DE102006021493A1

DE102006021493A1 - Massenspektrometrische Messung mikrobieller Resistenzen

Info

Publication number: DE102006021493A1
Application number: DE102006021493A
Authority: DE
Inventors: Vadim Markovich Govorun; Jochen Franzen
Original assignee: Bruker Daltonik GmbH
Current assignee: Bruker Daltonics GmbH and Co KG
Priority date: 2006-05-09
Filing date: 2006-05-09
Publication date: 2007-11-15
Anticipated expiration: 2026-05-10
Also published as: US8580535B2; US8293496B2; GB2438066A; US9897613B2; DE102006021493B4; US20140106396A1; US9051594B2; US20150233940A1; US20120264162A1; GB0708804D0; GB2438066B; US20080009029A1

Abstract

Die Erfindung betrifft die Identifizierung und Charakterisierung von Mikroorganismen, insbesondere von Bakterien, anhand einer massenspektrometrischen Messung ihrer Proteinprofile mit Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption. Die Erfindung stellt ein Verfahren bereit, mit dem die mikrobielle Resistenz gegen Antibiotika gemessen werden kann. Das Verfahren misst die Proteinprofile von Mikroorganismen nach kurzem Züchtungsversuch von nur etwa zwei Stunden in Nährmedien, die Antibiotika enthalten.

Description

Die Erfindung betrifft die Identifizierung und Charakterisierung von Mikroorganismen, insbesondere von Bakterien, anhand einer massenspektrometrischen Messung ihrer Proteinprofile mit Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption.
Die Erfindung stellt ein Verfahren bereit, mit dem die mikrobielle Resistenz gegen Antibiotika gemessen werden kann. Das Verfahren misst die Proteinprofile von Mikroorganismen nach kurzem Züchtungsversuch von nur etwa zwei Stunden in Nährmedien, die Antibiotika enthalten.
Stand der Technik
Viele Arten von Mikroorganismen (im Folgenden auch Mikroben genannt), insbesondere Bakterien und einzellige Pilze, lassen sich nach einem jüngst gefundenen Verfahren sehr leicht massenspektrometrisch identifizieren, indem von einer Kolonie, die in üblicher Weise auf einem Nährmedium gezüchtet wurde, kleine Mengen von Mikroben auf eine massenspektrometrischen Probenträgerplatte übertragen und dort direkt massenspektrometrisch vermessen werden. Das Massenspektrum gibt insbesondere die verschieden schweren Proteine wieder, soweit sie mit genügender Konzentration in den Mikroben vorhanden sind. Aus diesem Proteinprofil der Mikroben wird über Spektrenbibliotheken mit Hunderten oder Tausenden von Mikrobenspektren ihre Identität festgestellt.
Das Nährmedium befindet sich gewöhnlich in einer feuchten Gelatine in einer Petrischale, wodurch in einfacher und durchaus üblicher Weise eine Züchtung von jeweils reinen Stämmen in getrennten Mikrobenkolonien erreicht wird. Die mit einem kleinen Spatel aus einer ausgewählten Kolonie auf den massenspektrometrischen Probenträger übertragene Mikrobenmenge wird dann mit einer Lösung einer fachüblichen Matrixsubstanz für eine Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) beträufelt. Das organische Lösungsmittel dringt in die mikrobiellen Zellen ein und zerstört diese. Anschließend erfolgt die Trocknung der Probe durch Verdunstung des Lösungsmittels, wodurch eine Kristallisation des gelösten Matrixmaterials eintritt. Lösliche Proteine und Peptide, in geringem Umfang auch andere Substanzen der Zelle, werden dabei in die Matrixkristalle eingebaut.
Die Matrixkristalle mit den eingebauten Analytmolekülen werden dann in einem Massenspektrometer mit Laserlichtblitzen beschossen, wobei Ionen der Analytmoleküle entstehen, die dann im Massenspektrometer nach Ionenmassen getrennt gemessen werden können. Vorzugsweise werden zu diesem Zweck Flugzeitmassenspektrometer verwendet. Das Massenspektrum ist das Profil der Massenwerte dieser Peptidionen, Proteinionen und anderen Analytionen. Dieses Profil ist sehr charakteristisch für die betreffende Mikrobenart, weil jede Mikrobenart ihre eigenen, genetisch vorgegebenen Proteine mit jeweils charakteristischen Massen produziert. Die Proteinprofile sind ähnlich charakteristisch für die Mikroben wie Fingerabdrücke für den Menschen. An zuverlässigen und rechtlich verwendbaren (so genannt „validierten") massenspektrometrischen Bibliothe ken der Proteinprofile von Mikroben wird an vielen Orten gearbeitet, darunter auch an zentralen staatlichen Einrichtungen für Krankheitsüberwachung und -Prävention.
Es können mit diesem einfachen Verfahren sogar eng verwandte Unterstämme von Mikroben auseinander gehalten werden, da die Ausstattung der Mikroben mit Proteinen genetisch vorgegeben ist und in den Unterstämmen eindeutig variiert. Kleine Veränderungen im genetischen Bauplan erzeugen zwingend anders aufgebaute Proteine, deren Massen verschieden sind von den genetisch unverändert gebauten Proteinen; sie ergeben somit ein anderes Proteinprofil. Es können sogar taxonomisch neue Einordnungen von Mikroben auf diese Weise vorgenommen werden.
