EP3186629A1 - Verfahren zum bestimmen der konzentration von glucoraphanin und/oder von sulforaphan in einer pflanze - Google Patents

Verfahren zum bestimmen der konzentration von glucoraphanin und/oder von sulforaphan in einer pflanze

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EP3186629A1
EP3186629A1 EP15754115.2A EP15754115A EP3186629A1 EP 3186629 A1 EP3186629 A1 EP 3186629A1 EP 15754115 A EP15754115 A EP 15754115A EP 3186629 A1 EP3186629 A1 EP 3186629A1
Authority
EP
European Patent Office
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sample
plant
glucoraphanin
extract
measurement signal
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP15754115.2A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Sonja Bednar
Holger Klapproth
Robert Seidel
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
QFood GmbH
De Smaakmaker Holding BV
Original Assignee
QFood GmbH
De Smaakmaker Holding BV
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Filing date
Publication date
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Publication of EP3186629A1 publication Critical patent/EP3186629A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/0098—Plants or trees
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/31—Brassicaceae or Cruciferae (Mustard family), e.g. broccoli, cabbage or kohlrabi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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    • G01N2201/00—Features of devices classified in G01N21/00
    • G01N2201/12—Circuits of general importance; Signal processing

Definitions

  • the invention relates to a method for determining the concentration of glucan-5-coraphanin in a plant, wherein
  • the sample is contacted with a polar, uncharged organic solvent and comminuted such that glucoraphanin contained in the sample and other plant substances contained in the sample are dissolved in the oil solvent, and
  • the invention further relates to a method for determining the concentration of bioavailable sulforaphane in a plant, which plant contains glucoraphanin and a spatially separated cleavage enzyme, upon contact with the glucoraphanin, the plant forms sulforaphane.
  • Such a method for determining the concentration of glucoraphanin is known in the art.
  • one of the plants to be investigated is prepared and comminuted in a solvent containing acetone such that glucoraphanine contained in the sample is dissolved in the solvent.
  • the thus-obtained extract is first clarified and purified, and then a liquid chromatography is performed, in which the extract is transported under high pressure through a column. Along the column, different molecules contained in the extract are separated from each other.
  • the column is irradiated with UV light, which is absorbed by the molecules.
  • the presence of the glucuraphanine molecules at a predetermined position of the column is detected by means of a UV-sensitive optical sensor.
  • the glucoraphanin molecules are then quantified by mass spectrometry in a further process step.
  • Bokkolicress has a special high content of glucoraphanin and also contains a spatially separate cleavage enzyme which contacts the glucoraphanin upon injury of the plant.
  • the glucoraphanin is split into sulforaphane and a sugar residue.
  • the sulforaphane is actually used to prevent predators from the plant.
  • Studies have shown, however, that foods containing sulforaphane in sufficient concentrations are also beneficial to human health. Therefore, boccolic cress is preferred for clinical trials.
  • concentration of glucoraphanin and, in particular, that of the bioavailable sulforaphane in boccolic cress must be known as accurately as possible.
  • concentration of the bioavailable sulforaphane is understood to mean the concentration of the sulforaphane which the plant itself can form when the glucoraphanin contained in the plant comes into contact with the cleavage enzyme also present in the plant.
  • the previously known method for determining the concentration of Glucoraphanins has the disadvantage that its naturalfijhrung is relatively cumbersome and time-consuming and that large equipment is required, which are usually present only in a entspre ⁇ accordingly equipped laboratory. It is also unfavorable that the required analyzers are maintenance-intensive and that suitably qualified personnel are required to carry out the process.
  • a method for determining the concentration of bioavailable sulforaphane of the type mentioned is not known to the knowledge of the applicants. It is therefore the object to provide a method of the type mentioned above, which makes it possible to determine the concentration of glucoraphanin a plant in a simple manner .. Furthermore, the object is to provide a method which is a simple determination of the concentration of bioavailable sulforaphane in a plant allows.
  • a sample of the plant is provided, the sample is contacted with a polar, uncharged organic solvent and comminuted such that eggucoraphanin contained in the sample and other vegetable matter contained in the sample are dissolved in the solvent,
  • a UV absorption measurement of the clarified extract containing glucoraphanin and the further plant substances is carried out, in which an absorption measurement signal is recorded for a first wavelength range extending from 200 nm to 270 nm,
  • the second derivative of the absorbance measurement signal is formed for a second wavelength range between 240 nm and 250 nm, and the magnitude of the minimum of the second derivative in the second wavelength range is determined and a concentration value for the glucoraphanine concentration is determined as a function of this magnitude.
  • the method according to the invention can be carried out in a simple manner with little expenditure on apparatus, for example by means of a corresponding hand-held device. It is even possible to carry out the process at the place of cultivation of the plant to be examined, such as in a field or in a greenhouse. Since the method according to the invention can easily be automated, it can also be carried out reliably and quickly by persons who have no special qualifications in handling analysis devices.
  • the absorption measurement signal is smoothing filtered and the second derivative is formed from the smoothing filtered absorption measurement signal.
  • the smoothing filtering which may include a low-pass filtering, can suppress background noise and the like disturbances, so that they do not or only significantly affect.
  • a smoothing filter for example, a Savitzky-Golay filter can be used.
  • the plant contains in addition to the glucoraphanin a spatially separated therefrom cleavage enzyme, in its contact with the glucoraphanin the plant forms sulforaphane, wherein
  • a) a first sample of the plant is provided and, with the features of claim 1, a first concentration value for the concentration of glucuraphanine in the first sample is determined,
  • the difference between the determined for the first sample concentration value and the concentration value determined for the second sample is determined.
  • the sample is mixed with the solution brought into contact, so that then only that part of the glucoraphanine originally present in the sample dissolves in the solvent, which was not cleaved by the cleavage enzyme in Sulföraphan and the sugar residue and evaporated.
  • the concentration of glucanaphanine is measured, and the difference is formed from the concentration values thus obtained.
  • This difference corresponds to the concentration of glucoraphanin from which sulpho-graphane can be formed on contact with the cleavage enzyme contained in the sample, ie the concentration of the bioavailable sulforaphane of the plant.
  • step d) of claim 1 and / or in step f) of claim 1 absorption measurement signal
  • step d) of claim 1 is repeated with the dilute extract, wherein the dilution factor is chosen such that the absorbance measurement signal of the dilute extract does not exceed the limit and steps e)
  • the limit value is preferably selected such that the measurement signal detected during the absorption measurement is smaller than the value at which the absorption measurement 5 comes into the limit.
  • the threshold is preferably between 2 and 3.
  • the first sample is contacted with a polar, uncharged organic solvent and comminuted such that glucoraphanin contained in the sample and other substances contained in the sample are dissolved in the solvent; 0 c) from the thus obtained first extract unresolved convinced to clarify the first extract,
  • the second sample is comminuted such that the glucoraphanin comes into contact with the cleavage enzyme
  • Runaway ⁇ performs a first measurement of UV absorbance of the clarified first, the glucoraphanin and the extract contained other plant materials, wherein for a first wavelength range between 200 nm and 270 nm, a first absorption measurement signal is detected,
  • the amount of the minimum of the second derivative of the difference signal in the second wavelength range is determined and a concentration value for the concentration of the sulphonaphane is determined as a function of this amount.
