DE102010006450A1

DE102010006450A1 - Gestufte Suche nach Mikrobenspektren in Referenzbibiliotheken

Info

Publication number: DE102010006450A1
Application number: DE102010006450A
Authority: DE
Inventors: Markus 04425 Kostzewa
Original assignee: Bruker Daltonik GmbH
Current assignee: Bruker Daltonics GmbH and Co KG
Priority date: 2010-02-01
Filing date: 2010-02-01
Publication date: 2011-08-04
Anticipated expiration: 2030-02-02
Also published as: US9275188B2; EP2354796B1; EP2354796A1; US20110202282A1; DE102010006450B4

Abstract

Die Erfindung betrifft die Identifizierung von Mikroben in einer Probe durch Berechnungen der Ähnlichkeiten eines Massenspektrums der Probe zu den Referenzspektren in großen Spektrenbibliotheken. Die Erfindung stellt für eine schnellere Identifizierung ein mehrstufiges Verfahren bereit, da die Ähnlichkeitsanalyse für eine große Bibliothek von 10 000 Referenzspektren mit heutigen Rechnern etwa eine Minute dauert, während die Spektrenaufnahme selbst nur wenige Sekunden beträgt. Bei mehrstufiger Suche wird zunächst in einer relativ kleinen Teilbibliothek der ersten Stufe gesucht, die nur die Referenzspektren von wenigen, statistisch besonders häufig gemessenen Mikroben und zusätzlich alle Referenzspektren enthält, die zu den Referenzspektren dieser Mikroben mit einem Mindestmaß ähnlich sind. So können beispielsweise in Routinelaboratorien 50 Prozent aller Routineanalysen nur fünf Mikrobenarten betreffen; die Teilbibliothek, die alle zu den Spektren dieser Mikrobenarten genügend ähnlichen Referenzspektren enthält, ist etwa einhundert Referenzspektren groß, und die Suche in dieser Teilbibliothek der ersten Stufe dauert weit weniger als eine Sekunde. Nur wenn die Suche keinen Treffer genügender Ähnlichkeit ergibt, wird in analog erstellten Teilbibliotheken höherer Stufen oder schließlich in der Gesamtbibliothek gesucht. Es lässt sich eine Hierarchie von Teilbibliotheken automatisch erstellen, wobei durch Berücksichtigung aktueller Statistiken und durch Wahl von Anzahl und Größe der Teilbibliotheken die durchschnittliche Rechenzeit zur Identifizierung minimiert werden kann.

Description

Die Erfindung betrifft die Identifizierung von Mikroben in einer Probe durch Berechnungen der Ähnlichkeiten eines Massenspektrums der Probe zu den Referenzspektren in großen Spektrenbibliotheken.
Die Erfindung stellt für eine schnellere Identifizierung ein mehrstufiges Verfahren bereit, da die Ähnlichkeitsanalyse für eine große Bibliothek von 10 000 Referenzspektren mit heutigen Rechnern etwa eine Minute dauert, während die Spektrenaufnahme selbst nur wenige Sekunden beträgt. Bei mehrstufiger Suche wird zunächst in einer relativ kleinen Teilbibliothek der ersten Stufe gesucht, die nur die Referenzspektren von wenigen, statistisch besonders häufig gemessenen Mikroben und zusätzlich alle Referenzspektren enthält, die zu den Referenzspektren dieser Mikroben mit einem Mindestmaß ähnlich sind. So können beispielsweise in Routinelaboratorien 50 Prozent aller Routineanalysen nur fünf Mikrobenarten betreffen; die Teilbibliothek, die alle zu den Spektren dieser Mikrobenarten genügend ähnlichen Referenzspektren enthält, ist etwa einhundert Referenzspektren groß, und die Suche in dieser Teilbibliothek der ersten Stufe dauert weit weniger als eine Sekunde. Nur wenn die Suche keinen Treffer genügender Ähnlichkeit ergibt, wird in analog erstellten Teilbibliotheken höherer Stufen oder schließlich in der Gesamtbibliothek gesucht. Es lässt sich eine Hierarchie von Teilbibliotheken automatisch erstellen, wobei durch Berücksichtigung aktueller Statistiken und durch Wahl von Anzahl und Größe der Teilbibliotheken die durchschnittliche Rechenzeit zur Identifizierung minimiert werden kann.
Stand der Technik
Die routinemäßig schnelle und fehlerfreie Identifizierung vieler Proben von Mikroorganismen spielt insbesondere in der klinischen und außerklinischen Infektionsdiagnostik, in der Hygieneüberwachung in Krankenhäusern oder Badegewässern, aber auch in der Lebensmittelanalytik, bei der Überwachung und Regelung von biotechnologischen Prozessen oder in der forschenden Mikrobiologie eine wichtige Rolle. Zu den Mikroorganismen, die hier auch kurz als Mikroben bezeichnet werden, zählen alle mikroskopisch kleinen Lebewesen, beispielsweise einzellige Pilze (z. B. Hefen), Algen, oder Protozoen (z. B. Plasmodien als Malaria-Erreger), wenn auch meist der Schwerpunkt für die Identifizierung auf Bakterien liegt. Gelegentlich werden auch Viren zu den Mikroorganismen gerechnet, obwohl sie im strengen Sinne wegen fehlenden Stoffwechsels nicht zu den Lebewesen zählen.
Die Identifizierung der Mikroben bedeutet m Prinzip die Bestimmung der Art und damit deren Einordnung in das taxonomische Hierarchieschema: Domäne (Eukaryoten und Prokaryoten), Reich, Abteilung, Klasse, Ordnung, Familie, Gattung und Art (Species). Da die Bezeichnung „Art” im deutschsprachigen Raum vielfach und in wechselnden Bedeutungen gebraucht wird, wird hier häufig auch die Bezeichnung „Species” gebraucht.
Die Aufteilung der Mikroorganismen in Arten stammt aus der Zeit, in der die Taxonomie weitgehend auf Unterscheidungen durch biochemische Reaktionen beruhte und ist in vielen Fällen ungenau und beschreibt innerhalb der Mikroorganismen nicht gleichförmige phylogenetische Einheiten. Die übliche biologische Definition für die Abgrenzung der Arten voneinander durch die unbegrenzte geschlechtliche Vermehrungsfähigkeit ihrer Angehörigen untereinander kann leider bei Mikroorganismen nicht angewendet werden. Moderne molekularbiologische Methoden führen daher dazu, viele Korrekturen der Zuordnung von Arten zu den Gattungen, aber auch neue Arten und bei Bakterien unterhalb der Art weitere taxonomische Klassen, z. B. Unterarten (Subspecies), einzuführen. Aus medizinischen und zellbiologischen Beobachtungen wurden ferner Serovaren oder Serotypen eingefügt, die sich besonders durch verschiedenartiges Anlagerungsverhalten an Zellmembranen unterscheiden, aber keine eigene Art oder Unterart bilden.
Mikroorganismen werden weltweit in vielen Instituten in Form tief gefrorener oder gefriergetrockneter Zuchtlinien gesammelt. In der deutschsprachigen Mikrobiologie ist es üblich, eine solche Zuchtlinie als „Stamm” zu bezeichnen, obwohl in der üblichen biologischen Hierarchie der „Stamm” eine Ebene zwischen Reich und Klasse bezeichnet. In der Mikrobiologie wird diese Ebene abweichend als „Abteilung” benannt. In der englischsprachigen Mikrobiologie besteht diese Doppeldeutigkeit nicht: Die Abteilung wird als „Phylus” und die Zuchtlinie als „Strain” bezeichnet.
