Laserlichtstrahl spielen eine untergeord­ nete Rolle. Der Sprengstoff wird dabei so dünn aufgetragen (teilweise nur Bruchteile eines Mikrometers), dass ein selbständiges Nachbrennen in Nachbarbereiche unterbleibt, da der Pro­ benträger stark kühlt und die Verbrennung löscht. Im Gegensatz zu normalem MALDI, bei dem man Laserlichtfokusdurchmesser von 100 bis 200 Mikrometer bevorzugt, um großflächig eine dünne Schicht der Matrixoberfläche abzutragen, kann man bei Sprengstoff-MALDI mit Fokusdurchmessern von 3 bis 10 Mikrometern arbeiten. Es wird dabei innerhalb dieses Durchmessers die gesamte Schicht bis auf den Probenträger darunter abgetragen.

Das Aufbringen der Analytmoleküle auf die Oberfläche der Lackschicht hat den weiteren Vor­ teil, dass die so gebildeten Ionen der Analytmoleküle nach Ausdehnung der Wolke eine weit geringere Streuung ihrer Anfangsgeschwindigkeiten zeigen. Die Ionen lassen sich daher viel besser in Speicherzellen von ionenspeichernden Massenspektrometern einfangen.

Für bestimmte Anwendungen ist allerdings die adsorptiv auf der Oberfläche bindbare Menge der Analytmoleküle zu klein. Es ist nun ein weiterer Gedanke der Erfindung, die Oberfläche der Schicht durch besondere Maßnahmen zu erhöhen, um die Aufnahmefähigkeiten für große Moleküle zu vergrößern. Dazu gibt es verschiedene Methoden. Die dünne Lackschicht kann man beispielsweise durch geeignete Lösungsmittel (beispielsweise durch ein Wasser-Alkohol- Gemisch) aufquellen lassen. Der Quellprozess ist langsam und braucht mehrere Tage. Es bildet sich dabei ein gerüstartiges Gel mit kavernenartigen Höhlen. Durch vorsichtiges Eintrocknen (beispielsweise durch Gefriertrocknen) lässt sich dann eine hochporöse Schicht erzeugen, die wegen ihrer großen Oberfläche eine höhere Menge (ein vielfaches) der Analytsubstanz auf­ nehmen kann.

Um die aufgebrachte Schicht auch gegen nicht-wässrige Lösungsmittel unlöslich zu machen, ist es besonders vorteilhaft, die meist fadenförmigen Moleküle der Lackschicht nach Aufbringen auf den Probenträger durch Zugabe eines Brückenbildners zu vernetzen. Für die Vernetzung von Zellulosenitrat hat sich Diisocyanat bewährt, das die restlichen OH-Gruppen benachbarter Molekülstränge miteinander verbindet. Diese Vernetzung unterbindet die Lösbarkeit, nicht aber die Quellbarkeit. Die Vernetzung unterbindet nicht die Zersetzlichkeit des Zellulosenitrats unter Einwirkung der Laserstrahlung.

Eine andere Methode geht von hochporösem, sehr feinen Pulver von Zellulosenitrat aus, das auf den Probenträger aufgebracht wird. Das kann beispielsweise durch Bestäuben einer Kleb­ stoffschicht geschehen, wobei die Klebstoffschicht beispielsweise wiederum auf der Basis von Zellulosenitrat aufgebaut sein kann.

Eine poröse Schicht auf einem elektrisch leitenden Probenträger kann beispielsweise auch di­ rekt zum Blotten eines durch 2-dimensionale Gel-Elektrophorese aufgetrennten Substanzge­ mischs benutzt werden. Die 2-dimensionale Abtastung durch MALDI ergibt eine Steigerung der Empfindlichkeit gegenüber üblichen Färbungsmethoden, die bei mehreren Zehnerpotenzen liegt und darüber hinaus zuverlässige Information über das Molekulargewicht bietet.

Es hat sich experimentell erwiesen, dass die Konzentration der zweiten Matrixkomponente, des Ionisierers, nicht hoch zu sein braucht. Unsere Versuche haben sich auf Alpha-Cyano-4- Hydroxi-Zimtsäure (kurz "Alpha-Cyano") beschränkt. Mit etwa 10% Alpha-Cyano in 90% Nitrozellulose erhält man einen nahezu klaren Lack, der sich sehr dünn aufbringen lässt. Er bildet eine gute Grundlage für die Ionisierung von praktisch allen Arten von Proteinen, die leicht aus wässriger Lösung auf die Oberfläche des wasserunlöslichen Lacks aufgebracht wer­ den können.

