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Die
Erfindung betrifft die Identifizierung von Mikroben anhand ihrer
Massenspektren durch Ähnlichkeitsvergleiche mit Referenzspektren
in Spektrenbibliotheken.
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Die
Erfindung stellt ein zweistufiges Verfahren bereit, mit dem die
Mikroben auf der Ebene der Arten (Species) oder Unterarten (Subspecies)
identifiziert werden können, auch wenn diese sehr ähnliche
Referenzspektren aufweisen. Nach einer ersten Ähnlichkeitsanalyse
durch Berechnung von Maßzahlen für die Ähnlichkeit
zwischen den Referenzspektren und dem Spektrum der Mikrobenprobe
werden in einer zweiten Stufe für eine ausgewählte
Gruppe von Referenzspektren, die dem Mikrobenspektrum alle sehr ähnlich
sind, vorübergehend neue Referenzspektren erstellt. Deren
Masseneinträge werden mit Differenzierungsgewichten versehen,
die bestimmen, wie stark das Massensignal in die Ähnlichkeitsanalyse
eingeht. Die Differenzierungsgewichte werden durch Vergleiche der
ausgewählten Referenzspektren untereinander gewonnen und
betonen ihre Unterschiede. Diese neuen Referenzspektren mit neu
berechneten Differenzierungsgewichten führen in der Regel
in einer zweiten Ähnlichkeitsanalyse zu einer weitaus klareren
Identifizierung, indem sich eine der Maßzahlen für
die Ähnlichkeit mit dem Mikrobenspektrum über
die anderen deutlich hinaushebt. Zwischen den beiden Stufen kann
eine Prüfung auf eine bereits ausreichende Identifizierung
eingeschaltet werden. Die neuen Referenzspektren werden nur vorübergehend
erzeugt, bleiben also nicht dauernd gespeichert, um die Bibliothek
der Referenzspektren nicht zu verändern, was besonders
für validierte Bibliotheken, die beispielsweise in Verfahren
mit IVD-CE-Zertifizierung benutzt werden, wesentlich ist.
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Stand der Technik
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Die
schnelle und fehlerfreie Identifizierung von Mikroorganismen spielt
insbesondere in der klinischen und außerklinischen Infektionsdiagnostik,
in der Hygieneüberwachung in Krankenhäusern oder Badegewässern,
aber auch in der Lebensmittelanalytik, bei der Überwachung
und Regelung von biotechnologischen Prozessen oder in der forschenden Mikrobiologie
eine wichtige Rolle. Zu den Mikroorganismen, die auch als Mikroben
bezeichnet werden, zählen alle mikroskopisch kleinen Lebewesen,
beispielsweise einzellige Pilze (z. B. Hefen), Algen, oder Protozoen
(z. B. Plasmodien als Malaria-Erreger), wenn auch meist der Schwerpunkt
für die Identifizierung auf Bakterien liegt. Gelegentlich
werden auch Viren zu den Mikroorganismen gerechnet.
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Die
Klassifizierung der Mikroben bedeutet deren Einordnung in das taxonomische
Hierarchieschema: Domäne (Eukaryoten und Prokaryoten),
Reich, Abteilung, Klasse, Ordnung, Familie, Gattung, Art (Species)
und Unterart (Subspecies). Bei Bakterien wird gelegentlich unterhalb
der Unterart eine weitere taxonomische Klasse, die Serovaren oder
Serotypen, eingefügt, die sich besonders durch verschiedenartiges
Anlagerungsverhalten an Zellmembranen unterscheiden. Mikroorganismen
werden weltweit in vielen Instituten in Form tief gefrorener Zuchtlinien
gesammelt. In der deutschsprachigen Mikrobiologie ist es üblich,
eine solche Zuchtlinie als „Stamm” zu bezeichnen,
obwohl in der üblichen biologischen Hierarchie der „Stamm” eine
Ebene zwischen Reich und Klasse bezeichnet. In der Mikrobiologie
wird diese Ebene abweichend als „Abteilung” benannt.
In der englischsprachigen Mikrobiologie besteht diese Doppeldeutigkeit
nicht: Die Abteilung wird als „Phylus” und die
Zuchtlinie als „Strain” bezeichnet.
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Die
Identifizierung einer Mikrobenprobe betrifft die Bestimmung mindestens
der Gattung, in der Regel der Art, aber möglichst auch
der Unterart oder – in günstigen Fällen – sogar
des Serotyps oder sogar des Stamms. Im weiteren Sinne kann eine
Identifizierung auch eine Charakterisierung in Bezug auf andere
Eigenschaften bedeuten, beispielsweise auf die Pathogenität
eines Mikroorganismus (Fähigkeit, eine Krankheit auszulösen)
oder auf die Resistenz eines Mikroorganismus gegenüber
Antibiotika, doch findet diese Art der Identifizierung im erweiterten
Sinne hier keine Anwendung.
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Die
traditionelle Identifizierung von Mikroorganismen in einer zu untersuchenden
Probe erfordert eine Kultivierung, bei der Kolonien der Mikroorganismen
angezüchtet werden. Die in der Laborpraxis verwendeten „Bunten
Reihen” umfassen unterschiedliche Nährmedien für
die Anzüchtung, mit denen spezifische Stoffwechseleigenschaften
der Mikroorganismen erfasst werden, wodurch eine erste, meist grobe
taxonomische Einordnung der Mikroorganismen möglich ist.
Des Weiteren werden die mikroskopische Morphologie von einzelnen
Organismen einer Kolonie und die Morphologie der Kolonie selber
untersucht. Demgegenüber sind seit einigen Jahren neuartige
Identifizierungsverfahren bekannt, die beispielsweise auf einer
DNA- oder RNA-Sequenzanalyse nach einer Vervielfältigung
von spezifischen Genabschnitten durch die Polymerase-Kettenreaktion
(PCR = Polymerase Chain Reaction) oder auf einem massenspektrometrischen
Nachweis spezifischer molekularer Zellbestandteile von Mikroorganismen
beruhen. Diese neuen Verfahren sind den klassischen Verfahren in
Bezug auf Spezifität (Richtignegativ-Rate), Sensitivität
(Richtigpositiv-Rate), anderen Fehlerraten und Analysengeschwindigkeit überlegen.
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Die
Identifizierung von Bakterien durch massenspektrometrische Messungen
wird beispielsweise in dem Übersichtsartikel von van
Baar (FEMS Microbiology Reviews, 24, 2000, 193–219: „Characterization
of bacteria by matrix-assisted laser desorption/ionization and electrospray
mass spectrometry") ausführlich beschrieben.
Die Identifizierung erfolgt durch eine Ähnlichkeitsanalyse
zwischen einem Massenspektrum der zu identifizierenden Bakterien und
Referenzspektren von genau bekannten Bakterien. Während
der Ähnlichkeitsanalyse wird jedem der Referenzspektren
eine Ähnlichkeitsmaßzahl zugeordnet, die die Übereinstimmung
des Referenzspektrums mit dem Massenspektrum der Probe charakterisiert.
Ein Bakterium kann beispielsweise dann als identifiziert ausgewiesen
werden, wenn die Ähnlichkeitsmaßzahl deutlich
größer ist als die Ähnlichkeitsmaßzahlen
für alle übrigen Referenzspektren und auch größer
als ein festgelegter Mindestwert.
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Die
Referenzspektren werden im Allgemeinen in einer Bibliothek zusammengefasst,
wobei die Bibliothek nicht nur Referenzspektren von Bakterien, sondern
auch von anderen Mikroben enthalten kann, um nicht nur Bakterien,
sondern auch andere Arten von Mikroorganismen identifizieren zu
können. Für eine Validierung einer Bibliothek
von Referenzmassenspektren muss jeder Eintrag sehr genau dokumentiert
und zurückverfolgbar sein. Die Referenzspektren werden
von genau charakterisierten Zuchtlinien (Stämmen) gewonnen.
Solche Zuchtlinien von Mikroorganismen werden weltweit in staatlichen, öffentlich-rechtlichen
und privaten Instituten gesammelt, meist tiefgekühlt gespeichert,
und stehen für wissenschaftliche Zwecke zur Verfügung.
In mikrobiologischen Instituten gibt es vielfach weitere Zuchtlinien
neu entdeckter Mikrobenarten. Die genaue Einordnung in das Hierarchieschema
ist manchmal umstritten, was dem Wert solcher Zuchtlinien aber keinen
Abbruch tut.
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Der
Begriff „Zuchtlinie” oder kurz „Stamm” beschreibt
eine Population, die aus einem einzigen Organismus heraus vermehrt
wurde. Die einzelnen Organismen eines Stammes sind genetisch identisch.
Für die Erstellung von Spektrenbibliotheken werden Stämme
verwendet, deren Identität und Einordnung in obiges Hierarchieschema
genau bekannt ist (wenn auch gelegentlich streitig und Änderungen unterworfen),
die also einer bestimmten Mikrobenart, oder, wenn vorhanden und
bekannt, einer bestimmten Unterart angehören. Da die Mikroben
weltweit an verschiedenen Stellen gesammelt und bewahrt werden,
finden sich weltweit auch viele Stämme, die der gleichen
Unterart angehören. Obwohl diese Zuchtlinien als gleiche
Unterart klassifiziert sind, finden sich manchmal leichte Unterschiede
in den Massenspektren, die darauf hindeuten, dass es individuelle
Unterschiede (wie bei Tieren oder Pflanzen der gleichen Art) oder
sogar weitere Verzweigungen des Hierarchieschemas gibt, wie beispielsweise
die Serotypen. Die Stämme tragen international vereinbarte
Kennzeichnungen hinter dem Namen der Art bzw. Unterart.
