DE102016109472A1 - Verfahren zur quantitativen Bestimmung flüssiger Multikomponentengemische - Google Patents

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Abstract

Verfahren zur gleichzeitigen quantitativen Bestimmung von mehreren Inhaltsstoffen in einem flüssigen Multikomponentengemisch, das aus mehreren unterschiedlichen Inhaltsstoffen besteht, umfassend die Schritte: a) Erfassen von optischen Molekülspektren für die zu analysierenden Inhaltsstoffe des Multikomponentengemisches und/oder der jeweiligen Reinsubstanzen zum Erhalt einer spektralen Signatur für den jeweiligen Inhaltsstoff und/oder Reinsubstanz, b) Erstellen eines Kalibrationsmodells für jeden Inhaltsstoff in einer zu untersuchenden Probenmatrix, bei dem – für jeden zu analysierenden Inhaltsstoff eine Standardaddition mit unterschiedlichen Konzentrationen in die Matrix erfolgt und – bei dem die Inhaltsstoffe zur Feststellung von gegenseitigen Wechselwirkungen miteinander unterschiedlich kombiniert werden, c) Durchführen einer multivariaten Datenauswertung, bei der ausgewählte Spektren der Standardadditionen der Inhaltsstoffe und deren unterschiedlichen Kombinationen für jede einzelne Substanz zur Erstellung des Kalibrationsmodells einbezogen werden.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur gleichzeitigen quantitativen Bestimmung von mehreren Inhaltsstoffen in einem flüssigen Multikomponentengemisch, das aus mehreren unterschiedlichen Inhaltsstoffen besteht, basierend auf einer multimodalen Standardaddition mit anschließender multivariaten Datenanalyse spektroskopischer Daten. Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere zur quantitativen Bestimmung von Inhaltsstoffen in einem komplexen Mischgetränk, beispielsweise einem Energy Drink, einsetzbar.
  • Mehrkomponentensysteme wie zum Beispiel Getränke umfassen eine Vielzahl unterschiedlicher Inhaltsstoffe, die bislang über aufwändige chemometrische Verfahren bestimmt werden mussten, um den Anforderungen an die Qualitätssicherung zu erfüllen. In der Getränkeindustrie werden beispielsweise unterschiedliche Grundstoffe für die Herstellung der einzelnen Getränke verwendet, wobei der Grundstoff an sich schon aus mehreren Komponenten bestehen kann. Bei einem nicht alkoholischen Energy Drink liegen z.B. mehrere unterschiedliche Inhaltsstoffe wie Taurin, Koffein, verschiedene B-Vitamine oder auch Süßstoffe wie Acesulfam-K (E 950) oder Aspartam (E 951) nebeneinander in unterschiedlichen Konzentrationen vor. Bei einem Biergetränk werden beispielsweise unterschiedliche Rohstoffe miteinander verarbeitet und es interessieren dabei z.B. die Komponenten Alkohol, Bitterstoffe oder auch phenolische Bestandteile.
  • Üblicherweise wird für die quantitative Bestimmung solcher oder anderer Inhaltsstoffe in einem flüssigen Multikomponentengemisch, wie z.B. einem Energy Drink, als Verfahren die Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie (HPLC) eingesetzt. Daneben bietet die Spektroskopie mit ihren unterschiedlichen Spektroskopiearten eine zuverlässige Möglichkeit zur quantitativen Analytik von Inhaltsstoffen, beispielsweise gezeigt bei der Bestimmung von Ethanol, Milch-, Wein- und Apfelsäure (Lachenmeier, D. W. (2007): Rapid quality control of spirit drinks and beer using multivariate data analysis of Fourier transform infrared spectra. Food Chemistry 101(2), S. 825–832; Vidal-Martelo, M. J.; Vázquez, M. (2014): Evaluation of UV, Vis, and NIR Spectroscopy for the analysis of wine compounds. Czech Journal of Food Science 32(1), S. 37–47). Koffein lässt sich mit Hilfe der UV-Spektroskopie nach Extraktion in einem Soft- oder Energy Drink nachweisen, was jedoch aufgrund der weiteren erforderlichen Verfahrensschritte weit aufwändiger wäre (Amos-Tautua, W.; Martin, B. W.; Diepreye, E. (2014): Ultra-violet Spectrophotometric determination of Caffeine in Soft and Energy Drinks available in Yenoga, Nigeria. Advance Journal of Food Science and Technology 6(2), S. 155–158).
  • Der Koffeingehalt lässt sich beispielsweise mittels einer Standardaddition der Reinsubstanz Koffein, welches in Tetrachlormethan (CCl4) gelöst war, sowie zugehörender Regressionsgerade bestimmen. Diese Methode wird jedoch Offline, d.h. über eine separate Probennahme, durchgeführt und ist bei Inline- oder auf Bypass-basierten Online-Verfahren nicht einsetzbar. Bei der Standardaddition werden bekannte Konzentrationen eines Stoffes in äquidistanten Schritten zu einer unbekannten Konzentration einer Probenmatrix dotiert (Normenausschuss Materialprüfung im DIN (2013): Chemische Analytik – Verfahren der Standardaddition 71.040.40 3263). Für eine ausreichende Genauigkeit sind wenigstens fünf oder mehr Proben notwendig, wobei eine Probe die Nullprobe darstellt, also die Ausgangsprobe ohne den hinzudotierten Analyt. Die hergestellten Proben werden dann mit einem geeigneten Messverfahren (z.B. photometrisch) vermessen und es wird für diese Messwerte eine Regressionsgerade bestimmt. Mit dieser Regressionsgeraden können die ursprünglichen und beliebig andere Konzentrationen berechnet werden. Dabei ist eine Voraussetzung für diese Vorgehensweise, dass für den Inhaltsstoff im verwendeten Konzentrationsbereich die Linearität gegeben ist. In komplexen Systemen ist dies nicht so einfach möglich, da Wechselwirkungen der einzelnen Stoffe die quantitative Bestimmung unmöglich machen kann.
  • Eine weitere häufig angewendete Methode zur Bestimmung von Inhaltsstoffen, beispielsweise des Koffein- oder Aspartamgehalts in Softdrinks, ist die FTIR-ATR-Methode (Paradkar, M. M.; Irudayaraj, J. (2002): Rapid determination of caffeine content in soft drinks using FTIR–ATR spectroscopy. Food Chemistry 78(2), S. 261–266). Die Bestimmung der B-Vitamine erfolgt häufig unter Einsatz der Fluoreszenz-Spektroskopie, beispielsweise mit Hilfe einer Standardaddition von Riboflavin und Folsäure in Wasser und Cu(II)-Lösung (Wang, Y.; Zhu, P.- H.; Tian, T.; Tang, J.; Wang, L.; Hu, X.-Y. (2011): Synchronous Fluorescence as a Rapid Method for the Simultaneous Determination of Folic Acid and Riboflavin in Nutritional Beverages. Journal of Agricultural and Food Chemistry 59(23), S. 12629–12634). Andere Substanzen wie Aminosäurepeptide, Proteine oder Taurin werden häufig mittels Chromatographie, aber auch mittels IR- und Ramanspektroskopie bestimmt (Freire, P.; Melo, F.; Mendes Filho, J. (1996): Polarized Raman and Infrared Spectra of Taurine Crystals. Journal of Raman Spectroscopy 27, S. 507–512; Ohno, K.; Mandai, Y.; Matsuura, H. (1992): Vibrational spectra and molecular conformation of taurine and its related compounds. Journal of Molecular Structure 268(1–3), S. 41–50). Mithilfe der MIR-ATR- sowie der NIR-Spektroskopie lassen sich auch Inhaltsstoffe wie Apfel- oder Milchsäure in komplexen Getränken analysieren (Cozzolino, D.; Cynkar, W.; Shah, N.; Smith, P. (2011): Technical solutions for analysis of grape juice, must, and wine: the role of infrared spectroscopy and chemometrics. Analytical and Bioanalytical Chemistry 401(5), S. 1475–1484).
