-
Anwendungsgebiet
-
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Unterstützung der händischen Präparation von Proben auf einem Probenträger für die Ionisierung mit matrix-unterstützter Laserdesorption sowie eine entsprechende Belegungshilfe.
-
Stand der Technik
-
Die schnelle und fehlerfreie Identifizierung von Mikroorganismen spielt in der Lebensmittelanalytik, bei der Überwachung und Regelung von biotechnologischen Prozessen, bei der Detektion von biologischen Waffen und insbesondere in der klinischen Mikrobiologie eine herausgehobene Rolle. Mikroorganismen, die auch als Keime oder Mikroben bezeichnet werden, sind im Allgemeinen mikroskopisch kleine Lebewesen, zu denen Bakterien, Pilze (beispielsweise Hefen), mikroskopische Algen, Protozoen – zum Beispiel Plasmodien als Malaria-Erreger – zählen, aber gelegentlich auch Viren gerechnet werden.
-
Die Identifizierung von Bakterien durch massenspektrometrische Nachweisverfahren wird beispielsweise in einem wissenschaftlichen Übersichtsartikel von van Baar (FEMS Microbiology Reviews, 24, 2000, 193–219: „Characterization of bacteria by matrix-assisted laser desorption/ionization and electrospray mass spectrometry") ausführlich beschrieben. Die Identifizierung erfolgt in den meisten Fällen durch eine Ähnlichkeitsanalyse zwischen einem Massenspektrum der zu untersuchenden Probe und Referenzspektren von bekannten Mikroorganismen. Jedem der Referenzspektren wird in der Ähnlichkeitsanalyse eine Kennzahl zugeordnet, die ein Maß für die Übereinstimmung des entsprechenden Referenzspektrums mit dem Massenspektrum der Probe ist (siehe beispielsweise Jarman et al., Analytical Chemistry, 72[6], 1217–1223, 2000: „An algorithm for automated bacterial identification using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry").
-
Im Routinebetrieb der klinischen Mikrobiologie ist in den letzten Jahren ein einfaches und kostengünstiges Verfahren für die massenspektrometrische Identifizierung von Mikroorganismen etabliert worden, das auf MALDI-Flugzeitmassenspektren (MALDI = matrix assisted laser desorption and ionization) beruht.
-
Der Ausgangspunkt für die massenspektrometrische Identifizierung sind geringe Mengen der Mikroorganismen, die üblicherweise in einer Aufzuchtplatte, beispielsweise einer Petrischale mit einem Nährmedium (Agarplatte), für einige Stunden – meist Übernachtkultur – bis zu einigen Tagen angezüchtet werden. Es wird angestrebt, dass die in der Agarplatte gewachsenen Kolonien jeweils nur einen einzigen Mikroorganismus enthalten, also als Reinkultur vorliegen. Für die Probenpräparation wird üblicherweise biologisches Material einer Einzelkolonie auf einer Agarplatte mit einem Impfstempel, beispielsweise einer Art Zahnstocher, händisch aufgenommen und auf einen Probenort eines MALDI-Probenträgers übertragen. Übliche MALDI-Probenträger haben zwischen 6 und 1536, insbesondere 16 bis 384 Probenorte. Die mit dem Impfstempel übertragene Probenmenge ist, wenn sie für eine massenspektrometrische Untersuchung richtig dosiert ist, mit bloßem Auge in der Regel nicht zu erkennen.
-
Durch Hinzufügung eines organischen Lösungsmittels, in dem eine Matrixsubstanz gelöst ist, werden die übertragenen Zellen in der Regel zerstört. Dadurch werden molekulare Zellbestandteile aus dem Zellinneren freigesetzt, insbesondere lösliche Proteine, die in hoher Konzentration vorliegen. Während einer Lufttrocknung verdunstet das organische Lösungsmittel, und die Matrixsubstanz kristallisiert. Dabei werden die freigesetzten molekularen Zellbestandteile in die polykristalline Matrixschicht eingebaut. Für die Präparation weiterer Probenorte auf dem MALDI-Probenträger werden jeweils neue Impfstempel verwendet, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden.
-
Der MALDI-Probenträger wird nach der Präparation in ein MALDI-Flugzeitmassenspektrometer eingeführt. Die Probenorte werden dort mit Laserpulsen beschossen. Dadurch werden die in der Matrixschicht eingebetteten molekularen Zellbestandteile zusammen mit der Matrixsubstanz desorbiert und ionisiert. Die Ionen werden in einem elektrischen Feld beschleunigt und treffen nach masseabhängigen Flugzeiten auf einen Detektor. Die mit dem Detektor gemessenen Flugzeiten werden mittels bekannter Kalibrierungsfunktionen in ladungsbezogene Massen m/z umgerechnet. Die gemessenen Signale lassen sich häufig auf Proteine zurückführen, die spezifisch für die Art (Spezies) des Mikroorganismus und meist auch für den Stamm, also den Mikroorganismus selber, sind. Das Massenspektrum kann also als molekularer Fingerabdruck gedeutet und insbesondere zur mikrobiellen Identifikation verwendet werden.
-
Die Druckschrift
DE 10 2004 020 885 A1 beschäftigt sich mit der Präparation von Proben mikrobiellen Ursprungs auf MALDI-Probenträgern mit dem Ziel, die Übertragung von biologischem Material aus Agarplatten auf Probenorten von MALDI-Probenträgern zu automatisieren. Dazu werden Agarplatten über ein Förderband zu einem Roboter transportiert und auf einem 3D-Tisch abgesetzt. Eine Bildverarbeitung erkennt Einzelkolonien auf der Agarplatte und positioniert einen Probenstab entsprechend. Ein einzelner Probenstab wird dabei nur für eine einzige Übertragung verwendet und danach ersetzt. Die Aufnahme von biologischem Material mit dem Probenstab erfolgt dadurch, dass der Probenstab aus einer Halterung gelöst wird und aus einer Höhe von einigen Millimeter auf die Kolonie fällt. Der so hergestellte Kontakt mit der Kolonie soll garantieren, dass nur biologisches Material am Probenstab haften bleibt, aber kein Agar auf den MALDI-Probenträger übertragen wird. Ist zuviel Agar auf den MALDI-Probenträger übertragen, wird die Güte der massenspektrometrischen Identifizierung herabsetzt, da Agar die Signale der charakteristischen Proteinionen unterdrückt. Eine Feinsensorik zur Regelung des Kontaktes ist nicht vorgesehen. Allerdings vibriert der Probenstab und kann vor der Probennahme mit Wasser benetzt werden, damit eine ausreichende Menge biologischen Materials aus einer Kolonie am Probenstab haften bleibt und auf einen Probenort eines MALDI-Probenträgers übertragen werden kann.
