DE102010023452A1

DE102010023452A1 - Massenspektrometrische Messung von β-Lactamase-Resistenzen

Info

Publication number: DE102010023452A1
Application number: DE102010023452A
Authority: DE
Inventors: Markus Kostrzewa; Karsten Michelmann; Katrin Sparbier
Original assignee: Bruker Daltonik GmbH
Current assignee: Bruker Daltonics GmbH and Co KG
Priority date: 2010-06-11
Filing date: 2010-06-11
Publication date: 2011-12-15
Anticipated expiration: 2030-06-12
Also published as: EP2806032A1; JP6055762B2; ES2544315T3; EP2580598B1; CA2791627C; JP2013529458A; AU2011263694B2; DK2580598T3; EP2580598A1; ES2515466T3; BR112012031558B1; US20130095511A1; BR112012031558A2; CN103003699B; DE102010023452B4; CA2791627A1; JP6286406B2; JP2016039814A; WO2011154517A1; CN103003699A

Abstract

Die Erfindung betrifft die Bestimmung der Resistenzen von Bakterien, die β-Lactamasen produzieren, insbesondere „Extended Spectrum β-Lactamasen” (ESBL). Die Erfindung stellt ein Verfahren bereit, mit dem die mikrobielle Resistenz durch die katalytische Wirkung der bakteriell hergestellten β-Lactamasen auf die β-Lactam-Antibiotika, die in einer hydrolytischen Spaltung des β-Lactamrings besteht, sehr einfach und schnell gemessen werden kann. Das Verfahren bestimmt die Resistenz der Bakterien wenige Stunden nach Zugabe eines geeigneten Substrats, entweder eines β-Lactam-Antbiotikums oder eines maßgeschneiderten β-Lactam-Derivats, durch direkte massenspektrometrische Messung des Substrat-Abbaus durch die β-Lactamasen.

Description

Die Erfindung betrifft die Bestimmung der Resistenz von Bakterien, die β-Lactamasen produzieren, unter anderen „Extended Spectrum β-Lactamasen” (ESBL).
Die Erfindung stellt ein Verfahren bereit, mit dem die mikrobielle Resistenz durch die katalytische Wirkung der bakteriell hergestellten β-Lactamasen auf β-Lactam-Antibiotika, die in einer hydrolytischen Spaltung des β-Lactamrings besteht, sehr einfach und schnell gemessen werden kann. Das Verfahren bestimmt die Resistenz der Bakterien wenige Stunden nach Zugabe eines geeigneten Substrats, entweder eines β-Lactam-Antibiotikums oder eines maßgeschneiderten β-Lactam-Derivats, durch direkte massenspektrometrische Messung des Substrat-Abbaus durch die β-Lactamasen.
Stand der Technik
Viele Arten von Mikroben, insbesondere Bakterien und einzellige Pilze, lassen sich schnell und leicht massenspektrometrisch identifizieren, indem von einer Kolonie, die in üblicher Weise auf oder in einem Nährmedium gezüchtet wurde, kleine Mengen von Mikroben auf eine massenspektrometrischen Probenträgerplatte übertragen, dort mit einer Lösung einer Matrixsubstanz präpariert und mit Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption massenspektrometrisch vermessen werden. Das Massenspektrum gibt die Massen der verschieden schweren Proteine wieder, soweit sie mit genügender Konzentration in den Mikroben vorhanden sind. Aus diesem Profil von jeweils etwa 40 bis 80 Proteinen der Mikroben wird durch Ähnlichkeitsanalysen mit Tausenden von Referenzspektren in entsprechenden Spektrenbibliotheken ihre Identität festgestellt. Unter dem Begriff „Identifizierung” wird hier die taxonomische Klassifizierung, also die Bestimmung von Familie, Gattung und Art (Genus) verstanden. An zuverlässigen und medizinrechtlich verwendbaren (so genannt „validierten”) Bibliotheken mit Referenzspektren von Tausenden von Mikroben wird an vielen Orten gearbeitet.
Dieses Identifizierungsverfahren für Mikroben hat sich sowohl in Studien wie auch im täglichen Einsatz in vielen mikrobiologischen Laboratorien als außerordentlich erfolgreich erwiesen. Es ist schnell, kostengünstig und hat sehr geringe Fehlerraten, weit geringer als die herkömmlicher mikrobiologischer Identifizierungsverfahren.
Mit besonderen Varianten dieser Verfahren gelingen Identifizierungen nicht nur der Mikrobenarten, sondern vielfach auch der Unterarten und manchmal sogar der einzelnen Stämme, wenn sich diese in den Massen oder Intensitäten der häufigeren und somit massenspektrometrisch erfassbaren Proteine unterscheiden. Für eine genauere Beschreibung siehe beispielsweise den Patentantrag DE 10 2009 032 649.9 (T. Maier und M. Kostrzewa, 2009), in dem neben einer detaillierten Schilderung des Verfahrens auch eine verfeinerte Identitätssuche wiedergegeben wird.
