DE69826114T2

DE69826114T2 - Verfahren und system zur identifizierung eines fleischprodukts mittels genotypisierung

Info

Publication number: DE69826114T2
Application number: DE69826114T
Authority: DE
Inventors: Ciaran Niall Dalkey MEGHEN; Edward Patrick Cunningham; Daniel Gerard Bradley; David Evan Machugh; Ronan Thomas Ballina LOFTUS
Original assignee: Parlanca Ltd
Current assignee: Parlanca Ltd
Priority date: 1997-03-07
Filing date: 1998-03-06
Publication date: 2005-09-15
Anticipated expiration: 2018-03-07
Also published as: ATE275638T1; DE69826114D1; AR011945A1; CA2283432A1; AU6633498A; EP0970244B1; WO1998039475A2; NZ337836A; EP0970244A2; ZA981975B; WO1998039475A3

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Identifizierung und insbesondere auf ein Verfahren zum Identifizieren oder zum Rückverfolgen von Fleischprodukten.
Gesundheits- und Sicherheitserwägungen erfordern, dass die Ursprünge von Lebensmittelprodukten erkennbar sein sollen. Zusätzlich fordern jetzt Verbraucher, und einige Länder verlangen jetzt, dass die Ursprünge von Fleischprodukten rückverfolgbar sein sollten, so dass die Qualitätskontrollaudits und Überwachungsabläufe effektiv und zuverlässig durchgeführt werden können.
Während Fleisch und auf Fleisch basierende Produkte eine wichtige Nahrungsquelle sind, können sie auch eine gefährliche Infektionsquelle sein, und demgemäß ist es aus wirtschaftlichen Gründen wichtig, dass das Verbrauchervertrauen in diese Produkte beibehalten wird.
Zur Zeit werden verschiedene Verfahren und Kombinationen von Verfahren verwendet, um zu versuchen, die Identität und die Quelle von Fleischprodukten zu gewährleisten. Zum Beispiel wird die Identität von Rindfleisch, Schweinefleisch und Geflügel auf einer Altersgruppen- oder Lieferungsbasis manchmal unter Verwendung von Altersgruppen-/Lieferungsnummern, die auf die Altersgruppen-/Lieferungsbasis von der Quelle angewendet werden, durch den Schlachtvorgang bis zum Verbraucher aufgezeichnet. Das Verfahren ist zeitaufwendig, mühsam und erfordert erhebliche Ressourcen von Bauern, Bearbeitern und der Regierung oder anderen Behörden.
Administrativ intensive Verfahren sind vorhanden, um die Identität von Rindfleischprodukten bis zur Schlachtung aufzuzeichnen. Zum Beispiel stellen Regierungsbehörden in vielen Ländern numerische oder alphanumerische Codes an Bauern aus, die folglich derartige Codes den von ihnen gezüchteteten Kälbern zuordnen. Im Allgemeinen sind die zugeordneten Codes auf Ohrenmarken, die an beide Ohren eines Tieres kurz nach der Geburt aufgetragen wurden, eingetragen. Der Code wird dann auf einer dem Tier eigenen Karte manuell aufgezeichnet, die einen Namen des Bauern und auch den Muttertiercode umfassen kann, so dass der Ursprung des Kalbs rückverfolgt werden kann. Wenn künstliche Insemination verwendet wird, wird im Allgemeinen die Identität des Vatertieres unbekannt sein. Die Karte kann dann als eine Art Passdokument für das bestimmte Tier verwendet werden.
Verschiedene andere Daten über ein Tier können auch aufgezeichnet werden, z. B. die Häufigkeit von Tuberkulosetests und andere veterinäre Informationen. Derartige Informationen können an eine Regierungsbehörde weiter geleitet werden. Im Allgemeinen sind die Identifizierungs- und Testaufzeichnungen jedoch nicht oder nicht leicht integrierbar.
Nach dem Züchten eines Tieres, z. B. zwei Jahre für Tiere für die Rindfleischerzeugung und sechs bis acht Jahre für ein Tier für die Milcherzeugung, wird das Tier im Allgemeinen in einem vorschriftsmäßigen Schlachthof geschlachtet. Die Ohrenmarken werden beim Schlachten von dem Tier entfernt und der Code wird aufgezeichnet. Auf ähnliche Weise können die Tierpassdaten aufgezeichnet und protokolliert werden. Die zuständige Regierungsbehörde vermerkt, dass das Tier entsprechend dem Code geschlachtet wurde.
Genauer gesagt wird der Schlachtkörper eines geschlachteten Tieres für gewöhnlich in zwei geteilt. Jede Seite des Schlachtkörpers kann mit einer Marke von dem Schlachthof versehen werden. In einem Schlachthof, in dem viele Tiere nacheinander geschlachtet werden, während weiterer Teilung oder Zerstückelung der zwei Hälften eines individuellen Schlachtkörpers, wird es jedoch unpraktisch die Identität jedes Fleischstücks, das von diesem Schlachtkörper abgeschnitten wurde, zum Ursprungstier, von dem das Fleisch abstammt, rückzuverfolgen.
Um die Nachfragen von Händlern und Verbrauchern zu befriedigen, wurden verschiedene Verfahren vorgeschlagen, um die Identität des Schlachtkörpers nach dem Schlachten zu überwachen. Alle derartigen Verfahren stützen sich jedoch auf die kontinuierliche Verwendung von Marken, Kennzeichen usw. Auf Grund der potentiell hohen Anzahl von Fleischschnitten, die von einem einzelnen Tier abstammen können, sind derartige Abläufe eindeutig sehr ressourcenintensiv, kostspielig und unterliegen einer hohen Fehlerrate.
Demgemäß ist ein Bedarf an zuverlässigen und schnellen Verfahren und Systemen zur Identifizierung für Fleischprodukte, bei denen die Identität des Fleischprodukts während der gesamten Lebensdauer des Fleischprodukts einholbar ist, vorhanden.
M. Georges, A-S Leguarre, M. Castelli, R. Hanset & G. Vassart, Cytogenet Cell Genet, 1988, (47) (127-131) zeigten die Möglichkeit, dass DNA-Fingerabdrücke bei vielen Spezies unter Verwendung einer M13 abgeleiteten Sequenz, eines Polymers von Jeffreys Kernsequenz, der hypervariablen Human- und Globin-Region und einer Maussonde, die sich auf das Drosophila per-Gen bezieht, erhalten werden können.
Ein Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren und System zur Identifizierung von Fleischprodukten bereitzustellen.
Gemäß der Erfindung ist ein Verfahren zum Rückverfolgen des Ursprungs eines Fleischprodukts gemäß Anspruch 1 bereitgestellt.
Vorzugsweise ist das Tier ein domestiziertes Nutztier. Das bekannte Tier kann zuerst kurz nach der Zerstückelung des Tierschlachtkörpers genotypisch bestimmt werden. Alternativ dazu wird das Tier zuerst zwischen der Geburt und der Schlachtung des Tieres genotypisch bestimmt.
Das Verfahren der Erfindung ist besonders für die Identifizierung von Rindfleisch geeignet.
Vorzugsweise beinhaltet der Ablauf zur Bestimmung des Genotyps die Schritte der Probenahme des Tiergewebes, des Extrahierens von genetischem Material aus dem Tiergewebe und des Durchführens einer molekular-genetischen Analyse des extrahierten genetischen Materials. Besser beinhaltet das genetische Material DNA. Vorzugsweise wird die DNA nach der Extraktion vervielfacht. Am besten beinhaltet die Vervielfachung eine Polymerase-Kettenreaktion.
Vorteilhafterweise ist die Probe aus der Gruppe, die Haarwurzeln, Tierhaut, Wangenabstriche, Blut, Muskel, Knochen und beliebige innere Organe beinhaltet, ausgewählt.
Am besten wird die Probe aus der Gruppe, die Abstriche, Tierhaut, Haarwurzeln und Muskel beinhaltet, ausgewählt.
Vorteilhafterweise beinhaltet die Probe eine Einheit Volumen oder Größe. Geeigneterweise wird die Probenahme mit einer Probenahme-Vorrichtung, die zum Einholen einer Einheit Volumen oder Größe bestimmt ist, durchgeführt.
Vorteilhafterweise wird die DNA unter Verwendung von Alkaliextraktion extrahiert. Geeigneterweise beinhaltet das Alkali NaOH und KOH. Besser wird die DNA extrahiert, indem eine Einheit Volumen von Alkali zu der Probe hinzugegeben wird, die Probe erhitzt wird, um die DNA zu extrahieren und das Alkali neutralisiert wird. Geeigneterweise wird das Alkali mit einer Säure neutralisiert. Vorteilhafterweise beinhaltet die Säure HCl. Vorzugsweise wird ein Farbstoff zu der Probe hinzugegeben, um die Probe zu veranschaulichen. Vorzugsweise beinhaltet der Farbstoff Cresolrot.
Geeigneterweise ist der pH-Wert der Probe mindestens 8.
Geeigneterweise wird das Probengewebe in eine Identifizierungszelle platziert. Vorzugsweise wird die Extraktion in der Identifizierungszelle durchgeführt. Vorzugsweise ist die Identifizierungszelle ein Teil einer Mikrotiterplatte.
Vorteilhafterweise ist die Identifizierungszelle mit der Identifizierung des Tieres oder des Fleisches nach der Probe gekennzeichnet. Alternativ dazu wird eine Referenznummer für die Mikrotiterplatte der Identifizierungszelle in einem Computer aufgezeichnet.
Alternativ dazu werden die Kennzeichnungsinformationen vor der Extraktion in einen Computer eingegeben. Am besten wird eine Miktotiterplattereferenznummer in einen Computer eingegeben.
Vorteilhafterweise sind die Informationen auf dem Computer absuchbar.
Vorzugsweise wird der Genotyp des genotypisch bestimmten Fleisches in den Computer eingegeben. Besser ist der Genotyp absuchbar. Am besten wird der Genotyp codiert.
Die Erfindung erstreckt sich auch auf ein Verfahren zum Identifizieren des Tieres, von dem ein Fleischprodukt abstammt, das Probenahme des Tiergewebes, Aufbewahren der Probe, Extrahieren von genetischem Material von der Probe wie erforderlich, Durchführen einer molekular-genetischen Analyse an dem extrahierten genetischen Material und Codieren der Ergebnisse der molekular-genetischen Analyse, Eingeben der Probeninformationen und der codierten genetischen Analyse in eine Computerdatenbank beinhaltet, wobei die Probeninformationen und die codierte genetische Analyse absuchbar sind, so dass die molekular-genetische Analyse einer Fleischprobe mit der molekular-genetischen Analyse eines Tieres abgestimmt werden kann.
Die Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung von molekular-genetischer Analyse zum Indentifizieren des Tieres, von dem ein Fleischprodukt abstammt. Vorzugsweise beinhaltet die molekular-genetische Analyse eine Polymerase-Kettenreaktion-Vervielfachung.
Ferner ist ein Mikrotiterplatten-Halter, der ein Mikrotiterplatten-Haltemittel, Identifizierungscodes für jedes Loch der Mikrotiterplatte und ein Kontrollmittel, um selektiven Zugriff auf die Löcher der Mikrotiterplatte zu ermöglichen, bereitgestellt.
Vorzugsweise beinhaltet das Kontrollmittel ein Abdeckmittel zum selektiven Abdecken und Aufdecken der Löcher der Mikrotiterplatte.
Vorteilhafterweise beinhaltet das Abdeckmittel eine Tür, die mindestens eine Öffnung darin zum selektiven Aufdecken oder Ermöglichen eines Zugangs zu einem Loch aufweist, wobei die Tür auf der Mikrotiterplatte gleitbar ist. Geeigneterweise ist die Tür in einem Rahmen, der auf der Mikrotiterplatte montierbar ist, gleitbar montiert. Vorzugsweise beinhaltet die Öffnung eine kreisförmige Öffnung, um Zugang auf eine einzelne ausgewählte Zelle zu ermöglichen. Besser beinhaltet die mindestens eine Öffnung einen Schlitz, damit Zugang auf eine Reihe oder Spalte von Zellen ermöglicht wird.
Ferner ist ein Kit zum Identifizieren des Tieres, von dem ein Fleischprodukt abstammt, das Reagenzien zum Extrahieren von genetischem Material beinhaltet, eine Mikrotiterplattenhandhabungsvorrichtung und ein Mittel zum Aufzeichnen der Identität auf dem genetischen Material offenbart. Das Kit beinhaltet ferner wahlweise ein Spritzenmittel zum Übertragen von Proben.
Ein Vorteil der Erfindung ist, dass die Identität von Tierfleischprodukten schnell und zu angemessenen Kosten, die minimale Ressourcen erfordern, eingeholt und rückverfolgt werden kann.
Eine Anwendung von genetischen Identifizierungstechniken, als ein Mittel zur Bereitstellung von Routinequalitätskontrolle in der Rindfleischindustrie, wird bereitgestellt. Der auf der DNA basierende Ansatz weist verschiedene Schlüsselvorteile gegenüber jedem anderen System auf:

