DE10336540B4

DE10336540B4 - Verfahren zur Isolierung von Metall-Cofaktoren aus biologisch-organischen Systemen unter Anwendung der präparativen nativen kontinuierlichen Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PNC-PAGE)

Info

Publication number: DE10336540B4
Application number: DE2003136540
Authority: DE
Inventors: Bernd Kastenholz
Original assignee: Bernd Kastenholz
Current assignee: KASTENHOLZ, BERND, 52249 ESCHWEILER, DE
Priority date: 2003-08-05
Filing date: 2003-08-05
Publication date: 2014-03-13
Anticipated expiration: 2023-08-06
Also published as: WO2005014147A3; WO2005014147A2; DE10336540A1

Abstract

Verfahren zur Isolierung von Metall-Cofaktoren aus biologisch-organischen Systemen unter Anwendung der präparativen nativen kontinuierlichen Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PNC-PAGE), dadurch gekennzeichnet, dass ein Acrylamidgel mit einem Gesamtmonomerenanteil von 4% (w/v) eingesetzt wird, ein Elektrophoresepuffer mit einem pH-Wert von 10,00 eingesetzt wird, sowie 0,5 μl TEMED/ml Gel und 0,5 mg Ammoniumperoxodisulfat/ml Gel eingesetzt werden, wobei das Gel über einen Zeitraum von 69 Stunden auspolymerisiert wird.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von Metall-Cofaktoren aus biologisch-organischen Systemen unter Anwendung der präparativen nativen kontinuierlichen (Preparative Native Continuous = PNC) Poly-Acrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE).
Die Protein- und Enzymforschung hat im Rahmen der aktuellen wissenschaftlichen Diskussionen eine überragende Bedeutung. Zum Beispiel ergeben sich auf den Gebieten der pharmazeutischen, medizinischen, biochemischen und biologischen Grundlagenforschung häufig Fragestellungen, die versuchen, den Zusammenhang zwischen Struktur und Funktion von Proteinen und Enzymen in biologischen Systemen zu klären.
Bei der Lösung dieser lebenswissenschaftlichen Fragen spielt die Entwicklung und Anwendung von Methoden oder Verbundverfahren, die aus dem Gebiet der analytischen Chemie kommen, eine entscheidende Rolle. Um die Bedeutung eines Proteins oder Enzyms, das aus einem pflanzlichen, tierischen, menschlichen oder einem Mikroorganismus stammt, zu bewerten, muss das Protein zunächst mit Hilfe analytischer Methoden aufgereinigt und isoliert werden. Dieser Prozess darf nicht einhergehen mit einer chemischen Veränderung der Proteinstruktur. Ebenso muss die elementare Zusammensetzung des Moleküls erhalten bleiben, da ansonsten keine gültige Aussage im Hinblick auf die Funktion eines Proteins getroffen werden kann.
Als besonders problematisch stellt sich in diesem Zusammenhang die präparative Aufreinigung und Isolierung von Proteinen aus biologisch-organischen Proben dar. Bei festen Biomatrices, wie z. B. Pflanzen, müssen zunächst die löslichen Anteile aus dieser Matrix durch einen Zellaufschluss in einem wässrigen Medium extrahiert werden. Durch Probenkühlung bleibt die biologische Aktivität der Moleküle gewahrt.
Nach Trennung der festen und flüssigen Fraktionen, z. B. durch Zentrifugation in einer Kühlzentrifuge, werden die gelösten Substanzen, die sich im Cytosol befinden, über flüssigem Stickstoff gelagert, um eine chemische Veränderung der vorliegenden Spezies auszuschließen und eine dauerhafte Konservierung zu gewährleisten.
Die Cytosole werden üblicherweise zunächst einem chromatographischen Aufreinigungsschritt unterworfen. Idealerweise wird zu diesem Zweck die Gelpermeationschromatographie (GPC) eingesetzt. Dabei wird die Probe nach Molekularmasse aufgetrennt. Als weiterer Schritt werden in den einzelnen GPC-Fraktionen Elementgehalte mit element-analytischen Methoden (z. B. der Atomabsorptionsspektrometrie) bestimmt, um eine Aussage über die Verteilung von einzelnen Elementen über die detektierten Molekularmassenbereiche zu erreichen (Elementspeziesanalytik). Häufig eluieren im hochmolekularen Bereich (> 10 ku) nach einer GPC Proteine, die beispielsweise Metalle enthalten. Dieser analytische Schritt ist sehr bedeutend, weil im Reich der Proteine Enzyme vorkommen, deren aktives Zentrum ein Metallion ist. Die qualitative Ermittlung dieser Metall-Cofaktoren und deren Stöchiometrie stellt einen wichtigen Schritt bei der Klassifizierung von Metall-Enzymen und Metall-Proteinen dar.