Die Massen der Proteine völlig gleicher Mikrobenarten sind naturgemäß immer gleich und daher streng reproduzierbar, die Intensitäten der Proteinsignale dagegen nur grob. Die Verwendung verschiedener Nährmedien für die Züchtung ist von Einfluss auf den Stoffwechsel der Mikroben und damit von Einfluss auf die Erzeugung der Mengen an verschiedenen Proteinen und auf ihre Intensität im Proteinprofil. Der Einfluss ist allerdings nicht stark. Die Intensitätsschwankungen stören die Identifizierung nicht, wenn die Computerprogramme darauf abgestimmt sind. Ebenso wirkt sich der Reifegrad der Kolonien nur auf die Intensitäten der Proteinsignale zueinander in den Massenspektren aus, allerdings auch hier nur geringfügig. Charakteristisch verschiedenartige Massenspektren für die gleiche Mikrobenart gibt es eigentlich nur bei Sporenbildnern: die Sporen zeigen andere Proteinprofile als die normalen Zellen.
Die Computerprogramme zur Bibliothekssuche durch Spektrenvergleiche nehmen Intensitätsschwankungen in Kauf, die Intensitäten spielen hier eine nur untergeordnete Rolle. Die Identifizierung der Mikroben mit diesen Programmen scheint, soweit heute untersucht, sehr sicher zu sein. Die Programme arbeiten ohne eine individuelle Identifizierung der beteiligten Proteine nur über die Ähnlichkeit der Massenspektren, wobei die Massen streng und die Intensitäten weit weniger streng in die Ähnlichkeitssuche eingehen. Im Einzelnen können sogar einige Proteine in Massenspektren fehlen (sehr geringe Intensität), ohne dass dies die Ähnlichkeitsbestimmung stört: Es genügt für die Identifizierung die Übereinstimmung der Massenwerte für eine überwiegende Anzahl an Proteinen, wobei die Bibliotheksspektren dabei auch Auskünfte darüber speichern können, welche Proteinsignale auf jeden Fall vorhanden sein müssen, beispielsweise über die Speicherung von Schwellenwerten für die Intensitäten.
Das oben kurz geschilderte Verfahren des Aufschmierens von einigen Mikroben aus einer Kolonie mit einem kleinen Spatel auf einen reservierten Fleck eines massenspektrometrischen Probenträgers mit anschließendem Beträufeln mit einer Matrixlösung ist die einfachste und bisher schnellste Art der Probenvorbereitung. Für die Verwendung in Routinelabors kann das Verfahren mit Hilfe von bild-erkennenden Pipettierrobotern auch automatisiert werden. Nach dem Züchten einer gerade eben sichtbaren Kolonie dauert es nur ein bis zwei Stunden bis zur vollständigen Identifizierung, selbst wenn gleichzeitig Hunderte von Proben analysiert werden. Es sind massenspektrometrische Probenträger für jeweils 384 Proben im Handel; die Aufnahme dieser Massenspektren dauert etwa ein bis zwei Stunden. Für Eilaufträge können einzelne Mikrobenproben in wenigen Minuten identifiziert werden.
Es sind auch andere Verfahren der Probenvorbereitung untersucht worden, wie Extraktion der Proteine nach Zerstörung der Mikroben durch Beschallung, oder Extraktion durch Zentrifugieren. Diese Verfahren liefern durchweg erstaunlich ähnliche Spektren.
Die Massenspektren der Mikroben-Proteine werden heute aus Gründen besonders hohen Nachweisvermögens in linearen Flugzeitmassenspektrometern aufgenommen, obwohl die Massenauflösung und die Massenrichtigkeit der Spektren aus Flugzeitmassenspektrometern mit Reflektoren deutlich besser ist. Im Reflektorbetrieb erscheinen aber nur etwa ein Zwanzigstel der Ionensignale, und das Nachweisvermögen ist um ein bis zwei Zehnerpotenzen schlechter. Die hohe Empfindlichkeit beruht darauf, dass im linearen Betrieb eines Flugzeitmassenspektrometers nicht nur die stabilen Ionen nachgewiesen werden, sondern auch die Fragmentionen aus so genannten „metastabilen" Zerfällen der Ionen. Sogar die Neutralteilchen, die unterwegs aus Ionenzerfällen entstanden sind, werden gemessen. Alle diese Fragmentionen und Neutralteilchen, die aus einer Mutterionensorte entstanden sind, haben die gleiche Geschwindigkeit wie die Mutterionen und erreichen daher den Ionendetektor zur gleichen Zeit. Die Ankunftszeit ist ein Maß für die Masse der ursprünglich unzerfallenen Ionen.
Das erhöhte Nachweisvermögen ist für viele Anwendungen so entscheidend, dass man viele der Nachteile des linearen Betriebsmodus der Flugzeitmassenspektrometer in Kauf nimmt. Für diese Anwendungen erhöht man die Energie des desorbierenden und ionisierenden Lasers, wodurch die Ausbeute an Ionen steigt, aber auch ihre Instabilität, die jedoch hier nicht stört.