i) DNA-Identifizierung stellt eine bedeutende Kosteneinsparung gegenüber jedem anderen Ansatz dar.
ii) Das DNA-System erfordert keine bedeutende Änderung von vorhandenen Produktionsmethoden.
iii) Vorteile des Systems sind nicht nur für große Supermarktketten und andere große Käufer verfügbar, sondern sind auch für kleinere Händler und Käufer zugänglich.
iv) Es gibt keine negativen Lebensmittelsicherheits-Auswirkungen, was klar von jedem System, das die physische Kennzeichnung von Fleisch in der Produktionsphase erfordert, absticht.
v) Das System unterliegt bedeutend weniger Bedienungsfehlern und ist manipulationssicher.

Das Verfahren der Erfindung erfordert, dass eine Probe von jedem Tier an einem Punkt in der Produktionsphase vor dem Verlust der Lebensdauer-Identität des Tieres genommen wird. Abhängig von den bestimmten Praktiken, kann dies sein, wenn die Tiere zuerst zur Fleischfabrik geliefert werden oder an dem Punkt, an dem die betriebsinternen Tötungsnummern den Schlachtkörpern zugeordnet werden. Probenahme ist technisch einfach und umfasst minimale Interferenz von vorhandenen Verarbeitungssystemen. Die Proben werden dem Testlabor vorgelegt und für die Analyse vorbereitet. Diese Tätigkeit stellt das Gerüst, mit welchem die Fleischrückverfolgung getestet werden kann, bereit. Fleischproben von einem beliebigen Punkt nach dem Verlust der Schlachtkörper-Identität können leicht mit dem richtigen Ursprungstier durch das Verfahren der Erfindung abgestimmt werden.
Proben müssen nur an einem einzigen Punkt in der Verarbeitungskette genommen werden. Dies ist typischerweise an dem Punkt, an dem die Schlachtkörper für den Handelskunden in Altersgruppen aufgeteilt werden (Kühlraum) – an dem eine Fleischprobe von jedem Schlachtkörper genommen wird und mit der betriebsinternen Tötungsnummer oder einem Äquivalent gekennzeichnet wird.
Das Verfahren der Erfindung sieht deshalb 100 % Fleisch-Schlachtkörperrückverfolgung vor, ohne den Bedarf an aufwendiger DNA-Analyse. An jedem beliebigen Punkt in der Zukunft können im Handel Fleischproben zum Ursprungsschlachtkörper rückverfolgt werden, auf Grund dessen, dass Fleischproben von allen Ausgangsschlachtkörpern genommen wurden und für die Lebensdauer des Fleischprodukts – typischerweise 7 Monate – aufbewahrt wurden; dies schließt die empfohlene maximale Aufbewahrungszeit für das Einfrieren von Fleischprodukten zu Hause ein.
Zusätzlich sorgt die Erfindung dafür, dass der Händler die Genauigkeit der Kennzeichnungsinformationen an einem beliebigen Punkt in der Zukunft unabhängig prüfen kann. Aus einer Sicht der Qualitätskontrolle kann der Händler wünschen, eine Routine von Fleischprobenahmen durchzuführen, um den Grad des statistischen Vertrauens in der Konformität der Fleischlieferungen für bestimmte Vertragsbeschreibungen zu erhalten. Das geeignete statistische Modell ist die hypergeometrische Verteilung, aber entweder die binomische oder Poissonverteilung ergeben ähnliche Ergebnisse.
Unter Verwendung der binomische Verteilung zeigt das folgende Beispiel den Grad der Handelsprobenahme, die erforderlich ist, um verschiedene Grade an Vertrauen zu erreichen, wobei Vertrauen als eine Wahrscheinlichkeit der Erfassung eines nicht rückverfolgbaren Produkts definiert ist.
Das Verfahren der Erfindung passt deshalb den Genotyp, der auf jedes individuelle Tier beschränkt ist, auf ein benutzerfreundliches Tier-/Fleischrückverfolgungssystem an. Der Genotyp in der Form von DNA-Sequenzen wird in jeder Zelle eines Tieres repliziert und kann deshalb unverändert in jedem Gewebe eines Tiereschlachtkörpers gefunden werden. Ein besonderer Vorteil der Nutzung der DNA-Sequenz ist, dass die DNA-Sequenz nach dem Tod und oft selbst nach dem Kochen, Pökeln oder Verarbeiten von Fleischprodukten, unverändert bleibt. Deshalb bleibt die Unversehrtheit der Identifikationsinformationen eines Tieres von Geburt bis zum Verzehr erhalten.
Im Gegensatz dazu können Kennzeichnungs- und zur Anbringungsverfahren von Marken die Identität eines Tieres nicht durch Koch-, Pökel- oder durch Verarbeitungsabläufe hindurch übermitteln.
Ein weiterer Vorteil der Erfindung ist, dass der Genotyp eines Tieres manipulationssicher ist – der genetische Code kann während der Lebensdauer eines Tier oder danach nicht modifiziert werden.
Demgemäß hat die vorliegende Erfindung den eingebauten genetischen Identifikationscode jedes Tieres in einem Verfahren zur Rückverfolgung der Ursprünge eines Tieres angepasst.
Ein erhebliches Vorurteil ist gegenüber der Verwendung von genetischen Informationen im großen Maßstab im Vergleich zur Verwendung derartiger Verfahren im kleinen Maßstab, wie sie in der forensischen Wissenschaft benutzt werden, vorhanden. Insbesondere werden bekannte DNA-Probenahmen-, Extraktions- und Analyseabläufe als Vorgänge, die sehr ressourcenintensive und geschicklichkeitsintensiv sind, angesehen.
Die vorliegende Erfindung beseitigt jedoch derartige Vorurteile und stellt ein einfaches, aber zuverlässiges Verfahren von Probenahmen, Extrahieren und Analysieren von Fleischprodukten im großen Maßstab bereit, das die Anwendung von Molekularbiologie auf Fleischrückverfolgung und -identifikation vereinfacht.
Das Verfahren der Erfindung kann aus einer Anzahl von verfahrenstechnischen Schritten bestehen und zwar aus Gewebeprobenahme, Extraktion von genetischem Material aus dem Gewebe, von dem eine Probe genommen wurde, molekular-genetischer Analyse des genetischen Materials und von welcher Stelle von einem Fleischprodukt die Gewebeprobe genommen wurde, Vergleich des Genotyps mit bekannten Tiergenotypen, die in der Datenbank gespeichert sind.
Die Erfindung stellt auch ein System oder Regime zur Probenhandhabung bereit, das die Kontinuität und Unversehrtheit jeder Probe in dem vorher erwähnten Verfahren gewährleistet.
Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die beigelegten Zeichnungen und Beispiele beschrieben, in denen:
1 eine Draufsicht eines Mikrotiterplattenhalters zur Verwendung in dem Verfahren und System der Erfindung ist;
2 eine auseinandergezogene Ansicht der Komponenten des Mikrotiterplattenhalters aus 1 ist;
3 eine Perspektivansicht des Mikrotiterplattenhalters aus 1 und 2 von oben ist, wobei die obere Platte entfernt ist;
4 ein Seitenriss des Mikrotiterplattenhalters ist, wobei die obere Platte über der Mikrotiterplatte und der Basisplatte angeordnet ist, und
5 ein Seitenriss des Mikrotiterplattenhalters ist, wobei die obere Platte auf der Mikrotiterplatte und der Basisplatte montiert ist.
Im Allgemeinen können geeignete Verfahren der Erfindung Folgendes beinhalten:
Gewebeprobenahme
Eine Gewebeprobe kann von einem Tier zu jedem Zeitpunkt in der Lebensdauer eines Tieres, aber vor dem Verlust der Schlachtkörper-Identität genommen werden. Demgemäß können das Verfahren und System der Erfindung als Ersatz für gegenwärtige Tiermarken-Identifizierungsverfahren oder zusätzlich zu derartigen Verfahren verwendet werden. Wenn zum Beispiel angenommen wird, dass ein Tiermarken-Identifizierungsverfahren bis zum Punkt der Schlachtung zufrieden stellend ist, kann die Gewebeprobenahme eines Tieres im Schlachthof vor dem Verlust der Schlachtkörper-Identität vollzogen werden.
Die Gewebeprobe kann Haarwurzeln, Tierhaut, Wangenabstriche, Blut, Muskel oder beliebige innere Organe beinhalten. Die Gewebeproben können auch Knochen beinhalten, obwohl die vorher erwähnten Probearten bevorzugt werden.
Die Gewebeprobe wird in ein Identifizierungsröhrchen oder eine Identifizierungszelle platziert, die, wo das Verfahren der Erfindung zusammen mit einem Tiermarken-Identifizierungssystem verwendet wird, mit dem Tiermarken-Identifizierungscode markiert wird.
Die Identität der Zelle bleibt durch das Verfahren der Erfindung hindurch konstant, wobei die Unversehrtheit und die Kontinuität der Gewebeprobe während der Extraktion und der Analyse garantiert bleibt. Im Gegensatz dazu erfordern forensische Analysen, die in kleinem Maßstab durchgeführt werden, häufige Änderungen bei Probenbehältern, die Unzuverlässigkeit und Versuchsfehler hervorrufen können.
Die erforderliche Menge/Größe der Probe wird durch die nachfolgenden Schritte, die in dem Verfahren der Erfindung und den spezifischen verwendeten Analyseverfahren verwendet werden, bestimmt. Idealerweise sollte die Größe/das Volumen der eingeholten Gewebeprobe so beständig wie möglich von Tier zu Tier sein.

