-
Anwendungsgebiet
-
Die
Erfindung betrifft die massenspektrometrische Identifizierung von
Mikroorganismen in komplexen Proben (Mischkulturen).
-
Stand der Technik
-
Die
schnelle und fehlerfreie Identifizierung von Mikroorganismen spielt
in der Lebensmittelanalytik, bei der Überwachung und Regelung
von biotechnologischen Prozessen, bei der Detektion von biologischen
Waffen und insbesondere in der klinischen Mikrobiologie eine herausgehobene
Rolle. Mikroorganismen, die auch als Keime oder Mikroben bezeichnet
werden, sind im Allgemeinen mikroskopisch kleine Lebewesen, zu denen Bakterien,
Pilze (z. B. Hefen), mikroskopische Algen, Protozoen (z. B. Plasmodien
als Malaria-Erreger) zählen, zu denen hier aber auch Viren
gerechnet werden sollen.
-
Die
Identifizierung eines Mikroorganismus umfasst dessen Einordnung
in folgende taxonomische Hierarchieebenen: Reich, Abteilung, Klasse,
Ordnung, Familie, Gattung, Art, Unterart. Der Begriff „Stamm” beschreibt
im Folgenden eine Population, die aus einem einzelnen Organismus
heraus vermehrt wird oder die von einer Reinkultur (Isolat) abstammt.
Die einzelnen Organismen eines Stammes sind genetisch identisch. Für
einen Fachmann ist der Begriff ”Mikroorganismus” im
Rahmen seiner taxonomischen Identifizierung gleichbedeutend mit
dem Begriff ”Stamm”.
-
Die
traditionelle Identifizierung von Mikroorganismen in einer zu untersuchenden
Probe erfordert eine Kultivierung, bei der Kolonien der Mikroorganismen
angezüchtet werden. Die in der Laborpraxis verwendeten „Bunten
Reihen” umfassen unterschiedliche Nährmedien für
die Anzüchtung, mit denen spezifische Stoffwechseleigenschaften
der Mikroorganismen erfasst werden, wodurch eine taxonomische Einordnung
der Mikroorganismen ermöglicht wird. Des Weiteren werden
die mikroskopische Morphologie von einzelnen Organismen einer Kolonie
und die Morphologie der Kolonie selber untersucht. Demgegenüber
sind seit einigen Jahren neuartige Identifizierungsverfahren bekannt,
die beispielsweise auf einer Vervielfältigung von spezifischen
Genabschnitten durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR = Polymerase
Chain Reaction) oder auf einem massenspektrometrischen Nachweis
spezifischer molekularer Zellbestandteile von Mikroorganismen beruhen.
Diese neuartigen Verfahren sind den klassischen Verfahren in Bezug
auf Spezifität, Fehlerraten und Analysedauer überlegen.
-
Die
Identifizierung von Bakterien durch massenspektrometrische Nachweisverfahren
wird in einem Übersichtsartikel von van Baar (FEMS
Microbiology Reviews, 24, 2000, 193–219: „Characterization
of bacteria by matrix-assisted laser desorption/ionisation and electrospray
mass spectrometry") ausführlich beschrieben. Die
Identifizierung erfolgt in den meisten Fällen durch eine Ähnlichkeitsanalyse
zwischen einem Massenspektrum der zu untersuchenden Probe und Referenzspektren
von bekannten Bakterien. Jedem der Referenzspektren wird durch die Ähnlichkeitsanalyse
eine Kennzahl zugeordnet, die ein Maß für die Übereinstimmung
des entsprechenden Referenzspektrums mit dem Massenspektrum der
Probe ist. Ein Bakterium oder allgemein ein Mikroorganismus wird
als in einer Probe identifiziert ausgewiesen, falls die Kennzahl
des zugeordneten Referenzspektrums beispielsweise größer
als ein festgelegter Grenzwert ist.
-
In
der Praxis hat sich bei der massenspektrometrischen Identifizierung
von Mikroorganismen ein einfaches und kostengünstiges Verfahren
durchgesetzt, das auf MALDI-Flugzeitmassenspektren (MALDI = matrix assisted
laser desorption/ionization) beruht. Die Mikroorganismen einer zu
untersuchenden Probe werden dazu üblicherweise auf einer
Agarplatte mit einem Nährmedium für einige Stunden
zu Kolonien angezüchtet, wobei angestrebt wird, dass die
gewachsenen Kolonien jeweils als Reinkultur vorliegen, also nur
einen einzigen Mikroorganismus enthalten. Ein Abstrich einer solchen
Kolonie wird in Form von intakten Zellen auf einen Probenträger übertragen
(„aufgeschmiert”) und dort mit einer üblichen
Matrixlösung für eine Ionisierung durch matrixunterstützte
Laserdesorption (MALDI) beträufelt. In der Regel zerstört
das organische Lösungsmittel, in dem die Matrixsubstanz
gelöst ist, die auf dem Probenträger übertragenen
Zellen, wodurch molekulare Zellbestandteile aus dem Zellinneren,
insbesondere lösliche Proteine, freigesetzt werden. Anschließend
verdunstet das organische Lösungsmittel und die Matrixsubstanz
kristallisiert, wobei die freigesetzten molekularen Zellbestandteile
als Analytmoleküle in die kristallisierte Matrixschicht
eingebaut werden. Die so präparierte MALDI-Probe wird in
ein Flugzeitmassenspektrometer eingeführt und dort mit
Laserpulsen beschossen, wodurch die Analytmoleküle zusammen
mit der Matrixsubstanz desorbiert und ionisiert werden. Die Ionen
der Analytmoleküle (Analytionen) werden in einem elektrischen
Feld beschleunigt und treffen nach masseabhängigen Flugzeiten
auf einen Detektor. Die mit dem Detektor gemessenen Flugzeiten werden
mittels bekannter Kalibrierungsfunktionen in Massen (genauer Masse
zu Ladungs-Verhältnissen) umgerechnet.
-
Die
Massenspektren von Mikroorganismen sind sehr spezifisch für
den jeweiligen Mikroorganismus, da sich selbst geringe genetische
Unterschiede zwischen verschiedenen Arten, Unterarten und sogar
Stämmen in den Massen der exprimierten Proteine und damit
auch in den Sig nalen des Massenspektrums wiederspiegeln. Zur Identifizierung
von Mikroorganismen wird ein Massenspektrum der Probe aufgenommen
und mit Massenspektren bekannter Mikroorganismen verglichen, die
als Referenzspektren in einer Bibliothek vorliegen. Die Ähnlichkeitsanalyse
kann visuell durch eine Person erfolgen, wird aber bevorzugt computergestützt durchgeführt.