Die Aufnahme von Massenspektren mit Flugzeitmassenspektrometern erfordert im Allgemeinen die zeitlich schnell aufeinander folgende Aufnahme sehr vieler Einzelspektren, die üblicherweise Messpunkt für Messpunkt zu einem Summenspektrum aufaddiert werden. Die Ionen für jedes Einzelspektrum werden jeweils durch einen Laserschuss erzeugt. Dieses Vorgehen der Erzeugung von Summenspektren wird durch die geringe Messdynamik im Einzelspektrum erzwungen. Es werden dabei mindestens etwa 50, in einigen Fällen auch 1000 und mehr Einzelspektren aufgenommen; im Allgemeinen besteht ein Summenspektrum aus einigen Hundert Einzelspektren, die in modernen Massenspektrometern in wenigen Sekunden aufgenommen und addiert sind. Die Gesamtdauer für die Aufnahme eines Summenspektrums hängt von der Anzahl der Einzelspektren und der Schussfrequenz des verwendeten Lasers ab. Es sind heute Laser mit 20 bis 200 Hertz für diesen Zweck im Einsatz, die Aufnahme eines guten Summenspektrums dauert etwa 2 bis 20 Sekunden.
In den oben geschilderten Anwendungsgebieten werden Massenspektren bis in hohe Massenbereiche von beispielsweise 20 000 Dalton gemessen. Aus den genannten Gründen geringer Massenauflösung können in überwiegenden Teilen des Massenspektrums die Isotopengruppen, die aus Ionensignalen bestehen, die sich jeweils um ein Dalton unterscheiden, nicht mehr aufgelöst werden. Es werden daher nur die Einhüllenden der Isotopengruppen gemessen. Es sind aber auch massenspektrometrische Messverfahren bekannt geworden, die eine höhere Auflösung und eine höhere Massengenauigkeit bieten; es ist aber noch nicht bekannt, ob sich damit vergleichbare Empfindlichkeiten erzielen lassen.
Das Verfahren der schnellen und einfachen Identifizierung von Mikroben kann Anwendungen in vielen Gebieten finden, so beispielsweise in der Trinkwasserüberwachung oder der Qualitätskontrolle in der Nahrungsmittelherstellung. Bei der Nahrungsmittelherstellung entscheiden die Arten der vorhandenen Mikroorganismen über die schadlose Genießbarkeit der Nahrungsmittel. Es sei hier nur an schädliche Staphylokokken, Streptokokken oder Salmonellen erinnert, die durch stete Kontrollen gefunden werden müssen. Andererseits können Bier, Wein, Käse oder Joghurt nicht ohne den nützlichen Einsatz von Milliarden von Mikroben erzeugt werden. Die Reinheit der Stämme ist für diesen Einsatz entscheidend.
Eine strenge Überwachung ist auch auf medizinischem Gebiet erforderlich. Infektionserreger müssen vor allem aus Hospitälern ferngehalten werden. Eine ständige Überwachung mit Identifizierung der ubiquitär vorkommenden Mikroben ist beispielsweise für Operationsräume zwingend gesetzlich vorgeschrieben.
Eine besondere Rolle spielt die Identifizierung der Mikroben bei infektiösen Krankheiten. Hier ist es wichtig, die Identifizierung von Erregertypen sehr schnell vornehmen zu können, damit sofort medizinisch richtig reagiert werden kann. Auch hier hat sich die massenspektrometrische Identifizierung bewährt, wenn auch noch nicht durchgesetzt.
Im medizinischen Bereich tritt aber nicht nur das Problem einer schnellen Identifizierung, sondern auch das Problem der Erkennung von Resistenzen gegen die gebräuchlichen Antibiotika auf. Ohne die Kenntnis über die Resistenzen ist eine schnelle Bekämpfung nicht möglich. Es bedarf daher neben einer schnellen Identifizierung auch einer schnellen Feststellung und Charakterisierung der Resistenzen von Mikroorganismen.
Die Feststellung der Resistenzen beruht bisher vorwiegend auf Züchtungsversuchen der Mikroorganismen in verschiedenen Nährmedien, denen Bakterizide oder andere Antibiotika zugegeben wurden. Diese Versuche sind langwierig und arbeitsintensiv. Sie dauern mindestens 24 Stunden, meist sogar zwei Tage. Es werden zur Zeit Versuche unternommen, die Resistenzen über Analysen von DNA-Sequenzen in den Plasmiden der Bakterien zu erkennen. In den Plasmiden sind die Resistenzen codiert. Diese Art von Analysenverfahren ist viel versprechend, aber bisher nicht zum Durchbruch gekommen.
