DE102014012367B3

DE102014012367B3 - Verfahren zum Bestimmen der Konzentration von Glucoraphanin und/oder von Sulforaphan in einer Pflanze

Info

Publication number: DE102014012367B3
Application number: DE102014012367.7A
Authority: DE
Inventors: Sonja Bednar; Holger Klapproth; Robert Seidel
Original assignee: QFOOD GmbH; DE SMAAKMAKER HOLDING BV; Smaakmaker Holding De BV
Current assignee: QFOOD GmbH; DE SMAAKMAKER HOLDING BV; Smaakmaker Holding De BV
Priority date: 2014-08-25
Filing date: 2014-08-25
Publication date: 2015-08-27
Anticipated expiration: 2034-08-26
Also published as: US10444212B2; EP3186629A1; WO2016029998A1; US20170205384A1

Abstract

Bei einem Verfahren zum Bestimmen der Konzentration von Glucoraphanin in einer Pflanze, wird eine Probe der Pflanze bereitgestellt, die Probe mit einem polaren, ungeladenen organischen Lösungsmittel in Kontakt gebracht und derart zerkleinert, dass in der Probe enthaltenes Glucoraphanin und weitere in der Probe enthaltene Pflanzenstoffe in dem Lösungsmittel gelöst werden, und aus dem so erhaltenen Extrakt werden ungelöste Pflanzenbestandteile entfernt, um das Extrakt zu klären. Es wird eine UV-Absorptionsmessung des geklärten, das Glucoraphanin und die weitere Pflanzenstoffe enthaltenen Extrakts durchgeführt, bei der für einen ersten Wellenlängenbereich zwischen 200 nm und 270 nm ein Absorptionsmesssignal a(λ) erfasst wird. Die zweite d2a(λ)/dλ2 Ableitung des Absorptionsmesssignal a(λ) wird für einen zweiten einen Wellenlängenbereich zwischen 240 nm und 250 nm gebildet. Es wird der Betrag des Minimums der zweiten Ableitung im zweiten Wellenlängenbereich bestimmt und in Abhängigkeit von diesem Betrag wird ein Konzentrationswert für die Konzentration des Glucoraphanins ermittelt.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Bestimmen der Konzentration von Glucoraphanin in einer Pflanze, wobei

a) eine Probe der Pflanze bereitgestellt wird,
b) die Probe mit einem polaren, ungeladenen organischen Lösungsmittel in Kontakt gebracht und derart zerkleinert wird, dass in der Probe enthaltenes Glucoraphanin und weitere in der Probe enthaltene Pflanzenstoffe in dem Lösungsmittel gelöst werden, und
c) aus dem so erhaltenen Extrakt ungelöste Pflanzenbestandteile entfernt werden, um das Extrakt zu klären.

Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Bestimmen der Konzentration von bioverfügbaren Sulforaphan in einer Pflanze, wobei die Pflanze Glucoraphanin und ein räumlich davon getrenntes Spaltungsenzym enthält, bei dessen Kontakt mit dem Glucoraphanin die Pflanze Sulforaphan bildet.
Ein derartiges Verfahren zum Bestimmen der Konzentration von Glucoraphanin ist aus der Praxis bekannt. Dabei wird eine der zu untersuchenden Pflanze bereitgestellt und in einem Aceton enthaltenden Lösungsmittel derart zerkleinert, dass in der Probe enthaltenes Glucoraphanin in dem Lösungsmittel gelöst wird. Danach wird das so erhaltenen Extrakt zunächst geklärt und aufgereinigt und dann wird eine Flüssigchromatographie durchgeführt, bei der das Extrakt unter hohem Druck durch eine Säule transportiert wird. Entlang der Säule werden unterschiedliche, in dem Extrakt enthaltene Moleküle voneinander getrennt. Die Säule wird mit UV-Licht bestrahlt, das von den Molekülen absorbiert wird. Die Anwesenheit der Glucoraphanin-Moleküle an einer vorbestimmten Stelle der Säule wird mit Hilfe eines im UV-Bereich empfindlichen optischen Sensors detektiert. Die Glucoraphanin-Moleküle werden dann in einem weiteren Verfahrensschritt durch Massenspektrometrie quantifiziert.
Das vorbekannte Verfahren wird insbesondere zum Untersuchen von Bokkolikresse bzw. Brokkolisprossen verwendet. Bokkolikresse verfügt über einen besonders hohen Gehalt an Glucoraphanin und enthält außerdem ein räumlich davon getrenntes Spaltungsenzym, das beim Verletzen der Pflanze mit dem Glucoraphanin in Kontakt gerät. Dabei wird das Glucoraphanin in Sulforaphan und einen Zuckerrest gespalten. Das Sulforaphan dient eigentlich dazu, Fressfeinde von der Pflanze abzuhalten. Untersuchungen haben jedoch ergeben, dass Lebensmittel, die Sulforaphan in ausreichender Konzentration enthalten, auch für die menschliche Gesundheit förderlich sind. Daher wird Bokkolikresse bevorzugt für klinische Studien verwendet. Damit die Studien vergleichbar sind, muss die Konzentration des Glucoraphanin und insbesondere die des bioverfügbaren Sulforaphans in der Bokkolikresse möglichst genau bekannt sein. Dabei wird unter der Konzentration des bioverfügbaren Sulforaphans die Konzentration des Sulforaphans verstanden, das die Pflanze selbst bilden kann, wenn das in der Pflanze enthaltene Glucoraphanin mit dem ebenfalls in der Pflanze enthaltenen Spaltungsenzym in Kontakt gerät.
Das vorbekannte Verfahren zur Bestimmung der Konzentration des Glucoraphanins hat den Nachteil, dass seine Durchführung relativ umständlich und zeitaufwändig ist und dass Großgeräte benötigt werden, die üblicherweise nur in einem entsprechend ausgestatteten Labor vorhanden sind. Ungünstig ist außerdem, dass die benötigten Analysegeräte wartungsintensiv sind und dass für die Durchführung des Verfahrens entsprechend qualifiziertes Personal erforderlich ist. Ein Verfahren zum Bestimmen der Konzentration von bioverfügbarem Sulforaphan der eingangs genannten Art ist nach Kenntnis der Anmelder bislang noch nicht bekannt.
Aus US 200810 131 578 A1 ist ferner ein Verfahren zur Analyse von Glucosinolaten mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit reverse-phase Säulen und anderen Chromatographiesäulen und anschlißeßender Detektion im ultravioletten und sichtbaren Wellenlängenbereich bekannt. Auch andere Nachweisverfahren (post HPLC), wie z. B. Massenspektroskopie oder Kernspinresonanz, werden genannt aber nicht weiter beschrieben.
Die US 2008/0 176 942 A1 lehrt die Stabilisierung von Suforaphan mit Cyclodextrinen und deren Analyse durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie und UV-Detektion nach der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie.
Fred. A. Mellon et al., Analytical Biochemistry Vol. 306 (2002), Seiten 83 bis 91 lehrt die Analytik von Glucosinolaten mittels Flüssigchromatograpie und anschließender Massenspektrometrie.
Aus Winkler et al., Postharvest Biology and Technoloy Vol. 43 (2007), Seiten 89 bis 94 ist ferner ein Verfahren zur Analyse von Glucosinolaten bekannt, bei dem nach einer Extraktion durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Aufreinigung eine spektroskopische Messung durchgeführt wird, bei der ultraviolette und sichtbare optische Strahlung mittels einer Diodenzeile detektiert wird.
Es besteht deshalb die Aufgabe, ein Verfahren der eingangs genannten Art zu schaffen, das es ermöglicht, die Konzentration von Glucoraphanin einer Pflanze auf einfache Weise zu bestimmen. Ferner besteht die Aufgabe, ein Verfahren anzugeben, das eine einfache Bestimmung der Konzentration von bioverfügbarem Sulforaphan in einer Pflanze ermöglicht.
Diese Aufgabe wird bezüglich des Verfahrens zum Bestimmen der Konzentration von Glucoraphanin in einer Pflanze mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst. Diese sehen folgende Verfahrensschritte vor.

a) Es wird eine Probe der Pflanze bereitgestellt,
b) die Probe wird mit einem polaren, ungeladenen organischen Lösungsmittel in Kontakt gebracht und derart zerkleinert, dass in der Probe enthaltenes Glucoraphanin und weitere in der Probe enthaltene Pflanzenstoffe in dem Lösungsmittel gelöst werden,
c) aus dem so erhaltenen Extrakt werden ungelöste Pflanzenbestandteile entfernt, um das Extrakt zu klären,
d) es wird eine UV-Absorptionsmessung des geklärten, das Glucoraphanin und die weitere Pflanzenstoffe enthaltenen Extrakts ohne eine chromatographische Aufreinigung des Extrakts durchgeführt, bei der für einen ersten Wellenlängenbereich, der sich von 200 nm bis 270 nm erstreckt, ein Absorptionsmesssignal erfasst wird,
e) es wird die zweite Ableitung des Absorptionsmesssignals für einen zweiten Wellenlängenbereich zwischen 240 nm und 250 nm gebildet, und
f) es wird der Betrag des Minimums der zweiten Ableitung im zweiten Wellenlängenbereich bestimmt und in Abhängigkeit von diesem Betrag wird ein Konzentrationswert für die Konzentration des Glucoraphanins ermittelt.

Überraschenderweise ist es durch die Bildung der zweiten Ableitung des Absorptionsmesssignal möglich, den Einfluss der im Lösungsmittel gelösten weiteren Pflanzenstoffe auf das Messergebnis zu kompensieren. Dadurch ist es möglich, mit dem Extrakt direkt eine UV-Absorptionsmessung durchzuführen, ohne dass das Extrakt dazu aufgereinigt werden muss. In vorteilhafter Weise ist das erfindungsgemäße Verfahren mit geringem apparativem Aufwand beispielsweise mittels eines entsprechenden Handgeräts auf einfache Weise durchführbar. Dabei ist es sogar möglich, das Verfahren am Anbauort der zu untersuchenden Pflanze, wie zum Beispiel auf einem Feld oder in einem Gewächshaus, durchzuführen. Da sich das erfindungsgemäße Verfahren leicht automatisieren lässt, kann es auch von Personen, die im Umgang mit Analysegeräten keine besondere Qualifikation aufweisen, zuverlässig und schnell durchgeführt werden.
Bei einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung wird das Absorptionsmesssignal glättungsgefiltert und die zweite Ableitung wird aus dem glättungsgefilterten Absorptionsmesssignal gebildet. Durch die Glättungsfilterung, die eine Tiefpassfilterung umfassen kann, können Hintergrundrauschen und dergleichen Störungen unterdrückt werden, so dass sie die Messgenauigkeit nicht oder nur noch unwesentlich beeinträchtigen. Als Glättungsfilter kann beispielsweise ein Savitzky-Golay Filter verwendet werden.
Bei einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung enthält die Pflanze zusätzlich zu dem Glucoraphanin ein räumlich davon getrenntes Spaltungsenzym, bei dessen Kontakt mit dem Glucoraphanin die Pflanze Sulforaphan bildet, wobei