Für den Fall, dass die Bibliothek weder ein Referenzspektrum
des Mikroorganismus selber noch dasjenige eines Mikroorganismus
derselben Art enthält (was aufgrund der enormen Anzahl
an Arten und der noch beschränkten Größe
der bisherigen Bibliotheken vorkommen kann), kann eine computergestützte Ähnlichkeitsanalyse
dennoch eine Zuordnung auf höheren taxonomischen Klassifizierungsebenen
(z. B. auf Gattungs- oder Familienebene) ermöglichen, da
für verwandte Mikroorganismen durchaus Proteine identisch
sein können. Für den Fall, dass die Bibliothek
kein Referenzspektrum des Stammes selber, aber Referenzspektren von
Stämmen dergleichen Art enthält, ist eine Identifizierung
der Art sehr wahrscheinlich.
-
Neben
der Spezifität der Massenspektren sind für den
praktischen Einsatz die Reproduzierbarkeit der Massenspektren bei
veränderten Zucht- und Probenpräparationsbedingungen
und die damit verbundene Fehlerrate von entscheidender Bedeutung.
Diesbezüglich hat sich herausgestellt, dass zwar die Intensitäten
der Signale in den Massenspektren von Mikroorganismen schwanken,
aber die Positionen (Massen) der Signale in den Massenspektren überaus
reproduzierbar sind, und zwar nahezu unabhängig vom jeweiligen
Nährmedium, den Bedingungen bei der Anzüchtung
der Kolonien und dem Alter (Reifegrad) der Kolonien. Die Fehlerrate einer
massenspektrometrischen Identifizierung ist viel geringer als diejenige
der traditionellen Identifizierungsverfahren. Es konnte gezeigt
werden, dass unter Benutzung von Bibliotheken mit vielen hundert
Arten und einigen tausend Stämme über 90% der
Mikroorganismen richtig identifiziert werden (richtig-positive Identifizierung: > 90%, richtig-negative
Identifizierung: 100%). Dabei hat sich zudem ergeben, dass die tatsächliche
Fehlerrate schwer zu bestimmen ist, da in nicht wenigen Fällen
die Mikroorganismen in den Sammlungen selber falsch identifiziert
sind. Letztendlich hilft in den fraglichen Fällen nur eine
genetische Sequenzierung, um eine zweifelsfrei richtige Identifizierung
zu erhalten.
-
Aus
der Veröffentlichung von Jarman et al. (Analytical
Chemistry, 72(6), 2002, 1217–1223: "An Algorithm
for Automated Bacterial Identification Using Matrix-Assisted Laser
Desorption/Ionization Mass Spectrometry") sind
computergestützte Verfahren für eine automatische
Erzeugung von Referenzspektren als auch für eine Ähnlichkeitsanalyse
zwischen einem Massenspektrum einer zu untersuchenden Probe und
den automatisch erzeugten Referenzspektren bekannt.
-
Die
Referenzspektren sind bei Jarman et al. nicht mehr
gemessene Massenspektren, sondern spektrale Fingerabdrücke,
die mittels eines statistischen Algorithmus aus mehreren gemessenen
Massenspektren (Wiederholungsspektren) abgeleitet werden. Ein Wiederholungsspektrum
kann auf eine technische oder eine biologische Wiederholung zurückgehen,
wobei in einer technischen Wiederholung die Mikroorganismen in der Probe
selber nicht verändert sind. Ein technisches Wiederholungsspektrum
in einem MALDI-Flugzeitmassenspektrometer ergibt sich in der Regel
schon dadurch, dass mehrere Laserpulse für ein gemessenes
Massenspektrum notwendig sind. Weitere technische Wiederholungsparameter
sind beispielsweise die Position des Laserfokus auf der Oberfläche
der Probe, die Laserenergie, die Probenmenge, die verwendete Matrix und/oder
die Art der Probenpräparation (Dried Droplet-, Dünnschicht-
und Mehrfachpräparation). Eine biologische Wiederholung
bezieht sich beispielsweise auf die Bedingungen für die
Aufzucht (Nährmedium, Temperatur) und das Alter der Kolonie.
Ein spektraler Fingerabdruck nach Jarman et al. enthält
die folgenden über die gemessenen Wiederholungsspektren
gemittelten Größen der Signale: die gemittelte
Masse, die Streuung um die gemittelte Masse, die mittlere Intensität,
die Streuung um die mittlere Intensität und die Häufigkeit
des Auftretens eines Signals in den Wiederholungsspektren. In der
Regel werden nur diejenigen Signale für einen spektralen
Fingerabdruck (Referenzspektrum) berücksichtigt, die eine
vorbestimmte Mindesthäufigkeit in den Wiederholungsspektren
aufweisen, wodurch die für eine Identifizierung störenden
Schwankungen der Signalintensitäten beseitigt werden, ohne
die Spezifität des spektralen Fingerabdruckes wesentlich
zu verringern.
-
Die Ähnlichkeitsanalyse
zwischen dem Massenspektrum einer zu untersuchenden Probe und einem der
spektralen Fingerabdrücke der Bibliothek erfolgt derart,
dass für jedes Signal des Massenspektrums eine Wahrscheinlichkeit
dafür ermittelt wird, dass es mit einem Referenzsignal
des spektralen Fingerabdruckes übereinstimmt, wobei der
Abstand zu den Referenzsignalen, aber auch deren Streuung um die
gemittelten Massen berücksichtigt werden. Aus den so ermittelten
Einzelwahrscheinlichkeiten der Signale des Massenspektrums wird
eine Kennzahl für die Übereinstimmung mit dem
spektralen Fingerabdruck (Referenzspektrum) abgeleitet. Die Referenzspektren
werden in der Regel ihrer Übereinstimmung mit dem Massenspektrum entsprechend
sortiert, und es werden die Bezeichnungen der Mikroorganismen, die
den sortierten Referenzspektren zugeordnet sind, mit den entsprechenden
Kennzahlen in einer Ergebnisliste dargestellt.