Das Problem der Resistenzen von Mikroorganismen gegen Antibiotika wie Bakterizide oder Fungizide wird mit fortschreitender Zeit immer brennender. Zum einen nimmt die Geschwindigkeit der Resistenzbildung von Mikroorganismen gegen die verschiedenartigen Antibiotika zu, zum anderen werden immer weniger medizinisch anwendbare Antibiotika neu entwickelt. Man weiß heute, dass die Resistenzen nicht jeweils durch neuartige Mutationen und ihre Auslese gebildet werden, sondern durch Austausch von Plasmiden zwischen Mikroorganismen, ja sogar zwischen Mikroorganismen verschie dener Art. Die Mikroorganismen stecken sich sozusagen mit den Resistenzen gegenseitig an.
Die Gründe für die rapide Zunahme der Resistenzen sind vielfältig: leichtfertige Verschreibungen von Antibiotika, selbst wenn das nicht nötig wäre; leichtfertig abgebrochene Kuren mit Bakteriziden vor dem vollständigen Ausrotten der infektionsträger; leichtfertige, oft rein vorbeugende Anwendungen in der Land- und Viehwirtschaft. Alle diese Verhaltensweisen helfen der Auslese der resistenten Mikrobenarten gegenüber den nicht resistenten Arten.
Andererseits werden immer weniger neue Antibiotika entwickelt. Da viele neue Antibiotika bereits nach kurzer Zeit wegen Unwirksamkeit vom Markt genommen werden müssen, lohnt es für die Pharmafirmen immer weniger, viel Geld in die immer schwieriger werdende Entwicklung von Antibiotika zu stecken. Laut WHO sind seit 1990 nur drei neue Antibiotika-Präparate auf den Markt gekommen, während es zwischen 1940 und 1950 noch zehn Präparate, zwischen 1971 und 1980 noch fünf Präparate waren.
Seit der Entdeckung der Antibiotika durch Rudolf Fleming im Jahre 1929 (Penicillin) sind weit mehr als 2000 verschiedenartige antibiotisch wirksame Substanzen bekannt geworden, von denen allerdings wegen Toxizität und Nebenwirkungen nur etwa 30 in größerem Ausmaß chemotherapeutisch genutzt werden. Die wirksamsten Antibiotika sind häufig künstlich erzeugte Derivate von natürlichen pflanzlichen (aus Pilzen und Algen) oder tierischen Antibiotika; es gibt aber auch vollsynthetische Antibiotika. Die Antibiotika wirken auf sehr verschiedene Weisen: Es gibt Antibiotika, die die Mikroben regelrecht zerstören, andere führen zum stillen Zelltod, wiederum andere sind nur Wachstumshemmer und überlassen die Bekämpfung und Vernichtung der gehemmten und somit geschwächten Mikroben dem heilenden Immunsystem des betreffenden Patienten, sei es Mensch, Tier oder Pflanze.
Mitte des vorigen Jahrhunderts als Hoffnungsträger für die Bekämpfung von infektiösen Krankheiten gefeiert, drohen die Antibiotika rasch zu einem stumpfen Werkzeug zu werden. Eine Rettung ist nur durch gezielte Anwendungen mit vollständig durchgeführten Kuren zu erhoffen, und das setzt eine rasche Identifizierung der infektiösen Erreger wie auch die schnelle Erkennung ihrer spezifischen Resistenzen gegen die verschiedenen Arten von Antibiotika voraus.
Aufgabe der Erfindung
Es ist die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem schnell und einfach die Resistenzen von Mikroorganismen gegen verschiedenartige Antibiotika gemessen werden können.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung beruht auf der massenspektrometrischen Messung der Änderung des Proteinprofils nach Einwirkung von Antibiotika während einer kurzzeitigen Wachstumsphase in einem guten Nährmedium unter sonst idealen Bedingungen. Vorzugsweise werden dabei flüssige Nährmedien verwendet, da sie eine schnelle Vermehrung der Mikroben erlauben, jedenfalls schneller, als das auf der Oberfläche eines gelatinösen Mediums der Fall ist. Die Einwirkung der Antibiotika ist in der Regel bereits nach etwa zwei Stunden deutlich zu messen. Als Beispiel teilen sich Bakterien alle 20 bis 30 Minuten, in zwei Stunden treten Vermehrungen um Faktoren 16 bis 64 auf.
Die Mikroben werden nach der Einwirkungsphase durch Filtration oder vorzugsweise durch Zentrifugieren vom Nährmedium abgetrennt, auf einen massenspektrometrischen Probenträger aufgebracht, mit Matrixlösung beträufelt und nach Trocknung dem Massenspektrometer zugeführt. Die dort gemessenen Massenspektren können mit Spektrenbibliotheken verglichen werden, die auch die Massenspektren von resistenten und nicht-resistenten Mikroben nach Einwirkung von Antibiotika enthalten. Oft reichen aber auch einfache Vergleiche mit den Massenspektren von Mikroben, die in gleicher Weise, jedoch ohne die Einwirkung von Antibiotika gezüchtet wurden.