Nach einer GPC ist es wichtig, eine weitere Dimension zur Trennung von Molekülen einzusetzen, um ein bestimmtes Protein aufzureinigen und zu isolieren. Ist in einer hochmolekularen Fraktion mit der höchsten Konzentration eines bestimmten Metalls ein Protein nachgewiesen worden, so besteht die Möglichkeit, diese Fraktion mit Hilfe der präparativen nativen kontinuierlichen (Preparative Native Continuous = PNC) Poly-Acrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE) weiter aufzutrennen. Gemäß US 4 877 510 A wird eine Vorrichtung zur präparativen Gelelektrophorese beschrieben.
Da es sich bei Proteinen um amphotere Verbindungen handelt, sind die geladenen Gruppen im Molekül bei unterschiedlichen isoelektrischen Punkten verschieden angeordnet. Bei der PNC-PAGE erfolgt somit eine Trennung der Moleküle nach ihren isoelektrischen Punkten. Nativ bedeutet, dass die Proteine bei diesem Prozess weder strukturell, noch in ihrer elementaren Zusammensetzung verändert werden dürfen. Kontinuierlich bezieht sich auf das bei der PNC-PAGE verwendete Puffersystem. Das bedeutet, dass sowohl der Kathoden- als auch der Anodenpuffer die gleiche Zusammensetzung und den gleichen pH-Wert aufweisen. Der gleiche Puffer wird ebenfalls für die Herstellung des Gels verwendet.
Aus dem Stand der Technik [1], ist eine analytische Methode bekannt, die sich mit der Aufreinigung und Charakterisierung von hochmolekularen Cadmiumbindungsformen aus pflanzlichen Lebensmitteln beschäftigt. Nach einer GPC der Pflanzencytosole wurden in den Pflanzen hochmolekulare Cadmiumspezies (HM-Cd-SP) detektiert, die ein Molekulargewicht von ungefähr 200 ku aufwiesen. Es wurde festgestellt, dass es sich bei diesen Cadmiumspezies um Proteine handelt.
Um eine Veränderung der hochmolekularen Cadmiumspezie nach der GPC sicher auszuschließen, werden üblicherweise vor einer elektrophoretischen Aufreinigung dieser Substanzen keine weiteren Aufkonzentrierungsschritte, z. B. durch Ultrafiltration oder Lyophilisation der entsprechenden GPC-Fraktionen durchgeführt. Mögliche Kontaminationen oder Veränderungen der vorliegenden Speziesgleichgewichte durch weitere analytische Schritte sind ebenso ausgeschlossen.
Für die Aufreinigung der hochmolekularen Cadmiumspezies nach Ladung wird im allgemeinen die PNC-PAGE-Methode eingesetzt. Diese kann beispielsweise mit Hilfe der „Model 491 Prep Cell” ( U.S. patent number 4,877,510 ) der Firma Bio Rad [2, 3] durchgeführt werden.
Die mit der PNC-PAGE aufgetrennten hochmolekularen Cadmiumbindungsformen wurden zwar stets an der gleichen Stelle im Elektropherogramm detektiert, jedoch wies die Methode den Nachteil auf, dass die Metall-Cofaktoren bzw. Cadmium-Konzentrationen in diesen Fraktionen so gering waren, dass die Ergebnisse dieser Versuche als halb quantitativ eingestuft wurden [1].
Aufgabe der Erfindung ist es daher, im Vergleich zum Stand der Technik eine neue PNC-PAGE-Methode zu entwickeln, die es ermöglicht, Metall-Cofaktorhaltige-Proteine aus biologisch-organischen Systemen zu isolieren. Dabei sollen insbesondere Cofaktoren aus der Gruppe Cadmium, Zink, Palladium, Eisen, Kupfer, Nickel, Cobalt, Mangan, Chrom, Molybdän und Platin isoliert werden.