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Die
Erzeugung von Massenspektren der Mikroben geht für gewöhnlich
von einer Kolonie auf einem festen, meist gelatinösem Nährmedium
oder einem Zentrifugen-Sediment (Pellet) aus einem flüssigen
Nährmedium aus. Mit einem kleinen Tupfstempel wird aus
der ausgewählten Kolonie oder aus dem Sediment eine winzige
Mikrobenmenge auf den massenspektrometrischen Probenträger übertragen.
Diese Probe wird dann mit einer stark angesäuerten Lösung
einer fachüblichen Matrixsubstanz beträufelt, wobei
die Matrixsubstanz einer späteren Ionisierung durch matrixunterstützte
Laserdesorption (MALDI) dient. Dabei greift die Säure der
Matrixlösung die Zellwände an; das organische
Lösungsmittel dringt in die mikrobiellen Zellen ein, lässt
diese durch osmotischen Druck platzen und setzt die löslichen
Proteine frei. Anschließend erfolgt die Trocknung der Probe durch
Verdunstung des Lösungsmittels, wodurch eine Kristallisation
des gelösten Matrixmaterials eintritt. Die löslichen
Proteine, in geringem Umfang auch andere Substanzen der Zelle, werden
dabei in die Matrixkristalle eingebaut.
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Es
gibt Grenzfälle, in denen die Zellwände der Mikroben
durch die Matrixlösung nur schwer oder gar nicht zerstört
werden. Es ist dann ein etwas anders gearteter Aufschluss möglich,
bei dem neben starken Säuren auch Beschallung oder mechanische Behandlung
die mikrobielle Zellwand zu zerstören helfen. Diese Aufschlüsse
ergeben Massenspektren, die denen der gewöhnlichen Präparation
auf Probenträgern sehr ähnlich sind. Auf diese
Aufschlussverfahren werde hier jedoch nicht näher eingegangen. Die
Bibliotheken von Referenzspektren können Referenzspektren
für beide Präparationsverfahren nebeneinander
enthalten.
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Die
auf Probenträgern getrockneten Probenpräparationen,
also die Matrixkristalle mit den eingelagerten Analytmolekülen,
werden in einem Massenspektrometer mit gepulstem UV-Laserlicht beschossen,
wobei Ionen der Analytmoleküle entstehen, die dann im Massenspektrometer
nach Ionenmassen getrennt gemessen werden können. Diese
Art der Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption wird üblicherweise
mit „MALDI” abgekürzt („Matrix Assisted
Laser Desorption and Ionization”). Vorzugsweise werden
zu diesem Zweck besondere MALDI-Flugzeitmassenspektrometer verwendet.
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Die
Massenspektren der Mikroben-Proteine werden heute aus Gründen
besonders hohen Nachweisvermögens im linearen Betrieb dieser
Flugzeitmassenspektrometer aufgenommen, also ohne Benutzung eines
energiefokussierenden Reflektors, obwohl die Massenauflösung
und die Massenrichtigkeit der Spektren aus Flugzeitmassenspektrometern
im Reflektorbetrieb deutlich besser ist. Im Reflektorbetrieb erscheinen
aber nur etwa ein Zwanzigstel der Ionensignale, und das Nachweisvermögen
ist um ein bis zwei Zehnerpotenzen schlechter. Die hohe Empfindlichkeit
beruht darauf, dass im linearen Betrieb eines Flugzeitmassenspektrometers
nicht nur die stabilen Ionen nachgewiesen werden, sondern auch die Fragmentionen
aus so genannten „metastabilen” Zerfällen
der Ionen. Für die Messung der Ionen werden Sekundärelektronenverstärker
(SEV) eingesetzt, wodurch auch die Neutralteilchen, die unterwegs
aus Ionenzerfällen entstanden sind, mit dem Ionendetektor
gemessen werden, da auch sie beim Aufprall Sekundärelektronen
erzeugen. Alle diese Fragmentionen und Neutralteilchen, die aus
einer Mutterionensorte entstanden sind, haben die gleiche Geschwindigkeit
wie die Mutterionen und erreichen daher den Ionendetektor zur gleichen
Zeit. Ihre Flugdauer ist ein Maß für die Masse
der ursprünglich unzerfallenen Ionen.
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Das
erhöhte Nachweisvermögen ist für viele Anwendungen
so entscheidend, dass man viele der Nachteile des linearen Betriebsmodus
der Flugzeitmassenspektrometer, wie beispielsweise eine wesentlich
geringere Massenauflösung und auch geringere Massengenauigkeit,
in Kauf nimmt. Für diese Anwendungen erhöht man
die Energie des desorbierenden und ionisierenden Lasers, wodurch
die Ausbeute an Ionen steigt, aber auch ihre Instabilität,
die jedoch hier nicht stört. Durch die nicht reproduzierbaren
Desorptions- und Ionisierungsprozesse für die Erzeugung
der Ionen in einem linear betriebenen MALDI-Flugzeitmassenspektrometer
verschieben sich die Massen der einzelnen Massensignale leicht von
Spektrum zu Spektrum. Diese Verschiebungen der Massenskalen der
Wiederholungsspektren gegeneinander können durch ein Verfahren,
das in der Schrift
DE
10 2004 051 043 A1 (
M. Kostrzewa et al.;
GB 2 419 737 B ;
US 7,391,017 B2 )
beschrieben wurde, zueinander wieder justiert werden, bevor die
Wiederholungsspektren zu einem Referenzspektrum zusammengefasst
werden. Auch die Massenskalen von Proben- und Referenzspektren können
aneinander angeglichen werden. Dadurch können für
die Bestimmung der übereinstimmenden Massensignale während
der Ähnlichkeitsanalyse kleinere Massentoleranzintervalle
verwendet werden.
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Das
Massenspektrum der Mikrobe ist das Häufigkeitsprofil der
Massenwerte der Ionen. Es handelt sich dabei ganz vorwiegend um
Proteinionen. Die Massenspektren werden für gewöhnlich
im Massenbereich von 2000 bis 20000 Dalton aufgenommen; die für
Identifizierungen nützlichste Information befindet sich
im Massenbereich von etwa 3000 Dalton bis 15000 Dalton. Wegen der
verringerten Auflösung sind die Massensignale in diesem
Massenbereich nicht mehr einzeln aufgelöst, statt dessen
bildet jede Isotopengruppe ein einziges zusammengeschmolzenes Massensignal.
Die Proteinionen sind bei diesem Verfahren in der Regel nur einfach
geladen (Ladungszahl z = 1), weshalb hier auch einfach von der Masse
m der Ionen gesprochen werden kann, statt den genaueren Begriff
der „ladungsbezogenen Masse” m/z zu verwenden,
wie es eigentlich in der Massenspektrometrie notwendig und üblich
ist. Es kommen allerdings gelegentlich in den Massenspektren der
Mikroben auch die Massensignale doppelt geladener Ionen vor; da
diese Massensignale jedoch ohne jeden Unterschied wie alle anderen
behandelt werden, ist eine Unterscheidung zwischen einfach und doppelt
geladenen Ionen nicht notwendig.
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Jeder
Laserlichtpuls erzeugt ein einzelnes Massenspektrum, das jedoch
die Signale von nur einigen Hundert bis einigen Tausend Ionen enthält.
Um zu zuverlässigeren und rauschfreieren Massenspektren
zu kommen, werden einige Zehn bis einige Hundert dieser Einzelmassenspektren
zu einem Summenmassenspektrum addiert. Dabei können bevorzugt
die Einzelmassenspektren von verschiedenen Stellen der Probenpräparation
oder sogar von verschiedenen Probenpräparationen stammen.
Unter dem „Massenspektrum einer Mikrobe” oder
einfacher „Mikrobenspektrum” wird immer dieses
Summenmassenspektrum verstanden.
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Das
Profil der Proteine, das dieses Mikrobenspektrum wiedergibt, ist
sehr charakteristisch für die betreffende Mikrobenart,
weil jede Mikrobenart ihre eigenen, genetisch vorgegebenen Proteine
mit jeweils charakteristischen Massen produziert. Auch die Häufigkeiten
der einzelnen Proteine in den Mikroben, soweit sie massenspektrometrisch
gemessen werden können, sind über die Steuerung
ihrer Produktion durch andere Proteine weitgehend genetisch vorgegeben
und hängen in nur geringem Maße vom Nährmedium
oder vom Reifegrad der Kolonie ab. Die Proteinprofile sind ähnlich
charakteristisch für die Mikroben wie Fingerabdrücke
für den Menschen.
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Für
die Erzeugung von Referenzspektren für Spektrenbibliotheken
werden Kolonien oder Sedimente von Mikroben bestimmter, genau dokumentierter
Zuchtlinien erzeugt und davon Massenspektren aufgenommen. Dabei
werden grundsätzlich für ein Referenzspektrum
viele Massenspektren aufgenommen, die hier als Wiederholungsspektren
bezeichnet werden. Massenspektren von Mikroben enthalten meist etwa
50 bis 200 getrennte Massensignale, von denen aber wegen einer sehr
empfindlich eingestellten Massensignalsuche viele reines Rauschen sind.
Die Referenzspektren werden daher in der Regel auf eine Maximalzahl
von beispielsweise 70 oder 100 Massensignale reduziert; selbst eine
Beschränkung auf 50 Massensignale wird von Fachleuten als ausreichend
betrachtet. Der Informationsgehalt eines Massenspektrums mit 50
Massensignalen im Massenbereich von 3000 bis 15000 Dalton, in dem
auch bei verringertem Massenauflösungsvermögen
weit mehr als 2000 voneinander unterscheidbare Massensignale auftreten
können, ist bereits ohne Berücksichtigung der
Intensitätsunterschiede unvorstellbar hoch. Die Wiederholungsspektren
werden für die Beschränkung auf 70 oder 100 Massensignale
zunächst zu einem sehr signalreichen Mittelwertspektrum
zusammengefasst, woraufhin zunächst alle Massensignale,
die nur wenige Male in den Wiederholungsspektren vorkommen, und
dann die Massensignale kleinster Intensitäten gestrichen
werden, bis die gewünschte Maximalzahl von Massensignalen übrig
bleibt.