-
In
der Veröffentlichung von Jarman et al. werden
zudem in einer Blindstudie komplexe Proben hergestellt, indem 2
oder 3 bekannte Mikroorganismen aus Reinkulturen gemischt werden. Jarman
et al. zeigen, dass mit dem beschriebenen Verfahren die
in der komplexen Probe vorhandenen Mikroorganismen identifiziert werden
können, wenn als Identifizierungskriterium die Kennzahlen
der Referenzspektren größer als ein bestimmter
Grenzwert sind. Die dort verwendete Bibliothek bestand allerdings
nur aus den Referenzspektren 5 verschiedenen Mikroorganismen mit
einem geringen Verwandtschaftsgrad, so dass die Ergebnisse nur bedingt
auf die heute schon bestehenden Bibliotheksgrößen übertragbar
sind. Zudem gibt es Hinweise darauf, dass die Fehlerraten (falsch-positiv,
wie auch falsch-negativ) stark anwachsen, wenn komplexe Proben mehr als
drei verschiedene Mikroorganismen enthalten.
-
Es
besteht somit in der Laborpraxis mit umfangreichen Bibliotheken
weiterhin ein großer Bedarf, komplexe Proben sicher zu
identifizieren, um im Fall einer vermuteten Mischkultur eine zeitaufwendige
zweite Kultivierung zu vermeiden, was insbesondere in der klinischen
Diagnose von Krankheitserregern von enormer Wichtigkeit ist. Aus
der Patentanmeldung
DE 10
2007 058 516.2-54 ist des Weiteren ein Verfahren bekannt, in
dem Krankheitserreger direkt aus Körperflüssigkeiten
mittels MALDI-TOF Massenspektren identifiziert werden, was eine
erhebliche Verkürzung der Analysedauer ermöglicht.
Allerdings sind Proben, die direkt aus Körperflüssigkeiten
gewonnen werden, oft komplexe Proben mit mehr als einer Sorte von
Mikroorganismen, was deren Identifizierung erschwert.
-
Aufgabe der Erfindung
-
Die
Aufgabe der Erfindung besteht darin, mehrere Sorten von Mikroorganismen
in einer komplexen Probe mittels eines massenspektrometrischen Nachweises
sicher zu identifizieren.
-
Beschreibung der Erfindung
-
Die
Aufgabe wird durch die Patentansprüche 1, 5 und 6 gelöst.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind in den
abhängigen Patentansprüchen 2 4 sowie 7 bis 17
beschrieben.
-
Das
erfindungsgemäße Verfahren zur Identifizierung
von Mikroorganismen in einer komplexen Probe besteht darin, dass
mindestens zwei Referenzspektren von bekannten (identifizierten)
Mikroorganismen zu einem Kombinationsspektrum zusammengefasst werden
und dass die Mikroorganismen des Kombinationsspektrums als in der
Probe identifiziert ausgewiesen werden, falls das Kombinationsspektrum
eine größere Übereinstimmung mit einem
Massenspektrum der Probe aufweist als jedes der Referenzspektren
oder als jedes der mindestens zwei Referenzspektren. Der Ausdruck „Mikroorganismen
eines Kombinationsspektrums” umfasst diejenigen Mikroorganismen,
deren zugeordnete Referenzspektren zu dem Kombinationsspektrum zusammengefasst
sind. Es liegt im Rahmen der Erfindung, dass mehr als zwei Referenzspektren
zu verschiedenen Kombinationsspektren zusammengefasst werden und
dass nur die Mikroorganismen derjenigen Kombinationsspektren als
in der Probe identifiziert ausgewiesen werden, die eine größere Übereinstimmung
mit dem Massenspektrum der Probe aufweisen als jedes der Referenzspektren
oder als jedes ihrer jeweiligen Referenzspektren. Ein weiteres Kriterium
für eine Identifizierung kann darin bestehen, dass die
Kennzahl eines Kombinationsspektrums, die die Übereinstimmung
des Kombinationsspektrums mit dem Massenspektrum der Probe angibt,
größer als ein festgelegter Grenzwert ist.
-
In
der Regel unterscheiden sich mindestens zwei Mikroorganismen jedes
Kombinationsspektrums hinsichtlich ihrer Art, Gattung und/oder einer
höheren taxonomischen Hierarchieebene.
-
Mit
dem erfindungsgemäßen Verfahren können
Mikroorganismen in komplexen Proben sicher identifiziert werden,
was die Analysedauer für eine wahrscheinlich oder tatsächlich
vorliegende Mischkultur erheblich verringert, da auf eine zweite
Kultivierung verzichtet werden kann. Es können beispielsweise
auch direkt aus Körperflüssigkeiten gewonnene
Proben sicher identifiziert werden, bei denen das Vorliegen einer
Mischkultur prinzipiell zu vermuten ist bzw. nicht ausgeschlossen
werden kann.
-
Die
im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Referenzspektren
sind Massenspektren bekannter Mikroorganismen, die in der Regel
in einer rechnergestützten Datenbank gespeichert werden.
Der Begriff „Massenspektrum” umfasst sowohl gemessene
als auch bearbeitete Massenspektren, wobei die Bearbeitung etwa
eine Aufsummierung von Wiederholungsspektren, eine Korrektur des
Untergrundes, eine Kalibrierung der Massenachse oder eine Rauschunterdrückung
umfassen kann. Ein Massenspektrum im Sinne der Erfindung ist auch
eine so genannte Peakliste, die nur die in einem Massenspektrum
vorkommenden Signale und deren Massen enthält, oder ein
aus dem Stand der Technik bekannter spektraler Fingerabdruck, der
aus Wiederholungsspektren ermittelt wird und eine reduzierte Anzahl
von für den jeweiligen Mikroorganismus spezifischen Signalen
aufweist. Ein bekannter Mikroorganismus ist in die taxonomischen
Hierarchieebenen eingeordnet, wobei in der Regel nicht nur die Art,
sondern auch eine eindeutige Stammbezeichnung angegeben wird. Ein
Referenzspektrum kann aufgrund seiner hohen Spezifität
oft als Stellvertreter des zugeordneten Mikroorganismus betrachtet
werden.
-
Das
Zusammenfassen von Referenzspektren zu einem Kombinationsspektrum
kann etwa durch eine Mittlung oder eine gewichtete Mittelung der
Referenzspektren erfolgen. Die Gewichtung der Referenzspektren kann
iterativ so optimiert werden kann, dass eine möglichst
große Übereinstimmung zwischen dem Kombinationsspektrum
und dem Massenspektrum der Probe erzielt wird. Liegen die Referenzspektren
als Listen (z. B. als Peaklisten) vor, so können die Listen
vereinigt und nach Massen sortiert werden. Für den Fall,
dass in den Listen die Massen einiger Signale übereinstimmen
oder die Massen innerhalb eines vorbestimmten Toleranzbereiches
zusammenfallen, können diese „identischen” Signale
in dem Kombinationsspektrum jeweils zu einem Signal zusammengefasst
werden. Für den Fall, dass die Referenzspektren die aus
dem Stand der Technik bekannten spektralen Fingerabdrücke
sind, kann ein Kombinationsspektrum so erzeugt werden, dass der statistische
Algorithmus, mit dem ein spektraler Fingerabdruck berechnet wird,
auf alle Wiederholungsspektren der zusammenzufassenden Referenzspektren
gemeinsam angewendet wird oder dass die korrespondierenden gemittelten
Größen der zusammenzufassenden Referenzspektren
selber gemittelt werden. Die Anzahl der Signale in einem Kombinationsspektrum
ist dabei größer als die Anzahl der Signale in
jedem einzelnen der Referenzspektren, die zu dem Kombinationsspektrum
zusammengefasst werden.