Mit dem vorliegenden Verfahren ist es nunmehr möglich, niedermolekular (< 10 ku) gebundene und hochmolekular (> 10 ku) gebundene Metall-Cofaktoren aus biologisch-organischen Systemen, wie z. B. aus Pflanzenzellen, tierischen Zellen, humanen Zellen oder Zellen von Mikroorganismen quantitativ nachzuweisen. Die nachzuweisenden Metall-Cofaktoren bleiben mit dem erfindungsgemäßen Verfahren stabil und können nahezu vollständig eluiert werden.
Ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 1 wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 angegebenen Merkmalen.
Die vorteilhafte Ausgestaltung des Acrylamidgels mit einem Gesamtmonomerenanteil von 4% (w = weight/v = volume) gemäß Anspruch 1 bewirkt, dass Proteine bis zu einem Molekulargewicht von ca. 200 ku ungehindert durch das Gel wandern können und nach ihrem jeweiligen isoelektrischen Punkt aufgetrennt werden. Gemäß DE 199 35 115 A1 wird bei der Probentrennung durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese neben einem 7,5%-igem Trenngel auch ein 4%-iges Sammelgel, das aus einer Mischung aus Acrylamid, 4 µl TEMED und 40 µl Ammoniumperoxodisulfat besteht, eingesetzt.
Die weitere vorteilhafte Ausgestaltung des Elektrophoresepuffers mit einem pH-Wert von 10,00 gemäß Anspruch 1 bewirkt, dass alle Proteine mit isoelektrischen Punkten unter 10,00 (pI < 10,00) negativ geladen sind und zur Anode wandern. Gemäß US 4 891 119 A wird zur Verwendung in der Gelelektrophorese von biologisch-organischen Systemen ein Acrylamidgel mit einem Gesamtmonomerenanteil von 3 bis 30% und ein Elektrophoresepuffer mit einem pH-Bereich von 2,5 bis 10,0 wie z. B. Tris-Puffer eingesetzt.
Der vorteilhafte Zeitraum von 69 Stunden für die Auspolymerisation des Gels gemäß Anspruch 1 bewirkt, dass bei der elektrophoretischen Aufreinigung der Proteine keine reaktiven Monomere mehr im Gel vorliegen. Dadurch wird verhindert, dass die Metall-Cofaktoren der zu untersuchenden biologisch-organischen Systeme eine chemische Reaktion mit Restmonomeren oder anderen an der Reaktion im Gel beteiligten Substanzen eingehen können, was zur Denaturierung der Proteine führen kann. Gemäß US 5 458 760 A wird ein 6%-iges N-acryloyl-tris(hydroxy-methyl)aminomethane (NAT)-Gel durch Polymerisation mit TEMED und Ammoniumperoxodisulfat hergestellt. Dabei wird das Gel mindestens 16 Stunden getrocknet und für maximal 2 Wochen auspolymerisiert.
Durch die Beschwerung der zu untersuchenden Probe mit Glycerin mit einem Volumenanteil von 10% (v = volume/v = volume) bezogen auf das Gesamtvolumen des eingesetzten biologisch-organischen Systems gemäß Anspruch 2, wird eine optimierte Probenkomprimierung erreicht, die zu einer verbesserten Auflösung von Proteinbanden in der erfindungsgemäßen PNC-PAGE führt. Die Peakbreite einzelner Substanzen im Elektropherogramm wird so beispielsweise minimiert. Gemäß US 4 891 119 A wird Glycerin mit einem Volumenanteil von 1 bis 40% verwendet.
Weitere vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen angegeben.
Im Folgenden soll das erfindungsgemäße Verfahren beispielhaft beschrieben werden.