  • the concentration value for the concentration of the plant-available bioavailable sulforaphane can therefore also be determined by first forming the difference between the absorption measurement signals measured during the first and second experiments, and then forming the second derivative of the difference signal and in the wavelength range between 240 nm and 250 nrm the amount of the minimum of the second derivative is determined. Also in this method can be carried out directly with the extracts prepared in the experiments, the UV absorption measurement without the extracts must be previously purified. The process is simple to perform and can be easily automated.
  • the measured in step i) of claim ⁇ absorption measurement signal is compared with a limit, wherein in the event that the absorption measurement signal exceeds the limit, the extract diluted according to a dilution factor and step i) of claim ⁇ with the diluted Extract is repeated, wherein the dilution factor is selected such that the absorbance measurement signal of the diluted extract does not exceed the limit, and that in step k) of claim ⁇ as the first absorption measurement signal multiplied by the dilution factor absorption signal of the diluted extract is used.
  • the limit value is preferably selected such that the measurement signal detected in the absorption measurement is smaller than the value at which the absorption measurement comes within the limit.
  • the limit value is preferably between 2 and 3.
  • the absorption measurement signal and / or the difference signal is smooth-filtered and if the second derivative is formed from the smoothing-filtered difference signal.
  • the smoothing filtering which may include low-pass filtering, can suppress background noise and the like disturbances, so that they do not or only insignificantly affect the measuring accuracy.
  • the plant is broccoli cress. This has a particularly high content of glucoraphanin and bioavailable sulforaphane
  • methanol is preferably used as the solvent.
  • the solvent can then be disposed of environmentally friendly after its use.
  • FIG. 1 is a graphical representation of an absorption measurement signal ⁇ ( ⁇ ) and its first derivative da (A) / dA and its second derivative d 2 a (A) / dA 2 , wherein the abscissa on the wavelength in nanometers and on the Or ⁇ dinate left the absorption or its first derivative, and on the right Ordi ⁇ nate the second derivative of absorbance are plotted, and
  • Fig. 2 is a graph of a calibration curve, wherein the abscissa on the second derivative of the absorption and on the ordinate the concentration of glucoraphanin are applied in an extract.
  • a first sample of broccoli cress which has a mass of 251 mg.
  • the broccoli cress contains glucoraphanin and a spatially separate cleavage enzyme, which upon contact with the glucoraphanin sulforaphane is formed.
  • the broccoli cress contain other plant substances.
  • the first sample is mixed with a first amount of methanol having a mass of 1700 mg and pureed in such a way that the glucoraphanin contained in the first sample and the other plant substances are dissolved in the solvent.
  • a first amount of methanol having a mass of 1700 mg and pureed in such a way that the glucoraphanin contained in the first sample and the other plant substances are dissolved in the solvent.
  • undissolved plant constituents are clarified by filtering and / or centrifuging.
  • 18 mg are removed and mixed with a second amount of methanol having a mass of 759 mg, i.
  • the dilution factor is determined with the aid of an expectation value for the glucoraphanin concentration in such a way that an absorbance meter used in a UV absorption measurement carried out in a further process step to be described below would be optimally controlled if the concentration of glucoraphanine in the sample was of the expected value would agree.
  • the absorption measurement signal ⁇ ( ⁇ ) shown in FIG. 1 is detected for a first wavelength range which extends from 200 nm to 270 nm.
  • the absorption measurement signal ⁇ ( ⁇ ) has a resolution of 0.2 nm.
  • the Absorp ⁇ tion measurement signal ⁇ ( ⁇ ) is smoothed with a Savitzky-Golay filter, for example, about from 21 to 5 31 points of the spectral resolution.
  • the experiment i o is aborted and a new first attempt is made, in which a larger dilution factor is chosen than the first attempt.
  • the abovementioned method steps are carried out in a corresponding manner for the new experiment.
  • the absorption measurement signal ⁇ ( ⁇ ) is mathematically derived twice in a second wavelength range extending from 240 nm to 250 nm.
  • the first derivative da (A) / dA and the second derivative d 2 a (A) / dA 2 are shown graphically in FIG. These can be calculated numerically using a microcomputer. If necessary, the dual derivative can also be done in one step together with the Savitzky-Golay smoothing.
  • the magnitude of the minimum 5 M of the second derivative d 2 a (A) / dA 2 of the absorption measurement signal a (A) is determined.
  • the minimum M is at a wavelength AM of about 248 nm and the magnitude of the minimum M is 9.37 x 10 -5.
  • the absorption line is Therefore, the absorbance measurement signal a (A) 0 can not be directly used for the determination of the concentration of glucoraphanine in the first sample.
  • the second derivative shows a distinct local minimum at 246 nm, followed by a local maximum lying in the wavelength range between 241 nm and 203 nm.
  • the background spectrum that the makes up the largest part of the spectrum becomes negligibly small by the second derivative and focusing on a small, lying between 200 nm and 270 nm region of the spectrum.
  • a concentration value for the glucoraphanine concentration c of the diluted extract is assigned to it using the calibration curve shown in FIG. This is 0.54 ⁇ g / ml.
  • y (l) of glucoraphanin in the sample is then given as follows: y (1) - c ( ⁇ ) m ( extract ü + m ( meth ° 12) m ( methanol> l K l62, ⁇ 5 mg / 100 g,
  • the calibration curve shown in FIG. 2 can be determined by means of experiments which initially provide a number of reference extracts which contain glucoraphanine in different concentrations.
  • the glucoraphenine concentrations of the reference extracts are preferably determined by weighing a predetermined amount of glucoraphanine and then dissolving it in a predetermined amount of methanol.
  • the amount of methanol can also be determined by weighing.
  • the glucoraphanin concentration of the individual reference extracts then corresponds in each case to the quotient of the amount of glucoraphanin and the sum of the amount of glucoraphanin and the amount of methanol.
  • the amount or value of the minimum M of the second derivative of the absorption measurement signal in the second wavelength range is determined with the aid of the method according to the invention and assigned to the concentration value of the relevant reference extract.
  • the value combinations obtained in this way are stored as calibration parameters for determining the glucoraphanine concentration in future experiments, for example in a data memory of a microcomputer.
  • the calibration curve may be in the form of a calculation rule, such as a straight line equation, or in the form of sampling points, each comprising the amount or value of the minimum and a concentration of glucoraphanin. Intermediate values between two interpolation points can be interpolated if necessary.
  • a second sample is provided which has a mass of 250 mg.
  • the second sample is pureed such that the glucoraphanin contained in the first sample contacts the cleavage enzyme to form sulforaphane.
  • a predetermined period of time is waited, which is dimensioned such that the sulforaphane contained in the second sample can substantially completely evaporate.
  • the second sample is so mixed with a third amount of methanol in the amount of 1 772 mg that still contained in the second sample glucoraphanin, which was not cleaved in sulforaphane, and the other, still contained in the second sample plant substances in the methanol be solved. From the extract thus obtained, undissolved plant constituents are clarified by filtering and / or centrifuging.
  • the already mentioned UV absorption measurement of the clarified extract containing the glucoraphanin and the further plant substances is carried out, in which an absorption measurement signal is detected in the first wavelength range. If the measured absorption spectrum in the first wavelength range has readings above 2.5, it is assumed that the absorption meter has become saturated. In this case, the second attempt is aborted and a new second attempt is made using a larger dilution factor.