Die Identifizierung einer Mikrobenprobe im Sinne dieser Schrift betrifft die Bestimmung mindestens der Gattung, in der Regel der Art, aber möglichst auch der Unterart oder – in günstigen Fällen – sogar des Serotyps oder des Stamms. Die weltweit gelagerten Stämme einer Art können oft molekularbiologisch durchaus voneinander unterschieden werden, wie sich ja auch Menschen unterscheiden, obwohl sie alle der gleichen Art angehören.
Im weiteren Sinne kann eine Identifizierung auch eine Charakterisierung in Bezug auf andere Eigenschaften bedeuten, beispielsweise auf die Pathogenität eines Mikroorganismus (Fähigkeit, eine Krankheit auszulösen) oder auf die Resistenz eines Mikroorganismus gegenüber Antibiotika, doch findet diese Art der Identifizierung im erweiterten Sinne hier nur insoweit Anwendung, als viele dieser Eigenschaften mit den Arten, Unterarten, Serovaren oder Stämmen streng oder oft zumindest mit hohen statistischen Wahrscheinlichkeiten verknüpft sind.
Die traditionelle Identifizierung von Mikroorganismen in einer zu untersuchenden Probe erfordert eine Kultivierung, bei der Kolonien der Mikroorganismen angezüchtet werden. Die in der Laborpraxis verwendeten „Bunten Reihen” umfassen unterschiedliche Nährmedien für die Anzüchtung, mit denen spezifische Stoffwechseleigenschaften der Mikroorganismen erfasst werden, wodurch eine erste, meist grobe taxonomische Einordnung der Mikroorganismen möglich ist. Des Weiteren werden die mikroskopische Morphologie von einzelnen Organismen einer Kolonie und die Morphologie der Kolonie selber untersucht. Demgegenüber sind seit einigen Jahren neuartige molekularbiologische Identifizierungsverfahren bekannt, die beispielsweise auf einer DNA- oder RNA-Sequenzanalyse nach einer Vervielfältigung von spezifischen Genabschnitten durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR = Polymerase Chain Reaction) oder auf einem massenspektrometrischen Nachweis spezifischer molekularer Zellbestandteile von Mikroorganismen beruhen. Diese neuen Verfahren sind den klassischen Verfahren in Bezug auf Spezifität (Richtignegativ-Rate), Sensitivität (Richtigpositiv-Rate), anderen Fehlerraten und Analysengeschwindigkeit überlegen.
Die Identifizierung von Bakterien durch massenspektrometrische Messungen wird beispielsweise in dem Übersichtsartikel von van Baar (FEMS Microbiology Reviews, 24, 2000, 193–219: „Characterization of bacteria by matrix-assisted laser desorption/ionization and electrospray mass spectrometry") ausführlich beschrieben. Die Identifizierung erfolgt durch eine Ähnlichkeitsanalyse zwischen einem Massenspektrum der zu identifizierenden Bakterien und Referenzspektren von genau bekannten Bakterien. Während der Ähnlichkeitsanalyse wird jedem der Referenzspektren eine Ähnlichkeitsmaßzahl zugeordnet, die die Übereinstimmung des Referenzspektrums mit dem Massenspektrum der Probe charakterisiert. Ein Bakterium kann beispielsweise dann als identifiziert ausgewiesen werden, wenn die Ähnlichkeitsmaßzahl deutlich größer ist als die Ähnlichkeitsmaßzahlen für alle übrigen Referenzspektren und auch größer als ein festgelegter Mindestwert.
Die Referenzspektren werden im Allgemeinen in einer Bibliothek zusammengefasst, wobei die Bibliothek nicht nur Referenzspektren von Bakterien, sondern auch von anderen Mikroben enthalten kann, um nicht nur Bakterien, sondern auch andere Arten von Mikroorganismen identifizieren zu können.
Für eine Validierung einer Bibliothek von Referenzmassenspektren muss jeder Eintrag sehr genau dokumentiert und zurückverfolgbar sein. Die Referenzspektren werden von genau charakterisierten Zuchtlinien (Stämmen) gewonnen. Solche Zuchtlinien von Mikroorganismen werden weltweit in staatlichen, öffentlich-rechtlichen und privaten Instituten gesammelt, meist tiefgekühlt oder gefriergetrocknet gespeichert, und stehen für wissenschaftliche Zwecke zur Verfügung. In mikrobiologischen Forschungsinstituten gibt es vielfach weitere Zuchtlinien neu entdeckter Mikrobenarten. Die genaue Einordnung in das Hierarchieschema ist manchmal umstritten, was dem Wert solcher Zuchtlinien aber keinen Abbruch tut.
Der Begriff „Zuchtlinie” oder kurz „Stamm” beschreibt hier eine Population, die aus einem einzigen Organismus heraus vermehrt und in einem speziellen Laboratorium anerkannt sicher identifiziert wurde. Für die Erstellung von Spektrenbibliotheken werden Stämme verwendet, deren Identität und Einordnung in obiges Hierarchieschema also genau bekannt ist (wenn auch gelegentlich streitig und Änderungen unterworfen), die also einer bestimmten Mikrobenart, oder, wenn vorhanden, einer bestimmten Unterart angehören. Da die Mikroben weltweit an verschiedenen Stellen gesammelt und bewahrt werden, finden sich weltweit auch viele Stämme, die der gleichen Unterart angehören. Obwohl diese Zuchtlinien als gleiche Unterart klassifiziert sind, finden sich manchmal leichte Unterschiede in den Massenspektren, die darauf hindeuten, dass es individuelle Unterschiede (wie bei Tieren oder Pflanzen der gleichen Art) gibt, wie beispielsweise die Serotypen. Die Stämme tragen international vereinbarte Kennzeichnungen hinter dem Namen der Art bzw. Unterart. Eine Population, die einem normalen mikrobiologischen Laboratorium aus einem Organismus heraus vermehrt wurde und deren Identifizierung noch ansteht, wird als „Isolat” bezeichnet.
Die Erzeugung von Massenspektren der Mikroben geht für gewöhnlich von einer sauber getrennten Kolonie auf einem festen, meist gelatinösem Nährmedium oder einem Zentrifugen-Sediment (Pellet) aus einem flüssigen Nährmedium aus. Mit einem kleinen Tupfstempel, beispielsweise einem hölzernen Zahnstocher, wird aus der ausgewählten Kolonie oder aus dem Sediment eine winzige Mikrobenmenge auf den massenspektrometrischen Probenträger übertragen. Diese Probe wird dann mit einer stark angesäuerten Lösung einer fachüblichen Matrixsubstanz beträufelt, wobei die Matrixsubstanz einer späteren Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) dient. Dabei greift die Säure der Matrixlösung die Zellwände an und schwächt sie; das organische Lösungsmittel dringt in die mikrobiellen Zellen ein, lässt diese durch osmotischen Druck platzen und setzt die löslichen Proteine frei. Anschließend erfolgt die Trocknung der Probe durch Verdunstung des Lösungsmittels, wodurch eine Kristallisation des gelösten Matrixmaterials eintritt. Die löslichen Proteine, in geringem Umfang auch andere Substanzen der Zelle, werden dabei in die Matrixkristalle eingebaut.
Es gibt Grenzfälle, in denen die Zellwände der Mikroben durch die Matrixlösung nur schwer oder gar nicht zerstört werden. Es ist dann ein etwas anders gearteter Aufschluss möglich, bei dem neben starken Säuren auch Beschallung oder mechanische Behandlung die mikrobielle Zellwand zu zerstören helfen. Diese Aufschlüsse ergeben Massenspektren, die denen der gewöhnlichen Präparation auf Probenträgern sehr ähnlich sind. Auf diese Aufschlussverfahren werde hier jedoch nicht näher eingegangen. Die Bibliotheken von Referenzspektren können Referenzspektren für beide Präparationsverfahren nebeneinander enthalten.