  • Vielen der erwähnten Analysemethoden eignen sich im Wesentlichen nur zur Anwendung unter Laborbedingungen. Daneben sind auch Verfahren und Vorrichtungen zur spektroskopischen Bestimmung mehrerer Substanzen in Flüssigkeiten von Prozessleitungen der Getränkeindustrie bekannt und vom Anmelder der vorliegenden Erfindung beispielsweise in der EP 2 284 517 A1 , der DE 10 2014 000 056 B3 , der DE 10 2009 028 067 B3 und der DE 10 2008 039 836 B4 beschrieben. Diese Methoden basieren jedoch auf einer univariaten Datenauswertung der über die Spektroskopie erhaltenen Kurven. In einem Multikomponentengemisch bringt eine Änderung eines Stoffes eine vermeintliche quantitative Änderung der anderen Stoffe mit sich, wenn die Konzentration spektral bestimmt wird und die Form des Spektrums wegen überlagernder Banden durch diesen einen Stoff verändert wird. Bei einem Multikomponentengemisch mit drei oder weniger Komponenten kann dies unter Umständen bei einer Kalibration berücksichtigt und korrigiert werden, da die Stoffe dabei unabhängig voneinander verändert und eventuell auftretende Wechselwirkungen sichtbar werden. Sofern jedoch alle möglichen Kombinationen in einem Vielstoffgemisch berücksichtigt werden sollen, wäre eine Vielzahl von Versuchen und Kontrollen notwendig, was das Systems komplexer und außerordentlich fehleranfällig machen würde. Insofern stellt eine univariate Datenanalyse komplexer Multikomponentengemische keine zufriedenstellende Möglichkeit dar, mehrere Inhaltsstoffe gleichzeitig spektroskopisch zu erfassen und quantitativ zu bestimmen, da die Methode bei Online- oder Inline-Prozessen zu aufwändig wäre.
  • Noch komplexer wird das Vorhaben im Rahmen der Prozessanalytik bei einem Inline-Prozess. So beschreibt die DE 10 2014 106 916 A1 eine Vorrichtung und ein Verfahren zur automatisierten Bestimmung von mindestens zwei unterschiedlichen Prozessparametern in einer Probe einer Prozessflüssigkeit eines Prozesses. Auch hier wird mit Hilfe der Standardaddition eine Kalibrierung der Inhaltsstoffe durchgeführt. Allerdings basiert das Verfahren ebenfalls auf einer univariaten Datenauswertung und ist daher nicht für ein Vielkomponentengemisch geeignet. Das Gleiche trifft auch auf die in der DE 10 2010 022 408 A1 beschriebenen Verfahren und Vorrichtungen zu, die eine klassische Standardaddition zur Kalibrierung eines Analyten in einer Probe einsetzen. Bei diesen Verfahren wird die Probe mit einem internen Standard vermessen und eine Matrix-angepasste Kalibrierung durchgeführt. Damit sollen herkömmliche Ansätze zum Quantifizieren einer unbekannten Konzentration eines oder mehrerer Analyten, die auf spektrometrisch erfassten Daten basieren, verbessert werden. Dies geschieht vor dem Hintergrund, dass diese Kalibrierungslösungen individuell vor der Durchführung vorbereitet werden, was zeitaufwändig und fehleranfällig ist. Eine direkte Messung unterschiedlicher Inhaltsstoffe im Multikomponentengemisch, beispielsweise einem Getränk, zur Realisierung einer Inline-Analytik mit Hilfe spektroskopischer Verfahren ist mit einem solchen System nicht möglich. Insbesondere werden keine spektroskopischen Beeinflussungen der verschiedenen Komponenten untereinander bei der Standardaddition berücksichtigt, was die Fehleranfälligkeit und den Aufwand entsprechend erhöht.
  • Vor diesem Hintergrund ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Kalibrierungsmodell zur quantitativen Bestimmung von Einzelkomponenten in einem Multikomponentengemisch in einer komplexen Multikomponenten-Matrix bereitzustellen, mit dem eine gleichzeitige quantitative Bestimmung von mehreren Inhaltsstoffen in einem flüssigen Multikomponentengemisch möglich ist.
  • Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1. Bevorzugte Ausführungsformen finden sich in den Unteransprüchen wieder.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren basiert auf einer Auswertung von multimodalen Informationen und Datensätzen zur Erstellung eines Kalibrierungsmodells in einer komplexen Probenmatrix. Ausgangspunkt ist hierbei die spektroskopische Erfassung der Inhaltsstoffe in dem flüssigen Multikomponentengemisch anhand ausgewählter Wellenlängenbereiche, beispielsweise unter Einsatz von UV-Spektroskopie und/oder Vis-Spektroskopie und/oder Fluoreszenzspektroskopie und/oder IR-Spektroskopie und/oder Raman-Spektroskopie und/oder NMR-Spektroskopie oder einer Kombination dieser Methoden. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die über die spektroskopischen Methoden ermittelten Spektren datentechnisch erfasst und bei der Kalibration der einzelnen Inhaltsstoffe über eine Standardaddition direkt zu der Matrix des Multikomponentengemisches zugefügt. Dadurch lassen sich auch Matrix-Änderungen und Wechselwirkungen der einzelnen Inhaltsstoffe mit berücksichtigen. Auch können Einflüsse wie der pH-Wert des Getränks und nicht messbare Komponenten, wie sie in Naturstoffen vorkommen, in die Kalibration integriert werden. Anschließend werden die spektralen Signaturen einer multivariaten Datenanalyse unterzogen. Dabei werden die Spektren der Standardadditionen aller Inhaltsstoffe gleichzeitig zur Erstellung des Kalibrationsmodells für einen einzelnen Stoff in die Auswertung mit einbezogen. So kann der Einfluss von überlagernden Banden der verschiedenen Inhaltsstoffe zusammen mit der Matrix berücksichtigt werden. Bei der multivariaten Datenanalyse ist es möglich, nicht nur eine Wellenlänge zu nutzen, vielmehr werden die gesamten spektralen Signaturen der Komponenten und deren Wechselwirkungen mit der Matrix berücksichtigt. Vorzugsweise liegen bei bestimmten prozesstechnischen Anwendungen die Produktionswerte in einem eng definierten Aktionsbereich.
  • Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden in einem ersten Schritt optische Molekülspektren für die zu analysierenden Inhaltsstoffe des Multikomponentengemisches und/oder der jeweiligen Reinsubstanzen erfasst, um so eine spektrale Signatur für den jeweiligen Inhaltsstoff und/oder die Reinsubstanz zu erhalten. In einem weiteren Verfahrensschritt wird ein Kalibrationsmodell für jeden Inhaltsstoff in einer zu untersuchenden Probenmatrix erstellt, bei dem für jeden zu analysierenden Inhaltsstoff eine Standardaddition mit unterschiedlichen Konzentrationen in die Matrix erfolgt und bei dem die Inhaltsstoffe zur Festlegung von gegenseitigen Wechselwirkungen miteinander unterschiedlich kombiniert werden. Eine Änderung einer einzelnen Substanz zieht eine vermeintliche quantitative Änderung weiterer Substanzen mit sich, da infolge dessen sich die Form des Spektrums wegen überlagernder Banden durch die eine Substanz verändert. Durch das Kalibrationsmodell, in dem nun alle Spektren aller Standardadditionen integriert worden sind, wird eine daraus resultierende Konzentrationsänderung berücksichtigt und ggf. korrigiert. Zudem können auch Wechselwirkungen zwischen den Molekülen, wie beispielsweise nicht-lineare Effekte, berücksichtigt werden.
  • Anschließend wird erfindungsgemäß eine multivariate Datenauswertung durchgeführt, bei der ausgewählte Spektren der Standardadditionen der Inhaltsstoffe und deren unterschiedliche Konzentrationen für jede einzelne Substanz zur Erstellung des Kalibrationsmodells einbezogen werden. Dadurch kann der Einfluss der überlagernden Banden der verschiedenen Inhaltsstoffe zusammen mit der Matrix berücksichtigt werden.
  • Vorzugsweise werden die Daten für die multivariate Datenanalyse vorverarbeitet, um beispielsweise mögliche Basislinien-Verschiebungen oder Rauschen zu entfernen. So kann die erste oder zweite Ableitung benutzt werden, um Basislinien zu korrigieren oder bei sich überlagernden Banden einzelne Schultern einer Kurve hervorzuheben. Verrauschte Spektren können wiederum über eine Savitzky-Golay-Glättung verarbeitet werden.
  • Nach der Datenvorverarbeitung wird eine Hauptkomponentenanalyse durchgeführt, bei der aus den erhaltenen Messvariablen unabhängige Hauptkomponenten ermittelt werden, welche die Informationen der Spektren möglichst vollständig beschreiben. Dazu werden die Proben des flüssigen Multikomponentengemisches in eine Hauptkomponentenmatrix und eine Gewichtsmatrix aufgeteilt, wobei die Hauptkomponentenmatrix die Informationen beinhaltet, mit denen eine möglichst hohe Varianz der Ausgangsdatenmatrix beschrieben werden kann und wobei die Gewichtsmatrix den Anteil bezeichnet, den jede Hauptkomponente an dem einzelnen Probenspektrum hat. Variablen mit betragsmäßig kleinen Werten spielen für die Findung der betrachteten Hauptkomponenten keine oder nur eine geringe Rolle. Die Hauptkomponenten bilden ein neues Koordinatensystem für die Daten mit kleinerer Dimension als das Original-Koordinatensystem der Datenmatrix. Die Gewichtsmatrix kann wie eine Konzentrationsangabe bewertet werden, allerdings in Bezug auf die Hauptkomponenten. Aus den unerklärten Anteilen der ersten Hauptkomponente wird die zweite, dann die dritte, vierte usw. Hauptkomponente berechnet. Je nach Zahl der verwendeten Hauptkomponenten ändert sich der prozentuale Erklärungsanteil für das Gesamtsystem. Ziel ist dabei immer, mit möglichst wenigen Hauptkomponenten möglichst viel der spektralen Varianz zu beschreiben. Die Interpretation der "Loadings" der Hauptkomponentenmatrix ermöglicht eine spektroskopische Erklärung der Varianz in den Original-Spektren.
  • Bei der multivariaten Datenanalyse können mathematische Analysemethoden wie Partial Least Square (PLS)-Regression, 3-Wege-PLS-Regression, PCR, Varianzanalyse (ANOVA) und Responseflächenanalyse ANOVA, SIMCA-Klassifikation, Diskriminanzanalyse, PLSDA-Klassifikation, Hauptkomponentenanalyse (PCA), Faktorenanalyse, Kategorievariablen, Redundanzanalyse (RDA), PCA Projektion, Orthogonale Rotation von Faktoren (Varimax, Quartimax, Equimax und Parsimax), Multivariate Kurven Auflösung (MCR), Clustering (K-Means), Support Vector Machines (SVM) und/oder neuronale Netzwerke zur Anwendung kommen, wobei die Qualität der Analysemethoden durch die jeweiligen Figures of Merits bestimmt werden.
  • Bevorzugt ist die PLS-Regression, welche eine multivariate Regressionsmethode darstellt, mit der ein quantitativer Zusammenhang zwischen großen korrelierten X-Datenmengen (z.B. Spektren) mit einer Y-Zielgröße (z.B. Konzentration der Inhaltsstoffe) berechnet werden kann. Die PLS-Regression benutzt zur Berechnung des am besten passenden Regressionsmodells die X- und Y-Daten gleichzeitig. Zur Findung der Hauptkomponenten, die man bei der PLS als Faktoren bezeichnet, wird die Kovarianz zwischen X und Y maximiert. Das bedeutet, das PLS Regressionsmodell soll die vorhandene X-Variabilität (die Änderung der Spektren) möglichst umfassend beschreiben und gleichzeitig die vorhandene Y-Varianz möglichst umfassend erklären. Die PLS-Faktoren können damit besser an die Struktur der Zielgröße Y angepasst werden, d. h. die PLS-Faktoren werden zielgerichtet auf die Regression berechnet und unterscheiden sich in der Regel von den PCA-Hauptkomponenten. Es gibt verschiedene PLS-Algorithmen, am häufigsten wird der NIPALS (Non Linear Iterative Partial Least Squares) Algorithmus von HERMAN WOLD angewendet. Die PLS-Regressionsmodelle beschreiben den Zusammenhang zwischen den X-Daten und der Zielgröße Y in der Regel mit wenigen PLS-Faktoren. Anhand der PLS-Scores und -Loadings kann der Zusammenhang zwischen den X-Daten und der Y-Zielgröße analog zur PCA dargestellt werden. Zusätzlich werden bei der PLS-Regression die Regressionskoeffizienten berechnet, die den quantitativen Zusammenhang zwischen den X-Daten und der Y-Zielgröße wiedergeben.
  • Bei der multivariaten Datenanalyse müssen vorher der Fehler des Kalibrationsmodells und die Zuverlässigkeit der Vorhersage bestimmt werden. Zur Erstellung des Kalibrationsmodells werden möglichst repräsentative Spektren mit dem zugehörigen Referenzwert des Inhaltsstoffs ausgewählt. Diese sollten den Datenraum ausreichend komplett und großzügig abdecken. Mit dem erstellten Kalibrationsmodell wird jedes in der Kalibration verwendete Spektrum der Y-Wert (Yi Kal') vorhergesagt. Der Vergleich des gemessenen Referenzwertes (Yi Kal') mit dem berechneten, vorhergesagten Wert gibt die Güte der Kalibration in Form des mittleren Fehlers der Kalibration an (Root Mean Square Error of Calibration, RMSEC). Die Summe der Fehlerquadrate (Differenz aus Referenzwert abzüglich vorhergesagter Wert) wird durch die Anzahl der Proben n abzüglich der Zahl der verwendeten PLS Faktoren p geteilt. Je kleiner dieser Wert bei optimaler Anzahl an Komponenten, desto besser ist das Modell für die Prozessanalytik geeignet:
    Figure DE102016109472A1_0002
  • Da Störgrößen den RMSEC verschlechtern können, empfiehlt es sich, diese vorher zu reduzieren, z.B. durch Glättung der Spektren oder Bildung von Ableitungen, um eindeutige Informationen zu filtrieren.