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Für
gewöhnlich werden auch die Massenspektren der zu identifizierenden
Mikroben, im Weiteren kurz „Probenspektren” genannt,
in ähnlicher Weise aus Wiederholungsspektren gewonnen und
auf eine vorbestimmte Anzahl von Massensignalen beschränkt,
um Rauschsignale möglichst auszuschließen. Diese
Anzahl von Massensignalen in diesen Probenspektren wird meist etwas
höher gewählt als die der Referenzspektren.
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In
der Veröffentlichung von Jarman et al. (Analytical
Chemistry, 72(6), 2002, 1217–1223: "An Algorithm
for Automated Bacterial Identification Using Matrix-Assisted Laser
Desorption/Ionization Mass Spectrometry") ist
ein Berechnungsverfahren für die Erstellung von Referenzspektren
einer Bibliothek und für die Ähnlichkeitsanalyse
zwischen einem Massenspektrum einer zu untersuchenden Probe (hier „Probenspektrum” genannt)
und den Referenzspektren der Bibliothek angegeben, das sich insbesondere
auf die Reproduzierbarkeit der einzelnen Massensignale bei der Erstellung
der Referenzspektren stützt. Für die Ähnlichkeitsanalyse
eines Probenspektrums ermittelt das Verfahren für jedes
Massensignal jeden Referenzspektrums eine Einzelkennzahl, die angibt,
wie gut es mit dem Massensignal des Probenspektrums übereinstimmt,
wobei insbesondere einerseits die Übereinstimmung der Intensitäten
und andererseits eine Gewichtung durch die Streuung der Referenzsignale
berücksichtigt werden. Diese Einzelkennzahl wird umso höher
angesetzt, je geringer die Streuung der Intensität für
dieses Massensignal ist, je besser also dieses Massensignal reproduziert
werden kann. Schlecht reproduzierbare Massensignale erhalten eine
niedrige Einzelkennzahl. Aus den so ermittelten Einzelkennzahlen
der Massensignale der Referenzspektren wird für jedes Referenzspektrum
durch Summierung eine Ähnlichkeitsmaßzahl für
die Übereinstimmung mit dem Probenspektrum ermittelt. Die
Referenzspektren einer Bibliothek werden dann nach ihren der Größe
der Ähnlichkeitsmaßzahlen sortiert. Als Resultat
erhält man eine nach Ähnlichkeiten sortierte Liste
mit den Bezeichnungen der den Referenzspektren zugeordneten Mikroorganismen
und den Ähnlichkeitsmaßzahlen.
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Für
diesen hier nur grob dargestellten Algorithmus nach Jarman
et al. muss ein Referenzspektrum folgende aus den Wiederholungsspektren
ermittelten Größen für die einzelnen
Massensignale des Referenzspektrums enthalten: die gemittelte Masse, die
Streuung um die gemittelte Masse, die mittlere Intensität,
die Streuung um die mittlere Intensität und die prozentuale
Häufigkeit des Auftretens dieses Massensignals in den Wiederholungsspektren,
also des Auftretens oberhalb der Empfindlichkeitsschwelle. In der
Regel werden dabei nur diejenigen Signale in einem Referenzspektrum
berücksichtigt, die eine vorbestimmte Mindesthäufigkeit
aufweisen.
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Für
eine automatische Erzeugung von Referenzspektren aus den Wiederholungsspektren
sind bei Jarman et al. computergestützte
Verfahren angegeben, die zu den Referenzspektren führen.
Die Referenzspektren werden dabei durch einen statistischen Algorithmus
aus vielen Wiederholungsspektren abgeleitet. Um in besonderer Weise
die Stabilität und Reproduzierbarkeit der einzelnen Massensignale
erkennen zu können, können die Wiederholungsspektren
unter Variation der Zucht-, Präparations- oder Aufnahmebedingungen
gewonnen werden. Ein Wiederholungsspektrum kann auf einer technischen oder
einer biologischen Variation fußen. Die technischen Variationen
beziehen sich beispielsweise auf die Position des Laserfokus auf
der Oberfläche der Probe, die Laserenergie, die Probenmenge,
die verwendete Matrixsubstanz oder die Art der Probenpräparation
(Dried Droplet, Dünnschichtpräparation). Die biologischen
Variationen beziehen sich beispielsweise auf die Bedingungen für
die Aufzucht (Nährmedium, Temperatur) und den Reifegrad
der Kolonie.
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Werden
Referenzspektren von verschiedenen Stämmen der gleichen
Unterart einer Mikrobe erzeugt, so können sie zusammengefasst
werden, wenn sie innerhalb enger Toleranzen übereinstimmen,
sie können aber auch einzeln in die Bibliothek eingestellt
werden. Unterscheiden sich die Referenzspektren signifikant, so
werden sie auf jeden Fall getrennt eingestellt.
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In
einer vereinfachten Art von Referenzspektren im Sinne von Jarman
et al., die aber zu schneller ablaufenden Ähnlichkeitsanalysen
führen, kann jedem Massensignal ein Gewichtsfaktor mitgegeben werden,
der bestimmt, wie stark dieses Massensignal zur Ähnlichkeitsanalyse
beitragen soll. Dieser Gewichtsfaktor kann aus der Reproduzierbarkeit
dieses Massensignals in den Wiederholungsspektren abgeleitet werden,
also aus der Streuung von Massen und Intensitäten. Massensignale
geringer Intensitätsstreuung erhalten ein hohes Gewicht.
Massensignale, die nur in wenigen Wiederholungsspektren vorkommen,
werden entfernt. Als Referenzspektren werden dann die gemittelten
Massenspektren in die Bibliothek eingestellt, wobei die Massensignale
in den Referenzspektren jeweils nur noch mit dem Mittelwert der
Intensität und dem Gewichtsfaktor versehen sind. Die Gewichtsfaktoren
haben den weiteren Vorteil, dass sie für jedes Referenzspektrum
so normiert werden können, dass für vollständige Ähnlichkeit
eine bestimmte maximale Ähnlichkeitsmaßzahl herauskommt,
also beispielsweise ein Wert 3,00 für ein mit dem Referenzspektrum
identisches Massenspektrum.
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Referenzspektren
dieser Art werden im Folgenden als „Referenzspektren mit
Eigenwichtung” oder als „eigengewichtete Referenzspektren” bezeichnet,
da die Gewichte nur aus den statistischen Daten der Wiederholungsspektren
gewonnen wurden. Im Gegensatz dazu stehen „Referenzspektren mit
Fremdwichtung”, bei denen die Gewichte aus Vergleichen
mit anderen Referenzspektren der Spektrenbibliothek oder sogar anhand
von Bewertungen durch einen mikrobiologischen Fachmann gewonnen werden.
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So
ist aus der Schrift
DE
100 38 694 A1 (W. Kallow et al.) ein Verfahren zur Erzeugung
von fremdgewichteten Referenzspektren bekannt, bei denen die Gewichte
für die einzelnen Massensignale aus der Häufigkeit
bestimmt werden, mit denen diese Massensignale in den übrigen
Referenzspektren der Bibliothek auftauchen. Damit wird für
die Ähnlichkeitsanalysen die Unterscheidbarkeit zwischen
Referenzspektren vergrößert. Tritt beispielsweise
ein Massensignal nur in einem einzigen Referenzspektrum auf, erhält
dieses Massensignal ein Höchstgewicht, weil dieses Massensignal
allein schon die Mikrobe identifiziert; tritt aber ein Massensignal
unterschiedslos mit gleicher Intensität in allen Referenzspektren
auf, so erhält dieses Massensignal das Gewicht null. Diese
Art von Referenzspektren ist jedoch nachteilig für eine
Validierung von Spektrenbibliotheken, besonders dann, wenn einer
bereits validierten Bibliothek weitere Referenzspektren zugefügt
werden sollen. Es muss dann die gesamte Bibliothek neu bewichtet
und validiert werden; die Validierung betrifft nicht nur die zugefügten
Referenzspektren. Außerdem kann die Identifizierung von
Unterarten erschwert werden, wenn beispielsweise das einzige Massensignal,
das hier eine Unterscheidung zwischen den Unterarten einer Art bringen
könnte, durch zufälliges Auftreten des gleichen
Massensignals in vielen anderen, wenig verwandten Referenzspektren ein
niedriges Gewicht trägt. Mit steigender Komplexität
einer Referenzbibliothek wird diese Art der Wichtung einzelner Signale
immer weniger einsetzbar.
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Um
die Unterscheidbarkeit von Referenzspektren von Unterarten zu erhöhen,
haben daher die Autoren der zitierten Schrift in einer weiteren
Patentveröffentlichung
DE 103 00 743 A1 vorgeschlagen, für
jeweils zwei sehr ähnliche Referenzspektren, zwischen deren
zugehörigen Mikroben aber zu unterscheiden ist, auch noch
ein Differenzierungsspektrum der Bibliothek hinzuzufügen.