-
Das
erfindungsgemäße Verfahren wird bevorzugt in einen
hierarchischen Ablauf eingebunden, in dem in einem ersten Schritt
eine aus dem Stand der Technik bekannte Ähnlichkeitsanalyse
durchgeführt wird und das erfindungsgemäße
Verfahren anschließend zur sicheren Identifizierung eingesetzt
wird, falls nach der ersten Ähnlichkeitsanalyse eine Mischkultur
von Mikroorganismen zu vermuten ist, die sich taxonomisch unterscheiden,
z. B. in ihrer Art oder Gattung. In dem hierarchischen Verfahren
werden zuerst alle Referenzspektren der bekannten Mikroorganismen
mit einem Massenspektrum der zu untersuchenden Probe verglichen,
woraus sich eine Rangfolge der Referenzspektren bezüglich
ihrer Übereinstimmung mit dem Massenspektrum der Probe
ergibt. Aus der Rangfolge wird eine Teilmenge der „besten” Referenzspektren
(Bestmenge) ermittelt.
-
Die
Bestmenge ist dabei allgemein so festgelegt, dass die Referenzspektren
der Bestmenge besser mit dem Massenspektrum der Probe als die restlichen
(nicht in der Bestmenge enthaltenen) Referenzspektrum übereinstimmen.
Die Bestmenge kann nach der Ähnlichkeitsanalyse des ersten
Schrittes durch einen Anwender aus der Rangfolge der Referenzspektren
ausgewählt werden. Dazu werden in der Regel die Bezeichnungen
der Mikroorganismen, die den Referenzspektren zugeordnet sind, jeweils
zusammen mit einer Kennzahl, die die Übereinstimmung des
entsprechenden Referenzspektrums mit dem Massenspektrum der Probe
angibt, in einer nach der Kennzahl sortierten Liste dargestellt.
Die Bestmenge kann auch automatisch ermittelt werden, beispielsweise
derart, dass sie aus einer festgelegten Anzahl der besten Referenzspektren
der Rangfolge besteht. Die Bestmenge kann etwa aus den besten 3
bis 20 Referenzspektren der Rangfolge oder aus den besten 0.01%
bis 0.1% der Rangfolge bestehen. Eine weitere automatische Möglichkeit,
die Bestmenge zu ermitteln, besteht darin, nur diejenigen Referenzspektren
in der Bestmenge zu berücksichtigen, deren Kennzahl größer
als ein festgelegter Grenzwert ist, wodurch die Referenzspektren
der Bestmenge eine hinreichende Übereinstimmung mit dem
Massenspektrum der Probe aufweisen.
-
In
einem zweiten Schritt werden mindestens zwei Referenzspektren der
Bestmenge zu einem Kombinationsspektrum zusammengefasst, wobei sich
zumindest zwei Mikroorganismen des Kombinationsspektrums taxonomisch
unterscheiden. Falls sich die Mikroorganismen der Bestmenge taxonomisch
nicht unterscheiden, wird das Verfahren abgebrochen, da keine Mischkultur
zu vermuten ist.
-
In
einem dritten Schritt werden die Mikroorganismen des Kombinationsspektrums
als in der Probe identifiziert ausgewiesen, falls das Kombinationsspektrum
eine größere Übereinstimmung mit dem
Massenspektrum der Probe aufweist als jedes der Referenzspektren
der Bestmenge oder als jedes der mindestens zwei Referenzspektren.
-
Es
liegt im Rahmen der Erfindung, dass in dem hierarchischen Verfahren
mehr als zwei Referenzspektren der Bestmenge zu verschiedenen Kombinationsspektren
zusammengefasst werden, wobei sich zumindest zwei Mikroorganismen
jedes Kombinationsspektrums taxonomisch unterscheiden, und dass
die Mikroorganismen derjenigen Kombinationsspektren als in der Probe
identifiziert ausgewiesen werden, die eine größere Übereinstimmung
mit dem Massenspektrum der Probe aufweisen als jedes ihrer jeweiligen
Referenzspektren. Andererseits können auch nur die Mikroorganismen
derjenigen Kombinationsspektren als in der Probe identifiziert ausgewiesen
werden, die eine größere Übereinstimmung
mit dem Massenspektrum der Probe aufweisen als jedes der Referenzspektren
der Bestmenge oder deren Kennzahl größer als ein
festgelegter Grenzwert ist. Die Referenzspektren der Bestmenge werden
bevorzugt paarweise zu den verschiedenen Kombinationsspektren zusammengefasst.
Die taxonomischen Unterschiede der Mikroorganismen, deren Referenzspektren
zu einem Kombinationsspektrum zusammengefasst sind, beziehen sich
bevorzugt auf ihre Art und/oder ihre Gattung.
-
Für
den Fall, dass bestimmte Mikroorganismen häufig zusammen
in Proben vorkommen, können auch die Kombinationsspektren
der entsprechenden Mikroorganismen als Referenzspektren in einer
Datenbank gespeichert werden, wobei die Kennzahlen der gespeicherten
Kombinationsspektren, die sich aus einer Ähnlichkeitsanalyse
mit einem Massenspektrum einer zu untersuchenden Probe ergeben,
als Kriterium für die Identifizierung der Mikroorganismen
oder als Kriterium für das Vorliegen einer Mischkultur
verwendet werden können.
-
Es
gibt zudem ein weiteres erfindungsgemäßes Verfahren,
Mikroorganismen in komplexen Proben zu identifizieren. Dazu wird
mindestens ein Referenzspektrum von dem Massenspektrum einer zu
untersuchenden Probe abgezogen, also ein Differenzspektrum anstelle
eines Kombinationsspektrums erzeugt. Das Differenzspektrum wird
mit den Referenzspektren verglichen. Ein Mikroorganismus wird nur
dann als identifiziert ausgewiesen, falls dessen Referenzspektrum
hinreichend mit dem Differenzspektrum übereinstimmt, also
beispielsweise die Kennzahl des Differenzspektrums größer
als ein festgelegter Grenzwert ist. Um mehr als einen Mikroorganismus
in einer Probe zu identifizieren, werden verschiedene Differenzspektren
erzeugt und diejenigen Mikroorganismen als in der Probe identifiziert
ausgewiesen, deren Referenzspektren hinreichend mit einem der Differenzspektren übereinstimmen.