a) eine erste Probe der Pflanze bereitgestellt wird und mit einem Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 ein erster Konzentrationswert für die Konzentration des Glucoraphanins in der ersten Probe ermittelt wird,
b) wobei eine zweite Probe der Pflanze bereitgestellt wird,
c) wobei die zweite Probe derart zerkleinert wird, dass das Glucoraphanin mit dem Spaltungsenzym in Kontakt gerät,
d) wobei eine vorbestimmte Zeitdauer abgewartet wird, die derart bemessen ist, dass in der zweiten Probe das Sulforaphan gebildet und verdunstet wird,
e) wobei die zweite Probe derart mit einem polaren, ungeladenen organischen Lösungsmittel in Kontakt gebracht wird, dass in der zweiten Probe enthaltenes Glucoraphanin und weitere in der Probe enthaltene Pflanzenstoffe in dem Lösungsmittel gelöst werden,
f) wobei für die zweite Probe die Verfahrensschritte mit den Merkmalen c) bis f) aus Anspruch 1 durchgeführt werden, und
g) wobei als Konzentrationswert für die Konzentration des bioverfügbaren Sulforaphans der Pflanze die Differenz aus dem für die erste Probe ermittelten Konzentrationswert und dem für die zweite Probe ermittelten Konzentrationswert bestimmt wird.

Es werden also mindestens zwei Versuche durchgeführt, wobei bei mindestens einem ersten Versuch die Probe gleich nach ihrer Entnahme aus der Pflanze mit dem Lösungsmittel in Kontakt gebracht wird, derart dass das Glucoraphanin nicht oder nur so kurz mit dem Spaltungsenzym im Kontakt gerät, sodass kein oder nur ein sehr geringer Anteil des Glucoraphanins in Sulforaphan und einen Zuckerrest gespalten wird und sich verflüchtigt. Außerdem wird mindestens ein zweiter Versuch durchgeführt, bei dem die Probe gleich nach ihrer Entnahme aus der Pflanze zunächst zerkleinert wird, so dass in der Probe enthaltene Glucoraphanin mit dem Spaltungsenzym in Kontakt gerät. Dabei wird außer dem bereits in der Pflanzen-Probe enthaltenen Spaltungsenzym kein weiteres Spaltungsenzym zugegeben. Nachdem sich das Sulforaphan verflüchtigt hat, wird die Probe mit dem Lösungsmittel in Kontakt gebracht, so dass sich dann nur noch derjenige Teil des ursprünglich in der Probe vorhandenen Glucoraphanin in dem Lösungsmittel löst, der nicht durch das Spaltungsenzym in Sulforaphan und den Zuckerrest gespalten und verdunstet wurde.
Bei dem ersten und zweiten Versuch wird jeweils die Konzentration des Glucoraphanins gemessen und aus den so erhaltenen Konzentrationswerten wird die Differenz gebildet. Diese Differenz entspricht der Konzentration des Glucoraphanins, aus dem bei einem Kontakt mit dem in der Probe enthaltenen Spaltungsenzym Sulforaphan gebildet werden kann, also der Konzentration des bioverfügbaren Sulforaphans der Pflanze.
Bei einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung wird das in Schritt d) von Anspruch 1 und/oder das in Schritt f) von Anspruch l erfasste Absorptionsmesssignal mit einem Grenzwert verglichen, wobei für den Fall, dass das Absorptionsmesssignal den Grenzwert überschreitet, das Extrakt entsprechend einem Verdünnungsfaktor verdünnt und Schritt d) aus Anspruch 1 mit dem verdünnten Extrakt wiederholt wird, wobei der Verdünnungsfaktor derart gewählt wird, dass das Absorptionsmesssignal des verdünnten Extrakts den Grenzwert nicht überschreitet, und wobei die Schritte e) und f) aus Anspruch 1 mit dem Absorptionsmesssignal des verdünnten Extrakts durchgeführt und in Schritt f) von Anspruch 1) der Verdünnungsfaktor bei der Ermittlung der Konzentration des Glucoraphanins in der Pflanze berücksichtigt wird. Der Grenzwert wird bevorzugt derart gewählt, dass das bei der Absorptionsmessung erfasste Messsignal kleiner ist, als der Wert, bei dem die Absorptionsmessung in die Begrenzung gerät. Der Grenzwert liegt bevorzugt zwischen 2 und 3.
Die vorstehend genannte Aufgabe kann bezüglich der Bestimmung der Konzentration des bioverfügbarem Sulforaphans auch mit den Merkmalen des Anspruchs 6 gelöst werden. Dieser sieht folgende Verfahrensschritte vor:

a) Es wird eine erste Probe der Pflanze bereitgestellt,
b) die erste Probe wird mit einem polaren, ungeladenen organischen Lösungsmittel in Kontakt gebracht und derart zerkleinert, dass in der Probe enthaltenes Glucoraphanin und weitere in der Probe enthaltene Pflanzenstoffe in dem Lösungsmittel gelöst Werden,
c) aus dem so erhaltenen ersten Extrakt werden ungelöste Pflanzenbestandteile entfernt, um das erste Extrakt zu klären,
d) es wird eine zweite Probe der Pflanze bereitgestellt,
e) die zweite Probe wird derart zerkleinert, dass das Glucoraphanin mit dem Spaltungsenzym in Kontakt gerät,
f) es wird eine vorbestimmte Zeitdauer abgewartet, die derart bemessen ist, dass sich in der zweiten Probe Sulforaphan bildet und verdunstet,
g) die zweite Probe wird derart mit einem polaren, ungeladenen organischen Lösungsmittel in Kontakt gebracht, dass in der zweiten Probe enthaltenes Glucoraphanin und weitere in der Probe enthaltene Pflanzenstoffe in dem Lösungsmittel gelöst werden,
h) aus dem so erhaltenen zweiten Extrakt werden ungelöste Pflanzenbestandteile entfernt, um das zweite Extrakt zu klären,
i) es wird eine erste UV-Absorptionsmessung des geklärten ersten, das Glucoraphanin und die weitere Pflanzenstoffe enthaltenen Extrakts ohne eine chromatographische Aufreinigung des Extrakts durchgeführt, bei der für einen ersten Wellenlängenbereich zwischen 200 nm und 270 nm ein erstes Absorptionsmesssignal erfasst wird,
j) es wird eine zweite UV-Absorptionsmessung des geklärten zweiten, das Glucoraphanin und die weitere Pflanzenstoffe enthaltenen Extrakts ohne eine chromatographische Aufreinigung des Extrakts durchgeführt, bei der für den ersten Wellenlängenbereich ein zweites Absorptionsmesssignal erfasst wird,
k) es wird ein Differenzsignal aus dem ersten Absorptionsmesssignal und dem zweiten Absorptionsmesssignal gebildet,
l) es wird die zweite Ableitung des Differenzsignals für einen zweiten Wellenlängenbereich zwischen 240 nm und 250 nm gebildet, und
m) es wird der Betrag des Minimums der zweiten Ableitung des Differenzsignals im zweiten Wellenlängenbereich bestimmt und in Abhängigkeit von diesem Betrag wird ein Konzentrationswert für die Konzentration des Sulforaphans ermittelt.