  • the absorption measurement signal in the second wavelength range is mathematically derived twice.
  • the magnitude of the minimum of the second derivative of the absorbance measurement signal at the wavelength AM of about 248 nm is determined.
  • the amount of the minimum is 5.29 x 10 "5
  • This value is assigned a concentration value for the glucoraphanine concentration c of the diluted extract on the basis of the calibration curve shown in FIG. This is 0.31 g / ml.
  • concentration y (2) of the glucoraphanin in the sample, which is not cleaved into sulfobraphane upon injury of the sample, is then given as follows: m ⁇ extract, 2) + m (methanol, 4) m (methanol, 3)
  • m extract,! m (Viobe, 2) where: m (sample, 2) the amount of sample of the second experiment in [mg], m (methanol, 3) the third amount of methanol [mg], m (methanol, 4) the fourth amount of methanol [mg],

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Abstract

Bei einem Verfahren zum Bestimmen der Konzentration von Glucoraphanin in einer Pflanze, wird eine Probe der Pflanze bereitgestellt, die Probe mit einem polaren, ungeladenen organischen Lösungsmittel in Kontakt gebracht und derart zerkleinert dass in der Probe enthaltenes Glucoraphanin und weitere in der Probe enthaltene Pflanzenstoffe in dem Lösungsmittel gelöst werden, und aus dem so erhaltenen Extrakt werden ungelöste Pflanzenbestandteile entfernt, um das Extrakt zu klären. Es wird eine UV-Absorptionsmessung des geklärten, das Glucoraphanin und die weitere Pflanzenstoffe enthaltenen Extrakts durchgeführt, bei der für einen ersten Wellenlängenbereich zwischen 200 nm und 270 nm ein Absorptionsmesssignal a(λ) erfasst wird. Die zweite d2a(λ)/dλ2 Ableitung des Absorptionsmesssignal a(λ) wird für einen zweiten einen Wellenlängenbereich zwischen 240 nm und 250 nm gebildet. Es wird der Betrag des Minimums der zweiten Ableitung im zweiten Wellenlängenbereich bestimmt und in Abhängigkeit von diesem Betrag wird ein Konzentrationswert für die Konzentration des Glucoraphanins ermittelt.

Description

Verfahren zum Bestimmen der Konzentration von Glucoraphanin und/oder von
Sulforaphan in einer Pflanze
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Bestimmen der Konzentration von Glu- 5 coraphanin in einer Pflanze, wobei
a) eine Probe der Pflanze bereitgestellt wird,
b) die Probe mit einem polaren, ungeladenen organischen Lösungsmittel in Kontakt gebracht und derart zerkleinert wird, dass in der Probe enthaltenes Glucoraphanin und weitere in der Probe enthaltene Pflanzenstoffe in dem l o Lösungsmittel gelöst werden, und
c) aus dem so erhaltenen Extrakt ungelöste Pflanzenbestandteile entfernt werden, um das Extrakt zu klären.
Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Bestimmen der Konzentration von bioverfügbaren Sulforaphan in einer Pflanze, wobei die Pflanze Glucoraphanin und 15 ein räumlich davon getrenntes Spaltungsenzym enthält, bei dessen Kontakt mit dem Glucoraphanin die Pflanze Sulforaphan bildet.
Ein derartiges Verfahren zum Bestimmen der Konzentration von Glucoraphanin ist aus der Praxis bekannt. Dabei wird eine der zu untersuchenden Pflanze bereitge- 0 stellt und in einem Aceton enthaltenden Lösungsmittel derart zerkleinert, dass in der Probe enthaltenes Glucoraphanin in dem Lösungsmittel gelöst wird. Danach wird das so erhaltenen Exfrakt zunächst geklärt und aufgereinigt und dann wird eine Flüssigchromatographie durchgeführt, bei der das Extrakt unter hohem Druck durch eine Säule transportiert wird. Entlang der Säule werden unterschiedliche, in dem 5 Extrakt enthaltene Moleküle voneinander getrennt. Die Säule wird mit UV-Licht bestrahlt, das von den Molekülen absorbiert wird. Die Anwesenheit der Glu- coraphanin-Moleküle an einer vorbestimmten Stelle der Säule wird mit Hilfe eines im UV-Bereich empfindlichen optischen Sensors detektiert. Die Glucoraphanin- Moleküle werden dann in einem weiteren Verfahrensschritt durch Massenspektro- 0 metrie quantifiziert.
Das vorbekannte Verfahren wird insbesondere zum Untersuchen von Bokkolikresse bzw. Brokkolisprossen verwendet. Bokkolikresse verfügt über einen besonders hohen Gehalt an Glucoraphanin und enthält außerdem ein räumlich davon getrenntes Spaltungsenzym, das beim Verletzen der Pflanze mit dem Glucoraphanin in Kontakt gerät. Dabei wird das Glucoraphanin in Sulforaphan und einen Zuckerrest gespalten. Das Sulforaphan dient eigentlich dazu, Fressfeinde von der Pflanze abzuhalten. Untersuchungen haben jedoch ergeben, dass Lebensmittel, die Sulforaphan in ausreichender Konzentration enthalten, auch für die menschliche Gesundheit förderlich sind. Daher wird Bokkolikresse bevorzugt für klinische Studien verwendet. Damit die Studien vergleichbar sind, muss die Konzentration des Glucoraphanin und insbesondere die des bioverfügbaren Sulforaphans in der Bokkolikresse möglichst genau bekannt sein. Dabei wird unter der Konzentration des bioverfugbaren Sulforaphans die Konzentration des Sulforaphans verstanden, das die Pflanze selbst bilden kann, wenn das in der Pflanze enthaltene Glucoraphanin mit dem ebenfalls in der Pflanze enthaltenen Spaltungsenzym in Kontakt gerät.
Das vorbekannte Verfahren zur Bestimmung der Konzentration des Glucoraphanins hat den Nachteil, dass seine Durchfijhrung relativ umständlich und zeitaufwändig ist und dass Großgeräte benötigt werden, die üblicherweise nur in einem entspre¬ chend ausgestatteten Labor vorhanden sind. Ungünstig ist außerdem, dass die benötigten Analysegeräte wartungsintensiv sind und dass für die Durchführung des Verfahrens entsprechend qualifiziertes Personal erforderlich ist. Ein Verfahren zum Bestimmen der Konzentration von bioverfügbarem Sulforaphan der eingangs genannten Art ist nach Kenntnis der Anmelder bislang noch nicht bekannt. Es besteht deshalb die Aufgabe, ein Verfahren der eingangs genannten Art zu schaffen, das es ermöglicht, die Konzentration von Glucoraphanin einer Pflanze auf einfache Weise zu bestimmen.. Ferner besteht die Aufgabe, ein Verfahren anzugeben, das eine einfache Bestimmung der Konzentration von bioverftjgbarem Sulforaphan in einer Pflanze ermöglicht.
