CN106715459B - 芋螺毒素多肽κ-CPTx-bt104、其制备方法及应用 - Google Patents

芋螺毒素多肽κ-CPTx-bt104、其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

一种芋螺毒素多肽κ‑CPTx‑bt104，其制备方法以及应用。所述芋螺毒素多肽由11个氨基酸组成，分子量为1313.47道尔顿，全序列为SLCCPEDRWCC。所述芋螺毒素多肽具有抑制钾离子通道电流作用和镇痛作用，可应用于疼痛、癫痫、中风、痉挛、肌肉松弛、帕金森病、老年痴呆症、抑郁、成瘾、心血管疾病、癌症、炎症等疾病治疗的药物开发和临床应用。

Description

芋螺毒素多肽κ-CPTx-bt104、其制备方法及应用
技术领域
本发明涉及生物化学和分子生物学技术领域，特别涉及一种芋螺毒素多肽κ-CPTx-bt104、其制备方法及应用。
背景技术
离子通道(ion channel)是细胞膜上的一类特殊亲水性蛋白质微孔道，是神经、肌肉细胞电活动的物质基础，研究发现，离子通道的功能、结构异常与许多疾病的发生和发展有关，其功能发生不同程度的减弱或增强，将导致机体整体生理功能紊乱，形成某些先天性或后天获得性疾病，主要累及神经、肌肉、心脏、肾脏等系统和器官。
离子通道主要分为三类：电压门控型、配体门控型和机械门控型，按照出入离子的类别又可分为Na+、K+、Ca2+、Cl-离子通道。钠通道均为电压门控型，功能是维持细胞膜兴奋性及其传导，钙通道分为受体调控性和电压门控两种，钾通道是选择性允许K+跨膜通过的离子通道，分为电压依赖型和配体门控型，主要功能是调节细胞的膜电位和兴奋性、平滑肌舒缩活性。开发特异性离子通道协同或拮抗药物，研究特异性离子通道亚基基因的干预治疗，对探讨某些疾病的病理生理机制、早期诊断及发现特异性治疗药物等均有十分重要的指导意义。
目前，大约有15％的药物以离子通道作为作用靶点，其中包括高血压、心律失常、癫痫、糖尿病、尿失禁、帕金森病、癌症等的治疗药物。离子通道药物主要有以下几类：钙通道药物(钙拮抗剂、通道激活剂)，钙拮抗剂一般归属于心血管类药物，如维拉帕米、硝苯地平；钠通道药物有局部麻醉药(普鲁卡因)、抗心律失常药(奎尼丁)；钾通道药物对心绞痛、心律不齐、高血压、免疫抑制及尿失禁等疾病有潜在治疗作用。综上所述，目前临床上应用的这类药物主要以化学药物为主，而化学类药物用药的毒副作用较大，相比而言多肽类药物活性高、毒性反应较小、特异性强，开发成多种离子通道类药物有广阔的应用前景。
芋螺(Cone snails)，又称“鸡心螺”，据估计，全球约有500种芋螺，主要生长于热带海域，一般多生活在暖海，在生物分类学上属于软体动物门(Mollusca)，腹足纲(Gastropoda)，前鰓亚纲(Prosobranchia)，新腹足目(Neogastropoda)，芋螺科(Conidae)，芋螺属(Conus)。我国现今发现了约100余种芋螺，主要分布在南沙群岛、西沙群岛、海南岛及台湾附近海域，少数分布在广东、广西沿海。
芋螺毒素(Conopeptide，Conotoxin，CTX)是从芋螺中获得的一类具有生物活性的多肽类毒素，主要用于麻醉猎物、捕食和防御竞争对手，研究显示，每种芋螺可能含有1000种芋螺毒素，即全世界有可能有超过50万种芋螺毒素。芋螺毒素具有下述特点：相对分子量小、富含二硫键、结构稳定、高活性、高选择性及易于合成，它们能高效性、特异性地作用于乙酰胆碱受体及其他神经递质的各种受体亚型。