Der Konzentrationswert für die Konzentration des von der Pflanze bereitstellbaren bioverfügbaren Sulforaphans kann also auch dadurch ermittelt werden, dass zunächst die Differenz aus den beim ersten und zweiten Versuch gemessenen Absorptionsmesssignalen gebildet wird, und dass dann die zweite Ableitung des Differenzsignals gebildet und in dem Wellenlängenbereich zwischen 240 nm und 250 nm der Betrag des Minimums der zweiten Ableitung ermittelt wird. Auch bei diesem Verfahren kann mit den bei den Versuchen hergestellten Extrakten direkt die UV-Absorptionsmessung durchgeführt werden, ohne dass die Extrakte zuvor aufgereinigt werden müssen. Das Verfahren ist auf einfache Weise durchführbar und lässt sich gut automatisieren.
Bei einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird das in Schritt i) von Anspruch 6 erfasste Absorptionsmesssignal mit einem Grenzwert verglichen, wobei für den Fall, dass das Absorptionsmesssignal den Grenzwert überschreitet, das Extrakt entsprechend einem Verdünnungsfaktor verdünnt und Schritt i) aus Anspruch 6 mit dem verdünnten Extrakt wiederholt wird, wobei der Verdünnungsfaktor derart gewählt wird, dass das Absorptionsmesssignal des verdünnten Extrakts den Grenzwert nicht überschreitet, und dass in Schritt k) aus Anspruch 6 als erstes Absorptionsmesssignal das mit dem Verdünnungsfaktor multiplizierte Absorptionsmesssignal des verdünnten Extrakts verwendet wird. Der Grenzwert wird dabei bevorzugt derart gewählt, dass das bei der Absorptionsmessung erfasste Messsignal kleiner ist, als der Wert, bei dem die Absorptionsmessung in die Begrenzung gerät. Der Grenzwert liegt bevorzugt zwischen 2 und 3.
Vorteilhaft ist, wenn das die Absorptionsmesssignal und/oder das Differenzsignal glättungsgefiltert wird und wenn die zweite Ableitung aus dem glättungsgefilterten Differenzsignal gebildet wird. Durch die Glättungsfilterung, die eine Tiefpassfilterung umfassen kann, können Hintergrundrauschen und dergleichen Störungen unterdrückt werden, so dass sie die Messgenauigkeit nicht oder nur noch unwesentlich beeinträchtigen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens ist die Pflanze Brokkolikresse. Diese weist einen besonders hohen Gehalt an Glucoraphanin und bioverfügbarem Sulforaphan auf
Als Lösungsmittel wird bevorzugt Methanol verwendet. Das Lösungsmittel kann dann nach seiner Verwendung umweltverträglich entsorgt werden.
Nachstehend ist die Erfindung anhand eines Ausführungsbeispiels näher erläutert. Es zeigen
1 eine graphische Darstellung eines Absorptionsmesssignals a(λ) sowie seiner ersten Ableitung da(λ)/dλ und seiner zweiten Ableitung d²a(λ)/dλ², wobei auf der Abszisse die Wellenlänge in Nanometern und auf der Ordinate links die Absorption bzw. deren erste Ableitung und auf der Ordinate rechts die zweite Ableitung der Absorption aufgetragen sind, und
2 eine graphische Darstellung einer Kalibrierkurve, wobei auf der Abszisse die die zweite Ableitung der Absorption und auf der Ordinate die Konzentration von Glucoraphanin in einem Extrakt aufgetragen sind.
Bei einem Verfahren zum Bestimmen der Konzentration von Glucoraphanin in Brokkolikresse wird eine erste Probe der Brokkolikresse bereitgestellt wird, die eine Masse von 251 mg aufweist. Die Brokkolikresse enthält Glucoraphanin und ein räumlich davon getrenntes Spaltungsenzym, bei dessen Kontakt mit dem Glucoraphanin Sulforaphan gebildet wird. Außerdem sind in der Brokkolikresse weitere Pflanzenstoffe enthalten.
Die erste Probe wird mit einer ersten Menge Methanol, die eine Masse von 1760 mg aufweist, vermischt und derart püriert, dass das in der erste Probe enthaltene Glucoraphanin und die weiteren Pflanzenstoffe in dem Lösungsmittel gelöst werden. Aus dem so erhaltenen Extrakt werden ungelöste Pflanzenbestandteile durch Filtern und/oder Zentrifugieren geklärt.
Von dem geklärten Extrakt werden 18 mg entnommen und mit einer zweiten Menge Methanol, die eine Masse von 759 mg aufweist, vermischt, d. h. das Extrakt wird um den Faktor von 18/(18 + 759) = 1:43,2 verdünnt. Der Verdünnungsfaktor wird mit Hilfe eines Erwartungswerts für die Glucoraphanin-Konzentration derart bestimmt, dass ein bei einer in einem weiteren, noch näher zu beschreibenden Verfahrensschritt durchgeführten UV-Absorptionsmessung verwendetes Absorptionsmessgerät optimal ausgesteuert würde, wenn die Konzentration von Glucoraphanin in der Probe, mit dem Erwartungswert übereinstimmen würde.
Nun wird die bereits erwähnte UV-Absorptionsmessung des geklärten, das Glucoraphanin und die weitere Pflanzenstoffe enthaltenen, verdünnten Extrakts durchgeführt. Dabei wird für einen ersten Wellenlängenbereich, der sich von 200 nm bis 270 nm erstreckt, das in 1 dargestellte Absorptionsmesssignal a(λ) erfasst. Das Absorptionsmesssignal a(λ) hat eine Auflösung von 0.2 nm. Das Absorptionsmesssignal a(λ) wird mit einem Savitzky-Golay Filter geglättet, z. B. über 21 bis 31 Punkte der spektralen Auflösung.
Sollte das gemessene Absorptionsspektrum in dem ersten Wellenlängenbereich Messwerte oberhalb von 2,5 aufweisen, wird davon ausgegangen, dass das Absorptionsmessgerät in die Sättigung geraten ist. In diesem Fall wird der Versuch abgebrochen und es wird ein neuer erster Versuch durchgeführt, bei dem ein größerer Verdünnungsfaktor gewählt wird als beim ersten Versuch. Die vorstehend genannten Verfahrensschritte werden dabei in entsprechender Weise für den neuen Versuch durchgeführt.
Wenn das gemessene Absorptionsspektrum in dem ersten Wellenlängenbereich keine Messwerte oberhalb von 2,5 enthält, wird das Absorptionsmesssignal a(λ) in einem zweiten Wellenlängenbereich, der sich von 240 nm bis 250 nm erstreckt, mathematisch zweifach abgeleitet. Die erste Ableitung da(λ)/dλ und die zweite Ableitung d²a(λ)/dλ² sind in 1 graphisch dargestellt. Die können mit Hilfe eines Mikrocomputers numerisch berechnet werden. Bei Bedarf kann die zweifache Ableitung auch gemeinsam mit der Savitzky-Golay Glättung in einem Schritt geschehen.
In dem zweiten Wellenlängenbereich [240 nm...250 nm] wird der Betrag des Minimums M der zweiten Ableitung d²a(λ)/dλ² des Absorptionsmesssignals a(λ) bestimmt. Wie in 1 erkennbar ist, liegt das Minimum M bei einer Wellenlänge λ_M von etwa 248 nm und der Betrag des Minimums M hat den Wert 9,37 × 10^–5. Wie in 1 erkennbar ist, ist die Absorptionslinie von etwa 248 nm im Absorptionsmesssignal a(λ) nicht direkt erkennbar. Daher kann das Absorptionsmesssignal a(λ) nicht direkt für die Bestimmung der Konzentration des Glucoraphanins in der ersten Probe herangezogen werden.
Die zweite Ableitung zeigt dagegen ein deutliches lokales Minimum bei der Wellenlänge 246 nm, gefolgt von einem lokalen Maximum, das im Wellenlängenbereich zwischen 241 nm und 263 nm liegt. Das Hintergrundspektrum, das den weitaus größten Teil des Spektrums ausmacht, wird durch die zweite Ableitung und Fokussierung auf einen kleinen, zwischen 200 nm und 270 nm liegenden Bereich des Spektrums vernachlässigbar klein.
Nachdem der Betrag des Minimums M ermittelt wurde, wird diesem mit Hilfe der in 2 dargestellten Kalibrierkurve ein Konzentrationswert für die Glucoraphanin-Konzentration c des verdünnten Extrakts zugeordnet. Dieser beträgt 0,54 μg/ml. Die Konzentration y(1) des Glucoraphanins in der Probe ergibt sich dann wie folgt:
dabei bedeuten:

m(Probe, 1): die Menge der Probe des ersten Versuchs in [mg],
m(Methanol, 1): die erste Menge Methanol in [mg],
m(Methanol, 2): die zweite Menge Methanol [mg],
m(Extrakt, 1): die Menge des unverdünnten Extrakts des ersten Versuchs in [mg],
c(1): die Glucoraphanin-Konzentration im verdünnten Extrakt des ersten Versuchs in [μg/m] und
y(1): die Glucoraphanin-Konzentration in der Probe des ersten Versuchs in [mg/100 g].

Die in 2 dargestellte Kalibrierkurve kann mit Hilfe von Versuchen, bei denen zunächst eine Anzahl von Referenzextrakten, die Glucoraphanin in unterschiedlicher Konzentration enthalten, bereitgestellt wird, ermittels werden. Die Glucoraphanin-Konzentrationen der Referenzextrakte werden bevorzugt in der Weise ermittelt, dass eine vorbestimmte Menge Glucoraphanin gewogen und dann in einer vorbestimmten Menge Methanol gelöst wird. Die Menge Methanol kann ebenfalls durch Wiegen ermittelt werden. Die Glucoraphanin-Konzentration der einzelnen Referenzextrakte entspricht dann jeweils dem Quotient aus der Menge Glucoraphanin und der Summe aus der Menge Glucoraphanin und der Menge Methanol.
Für die so erhaltenen Referenzextrakte wird mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens jeweils der Betrag oder Wert des Minimums M der zweiten Ableitung des Absorptionsmessignals im zweiten Wellenlängenbereich ermittelt und dem Konzentrationswert des betreffenden Referenzextrakts zugeordnet.
Die auf diese Weise erhaltenen Wertekombinationen, jeweils bestehend aus dem Betrag oder Wert des Minimums M der zweiten Ableitung und dem Konzentrationswert werden als Kalibrierkenngrößen für die Bestimmung der Glucoraphanin-Konzentration bei zukünftigen Versuchen abgelegt, beispielsweise in einem Datenspeicher eines Mikrocomputers. Die Kalibrierkurve kann in Form einer Rechenvorschrift, wie zum Beispiel einer Geradengleichung, oder in Form von Stützstellen, die jeweils den Betrag oder den Wert des Minimums und einen Glucoraphanin-Konzentration umfassen, vorliegen. Zwischenwerte zwischen zwei Stützstellen können bei Bedarf interpoliert werden.
Bei einem Versuch wird von der Brokkolikresse des ersten Versuchs. eine zweite Probe der bereitgestellt, die eine Masse von 250 mg aufweist. Die zweite Probe wird derart püriert, dass das in der erste Probe enthaltene Glucoraphanin mit dem Spaltungsenzym in Kontakt gerät, so dass Sulforaphan gebildet wird.
Nun wird eine vorbestimmte Zeitdauer abgewartet, die derart bemessen ist, dass das in der zweiten Probe enthaltene Sulforaphan im Wesentlichen vollständig verdunsten kann. Danach wird die zweite Probe derart mit einer dritten Menge Methanol in Höhe von 1772 mg vermischt, dass das in der zweite Probe noch enthaltenes Glucoraphanin, welches nicht in Sulforaphan gespalten wurde, und die weiteren, in der zweiten Probe noch enthaltenen Pflanzenstoffe in dem Methanol gelöst werden. Aus dem so erhaltenen Extrakt werden ungelöste Pflanzenbestandteile durch Filtern und/oder Zentrifugieren geklärt.
Von dem so erhaltenen Extrakt werden 18 mg entnommen und mit einer zweiten Menge Methanol, die eine Masse von 728 mg aufweist, vermischt, d. h. das Extrakt wird um den Faktor von 18/(18 + 728) = 1:41,4 verdünnt. Der Verdünnungsfaktor wird mit Hilfe des Erwartungswerts für die Glucoraphanin-Konzentration derart bestimmt, dass bei einer in einem weiteren, noch näher zu beschreibenden Verfahrensschritt durchgeführten UV-Absorptionsmessung das Absorptionsmessgerät optimal ausgesteuert würde, wenn die Konzentration von Glucoraphanin in der zweiten Probe nach dem Verdunsten des Sulforaphan, mit dem Erwartungswert übereinstimmen würde.
Nun wird die bereits erwähnte UV-Absorptionsmessung des geklärten, das Glucoraphanin und die weitere Pflanzenstoffe enthaltenen, verdünnten Extrakts durchgeführt, bei der im ersten Wellenlängenbereich ein Absorptionsmesssignal erfasst wird.
Sollte das gemessene Absorptionsspektrum in dem ersten Wellenlängenbereich Messwerte oberhalb von 2,5 aufweisen, wird davon ausgegangen, dass das Absorptionsmessgerät in die Sättigung geraten ist. In diesem Fall wird der zweite Versuch abgebrochen und es wird ein neuer zweiter Versuch durchgeführt, bei dem ein größerer Verdünnungsfaktor gewählt.
Wenn das gemessene Absorptionsspektrum in dem ersten Wellenlängenbereich keine Messwerte oberhalb von 2,5 enthält, wird das Absorptionsmesssignal im zweiten Wellenlängenbereich mathematisch zweifach abgeleitet.
In dem zweiten Wellenlängenbereich wird der Betrag des bei der Wellenlänge λ_M von etwa 248 nm liegenden Minimums der zweiten Ableitung des Absorptionsmesssignals bestimmt. Der Betrag des Minimums hat den Wert 5,29 × 10^–5.
Diesem Wert wird anhand der in 2 dargestellten Kalibrierkurve ein Konzentrationswert für die Glucoraphanin-Konzentration c des verdünnten Extrakts zugeordnet. Dieser beträgt 0,31 μg/ml. Die Konzentration y(2) des Glucoraphanins in der Probe, das beim Verletzen der Probe nicht in Sulforaphan gespalten wird, ergibt sich dann wie folgt:
dabei bedeuten:

m(Probe, 2): die Menge der Probe des zweiten Versuchs in [mg],
m(Methanol, 3): die dritte Menge Methanol [mg],
m(Methanol, 4): die vierte Menge Methanol [mg],
m(Extrakt, 2): die Menge des unverdünnten Extrakts des zweiten Versuch in [mg],
c(2): die Glucoraphanin-Konzentration im verdünnten Extrakt des zweiten Versuchs [μg/m], und
y(2): die Konzentration des Glucoraphanins in der Probe, das beim Verletzen der Probe nicht in Sulforaphan gespalten wird in [mg/100 g].

In einem weiteren Verfahrensschritt wird die Konzentration c(3) des bioverfügbaren Sulforaphans in der Brokkolikresse aus dem für die erste Probe ermittelten Konzentrationswert c(1) und dem für die zweite Probe ermittelten Konzentrationswert c(2) wie folgt bestimmt: c(3) = y(1) – y(2) = 72,38 mg/100 g.

Claims

Verfahren zum Bestimmen der Konzentration von Glucoraphanin in einer Pflanze, wobei a) eine Probe der Pflanze bereitgestellt wird, b) die Probe mit einem polaren, ungeladenen organischen Lösungsmittel in Kontakt gebracht und derart zerkleinert wird, dass in der Probe enthaltenes Glucoraphanin und weitere in der Probe enthaltene Pflanzenstoffe in dem Lösungsmittel gelöst werden, und c) aus dem so erhaltenen Extrakt ungelöste Pflanzenbestandteile entfernt werden, um das Extrakt zu klären, dadurch gekennzeichnet, d) dass eine UV-Absorptionsmessung des geklärten, das Glucoraphanin und die weitere Pflanzenstoffe enthaltenen Extrakts ohne eine chromatographische Aufreinigung des Extrakts durchgeführt Wird, bei der für einen ersten Wellenlängenbereich, der sich von 200 nm bis 270 nm erstreckt, ein Absorptionsmesssignal erfasst wird, e) dass die zweite Ableitung des Absorptionsmesssignals für einen zweiten Wellenlängenbereich zwischen 240 nm und 250 nm gebildet wird, und f) dass der Betrag des Minimums der zweiten Ableitung im zweiten Wellenlängenbereich bestimmt und in Abhängigkeit von diesem Betrag wird ein Konzentrationswert für die Konzentration des Glucoraphanins in der Pflanze ermittelt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Absorptionsmesssignal glättungsgefiltert wird und die zweite Ableitung aus dem glättungsgefilterten Absorptionsmesssignal gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Pflanze zusätzlich zu dem Glucoraphanin ein räumlich davon getrenntes Spaltungsenzym enthält, bei dessen Kontakt mit dem Glucoraphanin die Pflanze Sulforaphan bildet, dadurch gekennzeichnet, a) dass eine erste Probe der Pflanze bereitgestellt wird und mit einem Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 ein erster Konzentrationswert für die Konzentration des Glucoraphanins in der ersten Probe ermittelt wird, b) dass eine zweite Probe der Pflanze bereitgestellt wird, c) dass die zweite Probe derart zerkleinert wird, dass das Glucoraphanin mit dem Spaltungsenzym in Kontakt gerät, d) dass eine vorbestimmte Zeitdauer abgewartet Wird, die derart bemessen ist, dass in der zweiten Probe das Sulforaphan gebildet und verdunstet wird, e) dass die zweite Probe derart mit einem polaren, ungeladenen organischen Lösungsmittel in Kontakt gebracht wird, dass in der zweiten Probe enthaltenes Glucoraphanin und weitere in der Probe enthaltene Pflanzenstoffe in dem Lösungsmittel gelöst werden, f) dass für die zweite Probe die Verfahrensschritte mit den Merkmalen c) bis f) aus Anspruch 1 durchgeführt werden, und g) dass als Konzentrationswert für die Konzentration des bioverfügbaren Sulforaphans der Pflanze die Differenz aus dem für die erste Probe ermittelten Konzentrationswert und dem für die zweite Probe ermittelten Konzentrationswert bestimmt wird,
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das in Schritt d) von Anspruch 1 und/oder in Schritt für von Anspruch 1 erfasste Absorptionsmesssignal mit einem Grenzwert verglichen wird, dass für den Fall, dass das Absorptionsmesssignal den Grenzwert überschreitet, das Extrakt entsprechend einem Verdünnungsfaktor verdünnt und Schritt d) aus Anspruch 1 mit dem verdünnten Extrakt wiederholt Wird, dass der Verdünnungsfaktor derart gewählt wird, dass das Absorptionsmesssignal des verdünnten Extrakts den Grenzwert nicht überschreitet, und dass die Schritte e) und f) aus Anspruch 1 mit dem Absorptionsmesssignal des verdünnten Extrakts durchgeführt und in Schritt f) von Anspruch 1) der Verdünnungsfaktor bei der Ermittlung der Konzentration des Glucoraphanins in der Pflanze berücksichtigt wird.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass Grenzwert zwischen 2 und 3 liegt.