Diese Aufgabe wird bezüglich des Verfahrens zum Bestimmen der Konzentration von Glucoraphanin in einer Pflanze mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst. Diese sehen folgende Verfahrensschritte vor:
a) Es wird eine Probe der Pflanze bereitgestellt, die Probe wird mit einem polaren, ungeladenen organischen Lösungsmittel in Kontakt gebracht und derart zerkleinert, dass in der Probe enthaltenes eiucoraphanin und weitere in der Probe enthaltene Pflanzenstoffe in dem Lösungsmittel gelöst werden,
aus dem so erhaltenen Extrakt werden ungelöste Pflanzenbestandteile entfernt, um das Extrakt zu klären,
es wird eine UV-Absorptionsmessung des geklärten, das Glucoraphanin und die weitere Pflanzenstoffe enthaltenen Extrakts durchgeführt, bei der für einen ersten Wellenlängenbereich, der sich von 200 nm bis 270 nm erstreckt, ein Absorptionsmesssignal erfasst wird,
es wird die zweite Ableitung des Absorptionsmesssignal für einen zweiten einen Wellenlängenbereich zwischen 240 nm und 250 nm gebildet, und es wird der Betrag des Minimums der zweiten Ableitung im zweiten Wellenlängenbereich bestimmt und in Abhängigkeit von diesem Betrag wird ein Konzentrationswert für die Konzentration des Glucoraphanins ermittelt.
Überraschenderweise ist es durch die Bildung der zweiten Ableitung des Absorpti¬ onsmesssignal möglich, den Einfluss der im Lösungsmittel gelösten weiteren Pflanzenstoffe auf das Messergebnis zu kompensieren. Dadurch ist es möglich, mit dem Extrakt direkt eine UV-Absorptionsmessung durchzuführen, ohne dass das Extrakt dazu aufgereinigt werden muss. In vorteilhafter Weise ist das erfindungsgemäße Verfahren mit geringem apparativem Aufwand beispielsweise mittels eines entsprechenden Handgeräts auf einfache Weise durchführbar. Dabei ist es sogar möglich, das Verfahren am Anbauort der zu untersuchenden Pflanze, wie zum Beispiel auf einem Feld oder in einem Gewächshaus, durchzuführen. Da sich das erfindungsgemäße Verfahren leicht automatisieren lässt, kann es auch von Personen, die im Umgang mit Analysegeräten keine besondere Qualifikation aufweisen, zuverlässig und schnell durchgeführt werden. Bei einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung wird das Absorptionsmesssignal glättungsgefiltert und die zweite Ableitung wird aus dem glättungsgefilterten Absorptionsmesssignal gebildet. Durch die Glättungsfilterung, die eine Tiefpassfilterung umfassen kann, können Hintergrundrauschen und dergleichen Störungen unterdrückt werden, so dass sie die Messgenauigkeit nicht oder nur noch unwe- sentlich beeinträchtigen. Als Glättungsfilter kann beispielsweise ein Savitzky-Golay Filter verwendet werden.
Bei einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung enthält die Pflanze zusätzlich zu dem Glucoraphanin ein räumlich davon getrenntes Spaltungsenzym, bei dessen Kontakt mit dem Glucoraphanin die Pflanze Sulforaphan bildet, wobei
a) eine erste Probe der Pflanze bereitgestellt wird und mit den Merkmalen des Anspruchs 1 ein erster Konzentrationswert für die Konzentration des Glu- coraphanins in der ersten Probe ermittelt wird,
b) wobei eine zweite Probe der Pflanze bereitgestellt wird,
c) wobei die zweite Probe derart zerkleinert, dass das Glucoraphanin mit dem Spaltungsenzym in Kontakt gerät,
d) wobei eine vorbestimmte Zeitdauer abgewartet wird, die derart bemessen ist, dass in der zweiten Probe das Sulforaphan gebildet und verdunstet wird, e) wobei die zweite Probe derart mit einem polaren, ungeladenen organischen Lösungsmittel in Kontakt gebracht wird, dass in der zweiten Probe ent¬ haltenes Glucoraphanin und weitere in der Probe enthaltene Pflanzenstoffe in dem Lösungsmittel gelöst werden,
f) wobei für die zweite Probe die Merkmale c) bis f) aus Anspruch 1 durchge- fuhrt werden, und
g) wobei als Konzentrationswert für die Konzentration des bioverfügbaren Sulforaphans der Pflanze die Differenz aus dem für die erste Probe ermittelten Konzentrationswert und dem für die zweite Probe ermittelten Konzentrationswert bestimmt wird.
Es werden also mindestens zwei Versuche durchgeführt, wobei bei mindestens einem ersten Versuch die Probe gleich nach ihrer Entnahme aus der Pflanze mit dem Lösungsmittel in Kontakt gebracht wird, derart dass das Glucoraphanin nicht oder nur so kurz mit dem Spaltungsenzym im Kontakt gerät, sodass kein oder nur ein sehr geringer Anteil des Glucoraphanins in Sulforaphan und einen Zuckerrest gespalten wird und sich verflüchtigt. Außerdem wird mindestens ein zweiter Versuch durchgeführt, bei dem die Probe gleich nach ihrer Entnahme aus der Pflanze zunächst zerkleinert wird, so dass in der Probe enthaltene Glucoraphanin mit dem Spaltungsenzym in Kontakt gerät. Dabei wird außer dem bereits in der Pflanzen- Probe enthaltenen Spaltungsenzym kein weiteres Spaltungsenzym zugegeben. Nachdem sich das Sulforaphan verflüchtigt hat, wird die Probe mit dem Lösungs- mittel in Kontakt gebracht, so dass sich dann nur noch derjenige Teil des ursprünglich in der Probe vorhandenen Glucoraphanin in dem Lösungsmittel löst, der nicht durch das Spaltungsenzym in Sulföraphan und den Zuckerrest gespalten und verdunstet wurde.
5
Bei dem ersten und zweiten Versuch wird jeweils die Konzentration des Glu- coraphanins gemessen und aus den so erhaltenen Konzentrationswerten wird die Differenz gebildet. Diese Differenz entspricht der Konzentration des Glucoraphanins, aus dem bei einem Kontakt mit dem in der Probe enthaltenen Spaltungsenzym i o Sulföraphan gebildet werden kann, also der Konzentration des bioverfügbaren Sulforaphans der Pflanze.
Bei einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung wird das in Schritt d) von Anspruch 1 und/oder in Schritt f) von Anspruch 1 erfasste Absorptionsmesssignal mit
15 einem Grenzwert verglichen, wobei für den Fall, dass das Absorptionsmesssignal den Grenzwert überschreitet, das Extrakt entsprechend einem Verdünnungsfaktor verdünnt und Schritt d) aus Anspruch 1 mit dem verdünnten Extrakt wiederholt wird, wobei der Verdünnungsfaktor derart gewählt wird, dass das Absorptionsmesssignal des verdünnten Extrakts den Grenzwert nicht überschreitet, und wobei die Schritte e)
20 und f) aus Anspruch 1 mit dem Absorptionsmesssignal des verdünnten Extrakts durchgeführt und in Schritt f) von Anspruch 1 ) der Verdünnungsfaktor bei der Ermittlung der Konzentration des Glucoraphanins in der Pflanze berücksichtigt wird. Der Grenzwert wird bevorzugt derart gewählt, dass das bei der Absorptionsmessung erfasste Messsignal kleiner ist, als der Wert, bei dem die Absorptionsmessung 5 in die Begrenzung gerät. Der Grenzwert liegt bevorzugt zwischen 2 und 3.