  • Für den Validierungsfehler wird in dem beschriebenen Beispiel eine Kreuzvalidierung oder „Cross Validation“ durchgeführt, bei der ein Teil der Daten ausgelassen und darauf basierend ein Modell erstellt wird. Die folgende Formel beschreibt diesen Zusammenhang:
    Figure DE102016109472A1_0003
  • Der Fehler der Genauigkeit wird beispielsweise anhand der RMSEP (Root Mean Square Error of Prediction) berechnet:
    Figure DE102016109472A1_0004
  • Vorzugsweise ist vorgesehen, dass die Konzentrationen und die Varianzen von Grundstoffen in der Matrix des flüssigen Multikomponentengemisches gleichzeitig bestimmt und abgeglichen werden, wobei die spektralen Signaturen der Grundstoffe in die Kalibration einbezogen und gegen einen Referenzwert verrechnet werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsvariante erfolgt eine multimodale Erfassung der Spektren in unterschiedlichen Wellenlängenbereichen unter Anwendung unterschiedlicher Erfassungsmethoden und/oder Aufnahmeparameter, wobei nur solche Wellenlängenbereiche für die Auswertung ausgewählt werden, die eine geeignete spektrale Signatur der Inhaltsstoffe des Multikomponentengemisches aufweisen, wobei bei überlappenden Spektren die für die Auswertung herangezogene spektrale Signatur so gewählt wird, dass möglichst geringe Überlagerungen auftreten. Vorzugsweise erfolgt eine Auswertung der spektralen Signatur der Inhaltsstoffe und/oder der Reinsubstanzen in einem Wellenlängenbereich vorzugsweise zwischen 180 nm und 380 nm, bevorzugter zwischen 180 nm und 280 nm, vorzugsweise in einem Bereich zwischen 200 nm und 315 nm.
  • Ein bevorzugter Bereich für die Auswahl der spektralen Signatur ist der UV-Bereich, der in folgende Subbereiche unterteilt werden kann: UV-A 380–315 nm; UV-B 315–280 nm; UV-C-FUV 280–200 nm; UV-C-VUV 200–100 nm.
  • Grundsätzlich lassen sich unterschiedliche spektroskopische Analysemethoden für das erfindungsgemäße Verfahren verwenden oder auch Kombinationen dieser Methoden. Dazu gehört beispielsweise die multimodale spektroskopische Bestimmung der Spektren anhand ausgewählter Wellenlängenbereiche unter Einsatz von UV-Spektroskopie und/oder Vis-Spektroskopie und/oder Fluoreszenzspektroskopie und/oder IR-Spektroskopie und/oder Raman-Spektroskopie und/oder NMR–Spektroskopie oder einer Kombination dieser Methoden.
  • Zur stichprobenhaften Überprüfung und Validierung des Kalibrationsmodells und der so erhaltenen quantitativen Daten für die einzelnen Inhaltsstoffe des Multikomponentengemisches kann ferner zusätzlich eine Versuchsplanung in Form eines "Design of Experiment" (DoE) oder ein zweistufiger Faktorenversuchsplan durchgeführt werden. Die Methodik zum DoE kann jedoch auch zusätzlich mit der multivariaten Datenauswertung und der Erstellung des Kalibrationsmo-dells für bestimmte Fragestellungen in die Prozessanalytik mit einbezogen werden. Bei der Versuchsplanung im Rahmen der DoE-Methodik werden die Inhaltsstoffe in allen möglichen Kombinationen miteinander gemischt. Ziel ist es, eine möglichst geringe Anzahl von Versuchen mit maximalem Informationsgehalt durchzuführen und die Wechselwirkungen mit einzubeziehen. Die Anzahl der erforderlichen Versuche ergibt sich aus 2n (n = Inhaltsstoffe). Dabei gilt es, für jeden zu untersuchenden Inhaltsstoff jeweils eine maximale und eine minimale Konzentration einzustellen. Dadurch können Wechselwirkungen der Inhaltsstoffe untereinander aufgedeckt werden. Die Konzentrationen werden dabei so gewählt, dass sie die Standardadditionen eingrenzen. Erkennbar stößt die DoE-Methodik bei einer Vielzahl von Komponenten jedoch an ihre Grenzen, so dass sie für eine effiziente Analyse eines Multikomponentengemisches oder gar für einen industriellen Inline-Prozess alleine nicht geeignet wäre. Sie kann somit allenfalls zur stichprobenartigen Überprüfung des erfindungsgemäßen Kalibrationsmodells herangezogen werden.
  • Aufgrund der multivariaten Auswertung und des geringen Fehlers eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere zur quantitativen Bestimmung von Inhaltsstoffen in einem Mischgetränk. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Getränk um ein Soft Drink oder Energy Drink. Aber auch bei traditionellen Getränken wie Bier und Wein lässt sich das Verfahren anwenden. Bei den zu bestimmenden Inhaltsstoffen kann es sich beispielsweise um Koffein, Taurin, Acesulfam-K, Aspartam, Steviosid, iso-Alphasäure, Apfel-, Wein- oder Milchsäure oder Vitamine wie Niacin, Pantothensäure, Pyridoxin, Riboflavin, Folsäure, Cobalamin handeln, wobei einer oder mehrere Inhaltsstoffe in einem Inline-Prozess ermittelt werden. Bei einem Biergetränk können über das erfindungsgemäße Verfahren beispielsweise Bitterstoffe quantitativ bestimmt werden.
  • Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, dass eine einfache Addition eines einzelnen Inhaltsstoffes ausreicht, um auch in einer komplexen und unbekannten Matrix alle Änderungen zu erfassen und die einzelnen Konzentrationen korrekt zu bestimmen. Im Gegensatz zur DoE-Methodik ist das erfindungsgemäße Verfahren weit weniger fehleranfällig, da nicht gleichzeitig mehrere Konzentrationen verändert werden müssen. Daher muss auch kein komplizierter und exzessiver Versuchsplan erstellt werden, da die einzelnen Wechselwirkungen der Inhaltsstoffe und die damit verbundene Änderung des Konzentrationsgefüges in die Matrix mit einfließen. Ferner ist die Durchführung der Kalibrationen sehr schnell umsetzbar, was eine erhebliche Zeitersparnis mit sich bringt. Dies ist insbesondere dann wichtig, wenn Naturstoffe als Inhaltsstoffe in dem Multikomponentengemisch verarbeitet werden. Hier treten erfahrungsgemäß Jahrgangsschwankungen von Rohstoffen, unterschiedliche Reinheitsgrade bei Chargen oder sonstige Änderungen bei der Herstellung von gelieferten Rohstoffen auf, die in der erfindungsgemäßen Probenmatrix und der anschließenden multivariaten Auswertung berücksichtigt werden. Die multivariate Auswertung und die Erstellung des Kalibrationsmodells können auf solche Abweichungen schnell reagieren und ggf. angepasst werden. Dadurch ist das erfindungsgemäße System flexibel einsetzbar und ermöglicht insbesondere eine automatische Inline-Prozessanalytik in laufenden Industrieprozessen.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht nicht nur die Quantifizierung von Konzentrationen der Inhaltsstoffe in einer komplexen Matrix, sondern auch die Ermittlung von Varianzen von Grundstoffen, beispielsweise von Naturstoffen wie Trauben, Hopfen, Malz, Coca-Extrakten, Orangensäften etc. Dies erfolgt dadurch, dass die spektralen Signaturen der Grundstoffe mit in die Kalibration einbezogen und gegen einen Referenzwert verrechnet werden.