Eine besondere Rolle spielt die Identifizierung der Mikroben bei infektiösen Krankheiten, insbesondere bei einer Sepsis. Hier ist es wichtig, die Identifizierung von Erregertypen sehr schnell vornehmen zu können, damit sofort medizinisch richtig therapiert werden kann. Auch hier hat sich die massenspektrometrische Identifizierung bewährt und ist gegenwärtig dabei, sich in klinischen und mikrobiologischen Laboratorien durchzusetzen.
Im medizinischen Bereich tritt aber nicht nur das Problem einer schnellen Identifizierung, sondern auch das Problem der Erkennung von Resistenzen gegen die gebräuchlichen Antibiotika auf. Ohne Kenntnisse über die Resistenzen ist eine schnelle Bekämpfung nicht möglich. Es bedarf daher neben einer schnellen Identifizierung auch einer schnellen Feststellung und Charakterisierung der Resistenzen von Mikroorganismen. Für einige Mikrobenarten ist bekannt, dass sie praktisch durchgängig gegen bestimmte Antibiotika resistent sind, hier erübrigt sich nach einer genauen Identifizierung die Resistenzbestimmung. Meist aber gibt es bei einer Spezies sowohl gar nicht resistente, wie auch schwach und insbesondere auch stark resistente Stämme, mit unterschiedlichen Resistenzen gegen verschiedenartige Antibiotika, hier ist die Bestimmung der Resistenz unerlässlich.
Es liegt nun nahe, das Massenspektrometer nicht nur für die taxonomische Bestimmung, sondern auch weitergehend für die Bestimmung der Resistenzen von Mikroben, insbesondere von Bakterien, gegen bestimmte Antibiotika einzusetzen. Diese Aufgabe hat sich jedoch als sehr schwierig erwiesen. Obwohl sich die Resistenzen auch im Vorhandensein neuer oder veränderter Proteine ausdrücken müssen, ist es bisher nicht gelungen, sie im massenspektrometrisch gemessenen Proteinprofil direkt zu erkennen. Von den Hunderten oder sogar Tausenden von Proteinen der Mikroben werden schließlich nur 40 bis 80 im Massenspektrum gemessen. Die Resistenzbestimmung muss also indirekte Wege gehen. In der Patentschrift DE 10 2006 021 493 B4 (V. Govorun und J. Franzen; GB 2 438 066 A ; US-2008-0009029-A1 ) ist ein erster Versuch einer solchen Resistenzbestimmung dargelegt; dieses Verfahren hat sich jedoch bislang nicht durchsetzen können. Das Verfahren beruht im Wesentlichen auf einer Änderung der Proteinprofile durch Zelltod nach Zugaben von Antibiotika oder auf der Feststellung eines Wachstumsstopps gegenüber resistenten Referenzmikroben.
Unter dem Begriff Antibiotika-Resistenz werden Eigenschaften von Mikroorganismen (hier vorwiegend Bakterien) zusammengefasst, die es ihnen ermöglichen, die Wirkung von antibiotisch aktiven Substanzen abzuschwächen oder ganz zu neutralisieren. Resistenzen sind inzwischen häufig; in den USA sind etwa 70% der in Krankenhäusern erworbenen infektiösen Keime resistent gegen mindestens ein Antibiotikum. Oft sind Patienten mit Bakterienstämmen infiziert, die gegen mehrere Antibiotika resistent sind (Multiresistenz). Sogenannte Problemkeime sind dabei vor allem der Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA), Pseudomonas spec., Escherichia coli mit ESBL-Resistenz und Mycobacterium tuberculosis. Schätzungen des CDC (Center for Disease Control and Prevention) gehen für die USA von zwei Millionen in Krankenhäusern erworbenen Infektionen für das Jahr 2004 aus, mit etwa 90 000 Todesfällen, weit mehr als Todsfälle im Straßenverkehr, bei Unfällen im Haushalt oder im Berufsleben.
Im allgemeinen Sprachgebrauch meint der Begriff Antibiotika meistens Arzneistoffe oder Arzneimittel zur Behandlung bakterieller Infektionskrankheiten. Der Siegeszug der Antibiotika in der Medizin begann mit dem Penicillin. Die Erfolge des Penicillins, aber auch das Auftreten der ersten Resistenzen führten zur Suche und Entdeckung vieler weiterer Antibiotika: Streptomycin, Chloramphenicol, Aureomycin, Tetracyclin und viele andere. Die meisten heute bekannten Antibiotika leiten sich von Naturstoffen ab. Das Penicillin ist heute in der Umgangssprache ein Synonym für Antibiotika.