Nicht einschränkende Beispiele geeigneter Probengrößen/-verfahren umfassen Folgendes:

Fettarmes Fleisch:	0,00028–0,0010 g
Tierhaut:	0,0004 g–0,0010 g
Haarwurzeln:	> 5, < 20
Wangenabstriche:	15 bis 20 Sekunden Reiben mit geringem Druck in dem Bereich zwischen der äußeren Lippe und dem Zahnfleisch unter Verwendung einer Zytobürste von Cytosoft (Warenzeichen).
Knochen:	0,0020 g–0,0040 g
Blut:	30 bis 70 μl

Typischerweise ist die Identifizierungszelle unter Verwendung eines Nummernsystems, das einen Code trägt, der dem Code auf der Identifizierungsmarke des Tieres entspricht, gekennzeichnet.
Die Identifizierungszelle wird dann in eine Mikrotiterplatte mit einer Mehrzahl von Löcher platziert, z. B. 96 Löcher oder Mehrfache davon. Jedes Loch ist mit einem Code versehen.
Das in dem Verfahren und dem System der Erfindung verwendete Nummernsystem wendet die Identifizierungsnummer des Tieres, wie ursprünglich auf der Ohrenmarke des Tieres angezeigt, an. Ein Derivat der Identifizierungsnummer des Tieres oder eine vollkommen neue Nummer kann auch verwendet werden. Demgemäß ist der Genotyp eines bestimmten Tieres zu jedem Zeitpunkt leicht rückverfolgbar.
Die Mikrotiterplatte, die die Identifizierungszellen trägt, wird dann in einem Labor zur Extraktion des genetischen Materials aus den Proben und Analysen verwendet. Alternativ dazu können die Proben zur Konservierung eingefroren und archiviert werden, zum Beispiel in der Fabrik/dem Schlachthof oder einem zentralen Aufbewahrungsort für zukünftige erforderliche Extraktion/Analyse.
Ein Gerät zur Probenahme kann dem Bauern, einem Schlachthof oder Händler geliefert werden. Das Gerät zur Probenahme nimmt vorzugsweise eine beständige und reproduzierbare Probe aus individuellen Tieren, während es gleichzeitig jede Kreuzkontamination von Gewebe vermeidet. Demgemäß würden die Größe und das Volumen der von individuellen Tieren stammenden Probegewebe beständig sein.
Ein Vorteil von einheitlichen Probevolumen/-größen ist, dass Reagenzien, die in den nachfolgenden Extraktions- und Analyseabläufen (siehe unten) verwendet wurden, wiederum einheitlich sein könnten und keinen Abweichungen auf Grund von Probengröße/-volumen unterliegen würden.
Extraktion von DNA
Extraktion von DNA von Gewebeproben unter Verwendung von Standardtechniken benötigt im Allgemeinen, unter Verwendung von bekannten organischen Extraktionverfahren, bis zu zwei Tage. Die forensischen oder organischen Extraktionsabläufe im kleinen Maßstab erfordern auch die Verwendung von gefährlichen Chemikalien und kostspieligen Reagenzien, wie beispielsweise Proteinase K oder Phenol. Zusätzlich erfordert bekannte DNA-Extraktion und -übertragung oft die Verwendung von mehreren Zentrifugationsschritten.
Ein starkes Vorurteil gegenüber der Verwendung von genetischer Analyse im großen Maßstab ist vorhanden, auf Grund der intensiven arbeits- und zeitaufwendigen Verfahren, die erforderlich sind, um hochreine DNA aus den Gewebeproben zu extrahieren. Zum Beispiel wird Proteinase K angewendet, um Proteine, die in der Probe vorhanden sind, abzubauen, die die Vervielfachung und Analyse der extrahierten DNA behindern könnten. Überraschenderweise hat sich herausgestellt, dass DNA von ausreichend hoher Qualität für die Vervielfachung und nachfolgende Analyse schnell im großen Maßstab von dem Tiergewebe extrahiert werden kann, ohne verlängerte und wiederholte Übertragungs- und Zentrifugierungsschritte und die Verwendung einer Proteinase, wie beispielsweise Proteinase K, zu benötigen. Das extrahierte DNA-Material kann dann vervielfacht werden, indem die Polymerase-Kettenreaktion, die weiter unten erläutert wird, verwendet wird.
Demgemäß war ein starkes Vorurteil gegenüber der Verwendung von routinemäßiger molekular-genetischer Analyse im großen Maßstab vorhanden, auf Grund der hohen Qualität von DNA, die für die Vervielfachung und nachfolgende Analyse benötigt wurde.
Viele im Fach bekannten Extraktionsverfahren können verwendet werden, um genetisches Material aus Gewebeproben in der vorliegenden Erfindung zu extrahieren.
Ein bevorzugtes Verfahren der Extraktion, in dem komplexer Proteinabbau, Übertragungs- und Zentrifugierungsschritte zur Verwendung in dem Verfahren und System der vorliegenden Erfindung, nicht erforderlich sind, was die schnelle Extraktion von DNA aus den Gewebeproben erleichtert, ist jedoch unten umrissen. Das bevorzugte Verfahren beinhaltet die Verwendung eines Alkali-Extraktionsverfahrens, das NaOH benutzt. Wie vom Fachmann jedoch verstanden werden wird, könnte auch KOH verwendet werden. Das Alkali weist typischerweise eine Konzentration von ungefähr 150 mM bis ungefähr 200 mM auf. Ein bevorzugtes Reagenz ist:
Es ist keine Manipulation der Gewebeprobe vor der Extraktion erforderlich. Eine Bedienungskraft in einem Labor gibt die Mikrotiterplattennummer/den alphanumerischen Code in eine Computerdatenbank ein und vor dem Handhaben jeder individuellen Identifizierungszelle gibt er den alphanumerischen Code auf dem Identifizierungszellenkennzeichen und der Nummer des entsprechenden Mikrotiterplattenlochs in die Datenbank ein. Danach ist das Hauptreferenzfeld in der Datenbank die Mikrotiterplattennummer, z. B. wenn ein Tiercode eingegeben wird, führt die Datenbank eine Bedienungskraft zu einer Platte.
Das Volumen der in der Extraktion verwendeten Reagenzien wird durch die Gewebeart und die Größe/das Volumen der Gewebeprobe bestimmt.
Typischerweise wird die Probengröße/das Probenvolumen auf einer Basis der Einheit Volumen bestimmt, wobei eine typische Einheit Volumen im Bereich von 25 Mikrolitern bis 100 Mikrolitern liegt.
Eine Einheit Volumen von 200 mM NaOH (Lösung A) wird zur Gewebeprobe in der Identifizierungszelle hinzugefügt. Die Identifizierungszelle wird dann erhitzt.
Die Temperatur und die Dauer des Erhitzens sollten ausreichend sein, um zu bewirken, dass das doppelsträngige DNA-Material in eine einsträngige Form zurückkehrt. Demgemäß werden Temperaturen im Bereich von ungefähr 95 °C bis ungefähr 99 °C bevorzugt und sie haben sich als besonders effektiv herausgestellt. Die Identifizierungszelle wird typischerweise in dem vorher erwähnten Temperaturbereich für eine Dauer von zwischen ungefähr 15 Minuten und ungefähr 25 Minuten erhitzt.
Das 20-minütige Erhitzen bei einer Temperatur von 97 °C, hat sich als besonders effektiv herausgestellt.
Lösung A beinhaltet einen Farbstoff. Der Farbstoff wird ausgewählt, um die Probenlösung, die für gewöhnlich transparent ist, farbig zu machen. Der Farbstoff wird ausgewählt, um nicht mit der extrahierten DNA zu reagieren oder die nachfolgende genetische Analyse zu behindern. Ein bevorzugter Farbstoff ist Cresolrot.
Ein Vorteil von Cresolrot ist, dass es auch als ein pH-Anzeiger dient, um zu zeigen, dass der Probe-pH-Wert nach der Mischung der Lösung A mit einer zweiten Lösung (weiter unten erläutert) B im richtigen Bereich liegt.
Ein Vorteil des Inkorporierens von Cresolrot in Lösung A ist, dass eine Farbänderung bei der Kombination von Lösungen A und B auftritt, d. h. eine Farbänderung von lila zu rot.
Der Probe-pH-Wert ist wichtig, da viele molekular-genetische Analyseverfahren Proben aus genetischem Material mit einem spezifischen pH-Wert erfordern. In dem bevorzugten Analyseverfahren, das unten umrissen wird, wird ein pH-Wert von ungefähr 8 bis ungefähr 9 bevorzugt.
Cresolrot weist die folgenden Farbbereiche auf:

pH-Wert 8–9: rot

pH-Wert > 9: lila

pH-Wert < 8: gelb
Demgemäß ist Cresolrot ein sehr geeigneter Farbstoff, der auch als ein pH-Wert-Anzeiger dient.
Die Verwendung des Farbstoffs in der Identifizierungszelle erleichtert die schnelle, leichte und sehr sichtbare Handhabung von Proben im großen Maßstab.
Lösung B beinhaltet eine Säure zum Reduzieren des pH-Wert der Identifizierungszellenlösung. Lösung B beinhaltet typischerweise eine Säure wie beispielsweise TRIS HCl, die HCl bei einer Konzentration von circa 150 mm bis circa 250 mm HCl enthält. Eine bevorzugte Lösung B beinhaltet:

Lösung B: 100 mM TRIS HCl pH-Wert 8,5 200 mM HCl
Für Analysezwecke ist es wünschenswert, dass gleiche Proportionen von der TRIS HCl-Lösung, wie mit der ersten NaOH-Lösung verglichen, benutzt werden sollten.
Eine Einheit Volumen von Lösung B wird dann zur Identifizierungszelle hinzugefügt. Die Endlösung weist deshalb einen pH-Wert von ungefähr 8,5 auf, der auf TRIS HCl basiert.
Die Probehandhabetechniken der Erfindung stellen sicher, dass die Übertragung der Probe zwischen den Röhrchen minimiert ist. Insbesondere bleibt die Identität der Zelle durch das gesamte Verfahren und System der Erfindung hindurch beständig, um die Kontinuität von Proben zu garantieren.
Wie vorher angezeigt werden alle Übertragungen, Übermittlungs- und Analysevorgänge auf einer Basis von Mikrotiterplatten und nicht auf einer Basis von Löchern oder Identifikationszellen durchgeführt. Demgemäß werden im Gegensatz zu den forensischen Verfahren des Stands der Technik die Fehlerraten außerordentlich reduziert und der Verlust der individuellen Zellen wird praktisch beseitigt.
Mikrotiterplatten können auf Grund ihrer vergleichsweise kleinen Größe leicht aufbewahrt werden und demgemäß kann das extrahierte genetische Material in einem Gefrierschrank über verlängerte Zeiträume aufbewahrt werden.
Die Probe, die innerhalb jeder Identifizierungszelle enthalten ist, ist mit Öl überzogen, um die Probe zu konservieren. Die Proben können eingefroren oder sofort analysiert werden, wie unten umrissen.
DNA-Vervielfachung
Die extrahierte DNA wird vor der DNA-Analyse vervielfacht.
Ein besonders bevorzugtes Verfahren zur Vervielfachung ist die Polymerase-Kettenreaktion (PCR-Analyse). Der Fachmann wird verstehen, dass PCR ein In-Vitro-Verfahren für enzymatisches Synthetisieren von definierten Sequenzen von DNA ist. Die Reaktion verwendet zwei Oligonukleotid-Primer, die zu sich gegenüberliegenden Strängen hybridisieren und an die Ziel-DNA-Sequenz, die vervielfacht werden soll, angrenzen.
Ein allgemeiner Leitfaden zu PCR-Analyseprotokollen ist in „PCR Protocols: A guide to methods and applications.", Hrsg. M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, J. J. White, San Diego, CA: Academic Press, 1990 zu finden, was hier unter Bezugnahme inkorporiert ist.
Im Allgemeinen führt in PCR-Vervielfachung, die eine wiederholende Serie von thermischen Kreisläufen, die Matrizendenaturierung, Primer-Annealing und Erweiterung der ausgehärteten Primer durch Taq-DNA-Polymerase umfasst, zur exponentiellen Ansammlung von spezifischen kurzen DNA-Sequenzen (siehe unten).
Der PCR-Ablauf kann deshalb verwendet werden, um die Längenvariation bei DNA-Sequenzwiederholungen oder Mikrosatelliten zu ermitteln. PCR kann deshalb gleichmäßig verteilte und polymorphe Mikrosatellitenmarker in DNA-Proben identifizieren. In der vorliegenden Erfindung können Mikrosatellitenorte, die den getesteten Tierspezies eigen sind, vervielfacht und analysiert werden.
Die Anzahl von Mikrosatellitenorten, die in dem Verfahren und dem System der Erfindung erforderlich sind, wird durch die Auflösungsstärke, die für das Testverfahren erforderlich ist, bestimmt. Zum Beispiel könnte die Anzahl von Mikrosatellitenorten vergleichsweise niedrig sein, wenn das Verfahren und das System der Erfindung auf einer Altersgruppenbasis angewendet wird, während die Anzahl erhöht werden würde, wenn das System und Verfahren zum Beispiel bei einer nationalen Herde angewendet werden sollte.
Die International Society of Animal Genetics (ISAG) hat neun Mikrosatellitenorte zur Verwendung bei Rinderherkunftsprüfung anerkannt, und weitere vier Marker wurden zur weiteren Untersuchung ausgewählt. Die ISAG-Marker sind für die Verwendung in dem Verfahren und dem System der vorliegenden Erfindung geeignet. Die Marker bilden jetzt die Basis eines international standardisierten Markersatzes. Diese Marker wurden als Kits für die Verwendung mit einem automatisierten Perkin Elmer-AB1377-Sequenzer und den Li-Cor 4200 Doppellaser-Sequenzern (Warenzeichen) optimiert. Diese Marker und Teilsätze dieser Marker wurden für die Verwendung in der Rindfleischrückverfolgung als am besten geeignet identifiziert. Details der Marker sind Folgende:
Empfohlene ISAG-Marker für die Verwendung bei Rinderherkunftsprüfung
Markername (Größenbereich: Basispaare) Chromosomen-Primer-Sequenzen (5'-3')
Wie oben gezeigt, werden geeignete Mikrosatellitenorte und PCR-Verfahren zur Verwendung beim Vervielfachen und nachfolgenden Analysieren desselben im Hinblick auf das ABI-PRISM-(Warenzeichen)-System zum automatisierten Bestimmen des Genotyps, erhältlich von Perkin Elmer (Warenzeichen), beschrieben. In diesem System werden 11 Mikrosatellitenorte unter Verwendung der Perkin Elmer Stockmarks (Warenzeichen) für ein Rinderherkunfts-Rinder-PCR-Typisierungskit vervielfacht und analysiert. Eine detaillierte Beschreibung des Kits findet man in „Stockmarks (Gemeinschaftmarke) for Cattle Paternitv Bovine PCR Typing Kit Protocol", Teilnr. 401917, Rev. A, das hier unter Bezugnahme inkorporiert ist. Die kombinierte Genauigkeit der Mikrosatellitenmarker stellt eine durchschnittliche Ausschlusskraft (EPR) von mehr als 99,999 bereit.
In dem Verfahren der Erfindung werden eine oder mehrere Doppelmikrotiterplatten vorbereitet. Die ursprüngliche Mikrotiterplatte wird archiviert. Die Doppelplatten werden vorbereitet, so dass jede Identifizierungszelle der Identifizierungszelle der Hauptidenzifizierungs-Mikrotiterplatte entspricht.
Wie vom Fachmann verstanden werden wird, wird die Anzahl von Doppelmikrotiterplatten durch die Anzahl und Kombination von Orten bestimmt.
Die Anwesenheit von Cresolrot-Farbstoff innerhalb der Probe ist eine Anzeige dafür, welche Zellen verdoppelt wurden und welche Identifizierungszellen nicht verdoppelt wurden.
Kurz, unter Verwendung von Reagenzien im Typisierungskit wird DNA-Vervielfachung auf der DNA-Probe durchgeführt, die vorher unter Verwendung von fluoreszierenden markierten Primern, die für die 11 Mikrosatellitenorte spezifisch sind, vorbereitet wurde. Das Kit beinhaltet alle gekennzeichneten und nicht gekennzeichneten Primer, Polymerase, Bezugs-Rinder-DNA, dNTPs und Puffer, um die Tiere an den 11 Orten zu testen. Die Marker sind zwei Basispaarwiederholungs-Mikrosatellitenorte. Die Primerpaare sind vorgemischt und die PCR-Bedingungen optimiert, so dass die Orte in drei Röhrchen (zwei Vierfachreaktionen und eine Dreifachreaktion) vervielfacht und dann in einer einzigen Bahn elektrophoretisch analysiert werden können. Das Protokoll listet alle notwendigen Materialien auf und beschreibt die Abläufe zur Ausführung der Analyse.
Wie vorher gezeigt wird die Analyse der Proben eng mit der Dateneingabe koordiniert. Zum Beispiel wird für jede PCR-Analyse eine Datei auf einem Computer geöffnet. Jeder Analyse wird ein Name oder eine Nummer zugeordnet. Jede Lochprobe wird mit den Daten auf dem Computer koordiniert, so dass die Integrität jedes Lochs der Mikrotiterplatte durch die Analyse hindurch klar erhalten bleibt.
Andere Mikrosatellitenorte, die für die Verwendung in dem Verfahren und dem System der Erfindung geeignet sind, sind die URB-Marker, wie von H. Lewin im Bovine Blood Typing Lab Saskatchewan Research Council, Saskatoon, Saskatchewan, Kanada entwickelt wurden. Die Anzahl der Orte wird durch die Stärke bestimmt, die vom Test erforderlich ist.
Molekulare Genetik-Analyse
Nach der PCR-Vervielfachung der Proben wird die DNA-Fragmentanalyse auf den vervielfachten genetischen Materialien durchgeführt. Ein Beispiel eines geeigneten DNA-Analysesystems ist der DNA-Sequenzer ABI Prism 377 (Warenzeichen), auf den oben Bezug genommen wurde, oder alternativ dazu der Li-Cor 4200S (Warenzeichen).
Ein detaillierter Ablauf eines geeigneten Analyseverfahrens kann in dem vorher erwähnten Protokoll gefunden werden.
Kurz, in der vorliegenden Erfindung wird das oben erwähnte Protokoll angewendet und typischerweise werden drei Reaktionslösungen, die sich aus der PCR-Vervielfachung ergeben, gemischt und auf ein elektrophoretisches Gel geladen. Ein spitzer Staubkamm wird zum Laden verwendet. Vorzugsweise wird eine Hamilton-Spritze mit mehreren Kanälen zum Laden des Gels verwendet.