-
In einem halbautomatischen Probenentnahmesystem erfolgt die Auswahl einer Einzelkolonie, von der biologisches Material auf den MALDI-Probenträger übertragen werden soll, durch einen Anwender, der die Einzelkolonien vor der automatischen Übertragung auf einem beispielsweise mit einer Kamera aufgenommen Bild der Agarplatte auswählt und markiert.
-
Der Vorteil einer automatischen und halbautomatischen Übertragung von einer Agarplatte auf einen MALDI-Probenträger besteht darin, dass die Agarplatte und der Ort der Probenentnahme auf der Agarplatte eindeutig einem MALDI-Probenträger zugeordnet sind und eine Übertragung von Proben mikrobiellen Ursprungs aus verschiedenen Kolonien auf einen einzigen Probenort vorgenommen wird, wobei eine Vertauschung ausgeschlossen ist. Wird von der Probenentnahme auf der Agarplatte zusätzlich ein Bild aufgenommen und gespeichert, kann sogar eine einzelne Kolonie eindeutig einem Probenort zugeordnet werden. Die Agarplatten und die MALDI-Probenträger sind heutzutage in der Regel schon mit entsprechenden Kodierungen versehen, zum Beispiel Barcodes oder RFID-Chips (RFID = radio frequency identification). Der Weg einer Probe von der Ankunft im Labor – oder sogar schon von der Probenentnahme beim Arzt – bis zur Aufnahme und Auswertung der Massenspektren kann somit lückenlos nachvollzogen werden.
-
Bei einer händischen Übertragung können dagegen leicht Übertragungsfehler auftreten, so dass mehrere Proben mikrobiellen Ursprungs durch ein Versehen des Laborpersonals auf einen Probenort übertragen werden oder die Zuordnung von Proben auf dem MALDI-Probenträger fehlerhaft in ein Labor-Informations- und Managementsystem eingetragen wird. In diesen Fällen ist natürlich auch die Identifizierung der Mikroorganismen fehlerhaft. Die Automatisierung der Probenübertragung konnte sich bislang allerdings kaum durchsetzen, da die Massenspektren von händisch präparierten Proben durchweg eine höhere Qualität aufweisen. Es besteht daher ein Bedarf, die Verfahren der händischen Präparation zu verbessern.
-
Das Gebrauchsmuster
DE 20 2007 018 535 U1 beschreibt eine Pipettierhilfe für durchsichtige Mikrotiterplatten, die über einen Adapter in einer Basisplatte abgelegt werden. Die Basisplatte umfasst Lichtquellen, die jeweils einer Öffnung in dem Adapter und einer Kavität der durchsichtigen Mikrotiterplatte zugeordnet sind. Eine Schalt- oder Steuereinheit aktiviert die Lichtquellen unabhängig voneinander und zeigt mittels Beleuchtung durch den Adapter und die durchsichtige Mikrotiterplatte an, wohin eine Probenflüssigkeit pipettiert werden soll. Im Gegensatz zu Miktrotiterplatten sind Probenträger für die Ionisierung mit matrixunterstützter Laserdesorption im Regelfall undurchsichtig. Dies ergibt sich meistens durch deren elektrische Leitfähigkeit, die dazu dient, statischen Aufladungen am Probenträger, die sich während der Laserdesorption bilden können, vorzubeugen. Elektrische Leitfähigkeit ist für Mikrotiterplatten grundsätzlich unerwünscht, weil die Kavitäten – im Gegensatz zu den flachen, mit der übrigen Oberfläche weitgehend fluchtend ausgelegten Probenorten auf MALDI-Probenträgern – eine größere Wechselwirkungsfläche mit der eingefüllten Probenflüssigkeit bieten. Diese vergrößerte Wechselwirkungsfläche kann – bei vorhandener Leitfähigkeit und flüssigen Proben – unerwünschte Grenzflächenprozesse, beispielsweise die Ablagerung von in der Flüssigkeit gelösten Ladungsträgern wie Salzen, oder chemische Grenzflächenreaktionen fördern.
-
Es ist für eine Fachkraft, die Probenflüssigkeit auf eine Mikrotiterplatte übertragen hat, relativ einfach zu erkennen, welche Kavitäten mit der Probenflüssigkeit befüllt sind und welche nicht. Dies ergibt sich insbesondere daraus, dass beim händischen Pipettieren als Menge der Probenflüssigkeit mindestens ein Mikroliter gewählt werden muss, da eine geringere Menge sich mit entsprechenden Pipetten üblicherweise nicht präzise abmessen lässt. Die Menge von einem Mikroliter ist hinreichend groß, dass sie von einem Menschen mit bloßem Auge, das überdies durch die Kavitäten selbst zu einem gewissen Grad geleitet wird, sicher erkannt werden kann.