Bei der PNC-PAGE-Methode ist u. a. die Zusammensetzung des Elektrophoresegels sowie die Polymerisationsdauer dieses Gels von Bedeutung [4]. Zur Herstellung von 40 mL eines Gels mit einem Gesamtmonomerenanteil von 4% (w/v) (= 4% T) wurden folgende Chemikalien eingesetzt:
4 mL Acrylamid/Bis-Stammlösung (40%, [g/100 mL], Acrylamid/Bis = 37,5:1)
4 mL Tris-HCl Pufferstammlösung (200 mmol/L Tris, pH 10,00; 10 mmol/L NaN₃) und
32 mL Reinstwasser,
20 μL TEMED als Katalysator und
200 μL APS (10%) als Starter. Alle Chemikalien haben zum Zeitpunkt der Gelherstellung Raumtemperatur und werden mit einem Magnetrührer für 1 Minute bei geringer Drehzahl in einem Becherglas homogenisiert. Die APS-Lösung (0,1 g Ammoniumpersulfat gelöst in 1 mL Wasser) wird jeweils frisch angesetzt. Gemäß US 4 891 119 A kann TEMED als Katalysator und z. B. Ammoniumperoxodisulfat als Startersubstanz in einem Gewichtsverhältnis zum Gesamtmonomerenanteil des Gels von etwa 0,3 bis 5% eingesetzt werden.
Nach Gießen des Gels auf eine Höhe von 4 cm wird die Gellösung für 60 Minuten mit 3 mL 2-Propanol luftdicht überschichtet. Nach ca. einer Stunde wird das Isopropanol abgezogen und die Geloberfläche mit 8 × 4 mL Tris-HCl-Puffer (pH 10,00; 20 mM Tris; 1 mM NaN₃) gespült und anschließend mit 4 mL dieses Puffers überschichtet. Unter diesen Bedingungen wurde das Gel bei Raumtemperatur über eine Zeit von 69 h 00' vollständig auspolymerisiert. Danach erfolgte unmittelbar der elektrophoretische Vorlauf.
Da die Gele bei allen PAGE-Versuchen thermisch stark beansprucht sind, werden sie unter den genannten Bedingungen für jeden Versuch neu gegossen. Der Gelsäulendurchmesser beträgt beispielsweise 28 mm.
Als Elekrophoresepuffer des kontinuierlichen Puffersystems kann beispielsweise ein Tris-HCl-Puffer (20 mM Tris, 1 mM NaN₃, pH 10,00) gewählt werden. Die Elektrolytkonzentration ist so gewählt, dass die Proteine nicht für die Leitung des Stroms in Anspruch genommen werden müssen. Das Volumen des Kathodenpuffers beträgt 500 mL, das des Anodenpuffers 2000 mL.
Als Elutionspuffer kann der gleiche Puffer (20 mM Tris, 1 mM NaN₃, pH 8,00), V = 700 mL wie beim Stand der Technik [1] verwendet werden.
Für die Elektrophorese kann beispielsweise die „Model 491 Prep Cell” von Bio Rad mit ihren Komponenten, bestehend aus der oberen und unteren Pufferkammer, dem Kühlfinger, der Gelsäule, der Elutionskammer mit einer Dialysemembran (Molekül-Ausschluss: 6000 u) und dem Gelgießstand eingesetzt werden.
Weiterhin wird eine Gleichspannungsquelle (z. B. Power-PAC 1000, BioRad), eine peristaltische Pumpe (z. B. Model EP-1 Econo Pump, BioRad), ein Fraktionssammler (z. B. Model 2110, BioRad), ein UV-Detektor (z. B. Model EM-1 Econo UV Monitor, BioRad), ein Schreiber (z. B. Model 1327 Econo Recorder, BioRad) und eine Umwälzpumpe (z. B. Buffer Recirculation Pump, BioRad) eingesetzt. Das System sollte gekühlt werden wie z. B. in einem Kühlschrank bei 4°C.
Folgende Parameter wurden beispielhaft eingestellt:

– Peristaltische Pumpe: Fließgeschwindigkeit des Eluenten (1 mL/min); Fraktionsgröße (5 mL); Anzahl Fraktionen (80); Gesamtvolumen Eluent (480 mL); Wait-Volumen (80 mL)
– Detektor: AUFS (1.0) Absorption unit full scale; λ = 254 nm
– Gleichspannungsquelle: Constant Power (5 W); Time (8 h)
– Schreiber: Range (100 mV); Paper Speed Dial (6 cm/h)
– Umwälzpumpe: Flow Rate (95 mL/min)
– Probe (2,7 mL + 0,3 mL Glycerin)

Der elektrophoretische Vorlauf kann bespielsweise 80 Minuten dauern. Nach 75 Minuten des Vorlaufs kann der elektrophoretische Prozess durch Abstellen des Stroms unterbrochen werden. Innerhalb von 5 Minuten kann nun die Probe vorsichtig unterschichtet werden. Mit Erreichen der 80 Minuten-Grenze kann die eigentliche elektrophoretische Aufreinigung der Proteine gestartet werden.