Die Ergebnisse der Analyse werden im Sequenzgelformat oder in farbcodierten Elektropherogrammen, die einzigartig für individuelle Tiere sind, dargestellt. Die Daten werden dann in codierte Genotypen, die einzigartig für ein Tier sind, transformiert.
Demgemäß kann das genetische Profil einer Gewebeprobe auf der Datenbank abgesucht werden, um ein Gegenstück, das sich auf das ursprüngliche Tier bezieht, von dem das Gewebe abstammt, zu lokalisieren, wobei die schnelle Identifizierung der Ursprünge des Fleischprodukts erleichtert wird.
Das System und das Verfahren der Erfindung sind offensichtlich für die Verwendung mit beliebigen anderen bekannten molekular-genetischen Analyseverfahren angepasst, z. B. Matrix-unterstützte Laserdesorptions-/Ionisationstechniken (MALDI) in Kombination mit Flugzeitanalyse ausgestoßener Ionen (MALDI-TOF). Zusätzlich könnten in der Entwicklung befindliche molekular-genetische Analyseverfahren auch durch PCR-Analyse, auf die oben verwiesen wurde, ersetzt werden. Ein Beispiel eines derartigen Verfahrens ist die Anordnung des Affymetrix GeneChips (Warenzeichen). Ein Vorteil des Mikrochipverfahrens ist, dass keine Elektrophorese erforderlich ist. Alternativ dazu könnten Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (SNP) verwendet werden, wenn sie erhältlich werden.
Verfahren und Gerät zur Probenhandhabung
Um die Verwendung der Techniken zur Bestimmung des Genotyps zum Identifizieren des Tieres, von dem ein Fleischprodukt abstammt, zu verbessern, kann ein einzigartiges Probenhandhabungsverfahren und -gerät angewendet werden.
Die Verwendung einer Identifizierungszelle, wie vorher beschrieben, hilft der Gewährleistung der Kontinuität bei der Identifizierung der Probe unter Verwendung des Verfahrens und Systems der Erfindung. Zusätzlich minimiert die Verwendung eines Farbstoffs zur Unterstützung der Visualisierung der Probe in dem Verfahren und dem System der Erfindung ferner Versuchsfehler und erleichtert einen schnellen Durchlauf.
Zusätzlich gewährleistet die Verwendung von Mikrotiterplatten, wie vorher beschrieben, eine schnelle Ortsbestimmung, einen schnellen Durchlauf und eine schnelle Aufbewahrung von Proben.
1 bis 5 zeigen einen Mikrotiterplattenhalter 1, der verwendet werden kann, um eine Mikrotiterplatte 6 während des Ablaufs gemäß der Erfindung zu halten.
Wie in den Zeichnungen gezeigt, ist der Mikrotiterplattenhalter 1 aus einer transparenten Kunststoffbasisplatte 2, die eine Schablone 3 auf ihr gedruckt oder montiert aufweist, zusammengesetzt. Die Schablone 3 ist aus einer Reihe von Zellnummern 4, die den individuellen Zellen einer Mikrotiterplatte 6 entsprechen, zusammengesetzt. Wie vorher gezeigt, kann die Mikrotiterplatte 6 96 Löcher darin oder Mehrfache davon aufweisen. Ein Mikrotiter-Halterahmen 5 ist auf der oberen Fläche der Basisplatte 2 gebildet, um die Mikrotiterplatte 6 darin aufzunehmen. Wie in 1 gezeigt, ist die Mikrotiterplatte 6 über der Schablone 3 in dem Halterahmen 5 angeordnet, so dass die einzelnen Löcher der Mikrotiterplatte 6 den Zellnummern 4, die auf der Schablone 3 gedruckt sind, entsprechen.
Eine obere Platte 7, die auch aus einem transparenten Kunststoffmaterial besteht, ist über der Mikrotiterplatte 6 montiert. Die obere Platte 7 weist einen Montierrahmen 8 auf ihrer Unterseite auf, um in die Mikrotiterplatte 6 an ihren Seiten in einzugreifen. Der Montierrahmen 8 ist aus zwei Seitenelementen 15, 16 zusammengesetzt, die im gleitenden Verhältnis mit den Seiten der Mikrotiterplatte 6 stehen, so dass die obere Platte 7 über die Mikrotiterplatte 6 auf eine waagerechte Weise in der von den Pfeilen in 1 angezeigten Richtung gleitbar ist.
Die obere Platte 7 ist ferner mit einer oberen Gleitschiene 9 und einer unteren Gleitschiene 10 auf ihrer oberen Fläche versehen. Die obere und unter Gleitschiene 9, 10 sind parallel und sind angepasst, um eine Tür 11 zwischen der oberen und unteren Gleitschiene 9, 10 zu empfangen. Die Tür 11 ist zwischen der oberen und unteren Gleitschiene 9, 10 von links nach rechts gleitbar.
Die Tür 11 ist mit einem Griff 12 und einem Loch 13 versehen.
Das Loch 13 ist über einem waagerechten verlängerten Schlitz 14, der in der oberen Platte 7 definiert ist, positioniert. Demgemäß verschiebt die Bewegung der Tür 11 zwischen der oberen und unteren Gleitschiene 9, 10 das Loch 13 entlang der Länge des Schlitzes 14.
Die obere Platte 7 und die Tür 11 sind aus getöntem oder geschwärztem Kunststoff gebildet, so dass nur das ausgewählte Loch einer Mikrotiterplatte 6, die unterhalb des Lochs 13 angeordnet ist, sofort mit dem Auge sichtbar sein wird.
Der Mikrotiterplattenhalter 1 kann in dem Verfahren und dem System der Erfindung auf viele Arten verwendet werden.
Während der Übertragung von Proben aus Probenröhrchen auf Mikrotiterplatten, wird eine Mikrotiterplatte 6 zum Beispiel in einem Halter 1 montiert, wie vorher beschrieben. Die obere Platte 7 befindet sich über der Mikrotiterplatte 6, so dass der Schlitz 14 über der ersten Reihe von Löcher der Mikrotiterplatte 6 angeordnet ist. Die Tür 11 wird dann unter Verwendung des Griffs 12 durch eine Bedienungskraft positioniert, so dass das Loch 13 über dem ersten Loch der ersten Reihe angeordnet ist. Eine erste Probe wird dann in das erste Loch durch das Loch 13 platziert und die Tür zwischen die obere und untere Gleitschiene 9, 10 gleitend geschoben, um das Loch 13 zum nachfolgenden Loch zu bewegen. Demgemäß wird eine Bedienungskraft in jeder Phase während der Übertragung an das richtige Loch, in das eine Probe platziert werden soll, erinnert, wobei Versuchsfehler beseitigt werden.
Die obere Platte 7 und die Tür 11 werden, wie erforderlich, eingestellt, um eine Übertragung auf die verbleibenden Löcher der Mikrotiterplatte 6 zu vollziehen. Auf Grund der geschwärzten oder getönten Eigenschaft der Tür und der oberen Platte 7, ist nur das Loch unterhalb des Lochs 13 für eine Bedienungskraft im Einsatz sofort sichtbar. Der Halter 1 kann auch für die Verwendung während der Vorbereitung der Verdopplungen angepasst sein, wie vorher im Verhältnis zur molekular-genetischen Analyse beschrieben wurde. Während der Vorbereitung von Verdopplungen aus einer Mikrotiterplatte 6 mit zwölf Spalten und acht Reihen kann zum Beispiel die Tür 11 von der oberen Platte 7 entfernt und die obere Platte 7 auf der Mikrotiterplatte 6 angeordnet werden, wie vorher beschrieben. Im vorliegenden Fall kann jedoch eine Pipette mit mehreren Kanälen, z. B. aus zwölf Kanälen zusammengesetzt, über dem Schlitz 11 angeordnet werden, so dass Verdopplungen auf einer Reihe-um-Reihe-Basis durch Bewegen der oberen Platte 7 entlang den Spalten und Reihen in die Richtung, die von dem Pfeil in 1 angezeigt wird, vorbereitet werden können. Demgemäß werden Fehler während des Verdopplungsschritts ferner beseitigt, da gewährleistet wird, dass die Bedienungskraft Proben aus der richtigen Reihe in der richtigen Sequenz entfernt.
Während des Ladens eines elekrophoretischen Gels während molekular-genetischer Sequenzanalyse kann schließlich der Halter 1 der Erfindung weiter angepasst werden, um schnelle Gelladung bereitzustellen.
Besonders erleichtert der Halter 1 zusammen mit einer Hamilton-Spritze mit mehreren Kanälen und der Code, der typischerweise bei der elektrophoretischen Analyse verwendet wird, die schnelle und genaue Anwendung der Probe aus der Mikrotiterplatte 6 auf das elektrophoretische Gel.
Genauer wird der Halter 1 durch das Entfernen der Tür 11 von der oberen Platte 7 angepasst. Die obere Platte 7 wird dann von der Mikrotiterplatte 6 entfernt und derart angeordnet, dass der Schlitz 14 in einer senkrechten Anordnung ausgerichtet ist, d. h. entlang den Spalten der Mikrotiterplatte 6.
Die Hamilton-Spritze mit mehreren Kanälen ist mit acht Kanälen oder Spritzen versehen, die mit Zwischenraum angeordnet entsprechend jedem vierten Kammleerfeld, angeordnet sind. Demgemäß richtet eine Bedienungskraft die obere Platte mit dem Schlitz in einer senkrechten anordnung im Einsatz aus, so dass die Proben von den Lochnummern A1, B1, C1, E1, F1,G1 und H1 in jedem vierten Kammleerfeld geladen werden. Die obere Platte 7 wird dann nach rechts verschoben, so dass die Lochnummern A2, B2, C2 usw. in dem Schlitz erscheinen. Demgemäß entfernt eine Bedienungskraft mit der Hamilton-Spritze mit mehreren Kanälen Proben aus den Lochnummern A2 bis H2 und lädt die Probe in den nächsten Kammplatz, der neben dem vorhergehenden Kammplatz liegt. Der Ablauf wird wiederholt, bis alle Proben genommen worden sind und der Kamm geladen ist.
Dementsprechend gewährleistet diese Probenhandhabungstechniken die Kontinuität der Probenidentität, während auch schnelles Laden von elektrophoretischen Gels unter Verwendung des Geräts zusammen mit der Hamilton-Spritze und dem Kamm ermöglicht wird.
Das Verfahren und das System der Erfindung werden nun mit Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben werden:
Beispiel 1
Verallgemeinerter Beispielablauf