Die auf Probenträgern getrockneten Probenpräparationen, also die Matrixkristalle mit den eingelagerten Analytmolekülen, werden in einem Massenspektrometer mit gepulstem UV-Laserlicht beschossen, wobei Ionen der Analytmoleküle entstehen, die dann im Massenspektrometer nach Ionenmassen getrennt gemessen werden können. Diese Art der Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption wird üblicherweise mit „MALDI” abgekürzt („Matrix Assisted Laser Desorption and Ionization”). Vorzugsweise werden zu diesem Zweck besondere MALDI-Flugzeitmassenspektrometer verwendet.
Die Massenspektren der Mikroben-Proteine werden heute aus Gründen besonders hohen Nachweisvermögens im linearen Betrieb dieser Flugzeitmassenspektrometer aufgenommen, das heißt, ohne Benutzung eines energiefokussierenden Reflektors, obwohl die Massenauflösung und die Massenrichtigkeit der Spektren aus Flugzeitmassenspektrometern im Reflektorbetrieb deutlich besser ist. Im Reflektorbetrieb erscheinen aber nur etwa ein Zwanzigstel der Ionensignale, und das Nachweisvermögen ist um ein bis zwei Zehnerpotenzen schlechter. Die hohe Empfindlichkeit des linearen Betriebs beruht darauf, dass im Flugzeitmassenspektrometer nicht nur die stabilen Ionen nachgewiesen werden, sondern auch die geladenen und ungeladenen Fragmente aus so genannten „metastabilen” Zerfällen der Ionen. Für die Messung der Ionen werden Sekundärelektronenverstärker (SEV) eingesetzt, wodurch neben den unzerfallenen Molekülionen und den Fragmentionen auch die Neutralteilchen mit dem Ionendetektor gemessen werden, da auch sie beim Aufprall Sekundärelektronen erzeugen. Wenn ein einfach geladenes Molekülion beispielsweise in fünf Teilchen zerfällt, sind notwendigerweise vier davon Neutralteilchen. Alle Fragmente, die aus einer Mutterionensorte entstanden sind, haben die gleiche Geschwindigkeit wie die Mutterionen und erreichen daher den Ionendetektor zur gleichen Zeit. Ihre Flugdauer ist ein Maß für die Masse der ursprünglich unzerfallenen Ionen.
Das erhöhte Nachweisvermögen ist für viele Anwendungen so entscheidend, dass man viele der Nachteile des linearen Betriebsmodus der Flugzeitmassenspektrometer, wie beispielsweise eine wesentlich geringere Massenauflösung und auch geringere Massengenauigkeit, in Kauf nimmt. Für diese Anwendungen erhöht man die Energie des desorbierenden und ionisierenden Lasers, wodurch die Ausbeute an Ionen steigt, aber auch ihre Instabilität, die jedoch hier nicht stört.
Durch die nicht reproduzierbaren Desorptions- und Ionisierungsprozesse für die Erzeugung der Ionen in einem linear betriebenen MALDI-Flugzeitmassenspektrometer verschieben sich die Massen der einzelnen Massensignale leicht von Spektrum zu Spektrum. Diese Verschiebungen der Massenskalen der Wiederholungsspektren gegeneinander können durch ein Verfahren, das in der Schrift DE 10 2004 051 043 A1 (M. Kostrzewa et al.; GB 2 419 737 B ; US 7,391,017 B2 ) beschrieben wurde, zueinander wieder justiert werden, bevor die Wiederholungsspektren zu einem Referenzspektrum zusammengefasst werden. Auch die Massenskalen von Proben- und Referenzspektren können durch dieses Massenskalen-Justierprogramm aneinander angeglichen werden. Dadurch können für die Bestimmung der übereinstimmenden Massensignale während der Ähnlichkeitsanalyse kleinere Massentoleranzintervalle verwendet werden, was für eine gute Identifizierung entscheidend ist, wenn es auch Zeit kostet.
Das Massenspektrum eines Mikrobenisolats ist das Häufigkeitsprofil der Massenwerte der Ionen. Es handelt sich dabei ganz vorwiegend um Proteinionen. Die Massenspektren werden für gewöhnlich im Massenbereich von 2000 bis 20000 Dalton aufgenommen; die für Identifizierungen nützlichste Information befindet sich im Massenbereich von etwa 3000 Dalton bis 15000 Dalton. Wegen der verringerten Auflösung sind die Massensignale der verschiedenen Isotopenzusammensetzungen der Ionen in diesem Massenbereich nicht mehr einzeln aufgelöst, statt dessen bildet jede Isotopengruppe ein einziges zusammengeschmolzenes Massensignal. Die Proteinionen sind bei diesem Verfahren in der Regel nur einfach geladen (Ladungszahl z = 1), weshalb hier auch einfach von der Masse m der Ionen gesprochen werden kann, statt den genaueren Begriff der „ladungsbezogenen Masse” m/z zu verwenden, wie es eigentlich in der Massenspektrometrie notwendig und üblich ist. Es kommen allerdings gelegentlich in den Massenspektren der Mikroben auch die Massensignale doppelt geladener Ionen vor; da diese Massensignale jedoch ohne jeden Unterschied wie alle anderen behandelt werden, ist eine Unterscheidung zwischen einfach und doppelt geladenen Ionen nicht notwendig.
Jeder Laserlichtpuls erzeugt ein einzelnes Massenspektrum, das jedoch die Signale von nur einigen Hundert bis einigen Tausend Ionen enthält. Um zu zuverlässigeren und rauschfreieren Massenspektren zu kommen, werden einige Zehn bis einige Hundert dieser Einzelmassenspektren zu einem Summenmassenspektrum addiert. Dabei können bevorzugt die Einzelmassenspektren von verschiedenen Stellen der Probenpräparation oder sogar von verschiedenen Probenpräparationen stammen. Unter dem „Massenspektrum einer Mikrobe” oder einfacher „Mikrobenspektrum” wird immer dieses Summenmassenspektrum verstanden.
Das Profil der Proteine, das dieses Mikrobenspektrum wiedergibt, ist sehr charakteristisch für die betreffende Mikrobenart, weil jede Mikrobenart ihre eigenen, genetisch vorgegebenen Proteine mit jeweils charakteristischen Massen produziert. Auch die Häufigkeiten der einzelnen Proteine in den Mikroben, soweit sie massenspektrometrisch gemessen werden können, sind über die Steuerung ihrer Produktion durch andere Proteine weitgehend genetisch vorgegeben und hängen in nur geringem Maße vom Nährmedium oder vom Reifegrad der Kolonie ab. Die Proteinprofile sind ähnlich charakteristisch für die Mikroben wie Fingerabdrücke für den Menschen.
Für die Erzeugung von Referenzspektren für Spektrenbibliotheken werden Kolonien oder Zentrifugen-Sedimente von Mikroben bestimmter, genau dokumentierter Zuchtlinien erzeugt und davon Massenspektren aufgenommen. Dabei werden grundsätzlich für ein Referenzspektrum viele Summenmassenspektren aufgenommen, die hier als Wiederholungsspektren bezeichnet werden. Massenspektren von Mikroben enthalten meist etwa 50 bis 200 getrennte Massensignale, von denen aber wegen einer sehr empfindlich eingestellten Massensignalsuche viele reines Rauschen sind. Die Referenzspektren werden daher in der Regel auf eine Maximalzahl von beispielsweise 70 oder 100 Massensignale reduziert; selbst eine Beschränkung auf 50 Massensignale wird von Fachleuten als ausreichend betrachtet. Der Informationsgehalt eines Massenspektrums mit 50 Massensignalen im Massenbereich von 3000 bis 15000 Dalton, in dem auch bei verringertem Massenauflösungsvermögen weit mehr als 2000 voneinander unterscheidbare Massensignale auftreten können, ist bereits ohne Berücksichtigung der Intensitätsunterschiede unvorstellbar hoch (es können nahezu 2000⁵⁰ ≈ 10¹⁵⁵ Muster voneinander unterschieden werden). Die Wiederholungsspektren werden für die Beschränkung auf 70 oder 100 Massensignale zunächst zu einem sehr signalreichen Mittelwertspektrum zusammengefasst, woraufhin zunächst alle Massensignale, die nur wenige Male in den Wiederholungsspektren vorkommen, und dann die Massensignale kleinster Intensitäten gestrichen werden, bis die gewünschte Maximalzahl von Massensignalen übrig bleibt.