Mit Hilfe der neu entwickelten PNC-PAGE-Methode konnten erstmals mehr als 90% einer hochmolekularen Cadmiumspezies nach einer elektrophoretischen Aufreinigung eines Pflanzencytosols wiedergefunden werden. Dies ist ein Hinweis dafür, dass diese aufzutrennenden Cadmiumbindungsformen sich in diesem System stabil verhalten und nahezu vollständig eluiert werden können. Weiterhin wurde durch eine chromatographische Aufreinigung der PAGE-Fraktion mit dem höchsten Cadmiumgehalt nachgewiesen, dass diese Cadmiumspezies nach einer GPC im Molekulargewichtsbereich von 200 ku eluieren. Dies spricht ebenfalls für die Stabilität der zu untersuchenden hochmolekularen Cadmiumspezies bei einer Auftrennung mit Hilfe der erfindungsgemäßen PNC-PAGE-Methode.
Hochmolekulare Cadmium-Proteine, die im Molekularmassenbereich von ungefähr 200 ku eluieren, wurden nach einer GPC eines Pflanzencytosols weiter mit der erfindungsgemäßen PNC-PAGE-Methode aufgereinigt. Als Ergebnis zeigte sich, dass diese hochmolekularen Cadmiumspezies in einem von der Basislinie getrennten und spitz zulaufenden Peak in wenigen Fraktionen im Elektropherogramm eluiert werden konnten. Dieses Ergebnis wurde reproduziert. Es deutet darauf hin, dass es sich bei den hochmolekularen Cadmiumspezies um ein bestimmtes Cadmium-Protein handelt.
Nach Auftrennung von pflanzlichen Cytosolen an einer GPC-Säule sind bestimmte Elementspezies bereits sehr hoch aufgereinigt. Somit werden nach Anwendung einer ersten Trennung nach Molekülgröße positive Ergebnisse bei der Strukturaufklärung bestimmter Substanzen erhalten. Da Proteine nicht nur als Monomer, sondern auch als polymere Proteine in biologischen Proben vorkommen, wird postuliert, dass z. B. die hochmolekularen Cadmiumspezies nach einer GPC als Polymere (≈ 200 ku) vorliegen. Nach einer weiteren Auftrennung der entsprechenden GPC-Fraktion mit der PNC-PAGE werden diese Spezies als Monomer (≈ 67 ku) detektiert. In diesem Fall würde es sich bei den hochmolekularen Cadmiumspezies um ein Trimer handeln, das einen unterschiedlichen isoelektrischen Punkt (pI) im Vergleich zum zugehörigen Monomer hat.
Sowohl bei der in der Literatur [1] beschriebenen Probenvorbereitung der Pflanzen als auch bei den folgenden Aufreinigungsschritten zur Isolierung von Metall-Proteinen können die jeweils vorliegenden Speziesgleichgewichte stark vom jeweiligen Puffer und dem pH-Wert beeinflusst werden. Deshalb werden die Pflanzenextraktion und die eingesetzten Aufreinigungsmethoden mit einem Puffer (pH 8,00) durchgeführt, dessen pH-Wert nahe am natürlichen pH-Wert innerhalb einer Pflanze im leicht alkalischen pH-Bereich liegt [6]. Verändert man jedoch bei einer Wurzelextraktion den pH-Wert z. B. im Bereich von pH 7 bis 9, so verändern sich auch die Metallspezies deutlich in ihrem Elutionsverhalten nach einer Aufreinigung mit der HPLC [7].
Das erfindungsgemäße Verfahren stellt ein sehr empfindlich reagierendes analytisches System dar. Es ist beispielsweise anwendbar zur Analyse hochmolekularer Cadmiumbindungsformen aus pflanzlichen Proben, die sich unter den gegebenen vorgenannten Bedingungen und insbesondere bei einem pH-Wert von 10,00 stabil verhalten.