  • Zusammengefasst ermöglicht die multimodale Standardaddition im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens eine vereinfachte Kalibration durch Addition der Komponenten in eine komplexe Matrix, wodurch Fehler deutlich vermindert oder vermieden werden. Die Durchführung einer Multikomponentenkalibration kann in einer unbekannten Probenmatrix durchgeführt werden und aufgrund der Multimodalität und der multivariaten Datenanalyse können nicht-lineare Abhängigkeiten ausgeglichen werden, da auch Wechselwirkungen mit berücksichtigt werden. Ferner können Stoffgemische mit spektroskopischen Überlagerungen auseinandergehalten werden, da sämtliche Kalibrationen der verschiedenen Stoffe in die Auswertung mit einbezogen werden und damit eine wesentlich höhere Selektivität erzielt werden kann. Schließlich können Rohstoffänderungen (z.B. der Grundstoffe) und Matrixänderungen leicht in die Kalibration integriert werden. Es wird der gesamte spektroskopische Fingerabdruck in die Kalibration einbezogen und nicht nur einzelne Wellenlängen.
  • Die Erfindung wird in den nachfolgenden Ausführungsbeispielen näher erläutert. Dabei wurden unterschiedliche Inhaltsstoffe eines komplexen Multikomponentengemisches, d.h. eines Energy Drinks, analysiert und einer multivariaten Datenanalyse unterzogen.
  • Material und Methoden
  • Inhaltsstoffe
  • Die verwendeten Inhaltsstoffe sind in der nachfolgenden Tabelle aufgeführt:
    Inhaltsstoff Menge in Red Bull [mg/100mL]
    Taurin 400
    Koffein 32
    Acesulfam – K 14
    Aspartam 12
    Niacin (Vitamin B 3) 8
    Pantothensäure (Vitamin B 5) 2
    Pyridoxin (Vitamin B 6) 2
    Riboflavin (Vitamin B 2) 0,6
    Cobalamin (Vitamin B 12) 0,002
  • Proben und Probenvorbereitung
  • Für die Analysen wurde ein handelsüblicher Energy Drink verwendet. Bevor die Proben vermessen werden konnten, mussten sie zuerst von der Kohlensäure befreit werden, da enthaltene Restkohlensäure eine Störgröße darstellt und leicht zu Fehlmessungen führen kann. Dies erfolgte durch eine Behandlung der Energy Drinks in einem Ultraschallbad. Bei einer industriellen Verarbeitung ist diese Vorgehensweise nicht notwendig, da die Analyse auch unter Druck durchgeführt werden kann und somit eine Entgasung nicht notwendig ist.
  • Standardisierte Vorgehensweise zur spektralen Quantifizierung der Inhaltsstoffe
  • Bei der erfindungsgemäßen Kalibrationsmethode wurde eine standardisierte Vorgehensweise eingehalten. Dies gewährleistet konstant die gleichen Voraussetzungen für jede Messung, wodurch die Messungen jederzeit miteinander verglichen werden können.
  • Für die Auswertungen wurde für jede Spektroskopieart die optimale Datenvorverarbeitung ausgewählt. In diesem Ausführungsbeispiel wurden die UV- und Vis-Spektren abgeleitet und mittels Savitzky-Golay geglättet. Es wurde eine erste Ableitung durchgeführt und mit einem Polynom 2. Ordnung über 3 Datenpunkte geglättet. Für die Regression wurden die Bereiche der charakteristischen Peaks der Reinsubstanzen ausgewählt. Um das bestmöglichste Ergebnis zu erhalten, wurden zudem alle Standardadditionen in eine gemeinsame Datei integriert. Für die Auswertung der Standardaddition eines Stoffes wurden sämtliche gemessenen Standardadditionen in die Auswertung mit einbezogen, um mögliche Störgrößen in die Matrix zu integrieren.
  • Messergebnisse und Bewertung
  • Spektrale Signaturen von Energy Drinks als Multikomponentengemische
  • Je nach Art der zu untersuchenden Inhaltsstoffe in dem Multikomponentensystem kommen unterschiedliche Spektroskopie-Methoden zur Anwendung. Daher wird – je nach Signaturmethode – die IR-, Raman- oder UV-, Vis-Spektroskopie zur Anwendung kommen. Bestimmte Inhaltsstoffe benötigen aber auch Energien, die unterhalb eines Wellenlängenbereiches von 200 nm liegen.
  • Von den in den nachfolgenden Ausführungsbeispielen gezeigten Inhaltsstoffen ließen sich alle untersuchten Moleküle sowohl mit der UV-Spektroskopie, Vis-Spektroskopie als auch mit der Schwingungsspektroskopie (IR- oder Raman-Spektroskopie) analysieren. Je nach Inhaltsstoff kommen mögliche Spektroskopie-Arten zur Anwendung.
  • Die nachfolgende Tabelle fasst die möglichen Spektroskopiearten für eine multivariate Auswertung für eine Auswahl beispielhafter Inhaltsstoffe zusammen.
    Inhaltsstoff Mögliche Spektroskopieart
    Koffein UV, Raman/IR, Fluoreszenz
    Acesulfam-K UV, Raman/IR
    Aspartam UV, Raman/IR
    Vitamin B 3 UV, Raman/IR, Fluoreszenz
    Vitamin B 6 UV, Raman/IR, Fluoreszenz
    Vitamin B 2 Vis, Raman/IR, Fluoreszenz
    Vitamin B 12 Vis, Raman/IR, Fluoreszenz
    Taurin Raman/IR
    Vitamin B 5 UV, Raman/IR
  • Auswahl der Spektren der Reinsubstanzen
  • Zur Evaluierung der Messmethoden wurde als Kontrollexperiment die Reinsubstanz mit der jeweiligen Methodik spektral vermessen. Je nach Substanz werden charakteristische Spektren für die einzelnen Moleküle erhalten.
  • Anschließend wurde die Standardaddition der Reinsubstanzen durchgeführt.
  • In 1A ist beispielhaft die Standardaddition von Koffein über einen Bereich zwischen 195 nm und 400 nm gezeigt. Für die Kalibration von Koffein wurden die Peaks ausgewählt, in denen die Signatur von Koffein enthalten ist. Bei Koffein ist dies beispielsweise der UV B, C-Bereich von 200 bis 315 nm. In dem für die multivariate Auswertung ausgewählten Bereich und für zwei Faktoren wurde für die Kalibration ein Fehler von RMSEQ = 0,04 mg/100 ml erreicht und für die Validierung RMSEQV = 0,05 mg/100 ml (R2 = 99,97 %). Der Fehler der Kalibration stellt eine Abweichung von 0,13 % des maximal enthaltenen Sollwerts dar.