Für gewöhnlich werden auch die Massenspektren der zu identifizierenden Mikroben, im Weiteren kurz „Probenspektren” genannt, in ähnlicher Weise aus Wiederholungsspektren gewonnen und auf eine vorbestimmte Anzahl von Massensignalen beschränkt, um Rauschsignale möglichst auszuschließen. Diese Anzahl von Massensignalen in diesen Probenspektren wird meist etwas höher gewählt als die der Referenzspektren.
Es gibt verschiedene Arten von Ähnlichkeitsanalysen, die meist auch auf verschiedenen Ausbildungen der Referenzspektren beruhen. In den Referenzspektren können für jedes Massensignal viele oder wenige massenspektrometrische Parameter gespeichert sein, was sich stark auf die Länge der Referenzspektren und damit auf die Größe der Bibliothek auswirkt.
So ist beispielsweise in der Veröffentlichung von Jarman et al. (Analytical Chemistry, 72(6), 2002, 1217–1223: "An Algorithm for Automated Bacterial Identification Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry") ein Berechnungsverfahren für die Erstellung von Referenzspektren einer Bibliothek und für die Ähnlichkeitsanalyse zwischen einem Massenspektrum einer zu untersuchenden Probe (hier „Probenspektrum” genannt) und den Referenzspektren der Bibliothek angegeben, das sich insbesondere auf die Reproduzierbarkeit der einzelnen Massensignale bei der Erstellung der Referenzspektren stützt. Für die Ähnlichkeitsanalyse eines Probenspektrums ermittelt das Verfahren für jedes Massensignal jeden Referenzspektrums eine Einzelkennzahl, die angibt, wie gut es mit dem Massensignal des Probenspektrums übereinstimmt, wobei insbesondere einerseits die Übereinstimmung der Intensitäten und andererseits eine Gewichtung durch die Streuung der Referenzsignale berücksichtigt werden. Diese Einzelkennzahl wird umso höher angesetzt, je geringer die Streuung der Intensität für dieses Massensignal ist, je besser also dieses Massensignal reproduziert werden kann. Schlecht reproduzierbare Massensignale erhalten eine niedrige Einzelkennzahl. Aus den so ermittelten Einzelkennzahlen der Massensignale der Referenzspektren wird für jedes Referenzspektrum durch Summierung eine Ähnlichkeitsmaßzahl für die Übereinstimmung mit dem Probenspektrum ermittelt. Die Referenzspektren einer Bibliothek werden dann nach der Größe der Ähnlichkeitsmaßzahlen sortiert. Als Resultat erhält man eine nach Ähnlichkeiten sortierte Liste mit den Bezeichnungen der den Referenzspektren zugeordneten Mikroorganismen und den Ähnlichkeitsmaßzahlen.
Für diesen hier nur grob dargestellten Algorithmus nach Jarman et al. muss ein Referenzspektrum folgende aus den Wiederholungsspektren ermittelten Größen für die einzelnen Massensignale des Referenzspektrums enthalten: die gemittelte Masse, die Streuung um die gemittelte Masse, die mittlere Intensität, die Streuung um die mittlere Intensität und die prozentuale Häufigkeit des Auftretens dieses Massensignals in den Wiederholungsspektren, also des Auftretens oberhalb der Empfindlichkeitsschwelle. In der Regel werden dabei nur diejenigen Signale in einem Referenzspektrum berücksichtigt, die eine vorbestimmte Mindesthäufigkeit aufweisen.
Neben dem Verfahren von Jarman et al. sind in der Literatur mehrere andere Arten von Identifizierungsalgorithmen und Referenzbibliotheken bekannt geworden, die jedoch hier nicht weiter behandelt werden.
Wie Entwicklungen von Identifizierungsverfahren im Hause der Antragstellerin zeigen, können auch wesentlich einfachere massenspektrometrische Identifizierungsverfahren eine sehr hohe Erfolgsquote haben. So ist es zunächst zweckmäßig, anders als bei Jarman et al., für die Aufnahme der Referenzspektren wie auch der Probenspektren die Spektren unter standardisierten Bedingungen für die Aufzucht der Kolonie, für die Probenpräparation und für die massenspektrometrische Spektrenaufnahme zu erzeugen. Schon diese Maßnahme führt zu verbesserter Identifizierung. Es kann dann in den Referenzspektren auf die Speicherung der Streuungen von Massenwerten und Intensitätswerten ganz verzichtet werden, was die Bibliothek kleiner und handlicher und die Ähnlichkeitsanalyse schneller macht. Auf ein Verfahren zur Angleichung der häufig leicht verschobenen Massenskalen der Wiederholungsspektren aneinander wurde bereits oben eingegangen. Da viele Massensignale nur in einem Teil der Wiederholungsmessungen auftauchen, aber trotzdem zur Identifizierung beitragen können, hat es sich durch viele Experimente mit solchermaßen vereinfachten Referenzspektren gezeigt, dass es zweckmäßig ist, die prozentuale Präsenz eines Massensignals mitzuführen. Die prozentuale Präsenz gibt an, bei wie viel Prozent der Wiederholungsspektren dieses Massensignal auftritt. Ein Massensignal trägt dann nur drei Eintragungen: gemittelte Masse, gemittelte Intensität, und prozentuale Präsenz.
Das Verfahren zur Ähnlichkeitsanalyse mit diesen einfachen Referenzspektren kann in seiner einfachsten Form so aussehen, dass jedes Referenzspektrum daraufhin untersucht wird, wie viele seiner Massensignale sich jeweils mit denen des Mikrobenspektrums innerhalb einer vorgegebenen Massentoleranz treffen. Die Anzahl dieser Treffer geteilt durch die Anzahl der Massensignale im Referenzspektrum ist dann ein erstes Teilmaß für die Ähnlichkeit; die Anzahl der Treffer durch die Anzahl der Massensignale im Mikrobenspektrum ein zweites Teilmaß. Ein drittes Teilmaß kann aus der Intensitätsähnlichkeit der sich treffenden Massensignale abgeleitet werden. Das Produkt der drei Teilmaße ergibt die Ähnlichkeitsmaßzahl. Eine Verfeinerung kann dadurch eingeführt werden, dass ein Treffer jeweils nur mit der prozentualen Präsenz dieses Massensignals gezählt wird, also mit einer Zahl, die möglicherweise kleiner als eins ist.
Dieser Algorithmus kann durch eine entsprechende Skalen-Transformation auf eine maximale Ähnlichkeitsmaßzahl zwischen Mess- und Referenzspektren abgestimmt werden, beispielsweise auf eine maximale Ähnlichkeitsmaßzahl von 3,00 für identische Spektren. Es ist sogar möglich, die Ähnlichkeitsmaßzahlen so zu transformieren, dass ein Ähnlichkeitswert von 2,00 als Minimalanforderung für eine Identifizierung angesehen werden kann. Eine solche Minimalanforderung und ein entsprechender Maximalwert sind nach unseren Erfahrungen von hohem psychologischen Wert für die Akzeptanz des Verfahrens.