Die vorstehend genannte Aufgabe kann bezüglich der Bestimmung der Konzentration des bioverfügbarem Sulforaphans auch mit den Merkmalen des Anspruchs ό gelöst werden. Dieser sieht folgende Verfahrensschritte vor:
0
a) Es wird eine erste Probe der Pflanze bereitgestellt,
b) die erste Probe wird mit einem polaren, ungeladenen organischen Lösungsmittel in Kontakt gebracht und derart zerkleinert, dass in der Probe enthaltenes Glucoraphanin und weitere in der Probe enthaltene Pflanzen Stoffe 5 in dem Lösungsmittel gelöst werden, 0 c) aus dem so erhaltenen ersten Extrakt werden ungelöste Pflanzenbestandtei¬ le entfernt um das erste Extrakt zu klären,
d) es wird eine zweite Probe der Pflanze bereitgestellt,
e) die zweite Probe wird derart zerkleinert, dass das Glucoraphanin mit dem Spaltungsenzym in Kontakt gerät,
f) es wird eine vorbestimmte Zeitdauer abgewartet, die derart bemessen ist, dass sich in der zweiten Probe Sulforaphan bildet und verdunstet,
g) die zweite Probe wird derart mit einem polaren, ungeladenen organischen Lösungsmittel in Kontakt gebracht, dass in der zweiten Probe enthaltenes Glucoraphanin und weitere in der Probe enthaltene Pflanzenstoffe in dem
Lösungsmittel gelöst werden,
h) aus dem so erhaltenen zweiten Extrakt werden ungelöste Pflanzenbestandteile entfernt, um das zweite Extrakt zu klären,
i) es wird eine erste UV-Absorptionsmessung des geklärten ersten, das Glucoraphanin und die weitere Pflanzenstoffe enthaltenen Extrakts durchge¬ führt, bei der für einen ersten Wellenlängenbereich zwischen 200 nm und 270 nm ein erstes Absorptionsmesssignal erfasst wird,
j) es wird eine zweite UV-Absorptionsmessung des geklärten zweiten, das Glucoraphanin und die weitere Pflanzenstoffe enthaltenen Extrakts durchge- fuhrt, bei der für den ersten Wellenlängenbereich ein zweites Absorptionsmesssignal erfasst wird,
k) es wird ein Differenzsignal aus dem ersten Absorptionsmesssignal und dem zweiten Absorptionsmesssignal gebildet,
I) es wird die zweite Ableitung des Differenzsignal für einen zweiten einen Wellenlängenbereich zwischen 240 nm und 250 nm gebildet, und
m) es wird der Betrag des Minimums der zweiten Ableitung des Differenzsignals im zweiten einen Wellenlängenbereich bestimmt und in Abhängigkeit von diesem Betrag wird ein Konzentrationswert für die Konzentration des Sul- foraphans ermittelt.
Der Konzentrationswert für die Konzentration des von der Pflanze bereitstellbaren bioverfügbaren Sulforaphans kann also auch dadurch ermittelt werden, dass zunächst die Differenz aus den beim ersten und zweiten Versuch gemessenen Absorptionsmesssignalen gebildet wird, und dass dann die zweite Ableitung des Differenzsignals gebildet und in dem Wellenlängenbereich zwischen 240 nm und 250 nrm der Betrag des Minimums der zweiten Ableitung ermittelt wird. Auch bei diesem Verfahren kann mit den bei den Versuchen hergestellten Extrakten direkt die UV-Absorptionsmessung durchgeführt werden, ohne dass die Extrakte zuvor aufgereinigt werden müssen. Das Verfahren ist auf einfache Weise durchführbar und lässt sich gut automatisieren.
Bei einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird das in Schritt i) von Anspruch ό erfasste Absorptionsmesssignal mit einem Grenzwert verglichen, wobei für den Fall, dass das Absorptionsmesssignal den Grenzwert überschreitet, das Extrakt entsprechend einem Verdünnungsfaktor verdünnt und Schritt i) aus Anspruch ό mit dem verdünnten Extrakt wiederholt wird, wobei der Verdünnungsfaktor derart gewählt wird, dass das Absorptionsmesssignal des verdünnten Extrakts den Grenzwert nicht überschreitet, und dass in Schritt k) aus Anspruch ό als erstes Absorptionsmesssignal das mit dem Verdünnungsfaktor multiplizierte Absorptions- messsignal des verdünnten Extrakts verwendet wird. Der Grenzwert wird dabei bevorzugt derart gewählt, dass das bei der Absorptionsmessung erfasste Messsignal kleiner ist, als der Wert, bei dem die Absorptionsmessung in die Begrenzung gerät. Der Grenzwert liegt bevorzugt zwischen 2 und 3. Vorteilhaft ist, wenn das die Absorptionsmesssignal und/oder das Differenzsignal glättungsgefiltert wird und wenn die zweite Ableitung aus dem glättungsgefilterten Differenzsignal gebildet wird. Durch die Glättungsfilterung, die eine Tiefbassfilterung umfassen kann, können Hintergrundrauschen und dergleichen Störungen unterdrückt werden, so dass sie die Messgenauigkeit nicht oder nur noch unwesentlich beeinträchtigen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsförm des Verfahrens ist die Pflanze Brokkoli kresse. Diese weist einen besonders hohen Gehalt an Glucoraphanin und bioverfijgba- rem Sulforaphan auf
Als Lösungsmittel wird bevorzugt Methanol verwendet. Das Lösungsmittel kann dann nach seiner Verwendung umweltverträglich entsorgt werden.
Nachstehend ist die Erfindung anhand eines Ausführungsbeispiels näher erläutert. Es zeigen Fig. 1 eine graphische Darstellung eines Absorptionsmesssignals α(λ) sowie seiner ersten Ableitung da(A)/dA und seiner zweiten Ableitung d2a(A)/dA2, wobei auf der Abszisse die Wellenlänge in Nanometern und auf der Or¬ dinate links die Absorption bzw. deren erste Ableitung und auf der Ordi¬ nate rechts die zweite Ableitung der Absorption aufgetragen sind, und
Fig. 2 eine graphische Darstellung einer Kalibrierkurve, wobei auf der Abszisse die die zweite Ableitung der Absorption und auf der Ordinate die Konzentration von Glucoraphanin in einem Extrakt aufgetragen sind.
Bei einem Verfahren zum Bestimmen der Konzentration von Glucoraphanin in Brokkolikresse wird eine erste Probe der Brokkolikresse bereitgestellt wird, die eine Masse von 251 mg autweist. Die Brokkolikresse enthält Glucoraphanin und ein räumlich davon getrenntes Spaltungsenzym, bei dessen Kontakt mit dem Glucoraphanin Sulforaphan gebildet wird. Außerdem sind in der Brokkolikresse weitere Pflanzenstoffe enthalten.
Die erste Probe wird mit einer ersten Menge Methanol, die eine Masse von 1 700 mg aufweist, vermischt und derart püriert, dass das in der erste Probe enthaltene Glucoraphanin und die weiteren Pflanzenstoffe in dem Lösungsmittel gelöst werden. Aus dem so erhaltenen Extrakt werden ungelöste Pflanzenbestandteile durch Filtern und/oder Zentrifugieren geklärt. Von dem geklärten Extrakt werden 1 8 mg entnommen und mit einer zweiten Menge Methanol, die eine Masse von 759 mg aufweist, vermischt, d.h. das Extrakt wird um den Faktor von 1 8 / (1 8+759) = 1 : 3,2 verdünnt. Der Verdünnungsfaktor wird mit Hilfe eines Erwartungswerts für die Glucoraphanin-Konzentration derart bestimmt, dass ein bei einer in einem weiteren, noch näher zu beschreibenden Verfahrensschritt durchgeführten UV-Absorptionsmessung verwendetes Absorptionsmessgerät optimal ausgesteuert würde, wenn die Konzentration von Glucoraphanin in der Probe, mit dem Erwartungswert übereinstimmen würde.