Bei genauer Kenntnis der vorliegenden Elementbindungsformen der Metall-Cofaktoren in biologisch-organischen Systemen ist die Entwicklung neuartiger Medikamente für die Behandlung von Vergiftungen und schweren Erkrankungen möglich. Neben der Durchführung einer chemischen Synthese können die entsprechenden Wirkstoffe auch aus Heilpflanzen, Algen, Pilzen und anderen Organismen gewonnen werden. Insbesondere bei der Isolierung von Arzneistoffen aus Phytosystemen spielt die PNC-PAGE daher eine sehr wichtige Rolle. So können zum Beispiel durch Komplexierung der Metallionen durch Zugabe von z. B. Komplexbildnern Enzyme inaktiviert und damit ihre Wirkung im Organismus blockiert bzw. reguliert werden. Nach einer chemischen Reaktion des Komplex- bzw. Chelatbildners mit dem Metall-Cofaktor des entsprechenden Enzyms wird die komplexierte Metallspezies aus der Zelle zu den Ausscheidungsorganen des Organismus transportiert. Das verbleibende Apoenzym wird denaturiert. Ein geeigneter bereits bei Metallvergiftungen eingesetzter Chelatbildner ist „Berliner Blau”. Diese Substanz ist beispielsweise in der Lage, Thalliumionen in vivo zu komplexieren, die dann weiter über den Gastrointestinaltrakt ausgeschieden werden. Günther und Kastenholz haben in Buchbeiträgen eine Übersicht zur Speziation von Thallium [8] und Zink [9] in klinischen Proben verfasst. Das biochemische Verhalten und die Wirkung von Elementen in biologischen Organismen werden von den vorliegenden Elementspezies bestimmt. Daher spielt die Elementspeziesanalytik von klinischen Matrices eine bedeutende Rolle bei der Differential-Diagnose von Krankheiten.
Die qualitative Ermittlung des Metall-Cofaktors und dessen Stöchiometrie stellt einen wichtigen Schritt bei der Klassifizierung von Metall-Enzymen und Metall-Proteinen dar [10]. Ebenso wichtig bei einer PNC-PAGE ist die Frage, ob nach der Aufreinigung und Isolierung eines Enzyms nicht nur ein bestimmtes Metallion von dieser Substanz gebunden wird, sondern ob auch andere Metalle im aktiven Zentrum eines Moleküls vorhanden sein können. Daher ist es sinnvoll, eine Multielement-Speziesanalytik für das erfindungsgemäße Verfahren unter Anwendung der PNC-PAGE in den einzelnen PNC-PAGE-Fraktionen der aufgereinigten Proben durchzuführen. Kommen z. B. in Nickel-Fraktionen Zink oder weitere Metalle vor, deren Konzentrationen oberhalb der vorher ermittelten Blindwertkonzentrationen liegen, so erhöht sich die Wahrscheinlichkeit, dass neben Nickel weitere Elemente als Co-Faktoren des isolierten Protein-Metall-Komplexes existieren. Weiterhin muss bei der Bestimmung von Elementbindungsformen in den verschiedenen Matrices berücksichtigt werden, dass bestimmte Elemente ubiquitär in der Umwelt vorkommen. Daher ist bei allen analytischen Schritten darauf zu achten, dass keine Kontaminationen in die verschiedenen Systeme eingetragen werden.
Bei allen Prozessen eines Analysengangs besteht die Gefahr, dass organische und anorganische Spezies durch Änderungen des pH-Wertes in einer Probe irreversibel verändert werden. Werden Puffer verwendet, können die Puffersubstanzen Wechselwirkungen mit der Probe eingehen. Um dies auszuschließen, ist es bei der PNC-PAGE wichtig, die Eigenschaften der verwendeten Puffer zu überprüfen. So existieren beispielsweise Substanzen, die z. B. den pH-Wert von wässrigen gefrorenen Enzymlösungen stabilisieren. Ein Puffersystem, das die Enzymaktivität unter diesen Bedingungen bewahrt, ist beispielsweise ein HEPES-Puffer (N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid).