Für diese einfache Ähnlichkeitsanalyse kann ein Algorithmus entwickelt werden, der eine Ähnlichkeitsmaßzahl für ein Referenzspektrum in etwa fünf Millisekunden berechnet, wovon die Massenskalen-Justierung einen Teil beansprucht. Ein Identifizierung anhand eines Probenspektrums in einer Referenzbibliothek mit etwa 3500 Referenzspektren, wie sie heutzutage vorliegen, braucht in normalen Computerservern etwa 15 Sekunden. Diese Zeit ist kompatibel mit Aufnahmezeiten für die Probespektren, die bei Pulslasern mit 20 Hertz Wiederholfrequenz erreicht werden, doch können heutige Massenspektrometer die Massenspektren mit 200 Hertz bereits in kürzerer Zeit aufnehmen.
Die Entwicklung der MALDI-Massenspektrometer geht aber schnell voran; bereits jetzt sind die ersten Spektrometer mit 2000 Hertz Laserschussfrequenz auf dem Markt. Die Aufnahmedauer für Probenspektren geht auf ein bis drei Sekunden zurück. Andererseits steht zu erwarten, dass die Bibliotheken wegen der Aufnahme weiterer Referenzspektren schnell auf 10000 Referenzspektren und mehr anwachsen werden, während die Entwicklung der PCs und Rechnerserver in Bezug auf höhere Geschwindigkeiten nur noch langsam vorankommt. Die Rechenzeiten für die Identifizierung werden somit schnell auf etwa eine Minute anwachsen und mit den Aufnahmezeiten nicht mehr kompatibel sein. Eine – allerdings teure – Lösung des Problems besteht darin, die Massenspektrometer mit Multiprozessor-Systemen auszustatten. Es wäre aber zu begrüßen, Verfahren zur Erhöhung der Identifizierungsgeschwindigkeit zur Verfügung zu haben, die mit den bisher verwendeten einfachen Rechensystemen brauchbar kurze Identifizierungszeiten ergeben.
Aufgabe der Erfindung
Es ist die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Identifizierung von Mikroben anhand ihrer Massenspektren bereitzustellen, mit dem die Mikroben unter Benutzung üblicher Rechensysteme mindestens zehnmal schneller Identifiziert werden können als bisher.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung stellt ein mehrstufiges Verfahren zur Identifizierung von Mikroben anhand von Ähnlichkeitsvergleichen ihrer Massenspektren mit Referenzspektren in einer Hierarchie von Teilbibliotheken bereit, mit dem die Mikroben sehr viel schneller identifiziert werden können, als mit einer einstufigen Suche in großen Referenzspektrenbibliotheken. Bei der mehrstufiger Suche werden die ähnlichsten Referenzspektren zunächst in einer relativ kleinen Teilbibliothek einer ersten Stufe gesucht, die beispielsweise nur 100 bis 300 Referenzspektren umfasst. Diese enthält die Referenzspektren von nur wenigen, beispielsweise drei bis zehn der statistisch häufigst diagnostizierten Mikrobenarten. Sie enthält aber, und dieses ist der Kern der Erfindung, zusätzlich alle Referenzspektren, die zu diesen Mikrobenreferenzspektren eine Ähnlichkeit oberhalb einer Ähnlichkeitsschwelle aufweisen, damit nicht durch eine minimal genügende Identifizierung in der ersten Stufe eine viel bessere Identifizierung durch ein weit ähnlicheres Referenzspektrum, das sich aber in der Teilbibliothek einer höheren Stufe versteckt, verhindert wird.
Nur wenn die Suche in der Teilbibliothek der ersten Stufe keinen Treffer genügender Ähnlichkeit ergibt, wird in analog erstellten Teilbibliotheken hierarchisch höherer Stufen oder schließlich in der Gesamtbibliothek gesucht.
Es lassen sich die Hierarchien der Teilbibliotheken mit entsprechenden Softwareprogrammen automatisch erstellen, wobei durch Berücksichtigung aktueller Statistiken über die Mikroben in den Proben eines Laboratoriums oder in bestimmten Probenarten wie Stuhl, Urin oder Blut und durch Wahl von Anzahl und Größe der Teilbibliotheken die Durchschnittszeit zur Identifizierung laborspezifisch und gegebenenfalls probenartspezifisch minimiert werden kann.
Die hierarchisch gegliederten Teilbibliotheken brauchen nicht räumlich getrennt gespeicherte Bibliotheken zu sein. Es genügt, wenn die Zugehörigkeit eines Referenzspektrums zu einer Teilbibliothek in einem Feld des Referenzspektrums vermerkt wird, das nicht der Qualitätssicherung für eine Validierung unterliegt. Es können insbesondere aber auch Tabellen mit den Adressen der betreffenden Referenzspektren der einzelnen Stufen außerhalb der Bibliothek angelegt werden, um die Validierung einer Bibliothek nicht zu erschweren. Dadurch wird es auch möglich, mehrere Hierarchien nebeneinander zu benutzen, beispielsweise für verschiedene Probenarten.
Bevorzugte Ausführungsformen
Wie schon kurz angemerkt, besteht der Kern der Erfindung nicht einfach in einer Stufung der Ähnlichkeitssuche in einer nach statistischen Häufigkeiten angelegten Hierarchie von Teilbibliotheken, sondern darin, dass in einer Teilbibliothek jeweils neben den Referenzspektren der statistisch am häufigsten analysierten, aber nicht schon in einer niedrigeren Hierarchiestufe erfassten Mikroben zusätzlich alle Referenzspektren vorhanden sind, die zu den Referenzspektren der ausgewählten Mikroben genügend ähnlich sind. Der Begriff „genügend ähnlich” oder auch nur einfach „ähnlich” bedeutet, dass ein Referenzspektrum der Gesamtbibliothek, das im Spektrenvergleich zu mindestens einem der Referenzspektren der für diese Teilbibliothek ausgesuchten Mikroben eine Ähnlichkeitsmaßzahl über einem festgelegten Mindestmaß ergibt, der Teilbibliothek zuzuordnen ist. So wird gewährleistet, dass bei einem Identifizierungstreffer in einer Teilbibliothek sofort auch die beste Identifizierung durch das ähnlichste Referenzspektrum gefunden werden kann. In Teilbibliotheken höherer Stufen kann sich kein ähnlicheres Referenzspektrum mehr befinden.
Ergibt es sich, dass bei der Untersuchung der Ähnlichkeiten aller Referenzspektren zu den Referenzspektren der ausgewählten Mikroben genügend ähnliche Spektren von Mikrobenarten gefunden werden, die nicht zu den ausgewählten gehören, so ist es zweckmäßig, alle Referenzspektren dieser Mikrobenarten mit in die Teilbibliothek aufzunehmen, auch wenn nicht alle diese Referenzspektren genügende Ähnlichkeit besitzen. Es kann jedoch auch so vorgegangen werden, dass nur die genügend ähnlichen Referenzspektren anderer Mikrobenarten aufgenommen werden; landet jedoch die Ähnlichkeitssuche einen Treffer bei einem dieser ähnlichen Referenzspektren, so wird die Ähnlichkeitssuche in einer Teilbibliothek einer höheren Hierarchiestufe fortgesetzt.