Penicillin ist ein β-Lactam-Antibiotikum. Diese β-Lactame binden an das Penicillin-Binde-Protein (PBP), eine Peptidoglykan-Transpeptidase, die für das Entstehen der Peptidbindungen zur Festigung der Zellwand zuständig ist. Die Bindungen der β-Lactame an das PBP machen das PBP unwirksam. Wegen des Fehlens ausreichender Mengen an wirksamem PBP entstehen während des Bakterienwachstums Läsionen in der Zellwand, die Membran verliert demzufolge die Selektivität ihrer Permeabilität und kann die Zytoplasmakonzentration nicht mehr regulieren. Nach gewisser Zeit wird das Bakterium lebensunfähig. Unter extremen Bedingungen lassen sich im Labor regelrecht 'platzende' Bakterienzellen beobachten. β-Lactame wirken somit im Prinzip bakterizid.
Seit den ersten Anwendungen des Penicillins haben Bakterien in zunehmendem Maße verschiedenartige Resistenzen entwickelt. Eine Art der Resistenz von Bakterien gegenüber β-Lactamen besteht in der Ausbildung von Enzymen (β-Lactamasen), die den β-Lactamring katalytisch durch Hydrolyse aufsprengen und damit unwirksam machen. Zur Zeit sind mehr als 340 Varianten von β-Lactamasen bekannt, die von zahlreichen Bakterien gebildet werden. Sie lassen sich nach der Grobstruktur oder nach der Wirkungsart in verschiedene Klassen einteilen. Die zunächst durch Mutationen erzeugte genetische Information zur Synthese des Enzyms wird chromosomal oder plasmidal vererbt, die plasmidale Information kann aber auch durch verschiedene Mechanismen zwischen Bakterien ausgetauscht werden, sogar zwischen Bakterien verschiedener Arten („Horizontalaustausch”). Je nach der Wirkung der β-Lactamasen unterscheidet man zwischen Penicillinasen und Cephalosporinasen, es gibt jedoch weitere Klassen. Durch die katalytische Wirkung dieser Enzyme genügt eine geringe Menge an β-Lactamasen, um große Mengen an β-Lactam-Antibiotika zu zerstören.
Heute gibt es eine Vielzahl von Derivaten der β-Lactam-Antibiotika, darunter mehrere Penicilline (Benzypenicilline, Oralpenicilline, Aminopenicilline, Isoxazylpenicilline, Acylaminopenicilline), Cephalosporine, Monobactame und Carbapeneme. Diese sind meist mit größeren chemischen Gruppen derivatisiert, um die β-Lactamasen sterisch zu behindern. Extended Spectrum β-Lactamasen (ESBL) wiederum können ein großes Spektrum an β-Lactam-haltigen Antibiotika spalten. Die ESBL sind zunächst durch Punktmutationen an einer β-Lactamase entstanden. Die Gene für die ESBL befinden sich auf Plasmiden, die von Bakterium zu Bakterium horizontal weitergegeben werden können.
ESBL tragende Bakterien sind resistent gegen Penicilline, Cephalosporine (Generation 1–4) und gegen Monobactame. Hauptsächlich E. coli und Klebsiellen (Gram-negative Bakterien) tragen ESBL-Gene. Die schnelle Ausbreitung dieser ESBL-Resistenz wird aber von Mikrobiologen mit größter Sorge betrachtet. Sie ist neben der Methicillin-Resistenz des Staphylococcus aureus (MRSA) einer der sorgenreichsten Brennpunkte der Infektionsforschung.
Ein Hilfsmittel gegen β-Lactamasen sind β-Lactamase-Inhibitoren, welche zusammen mit β-Lactamen verabreicht werden, um die Wirkung von im Bakterium vorhandenen β-Lactamasen abzuschwächen. Feste Kombinationen sind Clavulansäure + Amoxicillin, Sulbactam + Ampicillin, Tazobactam + Piperacillin. Es sind nicht alle Kombinationen optimal wirksam. Diese Hilfsmittel sollten jedoch nur nach sorgfältiger Identifizierung der Bakterien und sorgfältiger Resistenzbestimmung angewendet werden, da zu erwarten ist, dass auch dieses Werkzeug sehr schnell wieder stumpf werden wird.
In den 1970er und 1980er Jahren wurde noch verstärkt auf dem Gebiet der Antibiotika geforscht. Heute ist die Entwicklung neuer Antibiotika stark zurückgegangen, obwohl Antibiotika zu den weltweit am häufigsten verschriebenen Medikamenten zählen, mit dreizehn Prozent Marktanteil bilden sie den größten Einzelbereich unseres Arzneimittelverbrauchs. Von den heute etwa 8.000 bekannten antibiotischen Substanzen werden aber, meist wegen Nebenwirkungen, aber auch wegen der Kosten einer Zulassung, nur etwa 80 therapeutisch angewendet. In Deutschland sind 2005 laut Bundesinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte (BfArM) insgesamt 2.775 Antibiotikapräparate zugelassen.