Nun wird die bereits erwähnte UV-Absorptionsmessung des geklärten, das Glu- coraphanin und die weitere Pflanzenstoffe enthaltenen, verdünnten Extrakts durchgeführt. Dabei wird für einen ersten Wellenlängenbereich, der sich von 200 nm bis 270 nm erstreckt, das in Fig. 1 dargestellte Absorptionsmesssignal α(λ) erfasst. Das Absorptionsmesssignal α(λ) hat eine Auflösung von 0.2nm. Das Absorp¬ tionsmesssignal α(λ) wird mit einem Savitzky-Golay Filter geglättet, z.B. über 21 bis 5 31 Punkte der spektralen Auflösung.
Sollte das gemessene Absorptionsspektrum in dem ersten Wellenlängenbereich Messwerte oberhalb von 2,5 aufweisen, wird davon ausgegangen, dass das Absorptionsmessgerät in die Sättigung geraten ist. In diesem Fall wird der Versuch i o abgebrochen und es wird ein neuer erster Versuch durchgeführt, bei dem ein größerer Verdünnungsfaktor gewählt wird als beim ersten Versuch. Die vorstehend genannten Verfahrensschritte werden dabei in entsprechender Weise für den neuen Versuch durchgeführt.
1 5 Wenn das gemessene Absorptionsspektrum in dem ersten Wellenlängenbereich keine Messwerte oberhalb von 2,5 enthält, wird das Absorptionsmesssignal α(λ) in einem zweiten Wellenlängenbereich, der sich von 240 nm bis 250 nm erstreckt, mathematisch zweifach abgeleitet. Die erste Ableitung da(A)/dA und die zweite Ableitung d2a(A)/dA2 sind in Fig. 1 graphisch dargestellt. Die können mit Hilfe eines 0 Mikrocomputers numerisch berechnet werden. Bei Bedarf kann die zweifache Ableitung auch gemeinsam mit der Savitzky-Golay Glättung in einem Schritt geschehen.
In dem zweiten Wellenlängenbereich [240 nm ... 250 nm] wird der Betrag des 5 Minimums M der zweiten Ableitung d2a(A)/dA2 des Absorptionsmesssignals a(A) bestimmt. Wie in Fig. 1 erkennbar ist, liegt das Minimum M bei einer Wellenlänge AM von etwa 248 nm und der Betrag des Minimums M hat den Wert 9,37 x 1 0"5. Wie in Fig. 1 erkennbar ist, ist die Absorptionslinie von etwa 248 nm im Absorptionsmesssignal a(A) nicht direkt erkennbar. Daher kann das Absorptionsmesssignal a(A) 0 nicht direkt für die Bestimmung der Konzentration des Glucoraphanins in der ersten Probe herangezogen werden.
Die zweite Ableitung zeigt dagegen ein deutliches lokales Minimum bei der Wellenlänge 246 nm, gefolgt von einem lokalen Maximum, das im Wellenlängen-5 bereich zwischen 241 nm und 203 nm liegt. Das Hintergrundspektrum, das den weitaus größten Teil des Spektrums ausmacht, wird durch die zweite Ableitung und Fokussierung auf einen kleinen, zwischen 200 nm und 270 nm liegenden Bereich des Spektrums vernachlässigbar klein. Nachdem der Betrag des Minimums M ermittelt wurde, wird diesem mit Hilfe der in Fig. 2 dargestellten Kalibrierkurve ein Konzentrationswert für die Glucoraphanin- Konzentration c des verdünnten Extrakts zugeordnet. Dieser beträgt 0,54 μg/ml. Die Konzentration y(l) des Glucoraphanins in der Probe ergibt sich dann wie folgt: y(1) - c(\) m(Extraktü + m(Meth °12) m(Methanol>lK l62,<\5 mg/100g,
m (Extrakt, \) m (Probe,!) dabei bedeuten: m (Probe, 1 ) die Menge der Probe des ersten Versuchs in [mg], m(Methanol,l ) die erste Menge Methanol in [mg],
m(Methanol,2) die zweite Menge Methanol [mg],
m (Extrakt,! ) die Menge des unverdünnten Extrakts des ersten Versuchs in [mg],
c(l ) die Glucoraphanin-Konzentration im verdünnten Extrakt des ersten Versuchs in ^g/m] und
y(l ) die Glucoraphanin-Konzentration in der Probe des ersten Versuchs in [mg/1 00 g].
Die in Fig. 2 dargestellte Kalibrierkurve kann mit Hilfe von Versuchen, bei denen zunächst eine Anzahl von Referenzextrakten, die Glucoraphanin in unterschiedlicher Konzentration enthalten, bereitgestellt wird, ermitteis werden. Die Glucorapha- nin-Konzentrationen der Referenzextrakte werden bevorzugt in der Weise ermittelt, dass eine vorbestimmte Menge Glucoraphanin gewogen und dann in einer vorbestimmten Menge Methanol gelöst wird. Die Menge Methanol kann ebenfalls durch Wiegen ermittelt werden. Die Glucoraphanin-Konzentration der einzelnen Referenzextrakte entspricht dann jeweils dem Quotient aus der Menge Glucoraphanin und der Summe aus der Menge Glucoraphanin und der Menge Methanol. Für die so erhaltenen Referenzextrakte wird mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens jeweils der Betrag oder Wert des Minimums M der zweiten Ableitung des Absorptionsmessignals im zweiten Wellenlängenbereich ermittelt und dem Konzentrationswert des betreffenden Referenzextrakts zugeordnet.
Die auf diese Weise erhaltenen Wertekombinationen, jeweils bestehend aus dem Betrag oder Wert des Minimums M der zweiten Ableitung und dem Konzentrationswert werden als Kalibrierkenngrößen für die Bestimmung der Glucoraphanin- Konzentration bei zukünftigen Versuchen abgeleg beispielsweise in einem Datenspeicher eines Mikrocomputers. Die Kalibrierkurve kann in Form einer Rechenvorschrift, wie zum Beispiel einer Geradengleichung, oder in Form von Stützstellen, die jeweils den Betrag oder den Wert des Minimums und einen Glucoraphanin-Konzentration umfassen, vorliegen. Zwischenwerte zwischen zwei Stützstellen können bei Bedarf interpoliert werden.
Bei einem Versuch wird von der Brokkolikresse des ersten Versuchs, eine zweite Probe der bereitgestellt, die eine Masse von 250 mg aufweist. Die zweite Probe wird derart püriert, dass das in der erste Probe enthaltene Glucoraphanin mit dem Spaltungsenzym in Kontakt gerät, so dass Sulforaphan gebildet wird.