-
Beim Belegen einer flachen MALDI-Probenträgerplatte mit Mikroorganismen können richtig dosierte Proben kaum mit dem Auge erkannt werden. In der Laborpraxis behilft man sich gelegentlich damit, dass der Probenträger nach dem Aufbringen einer Probe in die Hand genommen und gegen das Licht gehalten wird, um eine Probe auf dem Probenort auszumachen. Nur wenn das Auftragen der Matrixsubstanz mit Lösungsmittel unmittelbar nach dem Aufbringen der interessierenden Analytsubstanz, zum Beispiel biologisches Material aus einer angezüchteten Mikrobenkolonie, auf den Probenort erfolgt, sorgen der Flüssigkeitsfleck beziehungsweise die nach dessen Verdunstung entstandene Matrixkristallschicht auf dem Probenort mit ihren von der übrigen Probenträgeroberfläche abweichenden Lichtreflektions- und Streueigenschaften dafür, dass sich die Fachkraft über die Verteilung von Proben auf dem Probenträger mit einem Blick ohne größere Mühe Klarheit verschaffen kann. Diese Vorgehensweise des sofortigen Auftragens der Matrix-Lösung resultiert jedoch in einer geringen Flexibilität der Belegungssequenz, die in der Regel von einer Fachkraft als störend empfunden wird. Darüber hinaus bleibt die Übersicht über bereits belegte Probenorte auf der Strecke, wenn das Auftragen der Matrixsubstanz mit dem Lösungsmittel auf einen vorher mit einer Analytsubstanz belegten Probenort unterlassen wurde, beispielsweise weil die Fachkraft während der Belegungssequenz abgelenkt wurde und die Übersicht über die zuvor vorgenommenen Belegungen verloren hat.
-
Aufgabe der Erfindung
-
Die Aufgabe der Erfindung besteht insbesondere darin, während der händischen Präparation von Proben für eine Ionisierung mit matrix-unterstützter Laserdesorption die Gefahr einer Fehlzuordnung der Proben zu den Probenorten zu reduzieren.
-
Beschreibung der Erfindung
-
Die Aufgabe wird dadurch gelöst, dass für die händische Präparation von Proben für eine Ionisierung mit matrix-unterstützter Laserdesorption ein Probenträger mit mehreren Probenorten bereitgestellt wird, wenigstens ein Probenort ausgewählt wird und der ausgewählte Probenort zumindest gegenüber dazu benachbarten nicht-ausgewählten Probenorten in für einen Menschen visuell wahrnehmbarer Weise hervorgehoben wird.
-
Eine Fachkraft, die eine händische Präparation eines Probenträgers durchführen möchte, wird durch die für sie visuell erkennbare Hervorhebung darin unterstützt, die einem Nährmedium – beispielsweise Agarplatte, Bouillon- oder Blutkultur – entnommene Probe am richtigen Ort zu deponieren. Die Gefahr von Belegungsfehlern, die im Wesentlichen dadurch entsteht, dass im Regelfall das übertragene Probenmaterial auf Grund seiner geringen Menge visuell kaum wahrnehmbar ist, lässt sich auf diese Weise verringern.
-
Die Hervorhebung soll dabei insbesondere reversibel, also aktivierbar und deaktivierbar, sein und sich wieder rückgängig machen lassen. Die Arbeit einer Fachkraft soll insbesondere auch dadurch erleichtert werden, dass das Auswählen und das Hervorheben(halb-)automatisch mit elektronisch gestützten Mitteln erfolgen. Ein geringer Verfahrensaufwand lässt sich erreichen, wenn die Hervorhebung des ausgewählten Probenortes auf die dazu unmittelbar benachbarten nicht-ausgewählten Probenorte beschränkt wird. Der Hervorhebungseffekt kann jedoch durch Vergrößerung der Menge an nicht-ausgewählten Probenorten verstärkt werden, im äußersten Fall derart, dass der ausgewählte Probenort gegenüber allen übrigen nicht-ausgewählten Probenorten hervorgehoben wird.
-
Im Folgenden wird MALDI als bevorzugte Ionisierungsart angegeben, bei der Ionen während der durch Laser bewirkten Desorption entstehen. Es versteht sich jedoch, dass vorlegend lediglich die Laserdesorption zum Überführen der Analytsubstanzen – mithin Proteine oder Proteinketten – in die Gasphase von Bedeutung ist. Die Art der Ionisierung kann je nach Anwendung frei gewählt werden. Die Laserdesorption kann beispielsweise mit einer chemischen Ionisierung durchgeführt werden (LDCI). Aber auch andere Ionisierungsarten können Anwendung finden. Entsprechend weit ist der Begriff Ionisierung mit matrix-unterstützter Laserdesorption zu verstehen.
-
Der Probenort lässt sich danach auswählen, dass er unbelegt ist. Das Verfahren bietet eine gewisse Flexibilität in verschiedenen Stadien einer Belegungssequenz. Es ist ebenso möglich, eine geometrische Auswahlvorgabe zu machen, zum Beispiel in der Art, dass nur jeder n-te – zum Beispiel jeder zweite – Probenort zu belegen ist. Dies kann dann sinnvoll sein, wenn die Gefahr einer Kreuzkontamination durch Ausgasen einer Probe und Übergang der ausgegasten Probenteilchen in der Gasphase auf einen anderen Probenort bei geringem räumlichen Abstand der belegten Probenorte erhöht ist. In einer Variante kann die Auswahl durch ein elektronikgestütztes technisches Leitsystem, beispielsweise indem alle unbelegten Probenorte belegt werden, alternativ auch durch einen Anwender des Verfahrens erfolgen.
-
Der ausgewählte Probenort lässt sich mechanisch, mittels eines Lichteffekts oder einer Kombination davon hervorheben. Das maßgebliche Kriterium ist, dass durch die Hervorhebung der ausgewählte Probenort für einen Anwender des Verfahrens so ausgezeichnet wird, dass er erkennt, auf welchen Probenort er eine Probe aufbringen soll. Dies kann beispielsweise mechanisch mit einem verstellbaren Zeiger an der Vorderseite des Probenträgers geschehen, dessen Spitze auf einen ausgewählten Probenort ausrichtbar ist. Ferner ist es möglich, den ausgewählten Probenort von vorne an- oder auszuleuchten. Durch Erzeugung eines erhöhten Farb- und/oder Helligkeitskontrasts im Vergleich zu umliegenden nicht-ausgewählten Probenorten lässt sich der ausgewählte Probenort besonders deutlich kenntlich machen. Zusätzlich oder alternativ lässt sich eine Lochmaske an der Vorderseite des Probenträgers an der Position des Probenortes in Stellung bringen.