Das Problem der Resistenzen von Mikroorganismen gegen Antibiotika wie Bakterizide oder Fungizide wird mit fortschreitender Zeit immer brennender. Zum einen nimmt die Geschwindigkeit der Resistenzbildung von Mikroorganismen gegen die verschiedenartigen Antibiotika zu, zum anderen werden immer weniger medizinisch anwendbare Antibiotika neu entwickelt. Da viele neue Antibiotika bereits nach kurzer Zeit wegen Unwirksamkeit vom Markt genommen werden müssen, lohnt es für die Pharmafirmen immer weniger, viel Geld in die immer schwieriger werdende Entwicklung von neuen Antibiotika zu stecken. Laut WHO sind zwischen 1990 und 2005 nur drei neue antibiotische Wirkstoffe auf den Markt gekommen, während es zwischen 1940 und 1950 noch zehn Wirkstoffe, zwischen 1971 und 1980 noch fünf Wirkstoffe waren.
Die Gründe für die rapide Zunahme der Resistenzen sind vielfältig: leichtfertige Verschreibungen von Antibiotika, selbst wenn das nicht nötig wäre; leichtfertig abgebrochene Therapien mit Bakteriziden vor dem vollständigen Ausrotten der Infektionsträger; leichtfertige, oft rein vorbeugende Anwendungen in der Land- und Viehwirtschaft. Alle diese Verhaltensweisen helfen der Auslese und Verbreitung der resistenten Mikrobenarten gegenüber den nicht resistenten Arten.
Mitte des vorigen Jahrhunderts als Hoffnungsträger für die Bekämpfung von infektiösen Krankheiten gefeiert, drohen die Antibiotika rasch zu einem stumpfen Werkzeug zu werden. Eine Rettung ist nur durch gezielte Anwendungen mit vollständig durchgeführter Therapie zu erhoffen, und das setzt eine rasche Identifizierung der infektiösen Erreger wie auch die schnelle Erkennung ihrer spezifischen Resistenzen gegen die verschiedenen Arten von Antibiotika voraus.
Aufgabe der Erfindung
Es ist die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem eine β-Lactamase-Resistenz von Mikroben, insbesondere Bakterien, gegen verschiedenartige β-Lactam-Antibiotika schnell und einfach massenspektrometrisch bestimmt werden kann.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung stellt ein Verfahren bereit, mit dem eine mikrobielle Resistenz durch β-Lactamasen sehr einfach und schnell massenspektrometrisch gemessen werden kann. Das Verfahren bestimmt die Resistenz der Bakterien wenige Stunden nach Zusammenführung der Mikroben mit einem geeigneten Substrat, entweder eines β-Lactam-Antbiotikums oder auch eines maßgeschneiderten β-Lactam-Derivats, durch eine direkte massenspektrometrische Messung des hydrolytischen Angriffs der β-Lactamasen auf das Substrat. Durch die katalytische Wirkung der bakteriell hergestellten β-Lactamasen auf das Substrat wird der β-Lactamring hydrolytisch aufgespalten. Die Menge des Substrats nimmt ab, statt dessen erscheint das hydrolysierte Spaltungsprodukt, dessen Masse um 18 atomare Masseneinheiten schwerer ist.
Die enzymatische Spaltungsreaktion ist recht schnell; sie liegt, solange sie nicht durch allmählichen Mangel an Substraten behindert wird, zwischen etwa einer und hundert Millisekunden pro molekularer Reaktion, mit charakteristischen Unterschieden für die verschiedenen β-Lactamasen. Eine Messung der Reaktionsgeschwindigkeit gibt eine erste Auskunft über die Art der β-Lactamasen.
Die Messung kann im Prinzip mit jedem Massenspektrometer vorgenommen werden, es ist jedoch besonders günstig, dasselbe MALDI-Flugzeitmassenspektrometer zu benutzen, das auch für die Identifizierung der Bakterien eingesetzt wurde. Da der MALDI-Prozess (Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption) für die Ionisierung der Substanzen im unteren Massenbereich von einigen hundert atomaren Masseneinheiten einen sehr starken chemischen Untergrund erzeugt, ist es günstig, Substrate zu verwenden, die in untergrundarmen Bereichen liegen. Das gelingt durch die Herstellung maßgeschneiderter Substrate mit Molekulargewichten zwischen 700 und 1200 atomaren Masseneinheiten. Außerdem ist es günstig, die Protonenaffinität der Substrate zu erhöhen, um sie besser ionisierbar zu machen. Trotzdem ist es vielfach günstig, für eine Erhöhung der Empfindlichkeit höhere Konzentrationen der Substrate einsetzen zu können. Um aber durch eine hohe bakterizide Wirksamkeit nicht die Bakterien sofort abzutöten, können die Substrate so maßgeschneidert werden, dass ihre antibiotische Wirkung, also ihr MHK-Wert, relativ gering ausfällt. MHK ist die „minimale Hemmkonzentration” bei Hemmung durch β-Lactamase-Hemmer in Gegenwart des betreffenden Antibiotikums und dient als ein Maß für die Stärke der Resistenz, aber auch für die Stärke des Antibiotikums.