Diese Differenzierungsspektren haben Gewichte für die einzelnen Massensignale,
die einen Unterschied der Intensität dieses Massensignals
zu dem des zweiten Referenzspektrums betonen und so zu einer gesteigerten
Unterscheidbarkeit beitragen, während Massensignale, die
in beiden Referenzspektren etwa gleich intensiv sind, durch geringes
Gewicht bestraft werden. Das feste Hinzufügen von solchen
Differenzierungsspektren zur Bibliothek erschwert aber die Validierung
der Bibliothek nochmals gravierend. Bei diesen Differenzierungsspektren
handelt es sich ebenfalls um fremdgewichtete Referenzspektren.
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Wie
Entwicklungen von Identifizierungsverfahren im Hause der Antragstellerin
zeigen, können jedoch auch wesentlich einfachere massenspektrometrische
Identifizierungsverfahren eine sehr hohe Erfolgsquote haben, sogar
solche, die gar keine Gewichte für die einzelnen Massensignale
der Referenzspektren mit sich führen. So ist es zunächst zweckmäßig,
für die Aufnahme der Referenzspektren wie auch der Probenspektren
möglichst keine Variationen der technischen oder biologischen
Verfahrensparameter zuzulassen, sondern die Spektren unter standardisierten
Bedingungen für die Aufzucht der Kolonie, für
die Probenpräparation und für die massenspektrometrische
Spektrenaufnahme zu erzeugen. Schon diese Maßnahme führt
zu verbesserter Identifizierung. Es kann dann in den Referenzspektren
sowohl auf die Speicherung der Streuungen von Massenwerten und Intensitätswerten
wie auch auf die Speicherung von Gewichten ganz verzichtet werden,
was die Bibliothek kleiner und handlicher und die Ähnlichkeitsanalyse
schneller macht. Auf ein Verfahren zur Angleichung der häufig
leicht verschobenen Massenskalen der Wiederholungsspektren aneinander
wurde bereits oben eingegangen. Da viele Massensignale nur in einem
Teil der Wiederholungsmessungen auftauchen, aber trotzdem zur Identifizierung
beitragen können, hat es sich durch viele Experimente mit
solchermaßen vereinfachten Referenzspektren gezeigt, dass
es zweckmäßig ist, die prozentuale Präsenz
eines Massensignals mitzuführen. Die prozentuale Präsenz
gibt an, bei wie viel Prozent der Wiederholungsspektren dieses Massensignal
auftritt. Ein Massensignal trägt dann nur drei Eintragungen:
gemittelte Masse, gemittelte Intensität, und prozentuale
Präsenz.
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Das
Verfahren zur Ähnlichkeitsanalyse mit diesen einfachen
Referenzspektren kann in seiner einfachsten Form so aussehen, dass
jedes Referenzspektrum daraufhin untersucht wird, wie viele seiner
Massensignale sich jeweils mit denen des Mikrobenspektrums innerhalb
einer vorgegebenen Massentoleranz treffen. Die Anzahl dieser Treffer
geteilt durch die Anzahl der Massensignale im Referenzspektrum ist
dann ein erstes Teilmaß für die Ähnlichkeit;
die Anzahl der Treffer durch die Anzahl der Massensignale im Mikrobenspektrum
ein zweites Teilmaß. Ein drittes Teilmaß kann
aus der Intensitätsähnlichkeit der sich treffenden
Massensignale abgeleitet werden. Das Produkt der drei Teilmaße
ergibt die Ähnlichkeitsmaßzahl. Eine Verfeinerung
kann dadurch eingeführt werden, dass ein Treffer jeweils
nur mit der prozentualen Präsenz dieses Massensignals gezählt
wird, also mit einer Zahl, die möglicherweise kleiner als
eins ist. Für diese einfache Ähnlichkeitsanalyse
kann ein äußerst schnell ablaufender Algorithmus
entwickelt werden, der auch bei Tausenden von Referenzspektren in
normalen Computerservern in erträglicher Zeit von wenigen
Sekunden arbeitet. Dieser Algorithmus kann (wie es oben für
den Fall gewichteter Spektren vorgeschlagen wurde) auf eine maximale Ähnlichkeitsmaßzahl
zwischen Mess- und Referenzspektren abgestimmt werden, beispielsweise
auf eine maximale Ähnlichkeitsmaßzahl von 3,00 für
identische Spektren. Es ist sogar möglich, die Ähnlichkeitsmaßzahlen
so zu transformieren, dass ein Ähnlichkeitswert von 2,00
als gerade genügende Minimalanforderung für eine
Identifizierung angesehen werden kann. Eine solche Minimalanforderung und
ein entsprechender Maximalwert sind nach unseren Erfahrungen von
hohem psychologischen Wert für die Akzeptanz des Verfahrens.
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Heute
werden an vielen Orten zuverlässige, medizinisch und rechtlich
verwendbare („validierte”) Referenzmassenspektren
von Mikroben für Bibliotheken erarbeitet, darunter an vielen
mikrobiologischen Instituten und beispielsweise auch an zentralen
staatlichen Einrichtungen für Krankheitsüberwachung
und -Prävention. Auch für diese Arbeit ist es weitaus
einfacher, die Spektren nur unter standardisierten Bedingungen ohne
Variation aller Verfahrensparameter aufzunehmen.
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Es
können mit allen hier geschilderten Bibliotheken und Verfahren
in vielen Fällen bereits eng verwandte Mikroben auseinander
gehalten werden, wenn die Ausstattung der Mikrobenunterarten mit Proteinen
nach Art und Häufigkeit eindeutig variiert. Es stellt sich
aber immer wieder heraus, dass es zu einem Mikrobenspektrum mehrere
Referenzspektren gibt, die fast gleiche Ähnlichkeitsmaßzahlen
ergeben, so dass keine eindeutige Identifizierung der Unterart vorgenommen
werden kann, in einigen Fällen nicht einmal eine Identifizierung
der Art. Die Referenzspektren fast gleicher Ähnlichkeit
gehören in der Regel alle zu eng verwandten Mikroben auf
den Ebenen von Gattung oder Art.
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In
vielen Fällen ist eine Identifizierung der Mikroben auf
der Ebene der Gattung oder Art bereits ausreichend für
die Fragestellung. Es gibt jedoch bedeutende Fälle, in
denen die Kenntnis über eine Zugehörigkeit der
untersuchten Mikrobe zu einer Art oder Unterart zwingend erforderlich
ist, beispielsweise dann, wenn die Arten oder Unterarten sehr verschiedene
Pathogenität zeigen oder in verschiedener Weise bekämpft
werden müssen. Für diese Fälle wird eine
sichere Identifizierungsmethode nach Arten und Unterarten, manchmal
sogar nach Biovaren oder Serotypen benötigt.
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Aufgabe der Erfindung
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Es
ist die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Identifizierung
von Mikroben anhand ihrer Massenspektren bereitzustellen, mit dem
die Mikroben selbst dann auf der Ebene von Arten oder Unterarten
identifiziert werden können, wenn sich deren Referenzspektren
nur wenig voneinander unterscheiden und bei üblichen Ähnlichkeitsanalysen
fast gleiche Maßzahlen für die Ähnlichkeit
mit dem Probenspektrum zeigen.
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Kurze Beschreibung der Erfindung
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Die
Erfindung stellt ein zweistufiges Verfahren für die massenspektrometrische
Identifizierung von Mikroben bereit, das folgende Schritte umfasst:
- a) Bereitstellung einer Bibliothek von Referenzspektren,
- b) Aufnahme eines Massenspektrums der zu identifizierenden Mikrobenprobe,
- c) Berechnung von Ähnlichkeitsmaßzahlen der Referenzspektren
zu diesem Probenspektrum,
- d) Auswahl einer Gruppe ähnlichster Referenzspektren,
wahlweise ergänzt durch Referenzspektren von nahe verwandten
Mikroben,
- e) Ermittlung von Differenzierungsgewichten, die die Unterschiede
der Referenzspektren der Gruppe zueinander betonen, für
die Massensignale der Referenzspektren dieser Gruppe, ohne jedoch
die Differenzierungsgewichte in der Bibliothek dauernd zu speichern,
und
- f) Berechnung der Maßzahlen für die Ähnlichkeiten
der Referenzspektren dieser Gruppe zum Probenspektrum unter Berücksichtigung
der Differenzierungsgewichte, wobei sich in der Regel ein Referenzspektrum
als besonders ähnlich heraushebt und eine Art oder eine
Unterart eindeutig identifiziert.
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Die
Schritte a) bis c) bilden die erste Stufe des Verfahrens und entsprechen
dem üblichen einstufigen Identifizierungsverfahren, das
aber nicht immer zu ausreichend guten Identifizierungen nach Arten
und Unterarten führt. Im einstufigen Verfahren wird dabei
für gewöhnlich eine nach abnehmenden Ähnlichkeitsmaßzahlen
geordnete Hitliste der ähnlichsten Referenzspektren mit
Mikrobennamen erstellt, die zur Beurteilung der Identifizierung
dient.
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Die
zweite Stufe besteht aus den Schritten d), e) und f). Es wird hier
zunächst eine Gruppe von Referenzspektren ausgewählt,
die allein an der zweiten Stufe teilnehmen. Diese Gruppe umfasst
in der Regel die zum Probenspektrum ähnlichsten Referenzspektren.