Wenn wir vom Blotten absehen, so werden die Analytmoleküle meist einfach durch Aufbringen eines winzigen Tröpfchens der Analytlösung auf die adsorptive Schicht aufgebracht. Das Tröpfchen muss oft nicht einmal eintrocknen, nach Adsorption der Analytmoleküle kann der Rest einfach abgewaschen werden. Das ist besonders vorteilhaft, da so auch störende Puffer­ substanzen und Salze der Lösung entfernt werden können.

Für hochverdünnte Analytlösungen, bei denen ein aufgebrachter Tropfen nicht genügend Mo­ leküle für eine massenspektrometrische Untersuchung enthält, hat sich eine andere Art der Probenträger bewährt. Die adsorptive Matrixschicht wird auf die Oberfläche von winzigen magnetischen Kügelchen ("magnetic beads") aufgebracht. Besonders vorteilhaft ist es hier, die Matrixschicht durch Vernetzung vollkommen unlöslich zu machen. Die Kügelchen werden dann in kleiner Anzahl der sehr verdünnten Analytlösung beigegeben. Durch langandauernden und bewegten Kontakt können so die Analytmoleküle praktisch quantitativ adsorptiv an die Oberfläche der Kügelchen gebunden werden. Die Kügelchen lassen sich anschließend durch magnetische Spezialwerkzeuge aus der Lösung herausholen und auf eine flache Probenträger­ unterlage bringen. Dort können sie durch magnetische Kräfte, durch übergelegte Feinstgitter oder aber einfach durch Ankleben befestigt werden. Sie werden, nach Überführung ins Vaku­ um, direkt vom Laser beschossen und liefern ein hervorragendes MALDI.

Die Kügelchen sind besonders effektiv einsetzbar, wenn nur geringste Mengen an Analyt­ substanz vorliegen, weil sie die Analytmoleküle praktisch vollständig auch aus sehr verdünnten Lösungen oder aus kleinsten Volumina adsorbieren können. Dabei braucht die Lösung nicht pipettiert oder sonstwie transportiert werden, und es werden solchermaßen die Verluste durch Wandadsorptionen so gering wie möglich gehalten. Es lassen sich in dieser Weise sogar Ana­ lytsubstanzen aus einzelnen biologischen Zellen einer massenspektrometrischen Analyse zufüh­ ren.

Das bisher verwendete MALDI-Verfahren verlangte notwendigerweise eine Bestrahlung des Probenträgers von der Probenseite her, da jeweils nur eine sehr geringe Matrixmenge an der Oberfläche verdampft wurde, also jeweils nur ein Bruchteil der Schichtdicke abgetragen wur­ de. Auch die Verwendung von magnetischen Kügelchen verlangt einen Beschuss von der Pro­ benseite her, da die Kügelchen undurchsichtig sind.

Werden jedoch flache Probenträger benutzt, so kann ein anderes Verfahren verwendet werden, da die Verwendung einer dünnen Sprengstofflackschicht zu einer vollständigen Verdampfung eines kleinen Schichtbereiches führt, so dass eine nackte Stelle des Probenträgers übrigbleibt. Man kann daher die Matrixschicht von der Rückseite eines für die Laserstrahlung durchsichti­ gen Probenträgers her bestrahlen und so verdampfen. Die Rückseite des Probenträgers ist viel leichter zugänglich als die Vorderseite, auf der die Beschleunigungs- und Fokussierungsblen­ den mit ihren hohen Spannungen einem senkrechten Aufschuss oder einem Aufschuss mit kur­ zer Brennweite im Wege stehen und sehr trickreiche Konstruktionen notwendig machen.

Da der Fokusdurchmesser sehr viel kleiner sein kann als bei normalem MALDI, kann auch die Leistung des Lasers sehr viel geringer sein. Gegenüber heute allgemein verwendeten Gaslasern kann die gesamte Strahlungsenergie entsprechend der verringerten Fläche um einen Faktor 100 bis 1000 kleiner sein. Es können daher sehr viel schwächere Lasersysteme verwendet werden. So kann man einfache Diodenpulslaser benutzen, wie sie etwa bei beschreibbaren Compact Disks (CD) verwendet werden. Bei Verwendung von durchsichtigen Probenträgern lässt sich ein solcher Diodenpulslaser sehr leicht rückwärtig zum Probenträger installieren.