Eine günstige Ausführungsform eines Substrats ist beispielweise durch kovalentes Anbinden eines 6-His-Tags an ein β-Lactam gegeben. Ein 6-His-Tag besteht aus einer Kette von sechs Histidin-Molekülen, erhöht das Molekulargewicht um rund 800 atomare Masseneinheiten, verbessert die Protonierbarkeit, und erlaubt es zudem, das Substrat und sein Spaltungsprodukt aus der Reaktionsflüssigkeit isoliert herauszuziehen. Dieses Herausziehen kann beispielsweise durch Magnetkügelchen, geschehen, auf denen sich ein mit Nickelionen beladenes Chelat befindet, das das 6-His-Tag reversibel bindet. Es kann dann eine MALDI-Probenpräparation vorgenommen werden, die das restliche Substrat und sein Spaltungsprodukt in der Matrixsubstanz stark angereichert enthält und daher eine sehr empfindliche Messung erlaubt.
Insbesondere können auch spezifische Multiplex-Resistenz-Assays mit Einbringen mehrerer verschiedenartiger Substrate entwickelt werden, wobei die verschiedenen Substrate in einer solchen Form maßgeschneidert und in solchen Konzentrationen eingebracht sind, dass ihr Abbaumuster die Klasse oder auch Wirkungsstärke der β-Lactamasen erkennen lässt. So können die Substrate beispielsweise die Zugänglichkeit zum β-Lactamring der verschiedenen Gruppen von Antibiotika nachahmen.
Kurze Beschreibung der Abbildung
In zeigt das obere Massenspektrum die Wirkung einer Beimengung von Ampicillin mit der molaren Masse 349,41 g/mol zu einer Suspension des Stammes DH5a von E. coli, der keine Resistenz besitzt. Es findet weder ein Abbau des Ampicillin (hier Masse 350 atomare Masseneinheiten), noch des Natriumsalzes von Ampicillin (Masse 372 atomare Masseneinheiten) statt. Das untere Massenspektrum dagegen zeigt die Wirkung eines ESBL-resistenten Stammes von E. coli auf Ampicillin und sein Natriumsalz: beide werden zu den hydrolysierten Produkten der Massen 368 und 390 atomaren Masseneinheiten abgebaut.
Bevorzugte Ausführungsformen
Die Erfindung stellt ein Verfahren bereit, mikrobielle Resistenzen, die auf der Bildung von β-Lactamasen beruhen, sehr einfach und schnell zu bestimmen.
Das Verfahren beruht auf dem Zusammenführen eines oder mehrerer geeigneter Substrate mit einer Suspension der Bakterien. Die Substrate können entweder β-Lactam-Antbiotika oder vorzugsweise maßgeschneiderte β-Lactam-Derivate sein. Haben die Bakterien eine β-Lactamase-Resistenz, so wird zumindest ein Substrat unter geeigneten Inkubationsbedingungen in Minuten bis Stunden durch die β-Lactamase abgebaut, indem der β-Lactamring hydrolytisch aufgesprengt wird. Dieser hydrolytische Abbau des Substrats durch die β-Lactamasen kann direkt massenspektrometrisch gemessen werden. Die Menge des Substrats nimmt ab, statt dessen erscheint das hydrolysierte Spaltungsprodukt, dessen Masse um 18 atomare Masseneinheiten schwerer ist.
In ist dieser Abbau, der nur bei Vorliegen der Resistenz eintritt, anhand des β-Lactam-Antibiotikums Ampicillin in zwei Massenspektren gezeigt. Im oberen Massenspektrum ist das Ergebnis einer Beimengung von Ampicillin mit der molaren Masse 349,41 g/mol zu einer Suspension des Stammes DH5a von E. coli gezeigt. Dieser Stamm besitzt keine Resistenz. Es findet daher weder ein Abbau des Ampicillins statt (hier bei der Masse 350 atomare Masseneinheiten sichtbar), noch des Natriumsalzes von Ampicillin (bei Masse 372 atomare Masseneinheiten). Im unteren Massenspektrum dagegen ist die Wirkung eines ESBL-resistenten Stammes von E. coli auf Ampicillin und sein Natriumsalz zu sehen: beide werden zu den hydrolysierten Produkten der Massen 368 und 390 atomaren Masseneinheiten abgebaut.