Wirken die Antibiotika zerstörend auf die Mikroben ein, so ist der Unterschied zwischen resistent und nicht-resistent leicht im Massenspektrum zu sehen (und auch durch Computerprogramme festzustellen). Anders ist das, wenn die Mikroben lediglich ohne Zerstörung und ohne große Veränderungen ihrer Proteine absterben (was allerdings selten der Fall ist), oder wenn die Mikroben lediglich in ihrem Wachstum gestört werden und ohne weitere Vermehrung lebend im Nährmedium verbleiben. Den Nährmedien mit Antibiotika können für diese Fälle reaktive Substanzen beigegeben werden, die die Wirkung der Antibiotika verstärken und unterstützen. So können beispielsweise Enzyme beigegeben werden, die wachstumsgestörte Mikroben angreifen und zerstören können, während ungestörte Mikroben durch die Enzyme nicht angegriffen werden können.
Andererseits können den Nährmedien auch Substanzen beigegeben werden, die eine massenspektrometrische Unterscheidung frisch gewachsener von wachstumsgehemmten Mikroben anzeigen. So können beispielsweise isotopenmarkierte Nährstoffe beigegeben werden, die eine charakteristische Änderung des Massensprofils der Proteine bewirken. Sind die Mikroben in ihrem Wachstum gehemmt und nehmen keine Nahrung auf, so wird das in diesem Fall sofort massenspektrometrisch erkannt, weil die Veränderungen fehlen.
Auch die Zugabe einer gleichen Menge von Referenzmikroben ähnlicher Art kann über eine quantitative Referenzmessung der Erkennung von wachstumsgehemmten oder sogar abgestorbenen, aber nicht lysierten Mikroben dienen. Da die heranwachsende Menge zwischen nicht wachsenden und wachsenden Mikroben in zwei Stunden mindestens um einen Faktor 10 unterschiedlich ist, können wachstumsgehemmte Mikroben durch ihre geringere Quantität im Massenspektrum erkannt werden.
Das Verfahren kann an mehreren parallel verwendeten Portionen des Nährmediums, versehen mit verschiedenartigen Antibiotika, so ausgeführt werden, dass gleichzeitig mehrere Arten von Resistenzen parallel gemessen werden, beispielsweise in Mikrotiterplatten, die sich auch für das Zentrifugieren eignen. In verantwortungsvollen Krankenhäusern werden im Allgemeinen nur drei bis maximal fünf Antibiotika regelmäßig verwendet, mit etwa weiteren fünf Antibiotika, die für Resistenzfälle in Bereitschaft stehen, so dass regelmäßig nur etwa die Resistenzen gegen zehn Antibiotika gemessen werden müssen.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
In der 1 sind zwei Massenspektren mit Proteinprofilen von Escherichia coli gezeigt, wobei es sich im oberen Massenspektrum um eine nicht-resistente Art handelt, während bei den E. coli des unteren Massenspektrums durch ein Plasmid pUC19 eine Resistenz gegen Ampicillin vorhanden ist. Die Massenspektren enthalten im Wesentlichen massengleiche Proteinsignale, mit den üblichen Mängeln der Reproduzierbarkeit der Intensitäten. Sie werden von entsprechenden Computerprogrammen als gleich erkannt.
In der 2 sind die Proteinprofile der nicht-resistenten (oben) und resistenten (unten) E. coli aus 1 gezeigt, hier aber nach zweistündiger Einwirkung von Ampicillin in einem flüssigen Nährmedium. Die nicht-resistente Art der E. coli (oben) ist zerstört, alle Proteinsignale der Massenspektren aus 1 sind verschwunden. Die resistente Art (unten) ergibt ein Proteinprofil, wie es in genügend ähnlicher Form in in den beiden Massenspektren der 1 zu finden ist.
Bevorzugte Ausführungsformen
Die Erfindung stellt ein Verfahren für die Bestimmung der Resistenz von Mikroben gegen ein bestimmtes Antibiotikum zur Verfügung, das aus folgenden Schritten besteht:

(a) es wird eine Menge der zu untersuchenden Mikroben zu einem Nährmedium hinzu gegeben, in dem sich auch eine Menge des Antibiotikums befindet,
(b) die Mikroben werden bei einer vorbestimmten Temperatur für eine vorbestimmte Zeit inkubiert, vorzugsweise nicht länger als einige wenige Stunden,
(c) die Mikroben werden sodann in geeigneter Weise aus dem Nährmedium entnommen, zum Beispiel durch Zentrifugieren,
(d) die Mikroben werden mit einer Matrixlösung versehen und die Matrixlösung wird auf einem massenspektrometrischen Probenträger zu einer Probe eingetrocknet,
(e) es wird ein Massenspektrum dieser Probe aufgenommen, und
(f) das Massenspektrum wird mit einem Referenzmassenspektrum dieser Mikroben verglichen.

Die Erfindung beruht somit auf der massenspektrometrischen Messung der Änderung des Massenspektrums dieser Mikroben nach Einwirkung von Antibiotika während einer relativ kurzzeitigen Wachstumsphase in einem guten Nährmedium unter sonst möglichst idealen Wachstumsbedingungen. Das Massenspektrum stellt im Wesentlichen das Profil der löslichen Proteine im Inneren der Mikroben dar, die nicht löslichen Membranproteine der Mikroben sind im Allgemeinen nicht sichtbar. Es können dabei durchaus auch einige Substanzen im Massenspektrum wiedergegeben werden, die nicht Proteine sind; im Folgenden wird aber der Einfachheit halber von „Proteinprofilen" gesprochen, die hier in den Massenspektren der Mikroben dargestellt werden.