-
Der Probenträger kann in einer Ausführungsform wenigstens teilweise aus einem auf elektrische Spannungen ansprechenden Kunststoff gefertigt sein. Der Probenträger lässt sich dann in mehrere die Probenorte einfassende Areale aufteilen, die separat mit einer Spannung beschickt werden können. Unter dem Einfluss der Spannung ändert das entsprechende Areal seine Lichtreflexionseigenschaften, beispielsweise von partiell transparent zu opak oder umgekehrt. Auf diese Weise lässt sich ein Helligkeitskontrast ohne Einsatz einer separaten Lichtquelle herstellen. Vielmehr kann in diesem Beispiel das allgegenwärtige Raumlicht (im Labor), das auf die Vorderseite des Probenträgers fällt, für die Erzeugung eines Lichteffekts genutzt werden, indem die Eigenschaften der das Licht zurückwerfenden Oberfläche verändert werden.
-
In einer Weiterbildung des Verfahrens können mehrere Probenorte ausgewählt und die Hervorhebung in einem Belegungsprozess wiederholt ausgeführt werden, wobei mit jeder Wiederholung ein anderer ausgewählter Probenort hervorgehoben wird. Diese Weiterbildung ist insbesondere für eine sequenzielle Abarbeitung verschiedener Proben, die aus verschiedenen Kolonien auf einer Aufzuchtplatte stammen und auf einen Probenträger gebracht werden sollen, geeignet. Bevorzugt ist bei einer solchen sequenziellen Abarbeitung die Verwendung eines Überwachungs- und Kontrollsystems, das den Anwender des Verfahrens bei der Auswahl der zu übertragenden Proben unterstützt.
-
Die Aufgabe wird ebenfalls durch ein Verfahren zur händischen Präparation einer Probe auf einem Probenträger für die Ionisierung mit matrix-unterstützter Laserdesorption gelöst, in dem die Probe und die Probenorte jeweils mit Identifizierungskennzeichen versehen sind, bei dem ein Probenort gemäß einem oben beschriebenen Verfahren ausgewählt und hervorgehoben wird, die Probe auf den ausgewählten Probenort aufgebracht wird und die Identifizierungskennzeichen einander zugeordnet und gespeichert werden. Auf diese Weise lässt sich nach erfolgter Belegung des Probenträgers nachvollziehen und überprüfen, welche Proben mit welcher Herkunft auf einen bestimmten Probenort übertragen wurden. Dies ermöglicht eine nachträgliche Prozesskontrolle und kann zum Beispiel einen Fehler aufzeigen, wenn eine Probe bestimmter Herkunft auf zwei Probenorte abgelegt wurde, obwohl für jede Probe der entsprechenden Herkunft lediglich ein Probenort vorgesehen war. Das Zuordnen und Speichern kann in einem kombinierten Verfahrensschritt gemeinsam oder separat durchgeführt werden. Die Zuordnung kann beispielsweise vor dem eigentlichen Belegungsvorgang, das Speichern nach dem Abschluss des Belegungsvorgangs durchgeführt werden. Eine bestimmte zeitliche Abfolge des Zuordnens und Speicherns während des Verfahrens ist grundsätzlich nicht zwingend. Bevorzugt werden jedoch die Identifizierungskennzeichen nach dem Belegungsvorgang zugeordnet und gespeichert, da so eine Fehlzuordnung beziehungsweise Fehlbelegung leichter erkannt werden kann.
-
Als Proben sind insbesondere solche mikrobiellen Ursprungs geeignet. Vorzugsweise werden darunter die Mikroorganismen selbst in unbehandelter Form verstanden, wie sie in einem Nährmedium gezüchtet wurden.
-
Das Identifizierungskennzeichen der Probe kann von einer Kennzeichnung des Probengefäßes – beispielsweise einer Petrischale – abgeleitet werden, aus dem die Probe stammt. Auf diese Weise wird ein hohes Maß an Sicherheit bei der Probenrückverfolgung gewährleistet. Ebenso ist es möglich, ein Identifizierungskennzeichen zu generieren oder zu ergänzen, indem eine Kamera die Probenquelle, insbesondere das flächige Nährmedium in einer Petrischale, aufnimmt und in der Aufnahme die Koordinaten des Probenherkunftsorts mittels Bildauswertung bestimmt und der Probe zugewiesen werden. Zusätzlich oder alternativ zu einer optischen Abbildung des flächigen Nährmediums kann der Probenherkunftsort auch durch eine Messung der Kapazitätsänderung an dem flächigen Nährmedium im Vergleich vor der Probenentnahme zu nach der Probenentnahme identifiziert werden.
-
In einer Variante können die Probenherkunftsdaten und/oder Identifizierungskennzeichen über Fernkommunikationsmittel zum Probenpräparations-Instrumentarium übermittelt werden, um dort nach erfolgter Belegung eines Probenortes auf einem Probenträger zusammen mit den Belegungskoordinaten und/oder Identifizierungskennzeichen des Probenträgers beziehungsweise Probenortes gespeichert zu werden. Auf diese Weise ist eine besonders detaillierte Probennachverfolgung möglich.
-
Die Aufgabe wird weiterhin mit einer Belegungshilfe für die händische Präparation von Proben auf einem Probenträger für die Ionisierung mit matrix-unterstützter Laserdesorption gelöst. Die Belegungshilfe hat eine Aufnahme für einen Probenträger mit mehreren Probenorten, die an standardisierte Probenträger für die Ionisierung mit matrix-unterstützter Laserdesorption angepasst ist. Weiterhin ist eine Vorrichtung, die wenigstens einen ausgewählten Probenort an der Vorderseite des Probenträgers zumindest gegenüber dazu benachbarten nicht-ausgewählten Probenorten in für einen Menschen visuell wahrnehmbarer Weise hervorhebt, vorhanden. Ferner umfasst die Belegungshilfe ein Leitsystem, das den wenigstens einen Probenort auswählt und die Vorrichtung so ansteuert, dass der ausgewählte Probenort hervorgehoben wird.