Je nach gewählter Option des Verfahrens können
dafür beispielsweise einfach fest eingestellt die sechs
oder zehn Referenzspektren mit den höchsten Ähnlichkeitsmaßzahlen
ausgesucht werden, oder die Referenzspektren mit höchsten Ähnlichkeitsmaßzahlen
innerhalb einer vorgegebenen Maximaldifferenz. In einer anderen
Option können beispielsweise, wenn die ähnlichsten
Referenzspektren ganz überwiegend auf eine Mikrobenart
hinweisen, alle oder als typisch ausgewählte Referenzspektren
der Unterarten oder Stämme dieser Mikrobenart ausgewählt
werden. Die Gruppe der ausgewählten Referenzspektren kann
je nach Abstufung der Ähnlichkeitsmaßzahlen drei
bis fünfzehn, bevorzugt vier bis acht, in selteneren Fällen
auch mehr als fünfzehn Referenzspektren umfassen. Sind
in der Bibliothek jeweils mehrere Referenzspektren der gleichen
Unterart oder, falls keine Unterart existiert, der gleichen Art
vorhanden, die alle unter die Auswahlregel für die Gruppe
fallen würden und die Gruppe zu groß werden ließen,
so kann die Auswahl auf die als typisch markierten Referenzspektren
eingeschränkt werden. Diese Markierungen müssten
dazu in der Bibliothek vorhanden sein.
-
Die
Ermittlung der neuen Differenzierungsgewichte für die einzelnen
Massensignale der Referenzspektren dieser Gruppe wird in der Regel
durch ein Computerprogramm durchgeführt. Die Differenzierungsgewichte
beruhen auf einer Analyse der Unterschiede in diesen Referenzspektren
und betonen diese Unterschiede. Kommt beispielsweise ein Signal
einer bestimmten Masse nur in einem einzigen Referenzspektrum der
Gruppe vor, so erhält dieses Massensignal ein sehr hohes
Differenzierungsgewicht. Das Massensignal kann dabei durchaus eine schwache
Intensität haben. Kommt das Massensignal bei genau zwei
unter mehreren Referenzspektren der Gruppe vor, so wird das Differenzierungsgewicht niedriger,
aber immer noch mäßig hoch gewählt. Wenn
die Intensitäten der beiden Massensignale in den beiden
Referenzspektren signifikant verschieden sind, so kann auch deren
Differenzierungsgewicht hoch gewählt werden, sind die Intensitäten
dagegen fast gleich, so ist ein geringeres Gewicht angesagt. Kommt
ein Massensignal bei allen Referenzspektren der Gruppe mit genau
gleicher Intensität vor, so kann ein Differenzierungsgewicht
null angebracht werden, weil dieses Massensignal nicht zur Unterscheidung beitragen
kann. Für signifikant verschiedene Intensitäten
eines Massensignals, das in allen Referenzspektren vorkommt, können
mäßig hohe Differenzierungsgewichte verteilt werden.
Es ist für den Entwickler mit einiger Erfahrung für
die Entwicklung von Identifizierungsverfahren in Kenntnis dieser
Erfindung relativ einfach, für die Gewichtung günstige
Regeln aufzustellen. Die Regeln können von der analytischen Zielsetzung
abhängig sein. Die Differenzierungsgewichte werden nicht
in der Bibliothek der Referenzspektren dauernd abgespeichert.
-
Durch
diese Differenzierungsgewichte für die Referenzspektren
gelingt es in den überaus meisten Fällen, in der
zweiten Stufe des Identifizierungsverfahrens eine eindeutige Identifizierung herbeizuführen,
die beispielsweise durch eine vorgegebene Mindestdifferenz der höchsten Ähnlichkeitsmaßzahl
zur zweithöchsten gegeben ist. Die letztgültige
Entscheidung darüber, ob die Identifizierung ausreichend
gut ist, wird aber bei einem Fachmann liegen, der bei Bedarf auch
die zweite Stufe mit veränderter Auswahl der Gruppe der
Referenzspektren neu starten kann.
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Zwischen
den Schritten c) und d) kann wahlweise auch eine Prüfung
auf eine bereits ausreichende Identifizierung eingeschoben werden.
Diese Prüfung kann entweder automatisch erfolgen, beispielsweise
durch die Analyse der Differenzen der höchsten Ähnlichkeitsmaßzahlen
unter Berücksichtigung ihrer absoluten Höhe, oder
aber – wie bei dem einstufigen Verfahren üblich – visuell
durch einen fachlich versierten Benutzer. Dazu wird in der Regel
eine Hitliste der ähnlichsten Referenzspektren mit Mikrobenbezeichnung, Ähnlichkeitsmaßzahl
und anderen Angaben angeboten. Dieser Fachmann kann auch weitere
Kenntnisse über die Mikroben einfließen lassen; so
kann er beispielsweise beurteilen, ob wegen verschiedener Pathogenität
der Unterarten einer feiner abgestufte Identifizierung notwendig
ist. Bei nicht ausreichender Identifizierung startet er die zweite Stufe.
Dabei kann er auch bereits die Gruppe der Referenzspektren auswählen,
die für die weitere Differenzierung verwendet werden soll;
er kann aber auch diese Auswahl einem Computerprogramm überlassen.
Es kann durch diesen Experten beispielsweise auch ein jeweils als
typisch für eine Art oder Unterart eingestuftes Referenzspektrum
ausgewählt werden.
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Da
die Auswahl der Gruppen ähnlichster Referenzspektren und
die Ermittlung der Differenzierungsgewichte nur Bruchteile von Sekunden
dauert, werden die Differenzierungsgewichte nur vorübergehend
gebildet; sie werden insbesondere nicht in der Bibliothek der Referenzspektren
abgelegt. Durch diese vorübergehende Ermittlung der Differenzierungsspektren
wird die Bibliothek der Referenzspektren nicht mit dauernd gespeicherten
Differenzierungsspektren belastet. Das ist für eine Validierung
der Spektrenbibliothek zwingend notwendig. Die wiederkehrende Neuberechnung
hat sogar starke Vorteile: In einer ständig wachsenden
Bibliothek der Referenzspektren werden für ein gleich bleibendes
Probenspektrum immer wieder veränderte Gruppen von Referenzspektren
mit immer feineren Unterschieden ausgesucht, so dass automatisch
eine Anpassung des Identifizierungsverfahrens an die erweiterte
Bibliothek stattfindet.
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Bevorzugte Ausführungsformen
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Die
Erfindung stellt eine zweistufige Identifizierung der Mikroben durch Ähnlichkeitsanalysen zwischen
Mikrobenspektren und den Referenzspektren einer Referenzbibliothek
bereit. Die erste Stufe läuft nach einem der üblichen
Identifizierungsverfahren ab. In der zweiten Stufe wird zunächst
eine Gruppe von Referenzspektren ausgewählt, die höchste Ähnlichkeiten
zum Probenspektrum besitzen. Es werden dann Differenzierungsgewichte
für die Masseneinträge ermittelt, die die Unterschiede
der Referenzspektren der Gruppe betonen. Diese Differenzierungsgewichte
werden jedoch nicht in die Bibliothek eingespeichert. Es können
stattdessen beispielsweise neue Referenzspektren gebildet werden,
die nach Massen und Intensitäten genau den Referenzspektren
der Gruppe entsprechen, aber diese Differenzierungsgewichte tragen.
Die Ähnlichkeitsanalyse der zweiten Stufe wird nur noch
mit diesen neuen Referenzspektren mit ihren neu ermittelten Differenzierungsgewichten
für die Massensignale durchgeführt, also mit diesen
fremdgewichteten Referenzspektren. Als Gruppe der Referenzspektren
können diejenigen Referenzspektren ausgewählt
werden, die in der ersten Stufe fast gleiche Maßzahlen
für die Ähnlichkeit mit dem Mikrobenspektrum ergeben
haben (beispielsweise alle innerhalb eines vorgegeben Toleranzintervalls
für die Ähnlichkeitsmaßzahlen), es können feste
Anzahlen von ähnlichsten Referenzspektren, es können
aber auch alle oder ausgewählte Unterarten und Stämme
der Mikrobenart, die in der ersten Stufe die ähnlichsten
Referenzspektren lieferte, ausgewählt werden. Die Differenzierungsgewichte
betonen die Unterschiede in den Referenzspektren und führen
in der Regel in einer erneuten Ähnlichkeitsanalyse zu einer
besseren, meist eindeutigen Identifizierung der Unterart oder sogar
der Stammes. Es kann nach der ersten Stufe eine Prüfung
eingeführt werden, die bei einer Identifizierung, die in
Hinblick auf das Ziel der Analyse ausreicht, das Verfahren abbricht.
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Das
zweistufige Verfahren kann dabei insbesondere folgende Schritte
umfassen:
- a) Bereitstellung einer Bibliothek
von Referenzspektren,
- b) Aufnahme eines Probenspektrums der zu identifizierenden Mikrobenprobe,
- c) Berechnung der Maßzahlen für die Ähnlichkeiten
der Referenzspektren der Bibliothek zu diesem Probenspektrum, wobei
die Ähnlichkeitsmaßzahlen durch ihre Rangfolge
eine mehr oder weniger gute Identifizierung ergeben,
- d) Auswahl einer Gruppe von Referenzspektren, beispielsweise
die Gruppe der ähnlichsten Referenzspektren oder eine Gruppe
von Referenzspektren verwandter Mikroben,
- e) Ermittlung von Differenzierungsgewichten, die die Unterschiede
der Referenzspektren der Gruppe zueinander betonen, für
die Massensignale der Referenzspektren dieser Gruppe, ohne jedoch
die Differenzierungsgewichte in der Bibliothek dauernd zu speichern,
und
- f) Berechnung der Maßzahlen für die Ähnlichkeiten
der Referenzspektren dieser Gruppe zum Probenspektrum unter Berücksichtigung
der Differenzierungsgewichte, wobei sich in der Regel ein Referenzspektrum
als besonders ähnlich heraushebt und eine Art oder eine
Unterart eindeutig identifiziert.