Die für die Erzeugung der Differenzspektren verwendeten
Referenzspektren können analog zu dem oben beschriebenen
hierarchischen Ablauf aus einer Bestmenge ausgewählt werden.
-
Wie
bereits im Stand der Technik ausgeführt, hat sich in der
Praxis der massenspektrometrische Nachweis mittels MALDI-Flugzeitmassenspektren
etabliert. Neben der Ionisierung durch matrixunterstützte
Laserdesorption sind aber prinzipiell auch andere Ionisierungsarten
für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet, z.
B. die Ionisierung durch Elektrosprühen (ESI = electro-spray
ionization) oder Desorptionsverfahren mit anschließender
chemischer Ionisierung (CI = chemical ionization). Zudem lassen
sich unterschiedliche Arten von Massenanalysatoren einsetzen, z.
B. Flugzeitmassenspektrometer mit axialem oder orthogonalem Ioneneinschuss,
Ionenfallenmassenspektrometer oder Quadrupolfilter.
-
Beschreibung der Abbildungen
-
Die 1 zeigt
eine schematische Darstellung eines ersten erfindungsgemäßen
Verfahrens zur Identifizierung von Bakterien in komplexen Proben
mit den Verfahrensschritten S0, S11 und S12.
-
Die 2 zeigt
eine schematische Darstellung eines zweiten erfindungsgemäßen
Verfahrens mit einem hierarchischen Verfahrensablauf und den Verfahrensschritten
S0, S21, S22, S23 und S24.
-
Die 3 zeigt
ein normiertes gemessenes MALDI-Flugzeitmassenspektrum (10)
einer zu untersuchenden Probe und eine daraus ermittelte Peakliste
(20) im Massenbereich zwischen 3.000 und 12.000 Dalton.
-
Die 4A und 4B zeigen
zwei Referenzspektren (30) bzw. (40) einer Bestmenge
(REFB), die beide hinreichend mit dem ebenfalls
dargestellten Massenspektrum (20) der Probe übereinstimmen,
um die entsprechenden Mikroorganismen (3A:
Pseudomonas aeruginosa; 3B: Proteus
mirabilis) als in der Probe identifiziert auszuweisen. Die Mikroorganismen
unterscheiden sich ab ihrer taxonomischen Ordnung voneinander.
-
Die 5 zeigt
das Massenspektrum der Probe (20) und ein Kombinationsspektrum
(50) von zwei Referenzspektren der Bestmenge (REFB), wobei das eine Referenzspektrum von einem
Mikroorganismus der Art „Pseudomonas aeruginosa” und
das andere Referenzspektrum von einem Mikroorganismus der Art „Proteus
mirabilis” stammt.
-
Die 6 zeigt
eine schematische Darstellung eines dritten erfindungsgemäßen
Verfahren, das aus den Verfahrensschritten S0, S31 und S32 besteht
und in dem Differenzspektren statt Kombinationsspektren zur Identifizierung
von Mikroorganismen in komplexen Proben eingesetzt werden.
-
Bevorzugte Ausführungsbeispiele
-
Die 1 zeigt
eine schematische Darstellung eines bevorzugten Verfahrens zur Identifizierung
von Bakterien in komplexen Proben. Im Verfahrensschritt S0 wird
nach der Kultivierung einer zu untersuchenden Probe ein MALDI-Flugzeitmassenspektrum
der Probe (MS) aufgenommen. Im Verfahrenschritt S11 werden mindestens
zwei Referenzspektren (REF) einer Datenbank (DB) zu einem Kombinationsspektrum
zusammengefasst oder es wird ein vorher in der Datenbank (DB) gespeichertes
Kombinationsspektrum (KS*) ausgewählt. Im Verfahrenschritt
S12 werden die Mikroorganismen des erzeugten bzw. ausgewählten
Kombinationsspektrums (KS) nur dann als in der Probe identifiziert
ausgewiesen (ID), falls das Kombinationsspektrum (KS) eines der
oben genannten Kriterien erfüllt, also beispielsweise eine
größere Übereinstimmung mit dem Massenspektrum
der Probe (MS) als diejenigen Referenzspektren aufweist, aus denen
das Kombinationsspektrum (KS) erzeugt worden ist. Ansonsten werden
die entsprechenden Mikroorganismen des Kombinationsspektrums (KS)
als nicht identifiziert ausgewiesen (NO ID).
-
Die 2 zeigt
eine schematische Darstellung eines besonders bevorzugten hierarchischen
Verfahrensablaufes zur Identifizierung von Mikroorganismen in komplexen
Proben, der aus den im Folgenden beschriebenen Verfahrenschritten
S0 und S21 bis S24 besteht.
-
Im
Verfahrensschritt S0 wird eine zu untersuchende Probe auf eine mit
Nährmedium versetzte Agarplatte ausgestrichen, auf der
die in der Probe enthaltenen Mikroorganismen in etwa sechs bis zwanzig
Stunden zu Kolonien heranwachsen. Nach dieser Kultivierung wird
eine Teilmenge einer Kolonie mit einer Öse auf einen massenspektrometrischen
Probenträger übertragen („aufgeschmiert”).
Im Gegensatz zu den bisher eingesetzten Identifizierungsverfahren
müssen die Mikroorganismen nicht als Reinkulturen in sauber
getrennten Kolonien vorliegen, sondern es dürfen verschiedene
Mikroorganismen in der zu untersuchende Probe vorhanden sein. Der
Probenträger weist meist eine Vielzahl von räumlich
getrennten Probenstellen auf, auf die jeweils eine von mehreren
auf der Agarplatte gewachsenen Kolonien übertragen werden.
Eine auf den Probenträger aufgeschmierte Teilmenge einer
Kolonie wird mit einer Lösung einer üblichen Matrixsubstanz
für eine Ionisierung durch matrixunterstützte
Laserdesorption (MALDI) versetzt. In der Regel dringt das organische
Lösungsmittel in die übertragenen Zellen ein und
zerstört diese. Anschließend verdunstet das Lösungsmittel
und die gelöste Matrixsubstanz kristallisiert, wobei die
bei der Zerstörung freigesetzten molekularen Zellbestandteile, insbesondere
lösliche Proteine, als Analytmoleküle in die Matrixkristalle
eingebaut werden.