Nun wird eine vorbestimmte Zeitdauer abgewartet, die derart bemessen ist, dass das in der zweiten Probe enthaltene Sulforaphan im Wesentlichen vollständig verdunsten kann. Danach wird die zweite Probe derart mit einer dritten Menge Methanol in Höhe von 1 772 mg vermischt, dass das in der zweite Probe noch enthaltenes Glucoraphanin, welches nicht in Sulforaphan gespalten wurde, und die weiteren, in der zweiten Probe noch enthaltenen Pflanzenstoffe in dem Methanol gelöst werden. Aus dem so erhaltenen Extrakt werden ungelöste Pflanzenbestandteile durch Filtern und/oder Zentrifugieren geklärt. Von dem so erhaltenen Extrakt werden 1 8 mg entnommen und mit einer zweiten Menge Methanol, die eine Masse von 728 mg aufweist, vermischt, d.h. das Extrakt wird um den Faktor von 1 8 / (1 8+728) = 1 :41,4 verdünnt. Der Verdünnungsfaktor wird mit Hilfe des Erwartungswerts für die Glucoraphanin-Konzentration derart bestimmt, dass bei einer in einem weiteren, noch näher zu beschreibenden Verfahrensschritt durchgeführten UV-Absorptionsmessung das Absorptionsmessgerät optimal ausgesteuert würde, wenn die Konzentration von eiucoraphanin in der zweiten Probe nach dem Verdunsten des Sulföraphan, mit dem Erwartungswert übereinstimmen würde. Nun wird die bereits erwähnte UV-Absorptionsmessung des geklärten, das Glu- coraphanin und die weitere Pflanzenstoffe enthaltenen, verdünnten Extrakts durchgeführt, bei der im ersten Wellenlängenbereich ein Absorptionsmesssignal erfasst wird. Sollte das gemessene Absorptionsspektrum in dem ersten Wellenlängenbereich Messwerte oberhalb von 2,5 aufweisen, wird davon ausgegangen, dass das Absorptionsmessgerät in die Sättigung geraten ist. In diesem Fall wird der zweite Versuch abgebrochen und es wird ein neuer zweiter Versuch durchgeführt, bei dem ein größerer Verdünnungsfaktor gewählt.
Wenn das gemessene Absorptionsspektrum in dem ersten Wellenlängenbereich keine Messwerte oberhalb von 2,5 enthält, wird das Absorptionsmesssignal im zweiten Wellenlängenbereich mathematisch zweifach abgeleitet.
In dem zweiten Wellenlängenbereich wird der Betrag des bei der Wellenlänge AM von etwa 248 nm liegenden Minimums der zweiten Ableitung des Absorptionsmesssignals bestimmt. Der Betrag des Minimums hat den Wert 5,29 x 1 0"5
Diesem Wert wird anhand der in Fig. 2 dargestellten Kalibrierkurve ein Konzentrationswert für die Glucoraphanin-Konzentration c des verdünnten Extrakts zugeordnet. Dieser beträgt 0,31 g/ml. Die Konzentration y(2) des Glucoraphanins in der Probe, das beim Verletzen der Probe nicht in Sulfbraphan gespalten wird, ergibt sich dann wie folgt: m {Extrakt, 2) + m (Methanol, 4) m (Methanol, 3)
v(2) = c(2) - = 91,07 mg ! 100 g,
m (Extrakt,!) m (Viobe,2) dabei bedeuten: m(Probe,2) die Menge der Probe des zweiten Versuchs in [mg], m(Methanol,3) die dritte Menge Methanol [mg], m(Me†hanol,4) die vierte Menge Methanol [mg],
m(Extrak†,2) die Menge des unverdünnten Extrakts des zweiten Versuch in [mg],
c(2) die Glucoraphanin-Konzentration im verdünnten Extrakt des zweiten Versuchs [μς/ητι], und
y(2) die Konzentration des Glucoraphanins in der Probe, das beim Verletzen der Probe nicht in Sulföraphan gespalten wird in [mg/1 00 g]. In einem weiteren Verfahrensschritt wird die Konzentration c(3) des bioverfügbaren Sulforaphans in der Brokkolikresse aus dem für die erste Probe ermittelten Konzentrationswert c(l) und dem für die zweite Probe ermittelten Konzentrationswert c(2) wie folgt bestimmt: c(3) = y(l ) - y(2) = 72,38 mg / 100 g.

Claims

Patentansprüche
Verfahren zum Bestimmen der Konzentration von Glucoraphanin in einer Pflanze, wobei
a) eine Probe der Pflanze bereitgestellt wird,
b) die Probe mit einem polaren, ungeladenen organischen Lösungsmittel in Kontakt gebracht und derart zerkleinert wird, dass in der Probe enthaltenes Glucoraphanin und weitere in der Probe enthaltene Pflanzenstoffe in dem Lösungsmittel gelöst werden, und
c) aus dem so erhaltenen Extrakt ungelöste Pflanzenbestandteile entfernt werden, um das Extrakt zu klären,
dadurch gekennzeichnet,
d) dass eine UV-Absorptionsmessung des geklärten, das Glucoraphanin und die weitere Pflanzenstoffe enthaltenen Extrakts durchgeführt wird, bei der für einen ersten Wellenlängenbereich, der sich von 200 nm bis 270 nm erstreckt, ein Absorptionsmesssignal erfasst wird,
e) dass die zweite Ableitung des Absorptionsmesssignal für einen zweiten einen Wellenlängenbereich zwischen 240 nm und 250 nm gebildet wird, und
f) dass der Betrag des Minimums der zweiten Ableitung im zweiten Wellenlängenbereich bestimmt und in Abhängigkeit von diesem Betrag wird ein Konzentrationswert für die Konzentration des Glucoraphanins in der Pflanze ermittelt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Absorptionsmesssignal glättungsgefiltert wird und die zweite Ableitung aus dem glät- tungsgefilterten Absorptionsmesssignal gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Pflanze zusätzlich zu dem Glucoraphanin ein räumlich davon getrenntes Spaltungsenzym enthält, bei dessen Kontakt mit dem Glucoraphanin die Pflanze Sulföraphan bildet, dadurch gekennzeichnet,
a) dass eine erste Probe der Pflanze bereitgestellt wird und mit den Merkmalen des Anspruchs 1 ein erster Konzentrationswert für die Konzentration des Glucoraphanins in der ersten Probe ermittelt wird, b) dass eine zweite Probe der Pflanze bereitgestellt wird,
c) dass die zweite Probe derart zerkleinert, dass das eiucoraphanin mit dem Spaltungsenzym in Kontakt gerät,
d) dass eine vorbestimmte Zeitdauer abgewartet wird, die derart bemessen ist, dass in der zweiten Probe das Sulforaphan gebildet und verdunstet wird,
e) dass die zweite Probe derart mit einem polaren, ungeladenen organischen Lösungsmittel in Kontakt gebracht wird, dass in der zweiten Probe enthaltenes Glucoraphanin und weitere in der Probe enthaltene Pflanzenstoffe in dem Lösungsmittel gelöst werden,
f) dass für die zweite Probe die Merkmale c) bis f) aus Anspruch 1 durchgeführt werden, und