Um eine genaue Aufklärung der Struktur von Metall-Enzymen nach einer Isolierung mit der PNC-PAGE durchzuführen, ist es erforderlich, die Metallspezies, die sich in einer bestimmten PNC-PAGE-Fraktion befindet, zu kristallisieren. Die dreidimensionalen Strukturen von Protein-Cofaktor-Komplexen können dann beispielsweise durch Röntgenkristallographie [11] aufgeklärt werden. Die Verfügbarkeit wohlgeordneter dreidimensionaler Kristalle ist Voraussetzung für eine hochauflösende Röntgenstrukturanalyse. Sie ist die einzige Methode, um detaillierte Kenntnisse über die Struktur von großen biologischen Makromolekülen zu erhalten [12].
Ausführungsbeispiele:
1. Isolation eines Eisencofaktors aus Pflanzenzellen
Aus Pflanzenzellen sollen medizinisch wirksame Enzyme isoliert werden. Die Blätter der Pflanze werden entsprechend der dem Fachmann bekannten Methode vorbereitet und die resultierenden Cytosole in Polypropylen-Röhrchen in Cryoracks in einem Behälter zur Lagerung von Proben bei tiefen Temperaturen [5] gelagert.
Nach einer Aufreinigung der Cytosole an einer GPC-Säule mit einem Trennbereich von 20 bis 8000 ku für globuläre Proteine, werden die GPC-Fraktionen mit einer Multielementanalysenmethode (z. B. ICP-MS, TXRF) vermessen. Dabei werden in den einzelnen Fraktionen unterschiedliche Elementbindungsformen analysiert, die sich auf unterschiedliche Molekulargewichtsbereiche verteilen. So liegen beispielsweise 3 Eisenspezies mit einer Molekularmasse von 20, 50 und 70 ku im Elutionsmaximum und 2 Kupferspezies sowie weitere Elementbindungsformen vor (Multielement-Speziesanalytik).
Um festzustellen, welche der detektierten Element-Spezies Proteine sind, werden die Cytosole mit einer Proteinase inkubiert und anschließend mit einer GPC-Methode aufgetrennt. Die Fraktionen werden wieder mit der ICP-MS (inductively coupled plasma mass spectrometry) analysiert. Es stellte sich heraus, dass die kleinste Eisenspezies nach einer Proteasebehandlung des Cytosols nicht mehr im Chromatogramm sichtbar ist. Damit ist verifiziert, dass es sich bei der 20 ku Eisenbindungsform um ein Protein handelt.
Die GPC-Fraktion mit dem höchsten Eisengehalt dieser Eisenspezies wird unter Anwendung der erfindungsgemäßen PNC-PAGE-Methode weiter aufgereinigt und isoliert. Im Elektropherogramm wird ein Eisenpeak dargestellt. Die zugehörige Fraktion mit dem höchsten Eisengehalt, die das isolierte Eisenprotein enthält, kann nun einer Identifizierung und Strukturanalyse zugeführt werden. Dazu eignet sich besonders die MALDI-TOF-MS (matrix assisted laser desorption ionization – time of flight mass spectrometry). Da das Genom der untersuchten Arzneipflanze, die diese Substanz produziert, bekannt ist, kann das Gen, das für dieses Protein codiert, mit Hilfe von Datenbankrecherchen genau zugeordnet werden.
Da Eisen in diesem Fall als Co-Faktor eines Enzyms fungiert, dem bei Stoffwechselprozessen im menschlichen Organismus eine positive Wirkung zugeschrieben wird, kann es nunmehr aufgrund seiner durch das erfindungsgemäße Verfahren ermöglichten genauen genetischen Identifizierung gezielt in größeren Mengen industriellpharmazeutisch produziert werden. So besteht hier beispielsweise die Möglichkeit eine biotechnologische Produktion des Enzyms von Mikroorganismen durchführen zu lassen.
2. Beispiel:
Ein Zinkprotein, das im Bereich von 180 ku eluiert, wird ebenfalls mit der erfindungsgemäßen PNC-PAGE-Methode weiter aufgetrennt. Es wird bei einem pH-Wert von 10,00 nicht denaturiert und wandert während der elektrophoretischen Trennung zur Anode. Zink eluiert in mehreren Fraktionen, wobei zwei Zink-Peaks an unterschiedlichen Stellen im Elektropherogramm sichtbar sind.