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Die
ersten drei Schritte a), b) und c) bilden die erste Stufe des Verfahrens
und entsprechen dem bisherigen einstufigen Verfahren. Für
diese erste Stufe können im Prinzip alle Arten der eingangs
geschilderten Referenzspektren in Bibliotheken und alle Formen von Ähnlichkeitsanalysen
verwendet werden. Häufig brauchen nur leichte Anpassungen
der Algorithmen der Ähnlichkeitsberechnungen vorgenommen
zu werden, um sowohl in der ersten Stufe wie auch in der zweiten
Stufe mit den Schritten d), e) und f) zur Anwendung kommen zu können.
Es können insbesondere die Bibliotheken mit eigengewichteten
Referenzspektren wie auch die Bibliotheken mit fremdgewichteten
Referenzspektren verwendet werden, wobei die Ermittlung der neuen
Differenzierungsgewichte für die Gruppe der neuen Referenzspektren
nur die bereits vorhandenen Gewichtswerte in den alten Referenzspektren
der ausgewählten Gruppe zu verändern braucht,
so dass in der zweiten Stufe die exakt gleichen Algorithmen zur
Berechnung der Ähnlichkeitsmaßzahlen angewendet
werden können.
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Von
der technischen Durchführung her gesehen, kann beispielsweise
die in Schritt d) ausgewählte Gruppe der Referenzspektren
einfach in den Arbeitsspeicher des Computers kopiert werden. In Schritt
e) werden dann die Differenzierungsgewichte ermittelt und in die
Referenzspektren der kopierten Gruppe eingeschrieben; in dieser
Weise werden die Referenzspektren der Bibliothek nicht verändert.
In Schritt f) kann die kopierte Gruppe von Referenzspektren mit
Differenzierungsgewichten als neue, kleine Spezialbibliothek der Ähnlichkeitsanalyse
zur Verfügung gestellt werden.
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Die
Differenzierungsgewichte für die einzelnen Massensignale
der Referenzspektren der ausgewählten Gruppe werden in
der Regel durch ein Computerprogramm ermittelt. Die Differenzierungsgewichte
beruhen auf einer Analyse der Unterschiede in den Referenzspektren
dieser Gruppe und sollen diese Unterschiede betonen. Ein Differenzierungsgewicht
für ein Massensignal wird also umso höher gewählt,
je seltener sich dieses Massensignal oder seine Intensität
bei den übrigen Referenzspektren der Gruppe wiederfindet.
Kommt beispielsweise ein Signal einer bestimmten Masse nur in einem
einzigen Referenzspektrum vor, so erhält dieses Massensignal
ein sehr hohes Differenzierungsgewicht, beispielsweise 1000 gegenüber
einem Normwert von 100, weil es praktisch allein schon die Unterart
charakterisiert. Das Massensignal kann dabei durchaus eine schwache
Intensität haben. Kommt im Gegensatz dazu ein Massensignal
bei allen Referenzspektren der Gruppe mit genau gleicher Intensität
vor, so kann ein Differenzierungsgewicht null angebracht werden,
da dieses Massensignal überhaupt nicht zur Unterscheidung
beitragen kann. Kommt das Massensignal bei genau zwei unter mehreren
Referenzspektren der Gruppe vor, so wird das Differenzierungsgewicht
nur noch mäßig hoch gewählt, beispielsweise
300, wenn die Intensitäten gleich sind, und etwas höher,
beispielsweise 400 bis 600, wenn die Intensitäten voneinander
weniger oder mehr voneinander verschieden sind. Für mehr
oder weniger, jedoch signifikant verschiedene Intensitäten
eines Massensignals, das überall vorkommt, können
mäßig hohe Differenzierungsgewichte verteilt werden. Wie
schon oben angemerkt, ist es für den Entwickler mit einiger
Erfahrung in der Entwicklung von Identifizierungsverfahren relativ
einfach, günstige Regeln für diese Gewichtung
aufzustellen und einen entsprechenden Wichtungsalgorithmus zu programmieren.
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Etwas
verschieden ist die Sachlage bei Bibliotheken mit Referenzspektren,
die keine Gewichte für die einzelnen Massensignale, wohl
aber prozentuale Präsenzwerte tragen. Da diese prozentualen Präsenzen
in der Regel ähnlich wie Gewichte in die Berechnung der Ähnlichkeitsmaßzahlen
eingehen, können diese Felder auch für den Eintrag
der Differenzierungsgewichte verwendet werden. Somit können
auch hier in der zweiten Stufe die gleichen Algorithmen zur Berechnung
der Ähnlichkeitsmaßzahlen verwendet werden.
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Es
werde hier für eine detaillierte Beschreibung einer Ausführungsform
der Erfindung auf die Verwendung dieser einfachen Art von Referenzspektren,
die nur Masse, Intensität und Präsenz mitführen,
besonders eingegangen, da das damit verbundene sehr einfache Verfahren
zur Berechnung von Ähnlichkeitsmaßzahlen sehr
schnell ist und trotzdem zu hervorragenden Identifizierungsergebnissen
führt.
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Grundlage
dieses Verfahrens ist – wie für andere Verfahren
auch – die Bibliothek der Referenzspektren, die zunächst
erstellt werden muss. Dazu wird in diesem Fall ein standardisiertes
Anzucht- und Aufnahmeverfahren verwendet. Die Verfahren der Anzüchtung
der Mikroben genau bekannter Stämme, der Entnahme winziger
Mikrobenmengen, der Präparation von beispielsweise zehn
Proben jeder Mikrobe auf einem massenspektrometrischen Probenträger, und
der Aufnahme von beispielsweise je fünf Massenspektren
von jeder der Proben sind genau festgelegt. Es werden nach den genannten
Beispielen für jeden Mikrobenzuchtstamm 50 Wiederholungsmassenspektren
erhalten, deren Aufnahme in einem geeigneten Massenspektrometer
insgesamt nur etwa fünf Minuten benötigt. Die
große Anzahl von Wiederholungsspektren ist nur deswegen
erforderlich, weil die Prozesse der Präparation der Probe
mit Kristallisierung der Matrixsubstanz und der Ionenbildung durch
MALDI nur mäßig gut reproduzierbar sind und nur
durch eine Mittelung über viele Massenspektren zu guten
Referenzspektren führen. Eine hohe Zahl von Wiederholungsspektren
gibt auch verlässlichere Werte für die Präsenzen.
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Da
sich durch den Desorptions- und Ionisierungsprozess für
die Erzeugung der Ionen in einem linear betriebenen MALDI-Flugzeitmassenspektrometer
die Massen der einzelnen Massensignale von Spektrum zu Spektrum
leicht verschieben können, werden jetzt die Massenskalen
der Wiederholungsspektren durch ein eingangs bereits zitiertes Verfahren,
das in der Schrift
DE
10 2004 051 043 A1 (M. Kostrzewa et al.) beschrieben wurde,
zueinander justiert. Dadurch können für die unten
beschriebene Bestimmung der Treffer kleinere Massentoleranzintervalle
verwendet werden, beispielsweise 250 statt 1000 Millionstel der
Masse (ppm). Diese Anpassung der Massenskalen bedeutet eine entscheidende
Verbesserung für das Verfahren.
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Aus
den zueinander justierten Wiederholungsspektren werden für
jedes Massensignal, ob es nun einmal, mehrmals oder auch überall
vorkommt, automatisch die mittleren Massenwerte, die mittleren Intensitäten
und die prozentualen Präsenzen ermittelt. Die prozentualen
Präsenzen geben an, wie häufig ein Massensignal
in den Wiederholungsspektren auftritt; hier steht also der Wert
1,00 (= 100%), wenn dieses Massensignal in allen Wiederholungsspektren zu
finden ist, und ein entsprechend kleinerer Wert sonst. Das aus allen
Wiederholungsspektren zusammengefasste Referenzspektrum wird dann
durch Entfernen aller Massensignale unterhalb einer festgelegten
Schwelle für die Präsenz, beispielsweise 15%,
und durch Entfernen der Massensignale mit den kleinsten Intensitäten
auf maximal 70 Massensignale eingeschränkt. In wenigen
Fällen finden sich weniger als 70 Masseneinträge
in einem Referenzspektrum, wenn nach Entfernen der Rauschsignale, die
durch geringe Präsenzen charakterisieret sind, weniger
als 70 Massensignale übrig bleiben.
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Die
Referenzspektren der Bibliothek enthalten neben den genauen Bezeichnungen
der Mikrobenart, Unterart, und Stamm für jedes der maximal 70
eingetragenen Massensignale nur den Massenmittelwert, den Intensitätsmittelwert
und die Präsenz. Das Referenzspektrum kann auch einige
Zahlenwerte enthalten, die für die Berechnung der Ähnlichkeitsmaßzahlen
immer wieder gebraucht werden, beispielsweise die mit den Präsenzen
gewichtete Anzahl aller Massensignale. Zusätzlich enthalten
die Referenzspektren Verweise auf die Herkunft der Stämme
und auf das Laboratorium, das die Spektren aufgenommen hat, wie
für Validierungen erforderlich. Es können auch
Verweise auf besondere Pathogenität der Mikroben, ihre
Umweltschädlichkeit in Gewässern, ihre Toxizität
in Lebensmitteln, ihre Schädlichkeit in Bioprozessen und
dergleichen vorhanden sein, möglichst in verschlüsselter
Form, die gegebenenfalls für eine automatische Prüfung
auf die Notwendigkeit einer verfeinerten Identifizierung in einer zweiten
Stufe herangezogen werden kann. Auch die Bekämpfungsarten
von Pathogenen oder Umweltschädlingen können mit
entsprechenden Verschlüsselungen enthalten sein. Sind in
der Bibliothek die Referenzspektren mehrerer Stämme der
gleichen Unterart (oder Art, falls keine Unterarten bekannt sind)
vorhanden, so können eines oder auch zwei der Referenzspektren
als besonders typisch markiert sein, um bei der Auswahl einer Gruppe
von Referenzspektren für die zweite Stufe bevorzugt, gegebenenfalls
allein, ausgewählt werden zu können. Zwei Referenzspektren
können beispielsweise dann als typisch markiert werden,
wenn die Stämme der Unterart zwei deutlich voneinander
verschiedene Gruppen von jeweils untereinander ähnlichen
Referenzspektren aufweisen.