g) dass als Konzentrationswert für die Konzentration des bioverfügbaren Sulforaphans der Pflanze die Differenz aus dem für die erste Probe ermittelten Konzentrationswert und dem für die zweite Probe ermittelten Konzentrationswert bestimmt wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das in Schritt d) von Anspruch 1 und/oder in Schritt f) von Anspruch 1 er- fasste Absorptionsmesssignal mit einem Grenzwert verglichen wird, dass für den Fall, dass das Absorptionsmesssignal den Grenzwert überschreitet, das Extrakt entsprechend einem Verdünnungsfaktor verdünnt und Schritt d) aus Anspruch 1 mit dem verdünnten Extrakt wiederholt wird, dass der Verdünnungsfaktor derart gewählt wird, dass das Absorptionsmesssignal des verdünnten Extrakts den Grenzwert nicht überschreitet, und dass die Schritte e) und f) aus Anspruch 1 mit dem Absorptionsmesssignal des verdünnten Extrakts durchgeführt und in Schritt f) von Anspruch 1 ) der Verdünnungsfaktor bei der Ermittlung der Konzentration des Glucoraphanins in der Pflanze berücksichtigt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass Grenzwert zwischen 2 und 3 liegt. ό. Verfahren zum Bestimmen der Konzentration von bioverfügbarem Sulforaphan in einer Pflanze, die Pflanze Glucoraphanin und ein räumlich da- 1 ό von getrenntes Spaltungsenzym enthält bei dessen Kontakt mit dem Glu- coraphanin die Pflanze Sulforaphan bildet gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte:
a) Es wir eine erste Probe der Pflanze bereitgestellt,
b) die erste Probe wird mit einem polaren, ungeladenen organischen Lösungsmittel in Kontakt gebracht und derart zerkleinert, dass in der Probe enthaltenes Glucoraphanin und weitere in der Probe enthaltene Pflanzenstoffe in dem Lösungsmittel gelöst werden,
c) aus dem so erhaltenen ersten Extrakt werden ungelöste Pflanzenbestandteile entfernt, um das erste Extrakt zu klären,
d) es wird eine zweite Probe der Pflanze bereitgestellt
e) die zweite Probe wird derart zerkleinert, dass das Glucoraphanin mit dem Spaltungsenzym in Kontakt gerät,
0 es wird eine vorbestimmte Zeitdauer abgewartet, die derart bemessen ist, dass sich in der zweiten Probe Sulforaphan bildet und verdunstet,
g) die zweite Probe wird derart mit einem polaren, ungeladenen organischen Lösungsmittel in Kontakt gebracht, dass in der zweiten Probe enthaltenes Glucoraphanin und weitere in der Probe enthaltene Pflanzenstoffe in dem Lösungsmittel gelöst werden,
h) aus dem so erhaltenen zweiten Extrakt werden ungelöste Pflanzenbestandteile entfernt um das zweite Extrakt zu klären,
i) es wird eine erste UV-Absorptionsmessung des geklärten ersten, das Glucoraphanin und die weitere Pflanzenstoffe enthaltenen Extrakts durchgeführt, bei der für einen ersten Wellenlängenbereich zwischen 200 nm und 270 nm ein erstes Absorptionsmesssignal erfasst wird, j) es wird eine zweite UV-Absorptionsmessung des geklärten zweiten, das Glucoraphanin und die weitere Pflanzenstoffe enthaltenen Extrakts durchgeführt, bei der für den ersten Wellenlängenbereich ein zweites Absorptionsmesssignal erfasst wird,
k) es wird ein Differenzsignal aus dem ersten Absorptionsmesssignal und dem zweiten Absorptionsmesssignal gebildet,
I) es wird die zweite Ableitung des Differenzsignal für einen zweiten einen Wellenlängenbereich zwischen 240 nm und 250 nm gebildet, und m) es wird der Betrag des Minimums der zweiten Ableitung des Differenzsignals im zweiten einen Wellenlängenbereich bestimmt und in Ab¬ hängigkeit von diesem Betrag wird ein Konzentrationswert für die Konzentration des bioverfügbaren Sulforaphans der Pflanze Sul- foraphans ermittelt.
7. Verfahren nach Anspruch o, dadurch gekennzeichnet, dass das in Schritt i) von Anspruch ό erfasste Absorptionsmesssignal mit einem Grenzwert verglichen wird, dass für den Fall, dass das Absorptionsmesssignal den Grenzwert überschreitet, das Extrakt entsprechend einem Verdünnungsfaktor verdünnt und Schritt i) aus Anspruch ό mit dem verdünnten Extrakt wiederholt wird, dass der Verdünnungsfaktor derart gewählt wird, dass das Absorptionsmesssignal des verdünnten Extrakts den Grenzwert nicht überschreitet, und dass in Schritt k) aus Anspruch ό als erstes Absorptionsmesssignal das mit dem Verdünnungsfaktor multiplizierte Absorptionsmesssignal des verdünnten Extrakts verwendet wird.
8. Verfahren nach Anspruch ό oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Absorptionsmesssignale und/oder das Differenzsignal glättungsgefiltert wird und die zweite Ableitung aus dem glättungsgefilterten Differenzsignal gebildet wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Pflanze Brokkolikres- se ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Lösungsmittel Methanol ist.
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG11201701015QA (en) * 2014-08-29 2017-03-30 Univ Tohoku Optical concentration measuring method
DE102019118171A1 (de) * 2019-07-04 2021-01-07 Endress+Hauser Conducta Gmbh+Co. Kg Verfahren zum Betreiben eines automatischen Analysegeräts und ein automatisches Analysegerät

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5725895B1 (en) * 1995-09-15 2000-10-10 Hopkins J School Of Medicine Method of preparing food product from cruciferous seeds
US6242018B1 (en) * 1997-04-11 2001-06-05 Johns Hopkins School Of Medicine Cancer Chemoprotective food products
WO2006102236A1 (en) * 2005-03-18 2006-09-28 Caudill Seed Inc. Cancer chemoprotective compositions and natural oils and methods for making same
US20080312164A1 (en) * 2006-07-14 2008-12-18 Rajski Scott R Isothiocyanates and glucosinolate compounds and anti-tumor compositions containing same
US20080131578A1 (en) * 2006-10-27 2008-06-05 Caudill Seed and Warehouse Company, Inc. Food or drink products, supplements or additives produced from high glucoraphanin-containing broccoli variety 'hopkins'
HUE046151T2 (hu) * 2007-01-23 2020-02-28 Pharmagra Labs Inc Stabilizált szulforafán
NZ581988A (en) * 2007-07-19 2012-06-29 Univ Oregon State Method for converting glucosinolate
US8927007B2 (en) * 2010-09-17 2015-01-06 Paul Talalay Formulations for treatment with glucosinolates
MX2011005064A (es) * 2011-05-13 2012-11-19 Ceuticos De Vida S A De C V Metodo de cuantificación de sulforafano por cromatografía líquida de alta resolución en plantas crucíferas.
FR2977161B1 (fr) * 2011-07-01 2013-07-19 Sojasun Technologies Compositions pour le traitement ou la prevention du cancer de la prostate a base d'extrait de graines de brocoli.
EP3062802B1 (de) * 2013-11-01 2023-11-15 Rutgers, The State University of New Jersey Pflanzenextrakte aus moringa oleifera und verfahren zur herstellung
US20180332881A1 (en) * 2017-05-17 2018-11-22 Mead Johnson Nutrition Company Preterm infant formula containing butyrate and uses thereof

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
None *
See also references of WO2016029998A1 *

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Publication number Publication date
US20170205384A1 (en) 2017-07-20
WO2016029998A1 (de) 2016-03-03
US10444212B2 (en) 2019-10-15
DE102014012367B3 (de) 2015-08-27

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