Strukturuntersuchungen ergaben, dass es sich bei den Zinkbindungsformen um Substitutionsisomere mit unterschiedlichen isoelektrischen Punkten handelt, von denen nur ein Isomer das medizinisch wirksame ist. Um diesen Unterschied herauszufinden, besteht mittels einer isoelektrischen Fokussierung unter Anwendung von Proteinstandards die Möglichkeit, die isoelektrischen Punkte, die tatsächliche Molekularmasse und Reinheit der isolierten Zinkspezies zu bestimmen.
Literatur

[1] K. Günther, G. Ji and B. Kastenholz, Fresenius J. Anal. Chem. (2000) 368: 281–287, „Characterization of high molecular weight cadmium species in contaminated vegetable food”.
[2] Gang Ji, „Charakterisierung hochmolekularer Cadmiumspezies in kontaminierten pflanzlichen Lebensmitteln”, Cuvillier Verlag Göttingen, 1997, pp. 1–113.
[3] BioRad, „Model 491 Prep Cell, Instruction Manual”, pp. 1–47.
[4] BioRad, „Acrylamide Polymerization – A Practical Approach”, US/EG Bulletin 1156, pp. 1–8 (1989).
[5] DPMA, „Behälter zur Lagerung von Proben bei tiefen Temperaturen”, Offenlegungschrift DE 197 25 768 A1 , 1998, Erfinder: B. Kastenholz.
[6] G. Weber and J. Messerschmidt, Fresenius J. Anal. Chem. (2000) 367: 356–358, „Total determination of metal-binding carbohydrates in plant extracts by using FIA with electrochemical detection”.
[7] G. Weber, J. Messerschmidt, A. von Bohlen and F. Alt, Fresenius J. Anal. Chem. (2001) 371: 921–926, „Effect of extraction pH an metal speciation in plant root extracts”.
[8] K. Guenther and B. Kastenholz, ,Handbook of Elemental Speciation', Rita Cornelis (Chief Editor), Wiley, „Speciation of Thallium (Environment, Food, Clinical, Occupational Health)”, zur Begutachtung eingereicht in 2002.
[9] K. Guenther and B. Kastenholz, ,Handbook of Elemental Speciation', Rita Cornelis (Chief Editor), Wiley, „Speciation of Zinc (Environment, Food, Clinical, Occupational Health)”, zur Begutachtung eingereicht in 2003.
[10] A. Wittershagen, P. Rostam-Khani, C. Rittmeyer, D. Bublak, G. Stahl, H. Rüterjans und B. O. Kolbesen, „Detektion von Metall-Cofaktoren in biologisch-organischen Systemen. Ein Vergleich zwischen ICP-OES und Totalreflexions-Röntgenfluoreszensanalyse (TXRF)”, in ,CANAS'95 Colloquium Analytische Atomspektroskopie', Bernhard Welz (Hrsg.), Bodenseewerk Perkin-Elmer GmbH, 1996.
[11] R. Huber, Angewandte Chemie 101, 849–871 (1989).
[12] J. Deisenhofer, H. Michel, Angewandte Chemie 101, 872–892 (1989).

Claims

Verfahren zur Isolierung von Metall-Cofaktoren aus biologisch-organischen Systemen unter Anwendung der präparativen nativen kontinuierlichen Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PNC-PAGE), dadurch gekennzeichnet, dass ein Acrylamidgel mit einem Gesamtmonomerenanteil von 4% (w/v) eingesetzt wird, ein Elektrophoresepuffer mit einem pH-Wert von 10,00 eingesetzt wird, sowie 0,5 μl TEMED/ml Gel und 0,5 mg Ammoniumperoxodisulfat/ml Gel eingesetzt werden, wobei das Gel über einen Zeitraum von 69 Stunden auspolymerisiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass bei der elektrophoretischen Auftrennung Glycerin mit einem Volumenanteil von 10% (v/v) bezogen auf das Volumen des biologisch-organischen Systems eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass die zu isolierenden Metall-Cofaktoren vor Einsatz in der PNC-PAGE mit einer Gelpermeationschromatographie (GPC) aufgereinigt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Acrylamidgel nach dem Giessen für 60 min mit Isopropanol überschichtet wird und anschließend mit Elektrophoresepuffer gespült wird.