Es sei die Hierarchie der Teilbibliotheken am Beispiel eines beispielhaft ausgewählten medizinisch-mikrobiologischen Routinelaboratoriums beschrieben. In diesem Laboratorium konnten fast 50 Prozent aller Proben nur vier verschiedenen Mikrobenarten zugeordnet werden (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa). Die Teilbibliothek der ersten Stufe enthält die Referenzspektren dieser Mikrobenarten und zusätzlich alle zu den Referenzspektren dieser vier Mikrobenarten genügend ähnlichen Referenzspektren der Gesamtbibliothek. Obwohl die Teilbibliothek die Referenzspektren eng verwandter Mikrobenarten, von Mikroben verschiedener Zuchtstämme der gleichen Art einschließlich der Serovaren, aber auch zufällig ähnliche Referenzspektren nicht verwandter Mikroben enthält, umfasst sie nur etwa einhundert Referenzspektren. Die Suche in dieser Teilbibliothek der ersten Stufe dauert nur etwa eine halbe Sekunde. So können bereits 50 Prozent der Proben in diesem Laboratorium in jeweils einer halben Sekunde rechnerisch identifiziert werden. Dabei kann die Identifizierung auf Unterarten oder Serovaren genau sein, zumal wenn das Verfahren zur verbesserten Identifizierung von Mikroben mit sehr ähnlichen Referenzspektren verwendet wird, das in DE 10 2009 032 649.9 (T. Mayer und M. Kostrzewa, 2009) beschrieben wird.
Weitere Teilbibliotheken einer zweiten und höheren Hierarchiestufen können analog zur ersten Stufe nach Inhalt und Umfang so erstellt werden, dass die durchschnittliche Identifizierungs-Rechenzeit ein Minimum annimmt. So entfielen weitere 25 Prozent aller Proben in dem gewählten medizinisch-mikrobiologischen Laboratorium auf nur ein Dutzend weitere Bakterienarten (Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Staphylococcus hominis, Klebsiella oxitoca, Proteus mirabilis, Candida albicans, Stenotrophomonas maltophilia, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Staphylococcus haemolyticus, Candida glabrata, Candida krusei). Die Teilbibliothek für diese Mikroben umfasst durch Hereinnahme aller ähnlichen Referenzspektren etwa 300 Referenzspektren. Diese Teilbibliothek kann in Rechenzeiten von etwa 1,5 Sekunden durchsucht werden, so dass für eine Identifizierung einer dieser Mikroben insgesamt (einschließlich der vergeblichen Suche in der Teilbibliothek erster Stufe) etwa zwei Sekunden gebraucht werden. Es können somit drei Viertel aller Identifizierungen in durchschnittlich 0,75 Sekunden abgeschlossen werden (= ½·0,5 + ¼·2 Sekunden).
Es ist durch die Erstellung weiterer Teilbibliotheken möglich, die durchschnittliche Rechenzeit für eine Identifizierung insgesamt auf wenige Sekunden herabzudrücken, selbst wenn gelegentlich (möglichst in weit weniger als einem Prozent der Fälle) in der gesamten Restbibliothek gesucht werden muss. Muss in einem Prozent der Fälle in der gesamten Restbibliothek gesucht werden, und dauert diese Suche eine volle Minute, so erhöht sich durch diesen Anteil der Identitätssuchen die durchschnittliche Rechenzeit pro Identifizierung nur um 0,6 Sekunden.
Die oben angegebene statistische Aufteilung der Proben auf die Mikroben mag in anders spezialisierten mikrobiologischen Laboratorien anders aussehen. Es lassen sich dann durch Berücksichtigung aktueller Statistiken über das Vorkommen der Mikroben in den Proben andere Aufteilungen auf Teilbibliotheken durch Serien von Ähnlichkeitsberechnungen erstellen, wobei durch Wahl von Anzahl und Größe der Teilbibliotheken die Durchschnittszeit zur Identifizierung laborspezifisch minimiert werden kann. Die Aufteilung auf Teilbibliotheken kann durch entsprechende Rechenprogramme automatisch erfolgen, beispielsweise über Nacht. Auch die Wahl von Anzahl und Größe der Teilbibliotheken für die Minimierung der Identifizierungszeit kann automatisch erfolgen. Es kann sich die Aufteilung auf Teilbibliotheken auch dynamisch an sich verändernde Identifizierungshäufigkeiten anpassen.
Für bestimmte Arten von Proben, wie beispielsweise Blut, Urin, Stuhl oder Nasenschleim können sogar eigene Hierarchien von Teilbibliotheken aufgebaut werden, da hier statistisch andere Verteilungen von Mikroben gefunden werden. Auch für verschiedene Anwendungsgebiete, wie beispielsweise klinische Infektionsdiagnostik, Nahrungsmittel-, Gewässer- oder Hygieneüberwachung werden zweckmäßigerweise verschiedene Hierarchien von Teilbibliotheken erstellt. Ähnliches gilt für spezielle Analysenverfahren, die auf besondere Arten von Mikroben ausgerichtet sind, zum Beispiel durch Verwendung besonderer selektiver Nährmedien. Diese Analysenverfahren sind häufig nur auf die Antworten „positiv” oder „negativ” ausgerichtet. In diesen Fällen kann auch bei negativem Ergebnis die Suche nach der ersten Stufe abgebrochen werden.
Die Teilbibliotheken brauchen nicht räumlich getrennt gespeicherte Bibliotheken zu sein. Es genügt, wenn in einer großen Bibliothek die Zugehörigkeit eines Referenzspektrums zu einer Teilbibliothek in einem Feld des Referenzspektrums vermerkt wird, das nicht der Qualitätssicherung für eine Validierung unterliegt. Da die Validierung einer Referenzspektrenbibliothek sehr kritisch zu sehen ist, ist es jedoch besser, außerhalb der Bibliothek Tabellen mit den Adressen der Referenzspektren für die Teilbibliotheken der einzelnen Stufen anzulegen. In dieser Weise kann ein Referenzspektrum sogar zu zwei oder mehr Teilbibliotheken verschiedener Stufen gehören, falls das auf Grund von Ähnlichkeiten erforderlich sein sollte. Es lassen sich in dieser Weise auch leicht verschiedene Hierarchien von Teilbibliotheken für eine Gesamtbibliothek speichern, beispielsweise verschiedene Hierarchien für verschiedene Probenarten.
Es werde hier für eine detaillierte Beschreibung des erfindungsgemäßen Identifizierungsverfahrens auf eine einfache Art von Referenzspektren zurückgegriffen, die für die Massensignale nur jeweils Masse, Intensität und prozentuale Präsenz mitführen, da das damit verbundene sehr einfache Verfahren zur Berechnung von Ähnlichkeitsmaßzahlen sehr schnell ist und trotzdem zu hervorragenden Identifizierungsergebnissen führt. Diese einfache Art von Referenzspektren wurde bereits eingangs beschrieben.
Grundlage dieses Verfahrens ist – wie für andere Verfahren auch – die Bibliothek der Referenzspektren, die zunächst erstellt werden muss. Dazu werden standardisierte Anzuchtverfahren und ebenfalls standardisierte Verfahren zur Spektrenaufnahme verwendet. Die Verfahren der Anzüchtung der Mikroben genau bekannter Stämme, der Entnahme winziger Mikrobenmengen, der Präparation von beispielsweise mindestens fünf Proben jeder Mikrobe auf einem massenspektrometrischen Probenträger, und der Aufnahme von beispielsweise je mindestens fünf Massenspektren von jeder der Proben sind genau festgelegt, wobei jedes Massenspektrum aus einer festgelegten Anzahl von Einzelspektren summiert wird. Es werden nach den genannten Beispielen für jeden Mikrobenzuchtstamm mindestens 25 Wiederholungsmassenspektren erhalten, deren Aufnahme in einem geeigneten Massenspektrometer insgesamt nur ein bis zwei Minuten benötigt. Die große Anzahl von Wiederholungsspektren ist nur deswegen erforderlich, weil die Prozesse der Präparation der Probe mit Kristallisierung der Matrixsubstanz und der Ionenbildung durch MALDI nur mäßig gut reproduzierbar sind und nur durch eine Mittelung über viele Massenspektren zu guten Referenzspektren führen. Eine hohe Zahl von Wiederholungsspektren gibt auch verlässlichere Werte für die prozentualen Präsenzen der Massensignale.