-
Die Aufnahme ist, vorzugsweise geometrisch, an standardisierte Probenträger für die Ionisierung mit matrix-unterstützter Laserdesorption angepasst. Diese Anpassung kann auch mit Adapterstücken erfolgen, die in eine Aufnahme eingesetzt werden. Auf diese Weise lassen sich Probenträger verschiedener Konfigurationen oder Abmessungen in die Aufnahme einpassen. Dadurch kann eine bündige und/oder fluchtende Anordnung der Probenträger in der Aufnahme erzielt werden. Die Standardisierung der Probenträger bestimmt sich insbesondere über deren geometrische Abmessungen wie Höhe, Länge, Breite oder Fläche, die Anzahl der Probenone oder deren (Matrix-)Anordnung, insbesondere in Reihen und Spalten. Dabei ist zu berücksichtigen, dass Probenträger, die in Laserdesorptionsverfahren Anwendung finden, mit einer möglichst ebenen Vorderseite ausgeführt sein müssen, damit möglichst einfache Randbedingungen für in dem Raum vor der Probenträgervorderseite aufgespannte elektrische Felder bestehen. Dies erleichtert die Kontrolle des Gebietes im Phasenraum (aufgespannt durch Orts- und Impulskoordinaten), das von den bei der Laserdesorption entstehenden, interessierenden Ionen eingenommen wird. Kavitäten, wie sie in Mikrotiterplatten eingearbeitet sind, sind dafür nicht geeignet.
-
Die Betriebsweise der Vorrichtung kann beinhalten, dass sie an dem ausgewählten Probenort einen Helligkeits- und/oder Farbkontrast zumindest zu benachbarten nicht-ausgewählten Probenorten erzeugt. Zum Beispiel kann eine Lichtquelle vorgesehen sein, deren Licht gebündelt und als Lichtstrahl von vorne auf einen Probenort gerichtet wird.
-
Die Vorrichtung kann weiterhin mit einem verstellbaren Indikator ausgestattet sein. In einem einfachen Fall kann der Indikator ein über den Probenorten angeordneter Zeiger sein, der relativ zu dem Probenträger bewegt wird. Die Vorrichtung lässt sich zusätzlich oder alternativ mit einem Akzeptanzelement versehen, das den händischen Zugang zu einem ausgewählten Probenort ermöglicht und zumindest zu dazu benachbarten nicht-ausgewählten Probenorten verhindert. In einer Ausführungsvariante besteht das Akzeptanzelement aus einer Lochmaske und ist vorzugsweise dazu ausgelegt, in der Art einer Maske den ausgewählten Probenort freizugeben und zumindest dazu benachbarte nicht-ausgewählte Probenorte zu verdecken.
-
Die Belegungshilfe kann insbesondere mit einer Bewegungseinrichtung versehen sein, die mit dem Leitsystem kommuniziert und von diesem derart angesteuert wird, dass sie die Aufnahme für den Probenträger und die Vorrichtung relativ zueinander bewegt. Es ist dabei einerlei, ob die Aufnahme und der während eines Belegungsprozesses darin aufgenommene Probenträger oder – in einer kinematischen Umkehr – die Vorrichtung verstellbar ist. Es ist auch möglich, die Aufnahme und die Vorrichtung beide verstellbar auszugestalten. Die Bewegungseinrichtung gewährleistet, dass jeder Probenort mit den Hervorhebungsmitteln erreicht und hervorgehoben werden kann.
-
Das Leitsystem lässt sich mit einer Schnittstelle für eine Dateneingabe oder Datenausgabe versehen. Dies ist insbesondere von Nutzen, wenn ein Anwender einen Belegungsplan eines zu bearbeitenden Probenträgers in das Leitsystem eingeben oder einlesen lassen möchte. Die Schnittstelle kann beispielsweise auch mittels händischer Eingabe für eine Bestätigung eines vorgenommenen Belegungsvorgangs verwendet werden. Auf diese Weise lässt sich eine Sequenz an Belegungsvorgängen prozesssicher durchführen. In einer Erweiterung kann die Schnittstelle auch eine Fernkommunikationsfunktion aufweisen, beispielsweise zum Empfang von Probenherkunftsdaten und/oder entsprechenden Identifizierungskennzeichen, die dann mit den Belegungsdaten und/oder entsprechenden Identifizierungskennzeichen der belegten Probenorte zwecks Zuordnung gespeichert werden können. Die Fernkommunikationsfunktion kann auch das Aussenden entsprechender Daten umfassen. Die Femkommunikationsfunktion lässt sich mit bekannten Fernkommunikationsmitteln wie einer Funk-, Blue-Tooth-, Infrarot- oder einer sonstigen Schnittstelle einrichten.
-
Das Leitsystem kann überdies einen Speicher zur Zuordnung und Aufnahme von Identifizierungskennzeichen von Proben und Probenorten aufweisen. Dort sind die vorgenommenen Zuordnungen sicher aufgehoben und können für eine spätere Auswertung oder Überprüfung beliebig oft abgerufen werden.
-
Die Belegungshilfe kann in einer Ausführungsvariante stationär sein. Dann ist sie vorzugsweise in einem Arrangement einer Aufzuchtplattenstütze, auf der sich beispielsweise Petrischalen zur Probenentnahme anordnen lassen, und einer massenspektrometrischen Probenbeschickungsstation mit einer Laserdesorptionseinrichtung derart angeordnet, dass eine möglichst zeitsparende Übertragung der Proben von der Aufzuchtplattenstütze zu der Belegungshilfe und von dort zu der Beschickungsstation möglich ist.
-
In einer weiteren Variante kann die Belegungshilfe aber auch portabel ausgebildet sein. Als portables Handgerät beispielsweise kann die Belegungshilfe von einer Fachkraft wie eine Malerpalette auf beziehungsweise an der Hand getragen werden. In diesem Fall weist die Belegungshilfe vorzugsweise eine Halteeinrichtung wie einen Griff, an die Finger einer menschlichen Hand angepasste Sacklöcher, oder ein Halteband auf, mit dem sie an einem Arm eines Anwenders festschnallbar ist. Die Portabilität lässt sich aber auch dadurch erzielen, dass die Belegungshilfe in der Art eines Bauchladens ausgestaltet, also zum Beispiel mit wenigstens einem Schulter- beziehungsweise Nackenriemen versehen ist, so dass sie von einem Anwender vor dem Bauch oder der Brust getragen werden kann. Diese Variante hat den Vorteil, dass der Anwender beide Hände frei hat. Durch die Portabilität wird die Handhabung der Belegungshilfe flexibler, ist insbesondere nicht mehr örtlich eingeschränkt.