1. Proben werden für Tiere, für die Fleischrückverfolgung erforderlich ist, genommen. Eine biologische Gewebeprobe (z. B. Haar, Blut, Tierhaut usw.) wird von jedem einzelnen Tier genommen und mit der Tiermarkennummer verbunden.
2. Proben werden an ein Labor abgesandt.
3. Im Labor werden die Ohrenmarkennummern des Tieres in einer Computerdatenbank aufgezeichnet und die Proben werden dem DNA-Extraktionsablauf (z. B. Alkalidenaturierungs-Neutralisation) ausgesetzt.
4. DNA-Proben werden einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ausgesetzt, die speziell für individuelle Identifizierung entwickelt wurde.
5. Die PCR-Produkte werden unter Verwendung eines automatisierten DNA-Sequenzers untersucht.
6. DNA-Profile, die mit der Markennummer verbunden sind, werden automatisch in einer „TIER"-Computerdatendatei aufgezeichnet.
7. DNA-Profile werden in passende Kategorien (z. B. nach Datum, nach Schlachthaus, nach Vertrag usw.) sortiert und sind für die Suche bereit.
8. Proben werden für Fleisch, für das Rückverfolgung erforderlich ist, genommen.
9. Proben werden an das Labor abgesandt und in eine „FLEISCH"-Datendatei eingegeben.
10. Im Labor werden Proben einem DNA-Extraktionsablauf (z. B. Alkalidenaturierungs-Neutralisation) ausgesetzt.
11. DNA-Proben werden einer Polymerase-Kettenreaktion ausgesetzt, die speziell für individuelle Identifizierung entwickelt wurde.
12. PCR-Produkte werden unter Verwendung eines automatisierten DNA-Sequenzers untersucht.
13. DNA-Profile werden in der Computerdatendatei automatisch aufgezeichnet.
14. DNA-Profile werden mit „TIER"-Profilen verglichen und Übereinstimmungen aufgezeichnet. Das Individuum, von dem das Fleisch abstammt, wird identifiziert.
15. Ergebnisse der Übereinstimmungssuche werden gemeldet.

Beispiel 2
Spezifischer Beispielablauf

1. Proben werden von allen Tieren, die in einer speziellen Fleischfabrik geschlachtet wurden, genommen. Eine biologische Gewebeprobe (z. B. Haar, Blut, Tierhaut usw.) wird von jedem einzelnen Tier genommen und mit der Tiermarkennummer verbunden.
2. Proben werden an ein Labor abgesandt.
3. Im Labor werden die Ohrenmarkennummern des Tieres in einer Computerdatenbank aufgezeichnet und die Proben werden einem DNA-Extraktionsablauf (z. B. Alkalidenaturierungs-Neutralisation) ausgesetzt.
4. DNA-Proben werden einer Polymerase-Kettenreaktion ausgesetzt, die speziell für individuelle Identifizierung entwickelt wurde.
5. PCR-Produkte werden unter Verwendung eines automatisierten DNA-Sequenzers untersucht.
6. DNA-Profile, die mit der Markennummer verbunden sind, werden automatisch in einer „FLEISCH-FABRIK"-Computerdatendatei aufgezeichnet.
7. DNA-Profile werden in passende Kategorien (z. B. nach Datum, nach Schlachthaus, nach Lieferung usw.) sortiert und sind für die Suche bereit.
8. Direkte oder indirekte Kunden der bestimmten Fleischfabrik nehmen Proben vom Fleischprodukt.
9. Proben werden an das Labor abgesandt und in eine „FLEISCH-FABRIK-KUNDE"-Datendatei eingegeben.
10. Im Labor werden Proben einem DNA-Extraktionsablauf (z. B. Alkalidenaturierungs-Neutralisation) ausgesetzt.
11. DNA-Proben werden einer Polymerase-Kettenreaktion ausgesetzt, die speziell für individuelle Identifizierung entwickelt wurde.
12. PCR-Produkte werden unter Verwendung eines automatisierten DNA-Sequenzers untersucht.
13. DNA-Profile werden in der Computerdatendatei automatisch aufgezeichnet.
14. DNA-Profile werden mit „FLEISCH-FABRIK"-Profilen verglichen und Übereinstimmungen aufgezeichnet. Das Individuum, von dem das Fleisch abstammt, wird identifiziert.
15. Ergebnisse der Übereinstimmungssuche werden gemeldet.