-
Die
Matrixkristalle und die darin eingebauten Analytmoleküle
werden in einem Flugzeitmassenspektrometer mit Laserlichtpulsen
beschossen, wodurch Analytmoleküle zusammen mit der Matrixsubstanz
desorbiert und ionisiert werden. Die so erzeugten Analytionen werden
im Flugzeitmassenspektrometer aufgrund der massenabhängigen
Flugzeit zeitlich aufgetrennt und in einem Detektor nachgewiesen.
Die gemessenen Flugzeiten der Ionen werden danach in ein Massen
umgerechnet. Dabei ist zu beachten, dass die Analytionen weitgehend
Proteinionen sind, die nach der Ionisierung durch den MALDI-Prozess überwiegend
als einfach geladene Ionen vorliegen (Ladungszahl z = 1), weshalb
hier einfach von der Masse m der Analytionen gesprochen werden kann,
statt den korrekten Begriff der „ladungsbezogenen Masse” m/z
zu verwenden.
-
Die
Flugzeitmassenspektrometer werden bei der Identifizierung von Mikroorganismen
aus Gründen des hohen Nachweisvermögens ohne Reflektor
betrieben (linearer Betriebsmodus), obwohl die Massenauflösung
und die Massenrichtigkeit bei Verwendung eines Reflektors deutlich
besser sind. Im Reflektorbetrieb erscheinen aber nur etwa ein Zwanzigstel
der Ionensignale, und das Nachweisvermögen ist um ein bis
zwei Zehnerpotenzen schlechter. Die hohe Empfindlichkeit beruht
darauf, dass im linearen Betrieb nicht nur die stabilen Analytionen
nachgewiesen werden, sondern auch Fragmentionen aus metastabilen
Zerfällen der Analytionen. Mit den als Detektor verwendeten
Sekundärelektronenverstärkern (SEV) werden neben
den Analyt- und Fragmentionen sogar diejenigen Neutralteilchen nachgewiesen,
die während der Flugzeit aus Ionenzerfällen entstanden
sind, da auch diese Neutralteilchen beim Aufprall auf den SEV Sekundärelektronen
erzeugen. Alle Fragmentionen und Neutralteilchen einer Mutterionensorte
haben die Geschwindigkeit der Mutterionen, aus denen sie entstanden
sind, und erreichen daher den Detektor gleichzeitig mit ihren Mutterionen,
was zu einem erhöhten Ionensignal führt. Das erhöhte
Nachweisvermögen ist für die Identifizierung von
Mikroorganismen oft so entscheidend, dass man die Nachteile des
linearen Betriebsmodus in Kauf nimmt. Für diese Anwendung erhöht
man sogar die Energie des desorbierenden und ionisie renden Laserpulse,
was zu einer erhöhten Ausbeute an Analytionen führt,
aber die Anzahl an Fragmentionen steigert, was aber hier aus den
genannten Gründen nicht stört.
-
Die
Aufnahme eines Massenspektrums mit Flugzeitmassenspektrometern erfordert
in der Regel die Aufnahme vieler Einzelspektren, die jeweils auf
einen einzelnen Laserpuls zurückgehen und die üblicherweise durch
Addition flugzeitgleicher Messpunkte zu einem Summenspektrum addiert
werden. Im Allgemeinen besteht ein Summenspektrum aus einigen Hundert
Einzelspektren, die in modernen Flugzeitmassenspektrometern in wenigen
Sekunden aufgenommen. Ein solches Summenspektrum wird in der Regel
weiter bearbeitet, beispielsweise wird die Flugzeit der Messpunkte
in eine Masse umgerechnet (Kalibrierung), der Untergrund korrigiert
und das Rauschen im Massenspektrum herausgefiltert. Aus dem bearbeiteten
Summenspek-trum wird in der Regel eine Peakliste erstellt.
-
In
der oberen Hälfte der 3 ist ein
gemessenes MALDI-Flugzeitmassenspektrum (Summenspektrum (10))
einer zu untersuchenden Probe dargestellt, das auf den Wert 1 normiert
worden ist. In der unteren Hälfte der 3 ist
die Peakliste (20) des Summenspektrums (10) dargestellt,
die nur die Signale des Summenspektrums (10) enthält
und dadurch gegenüber dem Summenspektrum (10)
einen wesentlich geringeren Speicherbedarf aufweist. Die Massenachse
reicht in der 3 von 3.000 bis 12.000 Dalton.
Die für die Identifizierung von Mikroorganismen eingesetzten
Flugzeitmassenspektren werden derzeit meistens in einem Massenbereich
von etwa 2.000 Dalton bis 20.000 Dalton aufgenommen, wobei die Signale
im unteren Massenbereich bis etwa 2.500 Dalton nicht gut verwertbar
sind. Die Signale im unteren Massenbereich gehen bei einer Ionisierung
durch den MALDI-Prozess vorwiegend auf Ionen der Matrixsubstanz
und deren Cluster zurück, aber auch auf solche molekularen
Zellbestandteile, die gegenüber Aufzucht- und Präparationsbedingungen veränderlich
und die dadurch nicht für eine sichere Identifizierung
geeignet sind. Die besten Identifizierungsergebnisse erhält
man, wenn nur die Signale im Massenbereich zwischen etwa 3.000 bis
15.000 Dalton ausgewertet werden.
-
Im
Verfahrensschritt S21 wird ein gemessenes Massenspektrum (MS), hier
die aus dem Summenspektrum (10) erzeugte Peakliste (20),
mit Referenzspektren (REF) verglichen, die in einer Datenbank (DB) als
Peaklisten gespeichert sind. Die Referenzspektren (REF) werden jeweils
aus Reinkulturen (Isolaten) von bekannten, bereits identifizierten
Mikroorganismen ermittelt. Eine kommerzielle Datenbank für
die Identifizierung von Mikroorganismen enthält heutzutage
Referenzspektren von einigen tausend verschiedenen Mikroorganismen.