Das Verfahren beginnt im Allgemeinen mit einer Identifizierung der Mikroben, wie sie oben dargestellt ist: es werden Mikroben auf gelatinösen Nährmedien gezüchtet und eine Teilmenge der Mikroben einer Kolonie wird verwendet, um anhand ihres Massenspektrums die Mikroben zu identifizieren. Diese Identifizierung ist nicht unbedingt absolut erforderlich, kann aber für die nachfolgende Bestimmung der Resistenzen nach dieser Erfindung hilfreich sein, indem sie abhängig von der Art der Mikroben die Messung der Resistenzen modifiziert. Zum Beispiel kann sie die Temperatur bestimmen, die für ein optimales Wachstum im Nährmedium eingehalten werden soll.
Da die parallele Identifizierung einer größeren Anzahl von Mikroben durch die Aufnahme der vielen Massenspektren etwa zwei Stunden dauert, kann diese Zeit genutzt werden, den Rest der Mikroben aus den jeweils ausgewählten Kolonien durch Inkubation zu vermehren. Vorzugsweise werden dabei flüssige Nährmedien verwendet, da sie eine schnelle Vermehrung der Mikroben erlauben. Diese Art der Vermehrung ist in aller Regel weitaus schneller als das Züchten auf der Oberfläche eines gelatinösen Nährmediums. Es teilen sich beispielsweise Bakterien in einem guten flüssigen Nährmedium bei optimalen Temperaturen alle 20 bis 30 Minuten, damit treten in zwei Stunden Vermehrungen um Faktoren 16 bis 64 auf. Die flüssigen Nährmedien sind kommerziell erhältlich.
Weitere Teilmengen der Kolonie oder Teilmengen der durch Inkubation vermehrten Mikroben der Kolonie können anschließend für die Bestimmung der Resistenzen gegen verschiedenartige Antibiotika verwendet werden, indem sie in Nährmedien inkubiert werden, die mit den vorgegebenen Antibiotika versetzt sind. Auch hier werden vorzugsweise flüssige Nährmedien verwendet. Die durch Inkubation in flüssigen Nährmedien zwischenzeitlich vermehrten Mikroben einer Kolonie können dabei leicht durch einfaches Pipettieren auf etwa ein Dutzend Gefäße verteilt werden, in denen sich die flüssigen Nährmedien zusammen mit Antibiotika befinden. Die Einwirkung der Antibiotika ist in der Regel bereits nach etwa zwei Stunden deutlich zu messen. Es ist besonders günstig, wenn sich in einem der Gefäße kein Antibiotikum befindet; man erhält dann sehr einfach ein Referenzmassenspektrum für Vergleichszwecke, das auf Mikroben beruht, die eine gleiche Historie haben. Das ist besonders günstig, wenn keine Spektrenbibliothek mit entsprechenden Referenzmassenspektren verwendet werden kann, oder wenn in der Spektrenbibliothek diese Mikrobe nicht identifiziert werden konnte, weil kein entsprechendes Referenzmassenspektrum enthalten war.
Infektiöse Mikroben werden bei Temperaturen von 35 bis 40 ° Celsius in Gegenwart der Antibiotika für etwa zwei Stunden inkubiert. Diese Temperatur ist für die meisten der infektiösen Mikroben optimal, da sie in der Regel an ein Leben in Säugetieren angepasst sind. Andere Arten von Mikroben wachsen optimal bei anderen Temperaturen, daher ist eine vorhergehende Identifizierung wichtig. Anschließend werden die Mikroben vom Nährmedium abgetrennt, vorzugsweise durch Zentrifugieren, wobei sie als Sediment abgesetzt werden. Dieser Vorgang des Züchtens und der Entnahme kann für mehrere Antibiotika parallel in den Mikrogefäßes von Mikrotiterplatten durchgeführt werden, wobei auch das Zentrifugieren in diesen Mikrotiterplatten stattfinden kann. Alternativ können die Mikroben auch durch Filtration oder andere geeignete Trennverfahren abgetrennt werden.
Die abgetrennten Mikroben werden dann wie bei der Identifizierung auf einen massenspektrometrischen Probenträger aufgebracht, mit Matrixlösung beträufelt und nach Trocknung und Auskristallisieren der Matrixsubstanz dem Massenspektrometer zugeführt. Es können auch die Sedimente nach Entfernen der Überstände direkt mit Matrixlösung versetzt werden, wonach die Matrixlösung dann erst mit den aufgenommenen Proteinen auf den massenspektrometrischen Probenträger aufpipettiert wird.
Die im Massenspektrometer gemessenen Massenspektren können bevorzugt mit Spektren in Spektrenbibliotheken verglichen werden, die auch die Massenspektren von resistenten und nicht-resistenten Mikroben nach Einwirkung von Antibiotika enthalten. Diese Massenspektren können jeweils weitere Information enthalten, wie beispielsweise Schwellenwerte für die Proteinsignale, die erreicht werden müssen. In der Regel sind die Unterschiede zwischen den Massenspektren von resistenten und nicht-resistenten Mikroben so drastisch verschieden, dass einfache Vergleiche mit den Massenspektren von Mikroben reichen, die in gleicher Weise, jedoch ohne die Einwirkung von Antibiotika gezüchtet wurden.