Beispiel 3
Vergleichsdaten
Das Verfahren und das System zur Identifizierung der Erfindung wurde mit einem bekannten Verfahren zur Fleischidentifizierung verglichen.
Das bekannte Verfahren basiert darauf, dass dokumentierte Aufzeichnungen des Fleischursprungs von dem Händler erhalten werden. Die Papierrückverfolgung des Fleisches versucht die Identifizierung von individuellen Fleischschnitten von einem Handelsladentisch zu dem Ursprungsbauernhof zu erleichtern. Unter Verwendung des bekannten Verfahrens wurde im Allgemeinen Fleischrückverfolgung auf Fleischprodukten, die von dem Händler und dem Fleischlieferanten an den Händler gehandhabt wurden, durchgeführt. Um die Rückverfolgung zu erleichtern, waren entworfene Produktionsabläufe und -techniken erforderlich. Insbesondere werden in einer Fleischfabrik bei der Lieferung von Tieren passende aufgezeichnete Schlachtkörper für den Händler ausgewählt, diese werden entbeint auf eine dazu bestimmte Produktionslinie platziert, – die Schlachtkörper wurdne in Gruppen gemäß dem Ursprungsbauernhof eingeteilt und typischerweise wurden zwei Schlachtkörper zur gleichen Zeit entbeint. Fertige Fleisch-Hauptschnitte werden dann gemäß dem Ursprungsbauernhof gekennzeichnet und verpackt.
Das Verfahren zur Rückverfolgung der Erfindung wurde mit dem papierintensiven Verfahren verglichen, was eine entworfene Produktion des Stands der Technik erforderte.
Materialien und Methoden
Probensammlung
Haarproben wurden von 326 Rindern in dem Lager eines Fleischlieferanten gesammelt. Jede Probe wurde in einen Umschlag eingeführt und mit der entsprechenden Ohrenmarkennummer für jedes Tier gekennzeichnet. Die Tiere wurden dann geschlachtet. Anschließend wurden Fleischproben von 28 Schlachtkörpern, die für Händler A bestimmt waren, gesammelt. Die Fleischproben wurden durch das Abschneiden eines kleinen Schnittstücks vom Halsbereich des Schlachtkörpers genommen. Die Proben wurden dann mit einer betriebsinternen Tötungsnummer gekennzeichnet. Ein betriebsinternes Tötungsblatt wurde benutzt, um die Tierohrenmarkennummer mit der entsprechenden Tötungsnummer abzustimmen.
Nach der Lieferung des geschlachteten Fleisches an Händler A, wurden Fleischproben aus den Kühlhäusern des Händlers genommen. Proben wurden von jedem der folgenden Fleischschnitte genommen.
8 × vakuumverpackte Roastbeefstücke
Fleischproben wurden aus den Kühlhäusern bei einer zweiten Verkaufsstelle von Händler A genommen. Proben wurden von Folgendem genommen:
10 × vakuumverpackte Bruststücke
6 × vakuumverpackte Roastbeefstücke
und wurden mit der Nummer des Bauernhofs, wie auf der Packung angezeigt, gekennzeichnet. Qualitätskontrolldaten waren erhältlich, um zu gewährleisten, dass das gesamte Fleisch, von dem Proben genommen wurden, aus der anfänglichen Tötung stammte, auf die oben Bezug genommen wurde.
Zusätzliche Fleischproben aus Verkaufsstellen von Händlern ohne Bezug zum Händler A, und die das Verfahren des Stands der Technik nicht anwendeten, wie folgt genommen:
Verkaufsstelle Nr. 1 ohne Bezug

1 × Lendensteak
3 × Rindfleisch zum Kochen (aus der vorderen Ladenauslage)

Verkaufsstelle Nr. 2 ohne Bezug

1 × Aberdeen Angus (AA) Lendensteak
2 × AA-Hackepeter (jede Probe wurde aus einer einzelnen Handelspackung genommen)
2 × Gewürfeltes Rindfleisch (jede Probe wurde aus einer einzelnen Handelspackung genommen)
1 × T-Bone-Steak
1 × Lendensteak
1 × Rippensteak
1 × Minutensteak
2 × Hackepeter von niedriger Qualität (jede Probe wurde aus einer einzelnen Handelspackung genommen)
2 × AA Rindfleisch zum Kochen (jede Probe wurde aus einer einzelnen Handelspackung genommen)
1 × Round Steak

Verkaufsstelle Nr. 3 ohne Bezug

1 × AA Lendensteak
1 × Rundes Steak
1 × Minutensteak
3 × Gewürfeltes Rindfleisch (jede Probe wurde aus einer einzelnen Handelspackung genommen)
3 × Hackepeter (jede Probe wurde aus einer einzelnen Handelspackung genommen)
1 × Lendensteak
1 × AA Roastbeef-Fleischzuschnitt
1 × Schnell gebratenes Steak