-
In
der Tabelle 1 sind die Gattungs-, Art- und Stammbezeichnungen von
denjenigen zwanzig Mikroorganismen dargestellt, deren Referenzspektren
am besten mit dem Massenspektrum der Probe (MS), also der Peakliste
(
20), übereinstimmen. Tabelle 1:
| 1 | Pseudomonas
aeruginosa 8147_2_CHB | 2.373 |
| 2 | Pseudomonas
aeruginosa DSM 50071T HAM | 2.325 |
| 3 | Proteus
mirabilis DSM 50903_DSM | 2.257 |
| 4 | Pseudomonas
aeruginosa ATCC 27853_CHB | 2.208 |
| 5 | Pseudomonas
aeruginosa 19955_1 CHB | 2.189 |
| 6 | Pseudomonas
aeruginosa ATCC 27853 THL | 2.187 |
| 7 | Proteus
mirabilis 13210 1_CHB | 2.185 |
| 8 | Proteus
mirabilis (PX) 22086112_MLD | 2.090 |
| 9 | Proteus
mirabilis 9482_2 CHB | 2.085 |
| 10 | Proteus
mirabilis DSM 18254_DSM | 2.084 |
| 11 | Proteus
mirabilis 22086103_MLD | 2.071 |
| 12 | Proteus
mirabilis DSM 30115_DSM | 2.064 |
| 13 | Proteus
mirabilis DSM 46227_DSM | 2.059 |
| 14 | Proteus
mirabilis DSM 788_DSM | 2.028 |
| 15 | Pseudomonas
jinjuensis LMG 21316 HAM | 1.671 |
| 16 | Proteus
penneri DSM 4544_DSM | 1.556 |
| 17 | Pseudomonas
resinovorans LMG 2274 HAM | 1.426 |
| 18 | Proteus
vulgaris DSM 13387 HAM | 1.422 |
| 19 | Serratia
rubidaea DSM 46275 DSM | 1.299 |
| 20 | Proteus
vulgaris (PX) 22086129_MLD | 1.283 |
| ... | | |
-
Die
Kennzahl in der rechten Spalte der Tabelle 1 ist ein logarithmisches
auf den maximalen Wert 3 normiertes Maß für die Übereinstimmung
mit der Peakliste (20). Eine Kennzahl zwischen 2.3 und
3 ist ein Kriterium für eine sehr wahrscheinliche Identifizierung
der Art (Spezies). Bei einer Kennzahl zwischen 2.0 und 2.3 wird
von einer sicheren Identifizierung der Gattung und einer wahrscheinlichen
Identifizierung der Art ausgegangen. Der Wertebereich zwischen 1.7
und 2.0 ermöglicht noch eine wahrscheinliche Identifizierung
der Gattung, während unterhalb eines Wertes von 1.7 keine
zuverlässige Identifizierung vorliegt.
-
In
diesem Ausführungsbeispiel werden die ersten zehn Mikroorganismen
der Tabelle 1 manuell ausgewählt. Die Referenzspektren
der so ausgewählten Mikroorganismen bilden die Bestmenge
von Referenzspektren (REFB), die in den
beiden folgenden Verfahrensschritten S22 und S23 untersucht bzw.
verwendet werden. Die restlichen Referenzspektren (REFR)
der Datenbank werden in den nachfolgenden Verfahrensschritten nicht
weiter berücksichtigt.
-
Im
Verfahrensschritt S22 wird untersucht, ob sich die ausgewählten
Mikroorganismen der Bestmenge hinsichtlich ihrer Art, Gattung und/oder
einer höheren taxonomischen Hierarchieebene unterscheiden.
Falls die ausgewählten Mikroorganismen alle nur verschiedene
Stämme der gleichen Art sind, wird das Verfahren abgebrochen.
Ansonsten wird das Verfahren mit den Verfahrensschritten S23 und
S24 fortgesetzt.
-
Die
ausgewählten Mikroorganismen gehören beide der
taxonomischen Klasse „Gammaproteobacteria” an,
unterscheiden sich aber bereits auf der taxonomischen Ordnungsebene
(Pseudomonadales bzw. Enterobacteriales) voneinander. Die Bestmenge
enthält fünf Referenzspektren von Mikroorganismen
der Art „Pseudomonas aeruginosa” und fünf
Referenzspektren von Mikroorganismen der Art „Proteus mirabilis”,
wobei selbst der „beste” Mikroorganismus aus der
Bestmenge (Pseudomonas aeruginosa 8147_2_CHB) eine Kennzahl aufweist,
die nur wenig größer als 2.3 ist. Pseudomonas
aeruginosa ist ein gramnegatives Oxidase-positives Bakterium der
Gattung Pseudomonas (Familie: Pseudomonadaceae, Ordnung: Pseudomonadales).
Das weit verbreitete Bakterium kommt in feuchten Milieus vor und
spielt als Krankheitserreger bei den zunehmenden und nicht selten
lebensbedrohenden Krankenhausinfektionen eine bedeutende Rolle,
da es durch seinen Stoffwechsel und seine Zellmembranstruktur Mehrfachresistenzen
gegenüber Antibiotika aufweist. Proteus mirabilis ist ein
gramnegatives stabförmiges Bakterium der Gattung Proteus
(Familie: Enterobacteriaceae, Ordnung: Enterobacteriales). Das Bakterium
ist ein fakultativ pathogener Krankheitserreger, der auch bei gesunden
Menschen häufig im Dickdarm vorkommt, aber nicht notwendigerweise
Krankheiten verursacht. Allerdings kann es bei immungeschwächten
Personen zusätzliche Krankheitsbilder auslösen,
wobei eine Therapie durch Antibiotika in der Regel erfolgreich ist.
-
Die 4A und 4B zeigen
das Referenzspektrum von „Pseudomonas aeruginosa 8147_2_CHB” (30)
bzw. von „Proteus mirabilis DSM 50903_DSM” (40)
jeweils im Vergleich mit der Peakliste (20) der zu untersuchenden
Probe. Die beiden Referenzspektren (30) und (40)
weisen die höchsten Kennzahlen ihrer jeweiligen Art auf
(siehe Zeilen 1 und 3 in Tabelle 1). In den 4A und 4B sind
jeweils diejenigen Signale der Peakliste (20) mit einem
Fragezeichen annotiert, die nicht im Referenzspektrum (30)
bzw. im Referenzspektrum (40) vorkommen. Während
beispielsweise das Signal (21) der Peakliste (20)
im Referenzspektrum (30) als Signal (31) vorhanden
ist, gibt es für das Signal (22) keine Entsprechung
im Referenzspektrum (30). Das Referenzspektrum (40)
weist demgegenüber ein Signal (42) auf, das mit
dem Signal (22) zusammenfällt. Die beiden Referenzsignale
(30) und (40) scheinen sich zumindest bezüglich
der Signale (21) und (22) zu ergänzen,
was auf eine Mischkultur hindeutet und die Vielzahl der annotierten
Signale in den 4A und 4B erklären
könnte.