Durch die Verwendung von Diodenpulslasern auf der Rückseite des Probenträgers ergeben sich weitere Vorteile. Erstens kann so die Linse, die zur Fokussierung benutzt wird, nicht ver­ schmutzt werden. Zweitens kann eine Linse sehr kurzer Brennweite eingesetzt werden, wo­ durch sich auch bei mäßiger Strahlqualität des Diodenlasers ein sehr kleiner Brennfleck ergibt. Auf die Wellenlänge des Lasers, die bei bisherigen MALDI-Verfahren immer sehr wichtig war und die Auswahl der Matrixsubstanzen mit bestimmt hat, kommt es nur noch in zweiter Linie an, da es der einzige Zweck der Laserstrahlung ist, den Sprengstoff zu zünden.

Fig. 1 zeigt eine Anordnung mit einer Lackschicht 4 aus Zellulosenitrat mit 10% Alpha- Cyano-4-Hydroxi-Zimtsäure auf einem beweglichen Probenträger 3, der für die Laserlicht­ strahlung 7 aus einem Diodenlaser 1 durchsichtig ist. Eine Linse 2 erzeugt an der Stelle 5 einen Fokus, der trotz mangelhafter Strahlqualität einen Durchmesser von nur etwa 10 Mikrometer hat. An dieser Stelle verpufft das Zellulosenitrat und bildet eine Wolke aus niedermolekularen Substanzen mit einem Anteil an ionisiertem Alpha-Cyno. In der Dampfwolke wird die ober­ flächlich auf die Lackschicht 4 aufgebrachte monomolekulare Schicht aus Analytmolekülen durch Ionen der Matrixsubstanz Alpha-Cyano ionisiert. An den Stellen 6 sind in vorausgehen­ den Verfahrensschritten bereits Teile der Matrixschicht entfernt worden.

Ein Laserlichtpuls von etwa 5 Nanosekunden Dauer aus einem Diodenpulslaser 1 wird vermit­ telst der Linse 2 durch den durchsichtigen Probenträger 3 hindurch auf die Matrixschicht 4 fokussiert. Diese Matrixlackschicht 4 besteht aus Zellulosenitrat mit 10% Alpha-Cyano-4- Hydroxi-Zimtsäure, sie ist nur etwa 0,5 Mikrometer dick. Der Fokusdurchmesser im Brenn­ punkt 5 beträgt wegen der unvermeidlichen Strahlfehler etwa 10 Mikrometer. Ein Teil des La­ serlichtes wird von der Matrixschicht 4 absorbiert und führt zur Verpuffung des Zellulosenit­ rats, ein weiterer kleiner Teil 7 des Laserlichts tritt hindurch und verschwindet. Die durch die Verpuffung des Zellulosenitrats erzeugte Wolke aus niedermolekularen Gasen enthält auch die vereinzelten Moleküle der Protonierungssubstanz Alpha-Cyano-4-Hydroxi-Zimtsäure, die zum Teil wegen der hohen Plasmatemperatur ionisiert vorliegen. Diese Ionen reagieren mit den e­ benfalls vereinzelten Molekülen der Analytsubstanz und protonieren diese. Die Analytionen werden in üblicher Weise dem Massenspektrometer zur Analyse zugeführt.

Der Probenträger ist parallel zu seiner Oberfläche beweglich und kann durch eine nicht ge­ zeigte Bewegungsvorrichtung verschoben werden. Die Löcher 6 in der Matrixschicht sind in vorausgegangenen Analysenzyklen erzeugte Brennflecke, in denen die Matrixschicht vollstän­ dig verpufft ist. Die Messwerte aus diesen vorausgegangenen Analysenzyklen werden gewöhn­ lich in einen Digitalspeicher addiert und liefern nach einigen Zyklen ein Massenspektrum mit verbessertem Signal-zu-Rausch-Verhältnis.