同样，芋螺毒素能选择性地作用于离子通道等蛋白受体，进而影响神经传导，产生不同的生理作用。例如，ω-Conotoxin，能专一阻断电压敏感型钙离子通道，作为神经生物学探针在镇痛、神经保护、抗惊厥、镇咳等方面具有巨大的应用潜力。μ-Conotoxin，能与钠通道各种亚型特异结合，改变其功能，μ-conotoxin PIIIA异构体阻断钠通道NaV1.4，有望应用在癌症患者止痛治疗领域。κ-Conotoxin，特异性阻断电压敏感型钾离子通道，对细胞增殖有重要作用，κ-conotoxins-PVIIA，能稳定地制约一种钾通道蛋白(HERG)，具有开发成抗癌药物分子的潜力。
美国犹他大学教授B.M.Olivera的实验室是芋螺毒素研究的发源地，研究始于二十世纪七十年代。至今已分离得到的芋螺毒素有数千种，其中数十种已申请美国专利。它们在治疗慢性疼痛、癫痫、中风、痉挛、肌肉松弛、帕金森病、老年痴呆症、抑郁、成瘾、心血管疾病、癌症等疾病中发挥重要作用。目前，已有芋螺毒素多肽进入临床研究或经FDA批准作为新药使用，齐考诺肽(ziconotide)，Eisai公司研制，2004年获得美国FDA审批，2006年7月在英国上市，用于对其它治疗药物无应答或耐受不良的严重慢性疼痛患者。镇痛药MrIA(Xen2174)和CVID(AM336)分别处于临床Ⅰ/Ⅱ、Ⅱ阶段，另外有部分芋螺毒素处于临床前研究阶段，ω-Conotoxin SO3及α-Conotoxin Lt14a目前作为镇痛药在研究。
虽然目前针对芋螺毒素的研究已经取得了一些成果，但是寻找新的芋螺毒素，探索其新的作用，对于离子通道的结构和功能探讨，以及研发作用于离子通道的相关药物或其先导化合物仍然具有重要作用，对研究神经生物学也具有重要意义。
发明内容
本发明旨在寻找新的芋螺毒素对于离子通道的新作用，提供一种新型芋螺毒素多肽κ-CPTx-bt104，能够作为钾离子通道阻断剂，用于心律失常治疗、心绞痛、高血压等疾病的治疗。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种芋螺毒素多肽κ-CPTx-bt104，其中，所述芋螺毒素多肽由11个氨基酸组成，所述芋螺毒素多肽的分子量为1313.47道尔顿，所述芋螺毒素多肽的氨基酸全序列为SLCCPEDRWCC。
另一方面，本发明提供一种制备方法包括：(1)芋螺毒素多肽的提取；(2)芋螺毒素多肽的检测；(3)芋螺毒素多肽的富集；(4)芋螺毒素多肽的分离、测序以及序列选取。
优选的，所芋螺毒素多肽的提取包括：从桶形芋螺中取出毒管，置于多肽提取液中，混合离心分离，取上清液冷冻抽干。
优选的，所述多肽提取液包括30％乙腈加0.1％三氟乙酸的去离子水溶液，以及蛋白酶抑制剂。
优选的，所述芋螺毒素多肽的检测包括：将提取得到的芋螺毒素多肽用8M尿素溶液复溶，再检测所述芋螺毒素多肽的蛋白含量和分子量分布。
优选的，所述芋螺毒素多肽的富集包括：将检测后的芋螺毒素多肽进行还原烷基化处理，再经过萃取柱富集得到芋螺毒素多肽。
优选的，所述还原烷基化处理包括：加入终浓度为10mM的二硫苏糖醇，在56℃下反应1h，冷却至室温后，加入终浓度为55mM的碘代乙酰胺，在室温暗室反应45min。