-
Bei
einer derartigen Probe, in der ein weitverbreiteter pathogener Krankheitserreger
von Krankenhausinfektionen neben einem nur fakultativ pathogenen
Krankheitserreger in der Ergebnisliste enthalten ist, ist eine sichere
und schnelle Identifizierung besonders wichtig, um eine erfolgreiche
Therapie sicherzustellen.
-
Im
Verfahrensschritt S23 werden die Referenzspektren der Bestmenge
(REF
B) jeweils paarweise zu verschiedenen
Kombinationsspektren (KS) zusammengefasst, wobei eines der zusammengefassten
Referenzspektrum der einen Art und das andere Referenzspektrum der
anderen Art angehört. Aus den 10 Referenzspektren (5× „Pseudomonas
aeruginosa”, 5× „Proteus mirabilis”)
werden insgesamt 25 (5 × 5) Kombinationsspektren (KS) gebildet,
die Wiederum mit der Peakliste (
20) verglichen werden.
Die Tabelle 2 zeigt der Übersichtlichkeit halber nur die
besten 10 der 25 Paare von Mikroorganismen mit den Kennzahlen des
entsprechenden Kombinationsspektrums. Tabelle 2:
| 1 | Pseudomonas
aeruginosa DSM 50071T HAM + Proteus mirabilis 13210 1_CHB | 2.640 |
| 2 | Pseudomonas
aeruginosa DSM 50071T HAM + Proteus mirabilis 9482_2 CHB | 2.575 |
| 3 | Pseudomonas
aeruginosa DSM 50071T HAM + Proteus mirabilis DSM 50903_DSM | 2.565 |
| 4 | Pseudomonas
aeruginosa ATCC 27853_CHB + Proteus mirabilis 13210 1_CHB | 2.565 |
| 5 | Pseudomonas
aeruginosa DSM 50071T HAM + Proteus mirabilis DSM 18254_DSM | 2.559 |
| 6 | Pseudomonas
aeruginosa 8147_2_CHB + Proteus mirabilis 13210 1_CHB | 2.549 |
| 7 | Pseudomonas
aeruginosa 8147_2_CHB + Proteus mirabilis 9482_2 CHB | 2.547 |
| 8 | Pseudomonas
aeruginosa ATCC 27853_CHB + Proteus mirabilis 9482_2 CHB | 2.545 |
| 9 | Pseudomonas
aeruginosa ATCC 27853_CHB + Proteus mirabilis DSM 50903_DSM | 2.533 |
| 10 | Pseudomonas
aeruginosa 8147_2_CHB + Proteus mirabilis DSM 50903_DSM | 2.513 |
| ... | | |
-
Die 5 zeigt
die Peakliste (20) und das Kombinationsspektrum (50),
das aus den Referenzspektren von „Pseudomonas aeruginosa
DSM 50071T HAM” und ”Proteus mirabilis 13210 1_CHB” zusammengefasst
ist. Das Kombinationsspektrum (50) weist die beste Übereinstimmung
aller 25 Kombinationsspektren (KS) auf und hat eine Kennzahl, die
deutlich größer als 2.3 ist. Entsprechend ist
die Anzahl von nicht übereinstimmenden Signalen, die in
der Peakliste (20) mit einem Fragezeichen annotiert sind,
gegenüber den besten Referenzspektren (30) und
(40) deutlich geringer.
-
Im
abschließenden Verfahrensschritt S24 wird jedes der 25
Kombinationsspektren (KS) daraufhin untersucht, ob es eine größere Übereinstimmung
mit der Peakliste (20) aufweist als die beiden Referenzspektren (REFB), aus denen es zusammengefasst worden ist.
Falls dem so ist, werden die entsprechenden Mikroorganismen des
Kombinationsspektrums (KS) als in der Probe identifiziert ausgewiesen
(ID). Ansonsten wird die Probe als nicht identifizierbar vermerkt
(NO ID). Es zeigt sich, dass hier das oben genannte Kriterium für
eine Identifizierung erfüllt ist, so dass die beiden Arten „Pseudomonas
aeruginosa” und ”Proteus mirabilis” als
identifiziert ausgewiesen werden. Dabei ist zu beachten, dass die
Kennzahlen aller Kombinationsspektren (KS) größer
als 2.3 sind, was zusätzlich für eine sehr wahrscheinliche
Identifizierung der beiden Arten spricht. Bei einem Verglich der
Tabellen 1 und 2 fällt auf, dass das Kombinationsspektrum
aus den beiden besten Referenzspektren der beiden Arten (Einträge
1 und 3 in Tabelle 1) nicht die größte Kennzahl
aufweist, sondern in der Rangfolge nur an zehnter Stelle steht.
-
Es
liegt im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die Referenzspektren
der Bestmenge auf andere Arten festgelegt und anders zu einem Kombinationsspektrum
oder zu mehreren Kombinationsspektren zusammengefasst werden können.
Auch das in diesem Ausführungsbeispiel angewendete Kriterium
zur Identifizierung der Mikroorganismen ist nur eine bevorzugte
Möglichkeit.
-
Die 6 zeigt
eine schematische Darstellung eines weiteren bevorzugten Verfahrens
im Sinne der vorliegenden Erfindung. Der Verfahrensschritt S0 entspricht
dem aus den 1 und 2. Im Verfahrensschritt
S31 wird ein Differenzspektrum (DS) erzeugt, indem mindestens ein
Referenzspektrum (REF) einer Datenbank (DB) von dem Massenspektrum
(MS) abgezogen wird. Das Differenzspektrum wird im Verfahrensschritt
S32 mit den Referenzspektren (REF) verglichen und daraufhin untersucht,
ob es mit einem der Referenzspektren (REF) soweit übereinstimmt,
dass der entsprechende Mikroorganismus sicher identifiziert werden
kann.
-
Die
erfindungsgemäßen Merkmale in der Beschreibung
der Erfindung, in den Ausführungsbeispielen und in den
Abbildungen können jeweils einzeln oder zu mehreren in
Kombination angewendet werden, um die Aufgabe zu lösen.
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
Diese Liste
der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert
erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information
des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen
Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt
keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
-
Zitierte Patentliteratur
-
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - FEMS Microbiology
Reviews, 24, 2000, 193–219: „Characterization
of bacteria by matrix-assisted laser desorption/ionisation and electrospray
mass spectrometry” [0005]
- - Jarman et al. (Analytical Chemistry, 72(6), 2002, 1217–1223: ”An
Algorithm for Automated Bacterial Identification Using Matrix-Assisted
Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry”) [0009]
- - Jarman et al. [0010]
- - Jarman et al. [0010]
- - Jarman et al. [0012]
- - Jarman et al. [0012]