-
Zusammen mit der Ausbildung der Belegungshilfe als portables Gerät, insbesondere Handgerät, kann eine Andockstation vorgesehen werden, die vorzugsweise stationär ist und eine Aufnahme für die Belegungshilfe aufweist. Ein Anwender kann, wenn er die nötige Freiheit benötigt, die am Körper oder in der Hand getragene portable Belegungshilfe in der Aufnahme absetzen und sich weiteren Arbeiten, bei denen die Belegungshilfe nicht erforderlich ist, widmen.
-
Kurzbeschreibung der Abbildungen
-
Im Folgenden wird die Erfindung an Hand von Ausführungsbeispielen in Verbindung mit der beigefügten Zeichnung beschrieben. In der Zeichnung zeigen:
-
eine Belegungshilfe gemäß der Erfindung, die einen Probenort mittels Lichteffekt hervorhebt,
-
eine Teilansicht einer Belegungshilfe in einer weiteren Betriebsweise,
-
eine weitere Teilansicht einer Belegungshilfe, die einen Probenort mittels Lichteffekt hervorhebt,
-
eine Teilansicht einer Belegungshilfe gemäß der Erfindung, die eine Probenort mechanisch hervorhebt,
-
eine weitere Teilansicht einer Belegungshilfe gemäß der Erfindung, die einen Probenort mechanisch hervorhebt,
-
eine Flussdiagramm-Darstellung von Verfahren gemäß der Erfindung, und
-
eine Belegungshilfe in einer portablen Handgerät-Ausführung.
-
Bevorzugte Ausführungsbeispiele
-
Die zeigt ein Ausführungsbeispiel einer Belegungshilfe 1. Ein Probenträger 2 ist in einer Aufnahme (schwarz) angeordnet, die in diesem Ausführungsbeispiel als Rahmen 5 ausgebildet ist. Ein Rahmen 5, der den Probenträger 2 an den Schmalseiten fixiert, hat den Vorteil, dass sowohl die Vorderseite als auch die Rückseite des Probenträgers 2 für das Mess- beziehungsweise Untersuchungsinstrumentarium zugänglich sind. Dies erleichtert die Handhabung der Belegungshilfe, insbesondere wenn sie portabel ist. In einer Variante könnte die Aufnahme auch als Mulde (nicht gezeigt) ausgebildet sein, deren Abmessungen an standardisierte Abmessungen eines Probenträgers angepasst sind, so dass sich der Probenträger 2 hineinlegen lässt. Der Probenträger 2 hat in diesem Beispiel eine standardisierte Anzahl von sechs mal siebzehn (= 102) Probenorten 4. Es sind auch andere Ausgestaltungen standardisierter Probenträger 2 mit 6 bis 1536 Probenorten möglich.
-
Eine Vorrichtung 6 mit einer Lichtquelle 8 und Führungselementen 10, hier in Form zweier verschwenkbarer Spiegel, ist über der die Probenorte 4 aufweisenden Vorderseite des Probenträgers 2 angeordnet. Mittels entsprechender Einstellung der Spiegel 10 kann der aus der Lichtquelle 8 austretende Lichtstrahl 12 über den Probenträger 2 gelenkt werden. Hier ist eine Verstellmöglichkeit aufseiten der Vorrichtung 6 gegeben. Es ist natürlich auch möglich, zusätzlich oder alternativ den Probenträger 2 verstellbar zu gestalten, beispielsweise indem er auf einem XY-Tisch (gestrichelte Pfeile) angeordnet wird.
-
Ein Leitsystem 14 ist vorgesehen, das mit der Vorrichtung 6 und dem Probenträger 2 kommuniziert. Das Leitsystem 14 kann über die Verbindung zu dem Probenträger 2 beispielsweise Anzahl, Anordnung und Position der einzelnen Probenorte 4 erfassen, indem zum Beispiel ein an dem Probenträger angebrachter Mikrochip, der die entsprechenden Konfigurationsdaten enthält, ausgelesen wird. Alternativ dazu kann das Leitsystem auch eine Kamera und ein optisches Bilderkennungssystem aufweisen (nicht gezeigt), mit dem die Vorderseite des Probenträgers aufgenommen und darauf erkennbare Merkmale der Probenorte für die Aufnahme von Probenmaterial geortet werden. Diese erkennbaren Merkmale können als Markierungen, beispielsweise ringförmige Einrahmungen, an der Vorderseite ausgebildet sein. Die Kommunikation mit der Vorrichtung 6 ermöglicht dem Leitsystem 14 in diesem Beispiel, die Lichtquelle 8 zu aktivieren und deaktivieren und die verschwenkbaren Spiegel 10 anzusteuern und zu verstellen.