优选的，所述芋螺毒素多肽的分离、测序以及序列选取包括：将富集得到的芋螺毒素多肽采用强阳离子交换高效液相色谱进行分离，再采用纳升高效液相色谱-质谱联用仪进行多肽质谱检测，根据质谱检测产生的质谱数据进行数据解析和生物信息分析，得到芋螺毒素多肽完整的氨基酸序列。
另外，本发明还提供芋螺毒素多肽在抑制钾离子通道电流作用和镇痛作用中的应用。以及芋螺毒素多肽在疼痛、癫痫、中风、痉挛、肌肉松弛、帕金森病、老年痴呆症、抑郁、成瘾、心血管疾病、癌症、炎症疾病治疗的药物中的应用。
本发明的有益效果在于：所保护的芋螺毒素多肽来源于天然活性动物资源，属于生物活性肽，与传统小分子化学药相比，更为安全、副作用更小，很少引起严重的免疫反应，且选择性高、特异性强。又因其结构简单、易于人工合成、作用于离子通道活性强的有益特点，可广泛应用于离子通道相关疾病。通过形成两对稳定二硫键组合后，实验验证其能够特异性作用于钾离子通道，具抑制钾离子通道电流，具有疼痛、癫痫、中风、痉挛、肌肉松弛、帕金森病、老年痴呆症、抑郁、成瘾、心血管疾病、癌症、炎症等疾病治疗的应用价值。
相对于已有报道的，用作钾离子通道开放剂的芋螺毒素BtX和ViTx，本发明的芋螺毒素多肽κ-CPTx-bt104，能够作为钾离子通道阻断剂，用于心律失常、心绞痛、高血压等疾病的治疗。
附图说明
图1为实施例芋螺毒素多肽Bradford蛋白浓度测定标准曲线图；
图2为实施例芋螺毒素多肽SDS-PAGE检测结果图；
图3为实施例提取得到芋螺毒素多肽的MALDI-TOF-MS检测结果图；
图4为实施例芋螺毒素多肽化学合成后MALDI-TOF-MS检测结果图；
图5为实施例芋螺毒素多肽复性后MALDI-TOF-MS检测结果图；
图6为实施例芋螺毒素多肽对钾离子通道抑制活性的膜片钳检测结果图；
图7为4-氨基吡啶对钾离子通道抑制活性的膜片钳检测结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，而不构成对本发明的限制。
一种芋螺毒素多肽κ-CPTx-bt104，其中，芋螺毒素多肽由11个氨基酸组成，分子量为1313.47道尔顿，全序列为SLCCPEDRWCC。
具体实施方式中，芋螺毒素多肽κ-CPTx-bt104的制备方法如下：
收集海南产桶形芋螺(Conus betulinus)，解剖剪取毒管，剪碎置于多肽提取液(30％乙腈(ACN)加0.1％三氟乙酸(TFA)的去离子水溶液，含蛋白酶抑制剂)中，涡旋震荡混匀后10000g 4℃离心10min取上清，冷冻抽干。
然后用8M尿素溶液复溶，用Bradford法及SDS-聚丙烯酰胺凝胶检测蛋白含量、分子量分布。
用二硫苏糖醇(DTT，56℃水浴1小时，终浓度为10mM)和碘代乙酰胺(IAM，室温暗室反应45分钟，终浓度为55mM)还原烷基化处理后，经过Strata-X C18萃取柱富集得到纯化的芋螺毒素多肽。
富集得到纯化的毒素多肽后，进一步采用强阳离子交换高效液相色谱(SCX-HPLC)分组分后采用纳升高效液相色谱-质谱联用仪(nanoLC-MS/MS)进行多肽质谱检测。产生的质谱数据经过数据解析和生物信息分析后得到芋螺毒素多肽完整的氨基酸序列。
制备得到的芋螺毒素多肽κ-CPTx-bt104，经过化学合成及复性后，测试其对钾离子通道抑制活性的作用。
具体的，芋螺毒素多肽的化学合成是采用标准氨基酸树脂化学合成方法合成其全序列。合成芋螺毒素多肽复溶后用ESI-MS(Shimadzu LCMS-2010EV)检测，C18柱纯化，用RP-HPLC(Shimazu SPD-10AVP)检测其纯度。然后用MALDI-TOF MS/MS进一步确认其分子量和序列。