Da sich durch den Desorptions- und Ionisierungsprozess für die Erzeugung der Ionen in einem linear betriebenen MALDI-Flugzeitmassenspektrometer die Massen der einzelnen Massensignale von Spektrengruppe zu Spektrengruppe leicht verschieben können, werden jetzt die Massenskalen der Wiederholungsspektren durch ein eingangs bereits zitiertes Verfahren, das in der Schrift DE 10 2004 051 043 A1 (M. Kostrzewa et al.) beschrieben wurde, zueinander justiert. Dadurch können für die unten beschriebene Bestimmung der Treffer kleinere Massentoleranzintervalle verwendet werden, beispielsweise 250 statt 1000 Millionstel der Masse (ppm). Diese Anpassung der Massenskalen bedeutet eine entscheidende Verbesserung für das Verfahren.
Aus den zueinander justierten Wiederholungsspektren werden für jedes Massensignal automatisch die mittleren Massenwerte, die mittleren Intensitäten und die prozentualen Präsenzen ermittelt. Die prozentualen Präsenzen geben an, wie häufig ein Massensignal in den Wiederholungsspektren auftritt; hier steht also der Wert 1,00 (= 100%), wenn dieses Massensignal in allen Wiederholungsspektren zu finden ist, und ein entsprechend kleinerer Wert sonst. Das aus allen Wiederholungsspektren zusammengefasste Referenzspektrum wird dann durch Entfernen aller Massensignale unterhalb einer festgelegten Schwelle für die Präsenz, beispielsweise 15%, und durch Entfernen der Massensignale mit den kleinsten Intensitäten auf maximal 70 Massensignale eingeschränkt. In wenigen Fällen finden sich weniger als 70 Masseneinträge in einem Referenzspektrum, wenn nach Entfernen der Rauschsignale, die durch geringe Präsenzen charakterisieret sind, weniger als 70 Massensignale übrig bleiben.
Die Referenzspektren der Bibliothek enthalten neben den genauen Bezeichnungen der Mikrobenart, Unterart, und Stamm für jedes der maximal 70 eingetragenen Massensignale nur den Massenmittelwert, den Intensitätsmittelwert und die prozentuale Präsenz. Das Referenzspektrum kann auch einige Zahlenwerte enthalten, die für die Berechnung der Ähnlichkeitsmaßzahlen immer wieder gebraucht werden, beispielsweise die mit den Präsenzen gewichtete Anzahl aller Massensignale. Zusätzlich enthalten die Referenzspektren Verweise auf die Herkunft der Stämme und auf das Laboratorium, das die Spektren aufgenommen hat, wie für Validierungen erforderlich. Es können auch Verweise auf besondere Pathogenität der Mikroben, ihre Umweltschädlichkeit in Gewässern, ihre Toxizität in Lebensmitteln, ihre Schädlichkeit in Bioprozessen und dergleichen vorhanden sein, möglichst in verschlüsselter Form, die gegebenenfalls für eine automatische Prüfung auf die Notwendigkeit einer verfeinerten Identifizierung herangezogen werden kann. Auch die Bekämpfungsarten von Pathogenen oder Umweltschädlingen können mit entsprechenden Verschlüsselungen enthalten sein.
Für die Identifizierung einer Mikrobenprobe wird diese zunächst nach dem gleichen standardisierten Verfahren wie für Referenzspektren zu einer Kolonie angezüchtet. Mikroben aus einem Isolat werden auf den Probenträger übertragen, mit Matrixlösung präpariert und im Massenspektrometer vermessen. Auch hier werden zweckmäßigerweise mehrere Massenspektren gemessen und in ähnlicher Weise wie bei den Referenzspektren zu einem gemittelten Massenspektrum zusammengefasst, das hier als „Probenspektrum” bezeichnet wird. Das Probenspektrum wird beispielsweise auf maximal 100 Massensignale eingeschränkt.
In der ersten Stufe des erfindungsgemäßen Identifizierungsverfahrens werden nun in einer ersten Ähnlichkeitsanalyse wie üblich die Maßzahlen für die Ähnlichkeiten des Probenspektrums zu den Referenzspektren der ersten Teilbibliothek berechnet. Das eingangs bereits kurz geschilderte einfache Berechnungsverfahren für diese Ähnlichkeitsmaßzahlen, das hier als Beispiel dienen soll, geht von drei Teilmaßen aus: Ein erstes Teilmaß der Ähnlichkeitsmaßzahl wird durch die Anzahl der sich jeweils innerhalb eines Massentoleranzintervalls treffenden Massensignale („Treffer”) in Mikrobenspektrum und Referenzspektrum dargestellt, geteilt durch die Anzahl der Massensignale im Referenzspektrum, wobei aber alle Massensignale jeweils nur anteilig mit ihrer Präsenz gezählt werden. Das Massentoleranzintervall kann absolut in atomaren Masseneinheiten (oder Dalton) oder aber als relative Größe in ppm (part per million) angegeben werden. Als günstig hat sich ein Massentoleranzintervall von 250 ppm erwiesen. Ein zweites Teilmaß ergibt sich aus der Trefferzahl geteilt durch die Anzahl der Massensignale im Mikrobenspektrum, wahlweise wiederum anteilig gezählt mit den Präsenzen. Erstes und zweites Teilmaß können jeweils maximal den Wert 1,00 annehmen. Das dritte Teilmaß wird aus der Ähnlichkeit der jeweiligen Intensitäten der sich treffenden Massensignale zueinander berechnet, wobei wiederum die Präsenzen multiplikativ berücksichtigt werden. Dieses dritte Teilmaß wird für alle Massensignale so normiert, dass bei Gleichheit aller Intensitäten das Teilmaß den Wert 1,00 annimmt.
Diese drei Teilmaße werden nun einfach miteinander multipliziert und ergeben so die Maßzahl für die Ähnlichkeit zwischen Referenz- und Mikrobenspektrum. Da jedes der drei Teilmaße maximal den Wert 1,00 annehmen kann, kann auch die Ähnlichkeitsmaßzahl maximal den Wert 1,00 annehmen.
Es hat sich nun in Tausenden von überprüften Identifizierungen durch diese Art von Ähnlichkeitsberechnungen herausgestellt, dass eine sichere Identifizierung praktisch immer mit einem Ähnlichkeitswert größer als 0,10 verbunden ist. Um zu handlicheren Größen zu kommen, kann durch eine Multiplikation mit dem Wert 1000 und eine nachfolgende Logarithmisierung eine Transformation vorgenommen werden, die eine maximale Ähnlichkeitsmaßzahl von 3,00 für identische Spektren und eine minimal für eine Identifizierung einer Art erforderliche Ähnlichkeitsmaßzahl von 2,00 ergibt. Diese Transformation ist nicht essentiell, sie hat, wie bereits oben angemerkt, nur psychologischen Wert; es können daher auch beliebige andere Transformationen angewandt werden, wenn sich diese als handhabbarer erweisen sollten.
Dieser Ablauf der Berechnung der Ähnlichkeitsmaßzahlen kann in einen sehr schnell arbeitenden Algorithmus umgesetzt werden, für den in heutzutage für die Verwendung mit Massenspektrometern gängigen Rechnern für Skalenjustierung und Berechnung der Ähnlichkeitsmaßzahl etwa jeweils fünf Millisekunden gebraucht werden.