-
Ein Anwender der Belegungshilfe 1 kann in einer halbautomatischen Ausführungsform dem Leitsystem 14 den Belegungszustand des Probenträgers 2 eingeben oder einlesen lassen, beispielsweise über eine Schnittstelle 16. Er kann dabei gleichzeitig das Kriterium vorgeben, nach dem die Probenorte 4 ausgewählt werden sollen. Dies kann beispielsweise ein unbelegter Zustand sein. Das Leitsystem 14 prüft dann, welche der Probenorte 4 für eine Belegung in Frage kommen, wählt davon einen aus, zum Beispiel nach Praktikabilitätsgründen insbesondere derart, dass der Probenträger 2 und/oder die Vorrichtung 6 nur wenig aus der gegenwärtigen Position heraus verstellt werden müssen, um den entsprechenden Probenort 4 hervorzuheben, richtet in diesem Beispiel die Spiegel 10 entsprechend aus und aktiviert die Lichtquelle 8. Der Lichtstrahl 12 beleuchtet dann den Probenort 4 und die ihn umgebende Fläche der Probenträgervorderseite und zeichnet ihn somit für einen Menschen visuell wahrnehmbar gegenüber den anderen nicht-ausgewählten Probenorten aus. Der Hervorhebungseffekt kann durch eine auf Verstärkung der visuellen Wirkung ausgerichtete Auslegung des Probenträgermaterials verstärkt werden, beispielsweise indem Partikel in das Material des Probenträgers 2 eingearbeitet sind, die bei Beleuchtung einen Glitzer- oder Farbeffekt hervorrufen. Unterstützt durch diese Hervorhebung kann der Anwender seine Probe auf den korrekten Probenort 4 aufbringen, und dann beispielsweise von Hand über die Schnittstelle 16 die erfolgte Belegung bestätigen. Dies kann dann zur Deaktivierung der Hervorhebung, in diesem Beispiel also dem Ausschalten der Lichtquelle 8, führen. Um den Anwender bei der Arbeit nicht zu irritieren, kann die Probenträgervorderseite mit einer Antiglanzbeschichtung versehen sein. Dies vermag blendenden Lichtreflexen, die bei der Beleuchtung des Probenortes auftreten könnten, vorzubeugen.
-
Das Leitsystem 14 weist in diesem Beispiel weiterhin einen Speicher 18 zur Zuordnung und Aufnahme von Identifizierungskennzeichen von Proben und Probenorten 4 auf. Diese Informationen können gegebenenfalls ebenfalls durch einen Anwender über die Schnittstelle 16 eingegeben oder eingelesen werden.
-
Die zeigt in einer vereinfachten Ansicht (ohne Leitsystem) einen Probenträger 2 in einem Rahmen 5 als Aufnahme und eine Vorrichtung 6 zur lichtbewirkten Hervorhebung ausgewählter Probenorte 4 in einem Betrieb, in dem mehrere ausgewählte Probenorte 4 gleichzeitig hervorgehoben werden. Dies lässt sich in einer Fortführung der Ausführungsform aus beispielsweise mit einem Lichtstrahlteiler und mehreren voneinander unabhängig betätigbaren Schwenkspiegeln (nicht gezeigt) erreichen. Diese Betriebsweise kann vorteilhaft sein, wenn eine Probenart aus einer bestimmten Probenquelle auf mehrere Probenorte 4 aufgebracht werden soll, beispielsweise um Vergleichsversuche unter voneinander abweichenden Bedingungen im Massenspektrometer mit der gleichen Probe zu ermöglichen. Die Darstellung in ist hier nur als Beispiel zu verstehen. Die ausgewählten und hervorgehobenen Probenorte 4 können auch voneinander beabstandet und/oder über die Matrix von Probenorten 4 auf dem Probenträger 2 verteilt sein. Es ist auch eine simultane Mehrfachbelegung von verschiedenen Proben möglich.
-
Die zeigt eine weitere Variante einer Belegungshilfe in vereinfachter Ansicht. Es sind in diesem Beispiel zwei Lichtquellen 8 vorgesehen, denen jeweils ein Spiegel 10 als Führungselement zugeordnet ist. Zweck der Lichtquellen 8 und der Führungselemente 10 ist es, Lichtbalken auf der Vorderseite des Probenträgers 2 zu erzeugen, die sich – über ein hier nicht dargestelltes Leitsystem entsprechend angesteuert – durch Verschwenkung der Spiegel entlang einer Richtung verstellen lassen und etwa rechtwinklig zueinander liegen. Durch den Kreuzungspunkt der beiden Lichtbalken auf dem Probenträger 2 kann ein Probenort 4 hervorgehoben werden. In dem Beispiel sind zwei Lichtquellen 8 vorgesehen, die voneinander beabstandet angeordnet sind. Es ist auch möglich, die Lichtquellen in platzsparender Weise in ein gemeinsames Gehäuse (nicht gezeigt) zu integrieren. Weiterhin lassen sich zwei Lichtbalken auch mit einer einzelnen Lichtquelle generieren, wenn das aus der Lichtquelle austretende Licht aufgespalten wird. In diesem Fall wären entsprechende Strahlführungseinheiten vorzusehen.
-
Die zeigt einen Probenträger 2 mit den darauf angeordneten Probeporten 4 und einen XY-Verschiebetisch 22, der mit einem Indikator 24 als Hervorhebungsvorrichtung, in diesem Ausführungsbeispiel in Form eines Zeigers, verbunden ist. Das Leitsystem ist in dieser Darstellung wiederum aus Gründen der Übersichtlichkeit nicht gezeigt. Der Zeiger 24 weist einen Finger mit einer Spitze auf, die mittels des Verschiebetischs 22 auf einen ausgewählten Probenort 4 ausgerichtet werden kann. In dem gezeigten Beispiel ist dies der fünfte von links in der vordersten Reihe von Probenorten 4. Der Verschiebetisch 22 ist so ausgelegt, dass jeder Probenort 4 auf dem Probenträger 2 mit der Zeigerspitze erreicht werden kann. Es versteht sich, dass es im Sinne einer kinematischen Umkehr auch möglich ist, zusätzlich oder alternativ den Probenträger 2 mit einem Verschiebetisch zu verbinden. Durch den langgestreckten Finger des in diesem Beispiel präsentierten Zeigers 24 wird auch erreicht, dass wenigstens einige der nicht-ausgewählten Probenorte 4 während des Hervorhebungsvorgangs verdeckt sind und damit nicht fehlbelegt werden können.