Ampicillin ist ein halbsynthetischer, antibiotisch wirksamer Arzneistoff aus der Gruppe der β-Lactam-Antibiotika (Penicilline). Aufgrund seiner Wirksamkeit gegen grampositive Erreger sowie einiger gramnegative Stäbchen wird es als Breitbandantibiotikum bezeichnet. Chemisch zählt Ampicillin zu den Aminopenicillinen.
Die bakterizide (bakterienabtötende) Wirkung von Ampicillin beruht wie bei allen β-Lactam-Antibiotika auf der Blockierung eines Enzyms, der D-Alanin-Transpeptidase, die in verschiedenen Bakterien in verschiedenen Formen vorliegt. Dieses Enzym ist für die Ausbildung einer neuen und festen Zellwand in der Teilungs- oder Vergrößerungsphase der Bakterien notwendig. Diese Transpeptidasen werden auch als Penicillin-Binde-Proteine (PBP) bezeichnet. Die Blockierung findet durch Anlagerung statt, wobei der β-Lactamring das Anlagerungsmotiv darstellt. Die Anlagerung verhindert die Neusynthese der Zellwand, die Zellen sind somit teilungsunfähig, leben aber zunächst weiter, bis ihr Wachstum zu genügend vielen Zellwandläsionen führt, um den Zelltod herbeizuführen. Teilung und Wachstum menschlicher Zellen wird dagegen nicht behindert, da menschliche Zellen nur eine Zellmembran, aber keine Zellwand besitzen und daher auch keine entsprechende Transpeptidase besitzen.
Im Beispiel der wurden 10 Mikroliter Ampicillinlösung mit einer Konzentration von 10 Milligramm pro Milliliter Wasser in einem Eppendorf-Röhrchen vorgelegt. Von den zu testenden Bakterien wurden drei Kolonien gepickt und in den 10 Mikrolitern Ampicillin-Lösung resuspendiert. Anschließend wurden die Gefäße für drei Stunden bei 37°Celsius unter Schütteln inkubiert. Nach der Inkubation wurde für zwei Minuten bei 13.000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert, um die Zellen abzutrennen. Das restliche Ampicillin und das hydrolysierte Reaktionsprodukt befinden sich jetzt im Überstand.
Die Messung kann im Prinzip mit jedem Massenspektrometer vorgenommen werden, es ist jedoch besonders günstig, dasselbe MALDI-Flugzeitmassenspektrometer benutzen zu können, das auch für die Identifizierung der Bakterien eingesetzt wurde. Dazu wurden vom Überstand 1,5 Mikroliter auf den massenspektrometrischen Probenträger aufgebracht. Nach dem Trocknen wurden die Proben mit einem Mikroliter einer Matrixlösung überschichtet. Als Matrix wurde α-Cyano-4-Hydroxi-Zimtsäure (HCCA) in einer Konzentration von 10 Milligramm pro Milliliter in einer Mischung von Wasser, 50% Acetonitril und 2,5% Trifluoressigsäure verwendet. Nach erneutem Trocknen wurde von dieser Präparation im MALDI-Flugzeitmassenspektrmeter in üblicher Weise ein Massenspektrum aufgenommen.
Die Konzentration des Ampicillins, die für dieses Beispiel als Substrat verwendet wurde, ist außergewöhnlich hoch, mehr als tausendmal höher als für eine therapeutische Behandlung nötig wäre. Dass diese Menge an Ampicillin abgebaut wird, zeigt die außerordentliche Wirksamkeit der Extended-Spectrum-β-Lactamasen (ESBL). Es kann kaum angenommen werden, dass die Bakterien bei dieser hohen Konzentration überleben; die geringe Menge an β-Lactamase aber reicht aus, um die große Menge Substrat katalytisch zu spalten. Die Konzentration wurde hier deshalb so hoch gewählt, um die Signale deutlich über dem chemischen Untergrund zu sehen, der in diesem Massenbereich herrscht. Die Konzentration kann um einen Faktor 100 geringer gewählt werden, wenn ein Substrat gewählt wird, dass im Massenbereich um 800 bis 1000 atomaren Masseneinheiten liegt, was durch die Herstellung maßgeschneiderter Substrate mit höheren Molekulargewichten gelingt.
Außerdem ist es günstig, die Protonenaffinität der Substrate zu erhöhen, um sie besser ionisierbar zu machen. Die niedermolekularen β-Lactame sind nicht sehr protonenaffin; sie werden daher im Ionisierungsprozess nur zu geringen Anteilen ionisiert. So kann beispielsweise durch den Einbau von protonenaffinen Aminosäuren eine weitere Steigerung der Empfindlichkeit um einen Faktor 10 erreicht werden.