Die Ergebnisse werden üblicherweise in einer Liste wiedergegeben, in der die ähnlichsten Referenzspektren nach den Ähnlichkeitsmaßzahlen geordnet dargestellt sind, mit Namen der zugehörigen Mikrobenarten, Unterarten und Zuchtstämmen. Es hat sich in Tausenden von überprüften Identifizierungen herausgestellt, dass mit Sicherheiten von über 95 Prozent durch Ähnlichkeitsmaßzahlen zwischen 1,70 und 2,00 zumindest die Gattung, zwischen 2,00 und 2,30 die Art identifiziert ist. Ähnlichkeitsmaßzahlen oberhalb von 2,30 identifizieren mit ähnlich hoher Sicherheit sogar einzelne Stämme.
Werden also in der Suche der ersten Stufe Ähnlichkeiten über 2,00 gefunden, so kann die Mikrobenart als identifiziert angenommen werden. Meist werden in der Liste der besten Ähnlichkeiten mehrere Referenzspektren gefunden, die der gleichen Art angehören. Diese können zu einer Bewertung der Identifizierungssicherheit herangezogen werden: Gehören beispielsweise die sechs besten Referenzspektren alle der gleichen Mikrobenart an, und gibt es in der Bibliothek überhaupt nur sieben Referenzspektren dieser Mikrobenart, so kann die Identifizierung als „high confidence identification” eingestuft werden, selbst wenn die höchste Ähnlichkeitsmaßzahl nur wenig über 2,00 liegt. Solche oder ähnliche Einstufungen helfen den Mitarbeitern in Routinelaboratorien bei ihren Entscheidungen über sichere Identifizierungen.
Wird dagegen in der ersten Stufe der Suche kein Referenzspektrum gefunden, das eine Ähnlichkeitsmaßzahl größer als 2,00 besitzt, so wird die Suche in der Teilbibliothek der zweiten Stufe fortgesetzt. Bei negativen Ergebnissen hier kann die Suche so lange in Teilbibliotheken höherer Stufen fortgesetzt werden, bis eine zufriedenstellende Identifizierung erfolgt ist.
Werden überhaupt keine Referenzspektren mit Ähnlichkeitsmaßzahlen über 2,00, jedoch solche zwischen 1,70 und 2,00 gefunden, so kann eine Identifizierung der Gattung angenommen werden, ohne dass die Identifizierung der Mikrobenart gelungen wäre. Mit hoher Wahrscheinlichkeit liegt dann in der Bibliothek der Referenzspektren kein Referenzspektrum für diese Mikrobenart vor, was bei den Millionen von Mikrobenarten immer wieder vorkommen muss. Es ist aber das Bestreben beim Aufbau von Bibliotheken mit Referenzspektren, zumindest alle Gattungen zu überstreichen.
Die gestufte Suche kann jedoch dann zu Problemen führen, wenn die Massenspektren nicht aus reinen Kulturen, also aus Isolaten, sondern aus Mischkulturen stammen, auch wenn diese Mischkulturen aus nur zwei oder höchstens drei Mikrobenarten bestehen. Diese Mischkulturen können auftreten, wenn beispielsweise für Patienten mit starker Sepsis hoch infizierte Blutkulturen aus Zeitgründen nach nur kurzer Bebrütung direkt analysiert werden, ohne weitere Anzucht sauberer Kolonien in Petrischalen. Meist wird in diesen Blutkulturen ganz überwiegend nur eine Mikrobenart gefunden, doch können gelegentlich zwei oder mehr Mikrobenarten auftreten. In DE 10 2009 033 368.1 (T. Mayer, 2009) wird ein entsprechendes Analysenverfahren und in DE 10 2009 007 266.7 (M. Kostrzewa et al. 2009) ein rechnerisches Identifizierungsverfahren für solche Mischkulturen beschrieben. Diese Verfahren sind auch hier anwendbar, wenn in einer Teilbibliothek solche Mikrobenarten, die miteinander in bestimmten Proben vorkommen können, gemeinsam vorhanden sind. Ist dies für eine Probe nicht der Fall, so bleibt das in der letztgenannten Schrift ebenfalls geschilderte Differenzenverfahren.
Die hier geschilderten Verfahren können vom einschlägigen Fachmann in Kenntnis der Erfindung in vielfältiger Weise modifiziert werden. Einige dieser Variationen sind bereits oben angedeutet; es gibt aber durchaus weitere Verfahren, die auf der grundlegenden Basis einer zwei- oder mehrstufigen Identifizierung nach dieser Erfindung durchgeführt werden können.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

DE 102004051043 A1 [0019, 0049]
GB 2419737 B [0019]
US 7391017 B2 [0019]
DE 102009032649 [0041]
DE 102009033368 [0061]
DE 102009007266 [0061]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

van Baar (FEMS Microbiology Reviews, 24, 2000, 193–219: „Characterization of bacteria by matrix-assisted laser desorption/ionization and electrospray mass spectrometry”) [0010]
Jarman et al. (Analytical Chemistry, 72(6), 2002, 1217–1223: ”An Algorithm for Automated Bacterial Identification Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry”) [0026]

Claims

Verfahren für die Identifizierung einer Mikrobenprobe durch Berechnung von Maßzahlen für die Ähnlichkeit zwischen dem Massenspektrum der Mikrobenprobe und Referenzspektren einer Referenzspektrenbibliothek, mit den Schritten a) Bereitstellen einer Bibliothek der Referenzspektren, die nach der Identifizierungshäufigkeit der Mikroben in Teilbibliotheken untergliedert ist, wobei die Teilbibliotheken jeweils zusätzlich alle Referenzspektren enthalten, die zu den Referenzspektren der Mikroben in der jeweiligen Teilbibliothek ähnlich sind, b) Aufnahme des Massenspektrums der Mikrobenprobe, b) Ähnlichkeitssuche in der ersten Teilbibliothek mit den Mikroben größter Identifizierungshäufigkeit, und c) Abbruch der Ähnlichkeitssuche, wenn nach Durchsuchen der ersten Teilbibliothek eine positive Identifizierung vorliegt, sonst Fortführung der Ähnlichkeitssuche in Teilbibliotheken mit Referenzspektren von Mikroben geringerer Identifizierungshäufigkeiten.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Identifizierungshäufigkeit der Mikroben auf das Vorkommen bei Messungen in einem Laboratorium, bei Messungen einer bestimmten Probenart, oder bei Messungen mit einem bestimmten Messverfahren bezieht.
Referenzspektrenbibliothek für die Identifizierung von Mikroben nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie in eine Hierarchie von Teilbibliotheken untergliedert ist, die jeweils die Referenzspektren einer Anzahl von am häufigsten gemessenen, jedoch nicht schon in einer unteren Hierarchiestufe erfassten Mikroben enthalten, und zusätzlich alle Referenzspektren, die zu den Referenzspektren dieser Mikroben ähnlich sind.
Referenzspektrenbibliothek nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Anzahl von am häufigsten gemessenen Mikroben auf die Messungen in einem Laboratorium beziehen.
Referenzspektrenbibliothek nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Anzahl von am häufigsten gemessenen Mikroben auf eine Probenart wie Nasenabstrich, Blut, Stuhl oder Urin beziehen.
Referenzspektrenbibliothek nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Anzahl von am häufigsten gemessenen Mikroben auf Messungen mit einem bestimmten Messverfahren beziehen.
Verfahren für die Untergliederung einer Referenzspektrenbibliothek nach Anspruch 3 in eine Hierarchie von Teilbibliotheken, dadurch gekennzeichnet, dass die Untergliederung unter Verwendung bekannter Identifizierungshäufigkeiten durch ein Rechenprogramm automatisch vorgenommen wird.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Untergliederung in Teilbibliotheken so vorgenommen wird, dass die Rechenschritte zur Identifizierung im statistischen Mittel ein Minimum an Zeit dauern.
Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Untergliederung in Teilbibliotheken den dynamisch verändernden Identifizierungshäufigkeiten anpasst.