-
Die zeigt einen Indikator als Hervorhebungsvorrichtung, der ein Akzeptanzelement 26 in Form einer Lochmaske aufweist. In diesem Beispiel lässt sich der Probenträger 2 lateral in zwei Raumrichtungen durch eine entsprechende Verstelleinrichtung (zum Beispiel einen XY-Verschiebetisch, durch Pfeile angedeutet) bewegen. Der Indikator umfasst, ähnlich wie in , einen Finger, an dessen Ende eine Platte 28 mit Durchgangsöffnung 30 angebracht ist. Die Durchgangsöffnung 30 weist einen solchen Durchmesser auf und bietet genügend Bewegungsraum, dass es einem Anwender möglich ist, ein Probenübertragungselement, zum Beispiel ein Stäbchen (nicht dargestellt), hindurchzustecken und seitliche Bewegungen damit durchzuführen, um eine Probe von einer Spitze des Stäbchens auf dem Probenort 4 abzustreifen. Die Platte 28 ist dabei für den Zweck, eine Umrandung für die Durchgangsöffnung 30 zu bieten, überdimensioniert. Damit wird erreicht, dass zu dem ausgewählten Probenort 4 benachbarte nicht-ausgewählte Probenorte während der Hervorhebung verdeckt und damit für einen Anwender unerreichbar gemacht werden. Auf diese Weise lässt sich durch diese zur Hervorhebung zusätzliche Maßnahme die Gefahr einer Fehlbelegung zusätzlich vermindern.
-
Die zeigt in einer Flussdiagramm-Darstellung einen bevorzugten Ablauf eines erfindungsgemäßen Verfahrens: Ein Probenträger für die Ionisierung mit matrix unterstützter Laserdesorption mit mehreren Probenorten wird bereitgestellt. Dabei kann es sich um einen MALDI-Probenträger handeln, der nicht durchsichtig zu sein braucht. Weiterhin wird eine Petrischale bereitgestellt, die ein flächiges Nährmedium enthält, in dem Kolonien von Mikroorganismen herangewachsen sind. Es können aber auch Agarplatten oder mittels einer Zentrifugation oder Filtration gewonnene Pellets als flächige Probenquellen dienen. Die hier beispielhaft genannte Petrischale kann mit einem Barcode als Identifizierungskennzeichen versehen sein, der in einem optionalen Verfahrensschritt eingelesen, zum Beispiel optisch abgetastet, wird. Zusätzlich oder alternativ wäre auch ein RFID-Chip als Träger eines Identifizierungskennzeichens denkbar, der sich per Funk auslesen ließe. Die Anordnung der Kolonien auf dem Nährmedium kann mit einer Kamera aufgenommen und auf die genaue Positionierung der einzelnen Kolonien ausgewertet werden, zum Beispiel auf die XY-Koordinaten der einzelnen Kolonien auf dem flächigen Nährmedium. Mit diesen Informationen lässt sich das Identifizierungskennzeichen des Nährmediumträgers, insbesondere der Petrischale, probenweise beziehungsweise kolonieweise ergänzen und damit detaillierter spezifizieren.
-
Als nächstes kann ein Auswahlkriterium – oder auch mehrere Auswahlkriterien – definiert werden, nach dem die Belegungssequenz von statten gehen soll. Kriterien für die Auswahl können zum Beispiel sein: eine Auswahl nach der Zählweise (beispielsweise Belegung jedes n-ten [unbelegten] Probenortes), Zufallsauswahl, Berücksichtigung einer Ausschlussliste mit bereits präparierten Probenorten. Die Reihenfolge, in der die die Kriterien erfüllenden und damit ausgewählten Probenorte zu belegen sind, kann grundsätzlich beliebig vorgegeben werden, beispielsweise kann sie einer Durchnummerierung der in Frage kommenden Probenorte auf dem Probenträger von kleineren zu größeren Ziffern folgen.
-
Der erste ausgewählte Probenort – in einer Variante auch mehrere Probenorte – wird nun hervorgehoben und händisch von einer Fachkraft belegt. Optional kann zwischen diesen Schritten ein Identifizierungskennzeichen des hervorgehobenen Probenortes eingelesen werden, um später eine Zuordnung zu dem Probenherkunftsort zu ermöglichen. Zum Abschluss des Belegungsvorgangs kann die Hervorhebung beendet werden, im Falle einer Lichtquelle kann diese beispielsweise ausgeschaltet werden. Optional lassen sich dann die Identifizierungskennzeichen einander zuordnen und auf einem geeigneten Speichermedium, insbesondere einem elektronischen Speicher, ablegen. Wenn mehr als ein Probenort die Auswahlkriterien erfüllten, können nun alle weiteren ausgewählten Probenorte iterativ bearbeitet werden, bis keiner der ausgewählten Probenorte übrig ist. Es versteht sich, dass ein weiteres, nicht explizit dargestelltes Kriterium für den Abbruch der Iterationen darin besteht, dass es keine Proben mehr zum Übertragen auf den Probenträger gibt.
-
Die zeigt eine Belegungshilfe 1 mit einer Aufnahme 40 für einen nicht gezeigten Probenträger. Die Aufnahme 40 ist in einem Gehäuse gebildet. Die Vorrichtung zum Hervorheben 6 weist einen verschwenkbaren Punktstrahler 8 als Lichtquelle auf, mit dem sich jeder Probenort auf einem Probenträger von vorne beleuchten lässt, wenn sich der Probenträger in der Aufnahme 40 befindet. Der Punktstrahler 8 ist in diesem. Beispiel an einem Haltearm auf dem Gehäuse angebracht. Die Energie für den Punktstrahler 8 kann durch eine integrierte Batterie oder einen Akkumulator geliefert werden. Mit einem Stäbchen 38, an dessen Spitze biologisches Material mikrobiellen Ursprungs beispielsweise von einer Kolonie in einer Petrischale aufgenommen ist, kann eine Probe auf einen Probenort eines in der Aufnahme 40 positionierten Probenträgers abgelegt werden. Über eine Schnittstelle 16 kann der Anwender der portablen Belegungshilfe 1 Daten eingeben oder sich ausgeben lassen, beispielsweise lässt sich darüber eine erfolgte Belegung bestätigen.
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
-
Zitierte Patentliteratur
-
- DE 102004020885 A1 [0008]
- DE 202007018535 U1 [0012]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- FEMS Microbiology Reviews, 24, 2000, 193–219: „Characterization of bacteria by matrix-assisted laser desorption/ionization and electrospray mass spectrometry” [0003]
- Jarman et al., Analytical Chemistry, 72[6], 1217–1223, 2000: „An algorithm for automated bacterial identification using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry” [0003]