Vielfach ist es trotzdem günstig, für eine weitere Erhöhung der Empfindlichkeit höhere Konzentrationen der Substrate einzusetzen. Damit aber durch eine hohe antibiotische Wirksamkeit die Bakterien mit weniger starken β-Lactamasen nicht sofort abgetötet werden, können die Substrate so maßgeschneidert werden, dass ihre antibiotische Wirkung, also ihr MHK-Wert, relativ gering ausfällt. Die antibiotische Wirksamkeit nimmt in der Regel schon mit der Größe der Moleküle ab, da dann ihr Eindringen durch die Zellwandporen in die Bakterien stark behindert wird.
Des Weiteren ist es günstig, die Substrate so zu schneidern, dass sie vollständig und leicht aus dem Überstand extrahiert werden können. Dazu können sie mit Ankergruppen versehen werden, mit denen sie durch immobilisierte Partner extrahiert werden können. Als Beispiel sei hier die Befestigung einer Biotin-Gruppe am Substrat erwähnt. Sowohl das Substrat wie auch das Abbau-Produkt können dann durch an Wänden immobilisiertes Streptavidin aus dem Überstand herausgezogen werden. Da die Bindung zwischen Biotin und Streptavidin reversibel ist, lässt sich so das Substrat und sein Abbauprodukt in bekannter Weise angereichert weiter verarbeiten und messen. Es sind sowohl geeignete Gefäße im Handel, deren Innenwände mit Streptavidin belegt sind, wie auch belegte Mikropartikel, beispielsweise Magnetkügelchen.
Eine besonders günstige Ausführungsform eines Substrats ist beispielweise durch kovalentes Anbinden eines 6-His-Tags an ein β-Lactam gegeben. Ein 6-His-Tag besteht aus sechs Histidin-Molekülen, erhöht das Molekulargewicht um rund 800 atomare Masseneinheiten, verbessert die Protonierbarkeit, und erlaubt es, das Substrat und sein Spaltungsprodukt aus der Reaktionsflüssigkeit herauszuziehen. Dieses Herausziehen kann beispielsweise durch Magnetkügelchen geschehen. Es sind Magnetkügelchen im Handel, die mit Chelaten belegt sind. Diese Chelate können mit Nickelionen beladen werden. Die Nickelionen binden reversibel an die 6-His-Tags. Es kann dadurch in bekannter Weise leicht eine MALDI-Probenpräparation vorgenommen werden, die neben der Matrixsubstanz nur das restliche Substrat und sein Spaltungsprodukt enthält und eine sehr empfindliche Messung erlaubt.
Die enzymatische Spaltungsreaktion der β-Lactamasen ist recht schnell; sie liegt, solange sie nicht durch allmählichen Mangel an Substraten behindert wird, zwischen etwa einer und hundert Millisekunden pro molekularer Reaktion. Die charakteristischen Unterschiede der Reaktionsgeschwindigkeit der verschiedenen β-Lactamasen kann gemessen werden und gibt Auskunft über die Stärke der vorliegenden β-Lactamase und damit auch Hinweise auf die Art der β-Lactamase. Eine Messung der Reaktionsgeschwindigkeit kann im günstigsten Fall in einem einzigen Massenspektrum vorgenommen werden. Wird beispielsweise die Inkubation nach genau einer halben Stunde abgebrochen, so kann man am Verhältnis des restlichen Substrats zum Abbauprodukt die Reaktionsgeschwindigkeit ablesen, wenn das Verfahren entsprechend kalibriert ist.
Eine weitere günstige Ausführungsform besteht darin, mehrere verschiedene maßgeschneiderte Substrate in einem einzigen Multiplex-Resistenz-Assays zu verwenden. Die Substrate können beispielsweise mit verschiedenartigen sterischen Behinderungen für den Angriff der β-Lactamasen ausgestattet sein, wie sie auch bei den verschiedenen Antibiotika vorliegen. Aus Abbau-Muster und Abbaugeschwindigkeiten kann dann wiederum auf die Art der β-Lactamasen und auf die Wirksamkeit verschiedenartiger Antibiotika geschlossen werden. Durch geeignete Substrate und richtige Wahl ihrer Konzentrationen kann auch die Stärke der Wirksamkeit der β-Lactamasen ermittelt werden. Ein einfaches Beispiel für den gleichzeitigen Abbau zweier Substrate (Ampicillin und sein Natriumsalz) ist in gegeben, wobei aber hier kein spezifischer Abbau verwendet wurde.
Die Resistenzmessung kann insbesondere auch auf Mikroben angewendet werden, die in reiner Form aus Blut oder Blutkulturen gewonnen werden können, wie beispielsweise in DE 10 2009 033 368.1 (T. Maier) dargelegt.