  • 1B zeigt die Kalibration und Validierung von Koffein, wobei die Standardadditionen von Acesulfam-K und Vitamin B 3 integriert sind.
  • In 2A ist die Standardaddition von Vitamin B 3 gezeigt. Der Fehler der Kalibration liegt im ausgewählten Bereich (200 bis 315 nm) mit drei Faktoren bei einem mittleren quadratischen Fehler von RMSEQ = 0,02 mg/100 ml. Die berechnete Validierung mit RMSEQV = 0,025 mg/100 ml liegt bei einer prozentualen Abweichung vom enthaltenen Sollwert bei ca. 0,25 %.
  • 2B zeigt die Kalibration und Validierung von Vitamin B 3, wobei die Standardadditionen von Acesulfam-K und Koffein mit integriert wurden.
  • Analog wurde mit den weiteren Inhaltsstoffen Acesulfam–K, Vitamin B 6, Aspartam verfahren. Die nachfolgende Tabelle fasst die Fehler der Kalibration und die Validierung der Standardaddition für die spektrale Untersuchung im UV-Bereich:
    λ-Bereich der Auswertungen [nm] Fehler Kalibration RMSEC [mg/100 ml] Fehler Validierung RMSECV [mg/100 ml] Faktoren
    Koffein UV B, C 0,049 0,051 2
    Vitamin B 3 UV B, C 0,023 0,025 3
    Acesulfam-K UV B, C 0,036 0,041 3
    Vitamin B 6 UV B, C 0,014 0,014 3
    Aspartam UV B, C 0,18 0,073 0,187 0,079 3 5
  • Des Weiteren wurden auch die Inhaltsstoffe Vitamin B 2 sowie Vitamin B 12 anhand der Vis-Spektroskopie analysiert und die Standardadditionen ermittelt (nicht gezeigt).
  • Die weiter getestete Komponente Taurin hat weder im ultravioletten Bereich oberhalb von 220 nm noch im visuellen Bereich eine auswertbare spektrale Signatur. Da Taurin über zwei charakteristische strukturelle Gruppen (HSO3- sowie -NH2) verfügt, bildet die Schwingungsspektroskopie eine Möglichkeit zur quantitativen Analyse von Taurin. Getestet wurden die IR-Spektroskopie mit ATR Technologie sowie die Raman-Spektroskopie, die aufgrund der guten Selektivität und Empfindlichkeit in Frage kommen und für das Arbeiten in einer wässrigen Matrix besonders geeignet sind.
  • Um zu entscheiden, welche Messmethodik später verwendet werden kann, wird zuerst die Güte der spektroskopischen Technik qualitativ bestimmt, wofür ein Kalibrier- und ein Validierset erzeugt wird. Für die qualitative Aussage wird mit dem Kalibrierset eine PLS-Regression gerechnet. Mit dem bestehenden Modell des Kalibriersets wird anschließend eine Vorhersage für das Validierset getätigt. Mit den vorhergesagten Werten und den vorgegebenen „realen“ Werten wird mittels einer Differenzrechnung die Standardabweichung der Werte bestimmt. Diese Vorgehensweise bestimmt die Streuung und die Güte der Spektroskopieart und lässt so die unterschiedlichen Spektroskopiearten miteinander vergleichen. Danach werden die angewendeten Techniken validiert.
  • Beispiel Raman-Spektroskopie
  • 3A zeigt die mit unterschiedlichen Konzentrationen von Taurin erhaltenen Rama-Spektren über einen Bereich zwischen 695 cm–1 und 1133 cm–1. Für die Auswertung werden nur solche Peaks ausgewählt, welche für Taurin spezifisch sind. Der Peak bei 1046 cm–1 ist charakteristisch für die S=O Bindung (Sulfonsäure) und zeigt einen der Konzentrationsänderung äquivalenten Anstieg.
  • Da auch die Spektren der Raman-Spektroskopie innerhalb der Messreihe Abweichungen aufzeigen, ist es notwendig die Spektren vorher zu normieren. Als Datenvorverarbeitung wird ein Polynom 2. Ordnung mit einer „Detrending“-Funktion genutzt, um eventuell schief liegende Spektren in die horizontale Position zu transformieren. Zusätzlich wird nur über den Bereich von 695 cm–1 bis 1133 cm–1 normalisiert, um bei den Auswertungen von der gleichen Grundlinie ausgehen zu können. Da die Eigenfluoreszenz des Energy Drinks die Messungen im Raman Bereich stark beeinflussen, kann lediglich der Bereich bis 1132 cm–1 verwendet werden. Die Peaks vor 695 cm–1 können den Raman Banden der Sonde und dem Probenbehälter zugeordnet werden.
  • Für die Bewertung ist besonders der Peak bei 1046 cm–1 (symmetrische Streckschwingung) der sich am eindeutigsten mit der Konzentration verändernde Peak. Dieser Peak ist für die S=O-Bindung charakteristisch. Die anderen kleineren Peaks sind u. a. dem Probenbehälter, der Raman-Wasserbande sowie Taurin zuzuordnen.
  • Für die Berechnung der Standardabweichung ist es unbeachtlich, ob über den gesamten Bereich eine PLS-R gerechnet wird oder lediglich über den Bereich um den Peak (1026 cm–1 bis 1061 cm–1). In beiden Fällen liegt sie bei s = 0,263 g/l also 26,3 mg/100 ml. Der mittlere quadratische Fehler der Kalibration liegt bei RMSEC = 22,7 mg/100 ml, der der Validierung bei RMSECV = 45,4 mg/100 ml. Der Fehler der Vorhersage des Validiersets liegt bei RMSEP = 27,4 mg/100 ml, was eine Abweichung vom Sollwert von ca. ± 5,6 % ergab.
  • 3B zeigt den Detailausschnitt um 1046 cm–1 des Spektrums von 695 cm–1 bis 1130 cm–1. Deutlich ist der konzentrationsabhängige Amplitudenverlauf des für Taurin spezifischen Peaks zu erkennen.
  • Die nachfolgende Tabelle fasst die Ergebnisse aller Messreihen der Standardaddition zusammen:
    Fehler Kalibration RMSEC [mg/100 ml] %-Abweichung zum Sollwert Fehler Validierung RMSECV [mg/100 ml] Spektroskopieart
    Koffein 0,049 0,15 0,051 UV
    Vitamin B 3 0,023 0,28 0,025 UV
    Acesulfam-K 0,036 0,25 0,041 UV
    Vitamin B 6 0,014 0,7 0,014 UV
    Aspartam 0,18 0,073 1,5 0,61 0,187 0,079 UV (mit 3 und 5 Faktoren)
    Vitamin B 2 0,005 0,8 0,01 Vis
    Vitamin B 12 0,0004 20 0,0009 Vis
    Taurin 3,3 22,7 0,82 5,6 50,1 45,5 IR Raman
  • Fast alle mittleren Fehler der Inhaltsstoffe im Multikomponentengemisch liegen unter einer prozentualen Abweichung von 5 % zum Sollwert. Somit zeigt sich die UV- und Vis-Spektroskopie als äußerst robust und für eine Anwendung in einem Inline-Prozess als hervorragend geeignet. Der Kalibrationsfehler bei dieser Methodik war weniger als 1 % Abweichung zum Soll-Wert in dem Multikomponentengemisch.
  • Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse, dass die Inhaltsstoffe typische spektrale Signaturen liefern, insbesondere im ultravioletten Bereich, um mit Hilfe einer multivariaten Datenanalyse eine ausreichende Selektivität aufzuweisen.
  • Um die Genauigkeit der Methode über den gesamten Arbeitsbereich zu überprüfen und damit den RMSEP zu bestimmen, werden die Substanzen Koffein, Acesulfam-K und Vitamin B 3 in einem Multikomponenten-Mischungsplan angesetzt und im UV-Bereich spektral vermessen.
  • Auswertung und Ergebnisse der Methode
  • 4A und 4B zeigen beispielhaft die Spektren einiger Mischungsversuche. Ergebnisse für Koffein Der mittlere quadratische Fehler der Standardaddition liegt bei RMSEC = 0,049 mg/100 ml bestimmt über den UV B, C-Bereich zwischen 200 nm bis 315 nm. Der errechnete Fehler der Vorhersage RMSEP für den Mischungsversuch liegt mit zwei Faktoren bei RMSEP = 0,12 mg/100 ml, was eine Abweichung vom Sollwert von gerade einmal 0,38 % ausmacht. Diese Abweichung ist gleichwertig oder besser im Vergleich zu der derzeit verwendeten Methodik im Labor.
  • Ergebnisse für Vitamin B 3
  • 4B zeigt den PC 2-PC 3 Scoreplot der Standardaddition von Vitamin B 3. PC 2 und PC 3 trennt die Inhaltsstoffe Acesulfam-K und Aspartam. Vitamin B 3 liegt schräg im Scoreplot, braucht also zusätzlich anteilig Informationen von PC 3, um vollständig erklärt zu werden. Beim ausgewählten Wellenlängenbereich liegt der mittlere Fehler der Kalibration mit drei Faktoren bei RMSEC = 0,023 mg/100 ml. Der ausgerechnete mittlere Fehler der Vorhersage der Mischungen beläuft sich auf einen Wert von RMSEP = 0,042 mg/100 ml, was einer Abweichung vom Sollwert von 0,5 % gleichkommt.
  • Ergebnisse für Acesulfam-K
  • In gleicher Weise wurde auch ein Scoreplot der Standardaddition von Acesulfam-K erhalten. PC 2 trennt die Inhaltsstoffe Acesulfam-K und Vitamin B 3 und benötigt ebenso wie Vitamin B 3 die Information des dritten Faktors zur genaueren Vorhersage. Mit einem Fehler der Kalibration RMSEC = 0,036 mg/100 ml ergibt der mittlere quadratische Fehler einen Wert von RMSEP = 0,12 mg/100 ml. Dies ergibt lediglich eine Abweichung von rund 1 % zum Sollwert von Acesulfam-K. Auch hier liegt die Acesulfam-K Bestimmung in einem besseren Bereich als die Ergebnisse der Laboranalysemethode.
  • Zusammenfassung
  • Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht eine gleichzeitige Analyse von mehreren Inhaltsstoffen in einem Multikomponentengemisch und die Erfassung korrekter Werte für die einzelnen Konzentrationen der in dem Multikomponentengemisch enthaltenen Inhaltsstoffe. Vorzugsweise werden für die Analyse die UV-Spektroskopie und/oder die Vis-Spektroskopie eingesetzt, da hier die geringsten quadratischen Fehler der Vorhersagen erzielt wurden. Jedoch sind auch andere Methoden, je nach Fragestellung und zu untersuchenden Inhaltsstoffen, geeignet. Eine bevorzugte Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt in der Inline-Prozesskontrolle bei industriellen Anlagen, beispielsweise der Getränkeindustrie. Die anhand des erfindungsgemäßen Verfahrens erzielten Ergebnisse wurden auch mittels der DoE-Methode bestätigt.
  • Dabei zeigt sich, dass anhand der chemischen Struktur der Moleküle der Analyten sich die geeigneten spektroskopischen Verfahren eingrenzen lassen können. Um eine charakteristische spektrale Signatur der Inhaltsstoffe zu erhalten, können ferner die Reinsubstanzen (beispielsweise gelöst in Wasser oder Lösungsmittel) spektral vermessen werden, um so die Wellenlängenbereiche für die spätere Auswertung festzulegen. Fehlende valide Konzentrationsangaben einzelner Komponenten werden mit Hilfe einer einfachen Standardaddition bestimmt, wobei dadurch zusätzlich geprüft werden kann, ob sich die Substanzen in dem jeweiligen Konzentrationsbereich linear verhalten. Sobald die Mengenangaben bekannt sind und die Reinsubstanzen vermessen wurden, kann mit der Standardaddition in der zu untersuchenden Matrix begonnen werden.
  • Je nach Inhaltsstoffen kann es sinnvoll sein, lediglich einen Grundstoff zu kalibrieren, wenn dieser bereits eine Komponente enthält. Die Konzentrationen müssen sich in einem sinnvollen Konzentrationsbereich bewegen und möglichst in äquidistanten Schritten zudotiert werden. Für die Bestimmung der Konzentration der einzelnen Komponenten und bei der Erstellung der chemometrischen Modelle müssen die Messungen aller Standardadditionen eingebunden werden. Als Datenvorverarbeitung empfehlen sich beispielsweise Methoden wie die Basislinienkorrektur oder die Bildung von Ableitungen. Vorzugsweise werden geeignete Wellenlängenbereiche innerhalb des Spektrums mittels einer bestimmten Methode analysiert, um möglichst kleine Fehler der Vorhersagekonzentrationen zu erhalten. So können beispielsweise in einem ersten Schritt die Wellenlängenbereiche ausgewählt werden, die aufgrund der Molekülstruktur die theoretisch vorhergesagten Bereiche sind. Bei überlappenden Bereichen muss in einem zweiten Schritt die spektrale Signatur so gewählt werden, dass möglichst wenige Überlagerungen auftreten. Erst in einem dritten Schritt werden dann multimodale Datenanalysen durchgeführt.
  • Um die Messmethodik zu validieren, kann die Methodik des Designs of Experiment (DoE) eingesetzt werden, um einen Versuchsplan zu erstellen, bei dem mögliche Wechselwirkungen aufgedeckt werden. Durch Vergleiche der mittleren quadratischen Fehler (RMSEC, RMSECV, RMSEP) können Aussagen über die Realisierbarkeit von Messungen einzelner Inhaltsstoffe in komplexen Matrizes gemacht werden.
  • Erfindungsgemäß werden die Standardadditionen in der zu messenden Matrix direkt erstellt. Damit können Einflüsse wie der pH-Wert des Multikomponentengemisches oder direkt nicht messbare Komponenten, wie bei Naturstoffen, in die Kalibration mit integriert werden. Vorzugsweise werden bei der Modellerstellung immer alle Kalibrationen mit einbezogen. Dies hat den Vorteil, dass eine simple Addition einer einzelnen Substanz ausreicht, um auch in einer komplexen oder unbekannten Matrix alle Änderungen zu erfassen und die einzelnen Konzentrationen korrekt vorherzusagen. Mit diesen Methoden können die Linearität und eventuelle Wechselwirkungen bewertet werden, ohne einen komplizierten und exzessiven Versuchsplan erstellen und durchführen zu müssen (beispielsweise ein DoE-Versuchsplan).