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Für
verschiedene Anwendungsgebiete, wie beispielsweise klinische Infektionsdiagnostik,
Gewässer- oder Hygieneüberwachung, können
durchaus verschiedene Spezialbibliotheken mit besonders relevanten
Referenzspektren erstellt werden. Wird hier der Begriff „Bibliothek” verwendet,
so soll unter diesem Begriff auch eine solche Spezialbibliothek verstanden
werden können.
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Für
die Identifizierung einer Mikrobenprobe wird diese zunächst
nach dem gleichen standardisierten Verfahren wie für Referenzspektren
zu einer Kolonie angezüchtet, auf den Probenträger übertragen,
mit Matrixlösung präpariert und im Massenspektrometer
vermessen. Auch hier werden zweckmäßigerweise
mehrere Massenspektren gemessen und in ähnlicher Weise
wie bei den Referenzspektren zu einem gemittelten Massenspektrum
zusammengefasst, das hier als „Probenspektrum” bezeichnet
wird. Das Probenspektrum wird beispielsweise auf maximal 100 Massensignale
eingeschränkt.
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In
der ersten Stufe des erfindungsgemäßen Identifizierungsverfahrens
werden nun in einer ersten Ähnlichkeitsanalyse wie üblich
die Maßzahlen für die Ähnlichkeiten der
Referenzspektren der Bibliothek zum Probenspektrum berechnet. Das
eingangs bereits kurz geschilderte einfache Berechnungsverfahren
für diese Ähnlichkeitsmaßzahlen geht
von drei Teilmaßen aus: Ein erstes Teilmaß der Ähnlichkeitsmaßzahl
wird durch die Anzahl der sich jeweils innerhalb eines Massentoleranzintervalls
treffenden Massensignale („Treffer”) in Mikrobenspektrum
und Referenzspektrum dargestellt, geteilt durch die Anzahl der Massensignale
im Referenzspektrum, wobei aber alle Massensignale jeweils nur anteilig
mit ihrer Präsenz gezählt werden. Das Massentoleranzintervall kann
absolut in atomaren Masseneinheiten (oder Dalton) oder aber als
relative Größe in ppm (part per million) angegeben
werden. Als günstig hat sich ein Massentoleranzintervall
von 250 ppm erwiesen. Ein zweites Teilmaß ergibt sich aus
der Trefferzahl geteilt durch die Anzahl der Massensignale im Mikrobenspektrum,
wahlweise wiederum anteilig gezählt mit den Präsenzen.
Das dritte Teilmaß wird aus der Ähnlichkeit der
jeweiligen Intensitäten der sich treffenden Massensignale
zueinander berechnet, wobei wiederum die Präsenzen multiplikativ
berücksichtigt werden. Dieses dritte Teilmaß wird
für alle Massensignale so normiert, dass bei Gleichheit
aller Intensitäten das Teilmaß den Wert 1,00 annimmt.
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Diese
drei Teilmaße werden nun einfach miteinander multipliziert
und ergeben so die Maßzahl für die Ähnlichkeit
zwischen Referenz- und Mikrobenspektrum. Da jedes der drei Teilmaße
maximal den Wert 1,00 annehmen kann, kann auch die Ähnlichkeitsmaßzahl
maximal den Wert 1,00 annehmen.
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Es
hat sich nun in Tausenden von Identifizierungen herausgestellt,
dass eine sichere Identifizierung praktisch immer mit einem Ähnlichkeitswert
größer als 0,10 verbunden ist. Um zu handlicheren
Größen zu kommen, kann durch eine Multiplikation
mit dem Wert 1000 und eine nachfolgende Logarithmisierung eine Transformation
vorgenommen werden, die eine maximale Ähnlichkeitsmaßzahl
von 3,00 für identische Spektren und eine minimal für
eine Identifizierung erforderliche Ähnlichkeitsmaßzahl
von 2,00 ergibt. Diese Transformation ist nicht essentiell, sie hat,
wie bereits oben angemerkt, nur psychologischen Wert; es können
daher auch beliebige andere Transformationen angewandt werden, wenn
sich diese als handhabbarer erweisen sollten.
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Dieser
Ablauf der Berechnung der Ähnlichkeitsmaßzahlen
kann in einen sehr schnell arbeitenden Algorithmus umgesetzt werden,
mit dem in gängigen Rechnern Tausende von Ähnlichkeitsmaßzahlen
in nur wenigen Sekunden berechnet werden können. Bei einstufigen
Verfahren wird jetzt üblicherweise eine Liste der besten Ähnlichkeiten
herausgegeben, mit Namen der zugehörigen Mikrobenarten,
Unterarten und Zuchtstämmen, geordnet nach abfallenden Ähnlichkeitsmaßzahlen.
Diese Liste kann bei zweistufigen Verfahren an dieser Stelle entfallen.
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Die
zweite Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens
beginnt mit der Auswahl einer Gruppe von Referenzspektren, die allein
an der zweiten Stufe teilnimmt. Die Auswahl kann optional eine feste
Anzahl von Referenzspektren höchster Ähnlichkeit
umfassen, wobei die feste Anzahl beispielsweise zwischen drei und
fünfzehn, vorzugsweise zwischen vier und acht liegen kann.
Die Auswahl kann sich optional aber auch auf die Differenzen zwischen
den Ähnlichkeitsmaßzahlen stützen, wobei
die Anzahl durch deutliche Sprünge in der Abstufung der Ähnlichkeitsmaßzahlen
oder durch die Summe der Differenzen zwischen den abnehmenden Ähnlichkeitsmaßzahlen bestimmt
werden kann. Liegen mehrere Referenzspektren einer gleichen Unterart
vor, so können die typischsten dieser Referenzspektren
ausgewählt werden, wenn diese in der Bibliothek als solche
markiert sind. Die Auswahl kann aber auch, wenn im Verfahren durch
eine weitere Option vorgegeben, alle oder ausgewählte Unterarten
und Stämme einer Mikrobenart umfassen (oder alle Arten
einer Gattung), wenn eine solche Mikrobenart (oder Gattung) durch die ähnlichsten
Referenzspektren der ersten Stufe nahegelegt wird. Es können
auch dabei die typischsten Referenzspektren für Arten oder
Unterarten ausgewählt werden, soweit diese in der Referenzbibliothek
als solche markiert sind.
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Die
Ermittlung der Differenzierungsgewichte für die ausgewählte
Gruppe der Referenzspektren erfolgt wie oben beschrieben. Die Differenzierungsgewichte
werden in die Spalte der Präsenzen eingetragen und in ihrer
Größe den bereits vorhandenen Werten angepasst.
Da die hier eingetragenen Werte in die Zählung sowohl der
Dividenden (Zähler) wie auch der Divisoren (Nenner) der
Teilmaßzahlen eingehen, kann das bisherige Verfahren zur
Berechnung der Ähnlichkeitsmaßzahlen ohne Änderung
beibehalten werden.
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Mit
der Gruppe neuer Referenzspektren wird nun die zweite Stufe durchlaufen,
in der für jedes der neuen Referenzspektren die Maßzahl
der Ähnlichkeit zum Probenspektrum berechnet wird. Die
Gruppe der neuen Referenzspektren kann dabei als Spezialbibliothek
verstanden werden, die dem Algorithmus der Ähnlichkeitsanalyse
zu Verfügung gestellt wird. Anschließend wird
eine Hitliste der ähnlichsten Referenzspektren herausgegeben,
geordnet nach absteigenden Ähnlichkeitsmaßzahlen.
Durch die Differenzierungsgewichte in den neuen Referenzspektren gelingt
es in den überaus meisten Fällen, in der zweiten
Stufe des Identifizierungsverfahrens eine eindeutige Identifizierung
herbeizuführen, die beispielsweise durch eine vorgegebene
Mindestdifferenz der höchsten Ähnlichkeitsmaßzahl
zur zweithöchsten gegeben ist. Die letztgültige
Entscheidung darüber, ob die Identifizierung ausreichend
gut ist, wird aber bei einem Fachmann liegen, der bei Bedarf auch
die zweite Stufe mit veränderter Auswahl der Gruppe der Referenzspektren
neu starten kann.
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Die
zweite Stufe des Verfahrens muss aber nicht immer durchlaufen werden. Über
die Fortführung der Identifizierung in einer zweiten Stufe
kann, wenn als Option eingeschaltet, eine Prüfung auf eine bereits
vorliegende genügend eindeutige Identifizierung der Mikrobe
entscheiden, die zwischen den Schritten c) und d) eingefügt
werden kann. Dabei kann, je nach Ziel der Analyse, eine genügend
eindeutige Identifizierung schon dann vorliegen, wenn durch eine
Mehrzahl an ähnlichen Referenzspektren nur die Mikrobenart
identifiziert wird, nicht eine der Unterarten. Es kann durchaus
vorkommen, dass für den Zweck der Analyse die Unterart
oder der Zuchtstamm nicht interessieren, beispielsweise, weil sich die
Unterarten in ihrer Schädlichkeit und in ihrer Bekämpfungsart
nicht unterscheiden. Die zweite Stufe kann dann entfallen. Die Prüfung
kann automatisch, aber auch durch einen versierten Benutzer erfolgen.
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Die
Prüfung durch einen versierten Fachmann kann anhand einer
nach Ähnlichkeitsmaßzahlen geordneten Hitliste
der Referenzspektren vorgenommen werden, die (wie bei einstufigen
Verfahren üblich) nach der ersten Stufe erstellt wurde.