Die Antibiotika können in verschiedener Weise auf die Mikroben einwirken: sie können sie vollständig zerstören („lysieren"), sie können sie abtöten, ohne die Zellmembran zu zerstören, oder sie können nur ihr Wachstum hemmen, so dass sie sich praktisch nicht weiter vermehren können. Die in ihrem Wachstum gehemmten Mikroben sind im Allgemeinen sehr geschwächt.
Die Zerstörung der Mikroben ist sofort im Massenspektrum sichtbar, weil das Massenspektrum überhaupt nicht mehr mit den Mikrobenspektren der lebenden Mikroben übereinstimmt. Ein solcher Fall ist in den 1 und 2 für E. coli unter der Einwirkung von Ampicillin dargestellt. Die Proteine der Mikroben gehen verloren, weil beim Zentrifugieren im Wesentlichen nur die Membranhüllen sedimentiert werden. Die meisten Antibiotika zerstören die Mikroben vollständig
Beim Abtöten der Mikroben unter Erhalt ihrer Zellstruktur und in gewissem Maße auch bei der Hemmung des Wachstums treten starke Änderungen des internen Stoffwechsels auf. So werden durch nicht mehr kontrollierte Proteasen sofort die konzentrationsstarken Nucleoproteine der Ribosome und auch andere hochkonzentrierte Proteine abgebaut. Damit werden stark veränderte Massenspektren gemessen, die aber durchaus noch einige der Proteinsignale aufweisen können, die in gesunden, lebenden Mikroben gefunden werden.
Ist die Hemmung des Wachstums nur schwach, so bleiben viele Proteine in den Mikroben unzerstört erhalten und sind daher auch unverändert in den Massenspektren zu finden. Nur wenige Proteine sind erkennbar geändert: durch enzymatische Angriffe (viele Antibiotika sind Enzyme), vor allem durch die oben geschilderten zelleigenen Proteasen, sind die Proteine in ihrer Massen geändert und erscheinen daher an anderer Stelle im Massenspektrum. Hier ist aber eine Erkennung der Resistenz deutlich schwieriger als im Falle der vollkommen zerstörten Mikroben. Die toten oder wachstumsgehemmten Mikroben haben aber in der Regel jetzt geschwächte Membranen, so dass auch andere Substanzen, die normalerweise nicht schädigend auf die Mikroben einwirken, jetzt in die Mikroben eindringen und charakteristische Änderungen, beispielsweise einen Verdau der Proteine, vornehmen können. Es ist daher eine Ausführungsform der Erfindung, gleichzeitig mit den Antibiotika auch andere angreifende Substanzen, beispielsweise Verdauenzyme wie Proteasen, zum Nährmedium hinzu zu geben.
Mangelndes Wachstum unter Einwirkung durch die Antibiotika kann aber auch in anderer Weise festgestellt werden. Beispielsweise können den Nährmedien Substanzen beigegeben werden, die eine massenspektrometrische Unterscheidung frisch gewachsener von wachstumsgehemmten Mikroben ermöglichen. So können zum Beispiel isotopenmarkierte Nährstoffe hinzu gegeben werden, die eine charakteristische Änderung des Massensprofils der Proteine in lebenden und wachsenden Mikroben bewirken. Es können beispielsweise alle Aminosäuren in den Nährmedien mit dem Isotop ¹⁵N des Stickstoffs markiert sein. Sind die Mikroben in ihrem Wachstum gehemmt und nehmen keine Nahrung auf, so wird das in diesem Fall sofort massenspektrometrisch erkannt, weil die charakteristischen Massenzuwächse durch ¹⁵N fehlen. Es können aber auch andere Arten von Derivatisierungen von Nährstoffen aus den Nährmedien vorgenommen werden. Es sind Nährstoffe bekannt, deren Derivate voll von Mikroben statt der originären Nährstoffe in den Stoffwechsel übernommen werden und die so Produkte bilden, die sich in der Masse unterscheiden.
Des Weiteren kann mangelndes Wachstum auch durch quantitative Wachstumsvergleiche aufgeklärt werden. Sind die Proteinprofile von gehemmten und normalen Mikroben nicht unterscheidbar, so kann die Zugabe einer gleichen Menge von Referenzmikroben ähnlicher Art über eine quantitative Referenzmessung der Erkennung von wachstumsgehemmten oder sogar abgestorbenen, aber nicht lysierten Mikroben dienen. Die Referenzmikroben sollten vorzugsweise resistent sein und normal wachsen; die Verwendung von nicht-resistenten Mikroben ist aber notfalls auch möglich. Die Massenspektren beider Mikrobenarten überlagern sich etwa 1:1, wenn gleiche Mengen beider Mikrobenarten in der Probenpräparation vorhanden sind. Da die heranwachsende Menge zwischen nicht wachsenden und wachsenden Mikroben in zwei Stunden mindestens um einen Faktor 10 unterschiedlich ist, können wachstumsgehemmte Mikroben durch ihre Quantität im Massenspektrum erkannt werden. Es können hier auch wachstumsgehemmte Mikroben selbst dann erkannt werden, wenn nicht vollständig in ihrem Wachstum gehemmt sind sondern nur deutlich langsamer wachsen als resistente Stämme. Eine vorherige Identifizierung kann Auskunft darüber geben, ob solche halbresistenten Mikrobenarten vorliegen können.