  • Die Kalibrationen sind relativ schnell durchzuführen, was eine enorme Zeitersparnis mit sich bringt. Dies ist insbesondere bei der Verarbeitung von Naturstoffen sehr wichtig. Die über das erfindungsgemäße Verfahren mögliche kontinuierliche Messung der Inhaltsstoffe eines Multikomponentengemisches, beispielsweise eines Energy Drinks, erleichtert die betriebliche Inline-Prozesskontrolle um ein Vielfaches. Damit einhergehen Ressourceneinsparungen, Prozessoptimierung, geringere Fehlproduktionen und Qualitätsbeanstandungen.
  • Die erfindungsgemäßen Daten zeigen, dass alle Stoffe charakteristische Molekülstrukturen besitzen, die sich über spektroskopische Methoden spezifisch ermitteln lassen können. Voraussetzung ist das Vorliegen einer eindeutigen spektralen Signatur der zu untersuchenden Inhaltsstoffe bzw. Analyte, um im Rahmen der Standardaddition eine Kalibration dieser Substanzen zu ermöglichen. Mit Hilfe der multivariaten Datenanalyse ist es möglich, eine Vielzahl von versteckten Kurveninformationen, wie z.B. Peaks, herauszurechnen, um auf diesen dann zu kalibrieren. Das erfindungsgemäße Verfahren ist für die Anwendung in einem Inline-Prozess geeignet, das es sehr genau und äußerst robust ist.
  • Eine Auswertung über eine univariate Standardaddition, wie sie bislang durchgeführt wurde, würde zu Ergebnissen mit großen Fehlern führen, da hier keine Wechselwirkungen mit berücksichtigt werden. Durch die erfindungsgemäße Integration aller Standardadditionen über eine gemeinsame Matrix und eine anschließende multivariate Auswertung werden jedoch die Fehler nahezu vollständig eliminiert. Die meisten mittleren Fehler befinden sich dabei in einem für eine Inline-Prozessanalytik geeigneten Rahmen. Im Wesentlichen basieren die noch vorhandenen Fehler auf der Möglichkeit der spektroskopischen Methoden.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims (10)

  1. Verfahren zur gleichzeitigen quantitativen Bestimmung von mehreren Inhaltsstoffen in einem flüssigen Multikomponentengemisch, das aus mehreren unterschiedlichen Inhaltsstoffen besteht, umfassend die Schritte: a) Erfassen von optischen Molekülspektren für die zu analysierenden Inhaltsstoffe des Multikomponentengemisches und/oder der jeweiligen Reinsubstanzen zum Erhalt einer spektralen Signatur für den jeweiligen Inhaltsstoff und/oder Reinsubstanz, b) Erstellen eines Kalibrationsmodells für jeden Inhaltsstoff in einer zu untersuchenden Probenmatrix, bei dem – für jeden zu analysierenden Inhaltsstoff eine Standardaddition mit unterschiedlichen Konzentrationen in die Matrix erfolgt und – bei dem die Inhaltsstoffe zur Feststellung von gegenseitigen Wechselwirkungen miteinander unterschiedlich kombiniert werden, c) Durchführen einer multivariaten Datenauswertung, bei der ausgewählte Spektren der Standardadditionen der Inhaltsstoffe und deren unterschiedlichen Kombinationen für jede einzelne Substanz zur Erstellung des Kalibrationsmodells einbezogen werden.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentrationen und die Varianzen von Grundstoffen in der Matrix des flüssigen Multikomponentengemisches gleichzeitig bestimmt und abgeglichen werden, wobei die spektralen Signaturen der Grundstoffe in die Kalibration einbezogen und gegen einen Referenzwert verrechnet werden.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass eine multimodale Erfassung der Spektren in unterschiedlichen Wellenlängenbereichen unter Anwendung unterschiedlicher Erfassungsmethoden und/oder Aufnahmeparameter erfolgt, wobei nur solche Wellenlängenbereiche für die Auswertung ausgewählt werden, die eine geeignete spektrale Signatur der Inhaltsstoffe des Multikomponentengemisches aufweisen, wobei bei überlappenden Spektren die für die Auswertung herangezogene spektrale Signatur so gewählt wird, dass möglichst geringe Überlagerungen auftreten.
  4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine Auswertung der spektralen Signatur der Inhaltsstoffe und/oder der Reinsubstanzen in einem Wellenlängenbereich zwischen 180 nm und 380 nm, vorzugsweise in einem Bereich zwischen 200 nm und 315 nm, vorzugsweise in einem Wellenlängenbereich < 210 nm erfolgt.
  5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die multimodale spektroskopische Bestimmung der Spektren anhand ausgewählter Wellenlängenbereiche unter Einsatz von UV-Spektroskopie und/oder Vis-Spektroskopie und/oder Fluoreszenzspektroskopie und/oder IR-Spektroskopie und/oder Raman-Spektroskopie und/oder NMR –Spektroskopie oder einer Kombination dieser Methoden erfolgt.
  6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass bei der multivariaten Auswertung zunächst eine Datenvorverarbeitung erfolgt und anschließend eine Hauptkomponentenanalyse durchgeführt wird, bei der aus den erhaltenen Messvariablen unabhängige Hauptkomponenten ermittelt werden, welche die Informationen der Spektren möglichst vollständig beschreiben, wozu die Proben des flüssigen Multikomponentengemisches in eine Hauptkomponentenmatrix und eine Gewichtsmatrix aufteilt werden, wobei die Hauptkomponentenmatrix die Information beinhaltet, mit der eine möglichst hohe Varianz der Ausgangsdatenmatrix beschrieben werden kann und wobei die Gewichtsmatrix den Anteil bezeichnet, den jede Hauptkomponente an dem einzelnen Probenspektrum hat.
  7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass bei der multivariaten Datenanalyse insbesondere Analysemethoden wie Partial Least Square (PLS)-Regression, 3-Wege-PLS-Regression, PCR, Varianzanalyse (ANOVA) und Responseflächenanalyse ANOVA, SIMCA-Klassifikation, Diskriminanzanalyse, PLSDA-Klassifikation, Hauptkomponentenanalyse (PCA), Faktorenanalyse, Kategorievariablen, Redundanzanalyse (RDA), PCA Projektion, Orthogonale Rotation von Faktoren (Varimax, Quartimax, Equimax und Parsimax), Multivariate Kurven Auflösung (MCR), Clustering (K-Means), Support Vector Machines (SVM) und/oder neuronale Netzwerke zur Anwendung kommen, wobei die Qualität der Analysemethoden durch die jeweiligen Figures of Merits bestimmt werden.
  8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur Kalibration der Messmethodik eine statische Versuchsplanung (Design of Experiment; DoE) durchgeführt wird, um mögliche Wechselwirkungen darzulegen oder auszuschließen.
  9. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Inhaltsstoffen in einem Mischgetränk unter Anwendung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den zu bestimmenden Inhaltsstoffen in dem Mischgetränk um Koffein, Taurin, Acesulfam-K, Aspartam, Steviosid, iso-Alphasäure, Apfel-, Wein- oder Milchsäure oder Vitamine wie Niacin, Pantothensäure, Pyridoxin, Riboflavin, Folsäure, Cobalamin handelt, wobei einer oder mehrere Inhaltsstoffe in einem Inline-Prozess ermittelt werden.
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