Eines der aussagekräftigsten Ergebnisse einer massenspektrometrischen Analyse ist das Mole­ kulargewicht der untersuchten Analytsubstanz. Reduziert sich die analytische Aufgabe auf die Bestimmung des Molekulargewichts, so reichen (bei gutem Massenauflösungsvermögen) im Minimum dafür etwa 100 Ionen, die am Detektor gemessen werden und bereits einen signifi­ kanten Massenpeak ergeben. Nimmt man einmal an, dass man nur ein fünftel der auf die Lack­ schicht aufgebrachten Analytmoleküle nutzen kann, und rechnet man vorsichtig mit einer Ione­ nausbeute von nur 1/10 000 gemessenen Ionen pro eingesetztem Analytmolekül, so braucht man etwa 5 000 000 Moleküle der Analytsubstanz für diese Bestimmung des Molekularge­ wichts. Bringt man die Analytmoleküle in einem Fleck der Größe von 100 mal 100 Mikrometer unter, so ergibt das einen Bedeckungsgrad zwischen 1/100 und 1/1000 einer monomolekularen Schicht. Die eingesetzte Menge entspricht dabei etwa 10 Attomol an Analytsubstanz. Die A­ nalyse braucht etwa 20 bis 40 Laserlichtschüsse von jeweils etwa 10 Mikrometer Laserlichtfo­ kusdurchmesser. Die gesamte Aufnahmedauer beträgt bei 20 Laserlichtschüssen pro Sekunde nur etwa ein bis zwei Sekunden. - Diese Werte entsprechen einer unteren Grenze. Für die Routineanalytik muss man mit dem zehn- bis hundertfachen Substanzeinsatz rechnen, also mit etwa 100 Attomol bis 1 Femtomol.

Claims (14)

1. Matrixkomponentengemisch für die Ionisierung großmolekularer Analytsubstanzen durch matrixunterstützte Laserdesorption und Ionisierung (MALDI), dadurch gekennzeichnet,

• - dass eine erste Komponente thermisch so instabil ist, dass ihre Moleküle durch die Ein­ wirkung der Laserstrahlung in kleine, unter Normalbedingungen gasförmige Neutralmole­ küle zersetzt werden und dadurch die Freisetzung der Analytmoleküle bewirken, und
• - dass eine zweite, leicht Protonen abspaltende Komponente die Ionisierung der Analyt­ moleküle übernimmt.

2. Matrixkomponentengemisch nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die durch die Laserstrahlung zersetzbare Substanz ein Sprengstoff oder eine sprengstoffähnliche Sub­ stanz mit exothermer Energiebilanz des Zersetzungsprozesses ist.

3. Matrixkomponentengemisch nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass Zellulosenit­ rat als zersetzbare Substanz verwendet wird.

4. Matrixkomponentengemisch nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass Zellulosenit­ rat mit einem optimalen Nitrierungsgrad zwischen 11,5 und 13,5% Stickstoff verwendet wird.

5. Verfahren zur Zubereitung eines Matrixkomponentengemisches für die MALDI- Ionisierung von Analytsubstanzen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekenn­ zeichnet, dass die Matrixkomponenten zusammen mit den Analytsubstanzen in einem Lö­ sungsmittel gemeinsam gelöst werden, und die Lösung als Schicht auf einen festen Pro­ benträger aufgebracht und eingetrocknet wird.

6. Verfahren zur Zubereitung eines Matrixkomponentengemisches für die MALDI- Ionisierung von Analytsubstanzen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekenn­ zeichnet, dass die Matrixkomponenten ohne Analytsubstanzen in einem Lösungsmittel ge­ meinsam gelöst werden, die Lösung als Schicht auf einen festen Probenträger aufgebracht und eingetrocknet wird, wobei die Schicht erst nachträglich oberflächlich mit den Molekü­ len der Analytsubstanzen belegt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6 zur Zubereitung eines Matrixkomponentengemisches nach ei­ nem der Ansprüche 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Zellulosenitrat und die an­ deren Matrixkomponenten gemeinsam in Azeton oder einem anderen Lösemittel gelöst und als Nitrolackschicht aufgebracht werden.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Nitrolackschicht nach Auf­ bringen auf den Probenträger durch einen Brückenbildner dreidimensional vernetzt und da­ durch unlöslich gemacht wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass Diisocyanat als Brückenbildner verwendet wird.

10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Nitrolackschicht nach Auf­ bringen und Trocknen durch langdauerndes Quellen in Wasser und anschließendes Trock­ nen in eine hochporöse Schicht umgewandelt wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Analyt­ moleküle durch Adsorption aus einer Lösung auf die Oberfläche der soliden oder porösen Schicht aufgebracht werden.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Analyt­ moleküle durch Blotten auf die Nitrolackschicht aufgebracht werden.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Nitrolack­ schicht auf kleine magnetische Kügelchen als Probenträger aufgebracht wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die magnetischen Kügelchen zur adsorptiven Beladung mit Analytmolekülen in eine Lösung der Analytmoleküle gege­ ben, durch ein Magnetfeld herausgeholt und für den Laserlichtbeschuss auf eine Probenträ­ gergrundplatte aufgebracht werden.