Statt einer Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) in einem MALDI-Flugzeitmassenspektrometer können selbstverständlich auch andere Arten der Ionisierung, beispielsweise Elektrosprühen (ESI), und andere Arten von Massenspektrometern wie beispielsweise Flugzeitmassenspektrometer mit orthogonalem Ioneneinschuss (OTOF), Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometer (ICR-MS), elektrostatische Kingdon-Massenspektrometer oder insbesondere auch preiswerte Ionenfallen-Massenspektrometer für die Analyse des Abbaus der Substrate verwendet werden. Dem einschlägigen Fachmann sind alle diese Massenspektrometer und Ionisierungsverfahren vertraut, so dass hier auf detaillierte Schilderungen verzichtet werden kann.
Besonders geeignet für die Messung des Abbaus des Substrats und der Zunahme des Abbauprodukts ist auch ein Triple-Quad-Massenspektrometer, das praktisch nur eine vergleichende Messung von Substrat und Abbauprodukt vornimmt. Mit diesem Triple-Quad-Massenspektrometer lässt sich höchste Empfindlichkeit erzielen, so dass geringste Mengen an Substrat für dieses Verfahren genügen.
Um die Bestimmung der Resistenz zu vereinfachen, können einige oder alle dazu benötigten Materialien in sterilen Packungen der Verbrauchsmaterialien (Kits) bereitgestellt werden. Insbesondere können die Verbrauchsmittelpackungen abgemessene Mengen maßgeschneiderter Substrate und gegebenenfalls auch entsprechende Matrixsubstanzlösungen enthalten. Sie können zusätzlich auch massenspektrometrische Einmal-Probenträger enthalten. Die Verbrauchsmittelpackungen können kommerziell hergestellt werden.
Die Auswertung der Massenspektren kann visuell vorgenommen werden, aber auch durch entsprechende Computer-Programme. Insbesondere können Programme für die Auswertung der Multiplex-Resistenz-Assays entwickelt und angewendet werden. Dies Programme können aus dem Abbaumuster sofort die Art und Stärke der β-Lactamase-Resistenz der Mikroben bestimmen und Therapievorschläge unterbreiten.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

DE 102009032649 [0005]
DE 102006021493 B4 [0008]
GB 2438066 A [0008]
US 2008-0009029 A1 [0008]
DE 102009033368 [0041]

Claims

Verfahren für die Bestimmung einer mikrobiellen β-Lactam-Resistenz, die auf der Erzeugung von β-Lactamasen beruht, dadurch gekennzeichnet, dass der enzymatische Abbau eines Substrats durch die β-Lactamasen der Mikroben massenspektrometrisch gemessen wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Abbau des Substrats durch Aufnahme eines Massenspektrums von restlichem Substrat und Abbauprodukt gemessen wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Moleküle des Substrats einen β-Lactamring enthalten.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat ein β-Lactam-Antibiotikum oder ein β-Lactam-Derivat ist.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat ein Molekulargewicht zwischen 700 und 1200 atomaren Masseneinheiten besitzt.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat eine nur geringe antibiotische Wirkung besitzt.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Moleküle des Substrats eine Ankergruppe besitzen, mit denen sie aus Lösungen extrahiert werden können.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Ankergruppe eine Biotin-Gruppe oder ein 6-His-Tag ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Abbau von mehreren verschiedenartigen Substraten gleichzeitig gemessen wird.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die verschiedenartigen Substrate so maßgeschneidert sind, dass ihr Abbaumuster die verschiedenartigen Klassen von β-Lactamasen erkennen lässt.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die verschiedenen Substrate um den β-Lactamring herum die sterischen Formen verschiedener Antibiotika nachbilden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionsgeschwindigkeiten des Abbaus der Substrate gemessen werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroben aus Blut oder einer Blutkultur gewonnen wurden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Mengen des restlichen Substrats und seines Abbauprodukts massenspektrometrisch mit einer Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption gemessen werden.
Verfahren für die Bestimmung einer mikrobiellen β-Lactam-Resistenz, die auf der Erzeugung von β-Lactamasen beruht, mit den Schritten: (a) Zugabe der Mikroben zu einer Lösung mindestens eines Substrats, das von den β-Lactamasen abgebaut werden kann, (b) Inkubation bei einer vorbestimmten Temperatur für eine vorbestimmte Zeit, (c) Entnahme der Lösung mit restlichem Substrat und seinem Abbauprodukt, und (d) Aufnahme eines Massenspektrums der Lösung.
Verbrauchsmittelpackung (Kit) für eines der Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass es das benötigte Substrat oder die benötigten Substrate bereitstellt.
Programm zur Auswertung zur Auswertung der Massenspektren, die mit einem der Verfahren nach den Ansprüchen 2 bis 15 gewonnen wurden.