Verfahren zum Bestimmen der Konzentration von bioverfügbarem Sulforaphan in einer Pflanze, wobei die Pflanze Glucoraphanin und ein räumlich davon getrenntes Spaltungsenzym enthält, bei dessen Kontakt mit dem Glucoraphanin die Pflanze Sulforaphan bildet, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte; a) Es wir eine erste Probe der Pflanze bereitgestellt, b) die erste Probe wird mit einem polaren, ungeladenen organischen Lösungsmittel in Kontakt gebracht und derart zerkleinert, dass in der Probe enthaltenes Glucoraphanin und weitere in der Probe enthaltene Pflanzenstoffe in dem Lösungsmittel gelöst werden, c) aus dem so erhaltenen ersten Extrakt werden ungelöste Pflanzenbestandteile entfernt, um das erste Extrakt zu klären, d) es Wird eine zweite Probe der Pflanze bereitgestellt, e) die zweite Probe wird derart zerkleinert, dass das Glucoraphanin mit dem Spaltungsenzym in Kontakt gerät, f) es wird eine vorbestimmte Zeitdauer abgewartet, die derart bemessen ist, dass sich in der zweiten Probe Sulforaphan bildet und verdunstet, g) die zweite Probe wird derart mit einem polaren, ungeladenen organischen Lösungsmittel in Kontakt gebracht, dass in der zweiten Probe enthaltenes Glucoraphanin und weitere in der Probe enthaltene Pflanzenstoffe in dem Lösungsmittel gelöst werden, h) aus dem so erhaltenen zweiten Extrakt werden ungelöste Pflanzenbestandteile entfernt, um das zweite Extrakt zu klären, i) es wird eine erste UV-Absorptionsmessung des geklärten ersten, das Glucoraphanin und die weitere Pflanzenstoffe enthaltenen Extrakts ohne eine chromatographische Aufreinigung des Extrakts durchgeführt, bei der für einen ersten Wellenlängenbereich zwischen 200 nm und 270 nm ein erstes Absorptionsmesssignal erfasst wird, j) es wird eine zweite UV-Absorptionsmessung des geklärten zweiten, das Glucoraphanin und die weitere Pflanzenstoffe enthaltenen Extrakts ohne eine chromatographische Aufreinigung des Extrakts durchgeführt, bei der für den ersten Wellenlängenbereich ein zweites Absorptionsmesssignal erfasst wird, k) es wird ein Differenzsignal aus dem ersten Absorptionsmesssignal und dem zweiten Absorptionsmesssignal gebildet, l) es wird die zweite Ableitung des Differenzsignals für einen zweiten Wellenlängenbereich zwischen 240 nm und 250 nm gebildet, und m) es wird der Betrag des Minimums der zweiten Ableitung des Differenzsignals im zweiten Wellenlängenbereich bestimmt und in Abhängigkeit von diesem Betrag wird ein Konzentrationswert für die Konzentration des bioverfügbaren Sulforaphans der Pflanze Sulforaphans ermittelt.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das in Schritt i) von Anspruch 6 erfasste Absorptionsmesssignal mit einem Grenzwert verglichen wird, dass für den Fall, dass das Absorptionsmesssignal den Grenzwert überschreitet, das Extrakt entsprechend einem Verdünnungsfaktor verdünnt und Schritt i) aus Anspruch 6 mit dem verdünnten Extrakt wiederholt wird, dass der Verdünnungsfaktor derart gewählt wird, dass das Absorptionsmesssignal des verdünnten Extrakts den Grenzwert nicht überschreitet, und dass in Schritt k) aus Anspruch 6 als erstes Absorptionsmesssignal das mit dem Verdünnungsfaktor multiplizierte Absorptionsmesssignal des verdünnten Extrakts verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Absorptionsmesssignale und/oder das Differenzsignal glättungsgefiltert wird und die zweite Ableitung aus dem glättungsgefilterten Differenzsignal gebildet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Pflanze Brokkolikresse ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Lösungsmittel Methanol ist.