Sind sich die größten Ähnlichkeitsmaßzahlen
alle sehr ähnlich, so kann der Fachmann darüber
entscheiden, ob das Verfahren mit seiner zweiten Stufe fortgesetzt
werden soll. Zu dieser Entscheidung können insbesondere
seine Kenntnisse über die verschiedenen Schädlichkeiten
der Mikrobenunterarten beitragen. Entscheidet sich der Fachmann
für eine Fortführung des Verfahrens, so kann er
auch leicht die Gruppe der Referenzspektren auswählen,
die für die Berechnung neuer Differenzierungsgewichte verwendet werden
sollen. Die Auswahl kann beispielsweise durch Anklicken der Referenzspektren
in der Liste auf dem Bildschirm erfolgen. Er kann aber auch alle zu
einem Stamm verwandten Arten oder Unterarten auswählen.
In den meisten Fällen liefert die erste Stufe bereits viele
Unterarten einer einzigen Mikrobenart als ähnlichste Referenzspektren.
Diese Gruppe kann der Fachmann beispielsweise durch die Referenzspektren
weiterer Unterarten ergänzen. Nach der Auswahl kann der
Fachmann dann die zweite Stufe des Verfahrens starten.
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Die
Prüfung auf ausreichend gute Identifizierung kann aber
auch automatisch erfolgen, beispielsweise durch eine Analyse der
Differenzen der höchsten Ähnlichkeitsmaßzahlen
und deren absoluter Größe. Unterschreiten diese
Differenzen eine vorgegebene Toleranzschwelle, oder liegen die Werte
unterhalb des Minimalwerts für die Ähnlichkeitsmaßzahl, so
wird automatisch eine Gruppe von Referenzspektren ausgewählt,
und die zweite Stufe des Verfahrens wird gestartet. Diese Feinanalyse
mag beispielsweise nicht notwendig sein, wenn keine besondere Schädlichkeit
einzelner Unterarten einer ansonsten unschädlichen Mikrobenart
vorliegt.
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Ein
zweistufiges Verfahren ohne jede Prüfung oder mit einer
automatischen Prüfung auf eine ausreichende Identifizierung
nach der ersten Stufe führt zu einem geschlossen ablaufenden
Verfahren. Diese Ausführungsform wird hier eindeutig bevorzugt,
da sie viele Vorteile bietet; sie benötigt insbesondere
keinen Fachmann für eine Zwischenbeurteilung. Sie dauert
nur Bruchteile von Sekunden oder höchstens einige Sekunden
länger als die bisherigen einstufigen Verfahren. Es findet
eine automatische und dynamische Anpassung des Verfahrens an das individuelle
Probenspektrum statt, da dieses über die Ähnlichkeitsmaßzahlen
der ersten Stufe die Auswahl der Referenzspektren für die
zweite Stufe beeinflusst. Bei wachsender Referenzbibliothek wird
die Identifizierung automatisch verfeinert. Der Fachmann für
die Beurteilung der Identifizierung wird erst nach der zweiten Stufe
gebraucht. In der Regel ist dann eine so gute Identifizierung nach
Art, Unterart oder sogar nach Stamm gegeben, dass der Fachmann die Identifizierung
akzeptieren kann.
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Der
größte Vorteil des zweistufigen Verfahren nach
dieser Erfindung liegt aber darin, dass die Differenzierungsspektren
nicht dauernd in der Referenzbibliothek gespeichert werden, sondern
jedes Mal neu berechnet werden. Das ist einerseits unabdingbar wichtig
für eine Validierung der Referenzbibliothek, andererseits
ergibt es die dynamische Anpassung des Verfahrens an jedes individuelle
Probenspektrum.
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Die
Güte eines jeden Identifizierungsverfahrens kann nur in
breit angelegten Studien geprüft werden, in der sehr genau
bekannte Mikrobenproben in verschiedenen Laboratorien mit verschiedenen
Instrumenten analysiert werden. Dabei werden insbesondere die Fehlerraten
des Verfahrens bestimmt. Studien dieser Art haben bereits für
die einstufige Form des oben detailliert beschriebenen Identifizierungsverfahrens
sehr gute Ergebnisse erbracht, wobei in strittigen Fällen
häufig sogar die Identifizierungen mit klassischen Identifizierungsmethoden
korrigiert werden mussten. Die Erfahrungen aus diesen Studien sind
in die gegenwärtige Erfindung eingeflossen.
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In
den oben geschilderten Verfahren wurden die Massenspektren der Mikroben
in Massenspektrometern mit Ionisierung durch matrix-unterstützte
Laserdesorption (MALDI) aufgenommen. Das ist zwar üblich,
jedoch nicht zwingend. Aufschlussflüssigkeiten von Mikroben
können beispielsweise auch durch Elektrosprühen
ionisiert werden, entweder bei Atmosphärendruck oder bei
niedrigerem Druck von einigen Tausend Pascal. Durch diese Art der
Ionisierung entstehen starke Überlagerungen von vielfach
geladenen Ionen, die zwingend ein Massenspektrometer mit hoher Auflösung
erfordern. Die vielfach geladenen Ionen finden sich alle im Massenbereich
von etwa 600 Dalton bis 1600 Dalton. Beispielsweise werden aus einem
Protein der Masse 3000 Dalton überwiegend zwei-, drei-
und vierfach geladene Ionen mit den ladungsbezogenen Massen von
m/z = 1501, 1001 und 751 Dalton gebildet; aus einem Protein der
Masse 15000 Dalton werden etwa 10- bis 20-fach geladene Ionen mit
einem Maximum bei 14-fach geladenen Ionen gebildet. Die 50 bis 100 Proteine
bilden also einen wirren Haufen an Ionen in einem relativ engen
Massenbereich, der jedoch in einem Massenspektrometer mit sehr hohem
Massenauflösungsvermögen von R > 40000 meist recht
gut aufgelöst werden kann. Aus dem Abstand der Massensignale
einer Isotopengruppe kann die Ladung z bestimmt werden, und damit
lässt sich eine Liste der Proteinionen erstellen, in der
die Ionen verschiedener Ladungsstufen und verschiedener Isotopenzusammensetzungen
jeweils zu einem Eintrag zusammengefasst sind. Diese Liste bildet
dann das Spektrum der Mikroben. Als Massenspektrometer können hier
Flugzeitmassenspektrometer mit orthogonalem Ioneneinschuss (OTOF-MS),
aber auch Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometer (ICR-MS) oder andere
hochauflösende Massenspektrometer Verwendung finden.
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Die
Aufschlussflüssigkeiten der Mikroben können der
Elektrosprüh-Ionenquelle auch über eine kurze
HPLC-Säule zugeführt werden, also flüssigkeitschromatographisch
getrennt. Schon durch eine geringe chromatographische Auftrennung
nimmt der Wirrwarr der Massensignale stark ab, so dass die rechnerische
Zusammenfassung der verschiedenen Ladungsstufen und Isotopensignale
der Proteinionen besser gelingt.
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Statt
der rechnerischen Zusammenfassung der Ladungsstufen der Ionen kann
auch eine physikalisch Ladungsverminderung durchgeführt
werden. Dazu werden positiv geladene Proteinionen in einem Ionenreaktor,
der sich zwischen Elektrosprüh-Ionenquelle und Analysator
befindet, mit geeigneten negativ geladenen Ionen zusammengebracht,
woraufhin eine Deprotonierung der Proteinionen stattfindet. Da die
Wirkungsquerschnitte für die Deprotonierung dem Quadrat
z2 der Ladungszahl z proportional sind, lässt
sich der Vorgang gut beenden, wenn praktisch nur noch einfach geladene
Ionen übrig sind. Diese werden dem Massenspektrometer zugeführt,
das aber einen hohen Massenbereich verkraften können muss.
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Es
sind auch noch weitere Verfahren der Ionisierung bekannt, die hier
eingesetzt werden können. Ein günstiges Verfahren
ist beispielsweise die chemische Ionisierung bei Atmosphärendruck
(APCI). Die Moleküle werden der chemischen Ionisierung
durch Versprühen einer Flüssigkeit mit Verdampfung
der Tröpfchen oder durch schwache, nicht ionisierende Laserdesorption
(„Laserablation”) zugeführt. Die chemische
Ionisierung liefert praktisch nur einfach geladene Ionen und ist
daher sehr günstig, erfordert aber ebenfalls ein Massenspektrometer
mit genügend hohem Massenbereich.
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Die
hier geschilderten Verfahren können vom einschlägigen
Fachmann in Kenntnis der Erfindung in vielfältiger Weise
abgeändert werden. Einige dieser Variationen sind bereits
oben geschildert; es gibt aber durchaus weitere Verfahren, die auf
der grundlegenden Basis einer zwei oder auch mehrstufigen Identifizierung
durchgeführt werden können.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- - DE 102004051043
A1 [0014, 0049]
- - GB 2419737 B [0014]
- - US 7391017 B2 [0014]
- - DE 10038694 A1 [0026]
- - DE 10300743 A1 [0027]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- - van Baar (FEMS
Microbiology Reviews, 24, 2000, 193–219: „Characterization
of bacteria by matrix-assisted laser desorption/ionization and electrospray
mass spectrometry”) [0007]
- - M. Kostrzewa et al. [0014]
- - Jarman et al. (Analytical Chemistry, 72(6), 2002, 1217–1223: ”An
Algorithm for Automated Bacterial Identification Using Matrix-Assisted
Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry”) [0020]
- - Jarman et al. [0021]
- - Jarman et al. [0022]
- - Jarman et al., [0024]