DNA-Extraktion
Für alle Fleischproben wurde das oben beschriebene Extraktionsprotokoll verwendet.
DNA-Vervielfachung und -analyse
Die extrahierten Fleischproben, die negative Extraktion, die PCR sowie die positive Kontrollen wurden vervielfacht und analysiert, wie vorher beschrieben.
In dem vorliegenden Beispiel waren jedoch nur 5 polymorphe Mikrosatelliten (Tabelle 1) erforderlich, auf Grund der vergleichsweise reduzierten Probe und der demgemäß geringen erforderlichen Stärke. Die Vervielfachung und Analyse wurden unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung von 96-Well-Mikrotiterplatten mit einer 5 ng-Schablonen-DNA in Reaktionsvolumen von 11 μL unter Verwendung von 0,5 U von Taq-Polymerase mit einem Reaktionspuffer, der 50 mM KCl; 10 mM Tris-HCl pH-Wert 9,0; 1,0-2,5 mM MgCl₂ (siehe Tabelle 1); 1 % Triton X-100 (Warenzeichen); 200 μM dATP, dGTP, dTTP; 10 μM dCTP beinhaltet, durchgeführt. 0,3 μM jedes Primers wurden hinzugefügt sowie 0,5 μCi (a-32P) dCTP. Ein 10 μl Mineralöl-Überzug wurde dann hinzugefügt und Vervielfachungen wurden in einer thermischen Zyklusvorrichtung von Hybaid Omnigene (Warenzeichen) unter Verwendung eines Denaturierungsschrittes von 4 min bei 94 °C, gefolgt von 35 Zyklen von 30 s bei 94 °C, 30 s bei 55-65 °C (siehe Tabelle 1), 30 s bei 72 °C und einem letzten Ausdehnungsschritt von 4 min bei 72 °C durchgeführt. Proben wurden dann mit 10 μL Formamid-Stammlösung gemischt. Nach der Hitzebehandlung von 4 min bei 93 °C wurde 1 μL der Mischung in ein 6 %iges Denaturierungs-Polyacrylamid-Gel geladen. Nach der Standard-Autoradiographie wurden Genotypen durch Bezugnahme auf vorher bemessene DNA-Standards bewertet und in den Computer eingegeben.
Statistische Methodik
Zur Bestimmung der Wahrscheinlichkeit des zufälligen Auftretens von zwei identischen Fleischprofilen (Übereinstimmungswahrscheinlichkeit), wurden genetische Standard-Bestand-Statistiken angewendet. Unter Verwendung einer Rinder-DNA-Datenbank von Allel-Häufigkeiten von vorherigen Untersuchungen war es möglich, Übereinstimmungswahrscheinlichkeiten unter Verwendung der Produktregel zu berechnen. Die Produktregel wurde als passend betrachtet, in Anbetracht dessen, dass sich vorher gezeigt hatte, dass alle der fünf verwendeten Orte im Hardy-Weinberg-Gleichgewicht waren.
Da die genaue Art jeder Probe unbekannt war, wurden Allel-Häufigkeiten von einem gepoolten Bestand der Britischen Inseln (BI), ein Simmental-Bestand (SIM) und ein gepoolter Europäischer Bestand (EU) verwendet. Es wurde für sinnvoll erachtet, dass die wahren Übereinstimmungswahrscheinlichkeiten für die experimentellen Proben innerhalb des Bereichs von Wahrscheinlichkeiten, die durch diese drei Bezugsdatensätze dargestellt werden, fallen würden.
Ergebnisse
Insgesamt wurden 82 Proben für jeden der fünf Orte analysiert. Aus 410 möglichen Genotypen wurden 93,4 % oder 383 erfolgreich bewertet. Nur jene Proben, in denen alle möglichen Genotypen bewertet wurden, von denen es 67 gab, wurden für Vergleichsanalysen verwendet. 7 Proben wurden für 4 Orte, 4 Proben für 3 Orte und 4 Proben für nur zwei Orte bewertet.
Ein paarweiser Vergleich aller voll bewerteten Proben machte eine 100 %ige Beständigkeit zwischen den DNA-Ergebnissen und den Qualitätskontrolldaten des Stands der Technik für die Proben deutlich. In jedem Fall ermöglichten die DNA-Ergebnisse, dass individuelle Fleischproben zum Ursprungsbauernhof zurückverfolgt werden konnten. Das Verfahren und das System der vorliegenden Erfindung ermöglichten jedoch auch, dass das genaue Ursprungstier identifiziert werden konnte.
Demgemäß nutzt das Verfahren der Erfindung die Identitätsinformationen, die von der DNA codiert sind, um die vollkommene Rückverfolgung von Fleischprodukten zu erleichtern.
Die Ergebnisse werden wie folgt zusammengefasst:
15 von den 18 Fleischproben von Händler A, für die alle fünf Orte bewertet wurden, wurden zu 11 individuellen Tierprofilen rückverfolgt, von denen alle Proben innerhalb des Pools von 28 Schlachtkörpern genommen wurden und von denen alle von dem richtigen Ursprungsbauernhof kamen, wie durch das Papiersystem von Händler A vorgesehen war.
Für die drei Proben, für die keine übereinstimmenden Schlachtkörper gefunden wurden, wurde angenommen, dass dies auf Grund von unvollständiger Probenahme von den Schlachtkörpern auftrat.
12 Fleischproben von Händler A haben sich als Übereinstimmungsverdopplungen herausgestellt. In allen Fällen waren die Verdopplungen von der gleichen Art Schnitt und kamen von dem richtigen Bauernhof, wie durch das Papiersystem der Erfassung des Stands der Technik vorgesehen war. Dies weist lediglich darauf hin, das sowohl von Hinterteilen, Bruststücken als auch Roastbeef-Fleischzuschnitten des gleichen Tieres Proben genommen wurden und analysiert wurden. Dies ist sehr wahrscheinlich in Anbetracht dessen, dass bei dem System von Händler A das Fleischprodukt von nur zwei Tieren zusammen eingepackt wird.
Keine der Fleischproben oder der Schlachtkörperproben des Händlers A stimmte mit einer der Fleischbproben, die nicht von Händler A stammen, überein.
Zwischen den Proben, die nicht von Händler A stammen, wurden keine Übereinstimmungen gefunden. In jedem der einzelnen Händlerprobensätze war jedoch ein Teil Übereinstimmung offensichtlich. In der Verkaufsstelle Nr. 2 ohne Bezug stimmte die Lendensteakprobe mit der Rippensteakprobe überein und die zwei AA-Hackepeterproben stellten sich als identisch heraus. In der Verkaufsstelle Nr. 1 ohne Bezug stimmten zwar das Rindfleisch zum Kochen II und III miteinander überein, stimmten aber nicht mit I überein. In der Verkaufsstelle Nr. 3 ohne Bezug hat sich herausgestellt, dass alle drei Hackepeterproben identisch waren.
Alle 28 Schlachtkörperprofile haben sich als einzigartig für diese Untersuchung herausgestellt.
Übereinstimmungswahrscheinlichkeiten
Übereinstimmungswahrscheinlichkeiten wurden für jeden der 11 individuellen Schlachtkörper, der mit den Fleischprofilen von Händler A übereinstimmte (Tabelle 2 und Tabelle 3) berechnet. Wahrscheinlichkeitsschätzungen wurden auf der Basis von den Allel-Häufigkeiten für jede von drei Bestände entwickelt i) BI – ein kombinierter Bestand, der aus 33 Aberdeen-Angus-, 34 Hereford-, 34 Jersey- und 40 Kerryrindern besteht ii) SIM – auf der Basis eines Bestands von 36 rein gezüchteten Simmental und iii) EU – ein kombinierter Bestand von (i) und (ii) darüber plus 36 rein gezüchtete Charolais und 40 rein gezüchtete Friesen.
TABELLE 2 Übereinstimmungswahrscheinlichkeiten für jeden der 11 Schlachtkörper
TABELLE 3 Übereinstimmungswahrscheinlichkeit nach niedrigster und höchster sortiert
Aus Tabelle 3 ist ersichtlich, dass die höchste Wahrscheinlichkeit für Schlachtkörper D1 beobachtet wurde, bei dem es eine Möglichkeit zu 107 000 gegeben hat, dass die Fleischprobe allein durch Zufall das gleiche Profil trug. Die niedrigste Wahrscheinlichkeit hat sich bei F1 herausgestellt, wo die Wahrscheinlichkeit, dass die Fleischprobe von Händler A mit dem Fleischkörper zufällig übereinstimmt, weniger als 1 zu 40 Milliarden war.
Eine Eindeutig kommt bei dem Verfahren und dem System der Erfindung eine äußerst niedrige Wahrscheinlichkeit von zufälliger Übereinstimmungswahrscheinlichkeit vor. Außerdem können Risiken einer zufälligen Übereinstimmung weiter reduziert werden, indem die Anzahl von Mikrosatellitenorten erhöht oder variiert wird.
Erläuterung
Die Ergebnisse zeigen, dass das Verfahren und das System der Erfindung eine sehr effektive Qualitätsanzeige bei der Fleischverarbeitung und im Einzelhandel ist.
Der 5-Ortsmarkersatz in dieser Untersuchung wurde auf der Basis gewählt, dass die Bestandssdaten zu Vergleichszwecken erhältlich waren. Wie oben gezeigt, könnte eine Anzahl anderer Markersätze genauso gut für diese spezielle Anwendung geeignet sein.
Das Verfahren der Erfindung erleichtert deshalb die Verwendung von DNA als eine interne Produktkennzeichnung bei der Fleischverarbeitung und im Einzelhandel.
Das Verfahren der Erfindung bietet vollkommene Rückverfolgung von Fleischprodukten zu angemessenen Kosten. Die genetischen Informationen werden in jeder Zelle eines Tieres repliziert und haben sich deshalb in jedem Fragment eines Schlachtkörpers als unverändert herausgestellt. Die genetischen Informationen sind auch manipulationssicher. Demgemäß können die Informationen in keiner Phase modifiziert werden, um die Identität eines Fleischprodukts zu ändern. Der Ablauf der Erfindung ist einfach anzuwenden und erfordert nur kleine Probenmengen. Das Verfahren und System der Erfindung kann auch bei der Aufzeichnung von nationalen Herden, der Geschichte von Tieren und der Bewegungen von Tieren angewendet werden. Das Verfahren der Erfindung negiert das Risiko von Markenwechsel oder Betrug und erleichtert einfache Korrektur von verlorengegangenen Marken oder Fehlern. Demgemäß kann das Verfahren der Erfindung für einen Verbraucher gewährleisten, dass Fleisch, das konsumiert werden soll, einen erkennbaren Ursprung aufweist, der leicht hergeleitet und ermittelt werden kann.
Das Verfahren der Erfindung kann auch verwendet werden, um Fleisch auf Wunsch zu identifizieren, z. B. als Reaktion auf spezifische Fleischanfragen.

Claims

Ein Verfahren zur Rückverfolgung des Ursprungs eines Fleischproduktes, das die Probenahme von Tiergewebe vor dem Verlust der Lebensdauer-Identität eines Tieres, das Aufbewahren der Probe für die Lebensdauer des Fleischproduktes, das Bestimmen des Genotyps des Fleischproduktes und der aufbewahrten Proben und das Vergleichen des Genotyps des Fleischproduktes mit den Genotypen der aufbewahrten Proben zur Identifizierung des Ursprungs des Fleischproduktes beinhaltet.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Tier ein domestiziertes Nutztier ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass eine Probe des Tieres an einem einzigen Punkt in der Verarbeitungskette genommen wird.
Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Gewebeprobenahme in einem Schlachthof vollzogen wird.
Verfahren gemäß Anspruch 3 oder Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Gewebeprobenahme kurz nach der Zerstückelung des Tiereschlachtkörpers vollzogen wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Gewebeprobenahme an dem Punkt vollzogen wird, an dem die Schlachtkörper für einen Handelskunden in Altersgruppen aufgeteilt werden.
Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass von jedem Schlachtkörper eine Fleischprobe genommen und mit einer betriebsinternen Tötungsnummer oder einem Äquivalent gekennzeichnet wird.
Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Fleischprodukt ein Rindfleischprodukt ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, das die Probenahme von Tiergewebe, das Extrahieren von genetischem Material aus dem Tiergewebe und das Durchführen einer molekular-genetischen Analyse des extrahierten genetischen Materials beinhaltet.
Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das genetische Material DNA beinhaltet, die DNA nach der Extraktion vervielfacht wird und die Vervielfachung eine Polymerase-Kettenreaktion beinhaltet.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe aus der Gruppe, die Haarwurzeln, Tierhaut, Wangenabstriche, Blut, Muskel, Knochen und beliebige innere Organe beinhaltet, ausgewählt ist und die Probe vorzugsweise eine Einheit Volumen oder Größe beinhaltet, und die Probenahme mit einer Probenahme-Vorrichtung, die zum Einholen einer Einheit Volumen oder Größe speziell entworfen ist, durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 10 oder Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA unter Verwendung von Alkaliextraktion extrahiert wird, das Alkali NaOH oder KOH beinhaltet und die DNA extrahiert wird, indem eine Einheit Volumen von Alkali zu der Probe hinzugegeben wird, die Probe erhitzt wird, um die DNA zu extrahieren, und das Alkali neutralisiert wird, und das Alkali mit einer Säure neutralisiert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Säure HCl beinhaltet.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass ein Farbstoff zu der Probe hinzugegeben wird, um die Probe zu veranschaulichen, und der Farbstoff Cresolrot beinhaltet.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert der Probe mindestens 8 ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Probengewebe in eine Identifizierungszelle platziert wird und die Extraktion in der Identifizierungszelle durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Identifizierungszelle mit der Identifizierung des Tieres oder des Fleisches nach der Probenahme gekennzeichnet wird und eine Referenznummer für die Mikrotiterplatte der Identifizierungszelle in einem Computer aufgezeichnet wird und die Referenznummer im Computer absuchbar ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Genotyp des genotypisch bestimmten Fleisches in einen Computer eingegeben wird und der Genotyp absuchbar ist.
Verfahren gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Genotyp codiert wird.