Das Verfahren kann an mehreren parallel verwendeten Portionen des Nährmediums, versehen mit verschiedenartigen Antibiotika, so ausgeführt werden, dass gleichzeitig mehrere Arten von Resistenzen parallel gemessen werden, beispielsweise in Mikrotiterplatten, die sich auch für das Zentrifugieren eignen. Dabei ist es zweckmäßig, in ei nem der Mikrogefäße die Mikroben ohne Zusatz von Antibiotika wachsen zu lassen, um Referenzmassenspektren dieser Mikroben zu erhalten.
In verantwortungsvollen Krankenhäusern werden im Allgemeinen nur drei bis maximal fünf Antibiotika regelmäßig verwendet, mit etwa weiteren fünf Antibiotika, die für Resistenzfälle in Bereitschaft stehen, so dass regelmäßig nur etwa die Resistenzen gegen etwa zehn Antibiotika gemessen werden müssen.
Die hier geschilderten Verfahren können vom einschlägigen Fachmann in Kenntnis der Erfindung in vielfältiger Weise abgeändert werden. Einige dieser Abänderungen sind bereits oben geschildert; es gibt aber durchaus weitere Verfahren, die auf der grundlegenden Basis einer kurzzeitigen Nachzüchtung die gewünschten informationsreichen Massenspektren der Mikroben mit Auskünften über ihre Resistenzen erzeugen können.

Claims

Verfahren für die Bestimmung der Resistenz von Mikroben gegen ein bestimmtes Antibiotikum, bestehend aus folgenden Schritten: (a) Zugabe einer Menge der Mikroben zu einem Nährmedium, in dem sich auch eine Menge des Antibiotikums befindet, (b) Inkubation bei einer vorbestimmten Temperatur für eine vorbestimmte Zeit, (c) Entnahme der Mikroben aus dem Nährmedium, (d) Versatz der Mikroben mit Matrixlösung und Präparation einer Probe durch Eintrocknen der Matrixlösung auf einem massenspektrometrischen Probenträger, (e) Aufnahme eines Massenspektrums der Probe, und (f) Vergleich des Massenspektrums mit mindestens einem Referenzmassenspektrum dieser Mikroben.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Nährmedium in Schritt (a) um ein flüssiges Nährmedium handelt.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass sich das flüssige Nährmedium in einem Mikrogefäß einer Mikrotiterplatte befindet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass sich im Nährmedium des Schrittes (a) zusätzlich reaktive Substanzen befinden, die solche Mikroben, die durch das Antibiotikum geschwächt werden, reaktiv verändern können.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den reaktiven Substanzen um Enzyme handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass sich im Nährmedium des Schrittes (a) markierte Nährstoffe befinden, deren Einnahme durch die Mikroben massenspektrometrisch nachgewiesen werden kann.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den markierten Nährstoffen um isotopenmarkierte Substanzen handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass dem Nährmedium des Schrittes (a) neben den zu untersuchenden Mikroben auch Referenzmikroben hinzugefügt werden.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Referenzmikroben zur quantitativen Bewertung des Wachstums der untersuchten Mikroben dienen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroben in Schritt (c) durch Filtern oder Zentrifugieren aus dem Nährmedium entnommen werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Präparation einer Probe auf dem massenspektrometrischen Probenträger in Schritt (d) durch Aufträufeln einer Matrixlösung auf die dort aufgebrachten Mikroben geschieht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (d) den ausfiltrierten oder auszentrifugierten Mikroben eine Matrixlösung zugesetzt wird, und dass diese Matrixlösung für die Präparation einer Probe auf den massenspektrometrischen Probenträger verbracht und dort eingetrocknet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die zu untersuchenden Mikroben einer einheitlichen Kolonie entstammen.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Referenzmassenspektrum ein Massenspektrum von Mikroben derselben Kolonie ist.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Referenzmassenspektrum ein Massenspektrum von Mikroben derselben Kolonie ist, die parallel in einem gleichen Nährmedium unter gleichen Bedingungen wie die untersuchten Mikroben inkubiert wurden, jedoch ohne Zugabe eines Antibiotikums.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Referenzmassenspektrum ein Massenspektrum der gleichen Mikrobenart in resistenter Form ist, das in einem gleichen Nährmedium mit Zugabe des Antibiotikums aufgenommen wurde.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Referenzmassenspektrum ein Massenspektrum der gleichen Mikrobenart in nicht-resistenter Form ist, das in einem gleichen Nährmedium mit Zugabe des Antibiotikums aufgenommen wurde.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Referenzmassenspektren in einer Spektrenbibliothek enthalten sind, die auch Massenspektren von resistenten und/oder nicht-resistenten Mikroben enthält.