芋螺毒素多肽的复性过程具体包括：将化学合成的芋螺毒素多肽一级结构进行复性，恢复其自然状态起活性作用的结构。具体复性方法为：使用复性溶液(0.1M Tris-HCl，0.1M NaCl，5mM GSH，0.5mM GSSG，PH 7.4)按质量体积比1：10溶解合成的芋螺毒素多肽，25℃反应24～48小时。复性完成后的芋螺毒素多肽用MALDI-TOF-MS进行复性效率检测。然后用Strata-X C18萃取柱进一步纯化复性后的芋螺毒素多肽。
具体的，芋螺毒素多肽的离子通道抑制活性检测包括：采用全细胞膜片钳方法检测芋螺毒素多肽对背根神经节细胞(DRG细胞)离子通道的作用。采用细胞外液为：140mMNaCl，4mM KCl，1mM MgCl2，2mM CaCl2，5mM D-葡萄糖-一水物(D-Glucose monohydrate)，10mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，pH＝7.4。细胞内液：20mM KCl，110mM K-天冬氨酸(KAspartic)，1mM MgCl2，5mM乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)，10mM HEPES,pH＝7.2。
取出恒温培养箱中的DRG细胞(从SD大鼠中急性分离培养的背根神经节细胞)，用室温下平衡好的细胞外液更换培养皿内的培养液，以防止溶液温度的剧烈变化。加细胞外液是用枪沿着皿壁轻轻加入，以防止细胞从培养皿底部脱落。将换好液的细胞放置倒置显微镜下观察，选择细胞膜较为光滑、细胞质均匀的细胞，在室温20-25℃条件下进行膜片钳实验。
选用100μl硼硅酸盐玻璃毛坯为玻璃微电极材料。经拉制仪两步拉制使电极尖端口径约为1.5-3.0μm，玻璃微电极入液后初始电阻为2-4MΩ。电极充灌安装并移入液面后即给持续正压以保证电极尖端清洁，即进行液接电位补偿。在倒置显微镜下将微电极移至所选细胞上方并接近细胞，去除正压并开始稍施负压吸引，待电极与细胞膜之间形成高阻抗的吉欧(GΩ)封接后，即进行电极快电容(fast capacitance)补偿。然后将细胞钳制在-60mV，给予一短而有力的负压，将钳制在微电极中的细胞膜迅速打破，再进行细胞慢电容(Slow capacitance)补偿。形成全细胞记录模式后将细胞钳制为-90mV，细胞稳定4-6min开始记录电流。串联电阻(Rs)在实验过程中在<10MΩ的范围之内始终保持不变，系统串联电阻(Rseries compensation)补偿在30％-70％之间。
本发明的芋螺毒素多肽来源于天然活性动物资源，属于生物活性肽，与传统小分子化学药相比，更为安全、副作用更小，很少引起严重的免疫反应，且选择性高、特异性强。又因其结构简单、易于人工合成、作用于离子通道活性强的有益特点，可广泛应用于离子通道相关疾病。通过形成两对稳定二硫键组合后，实验验证其能够特异性作用于钾离子通道，具抑制钾离子通道电流，具有疼痛、癫痫、中风、痉挛、肌肉松弛、帕金森病、老年痴呆症、抑郁、成瘾、心血管疾病、癌症、炎症等疾病治疗的应用价值。
实施例
芋螺毒素多肽κ-CPTx-bt104的具体制备步骤如下：
(1)芋螺毒素多肽的提取
将4只海南产桶形芋螺砸壳后解剖剪取毒管，ddH2O简单冲洗后放入800μl预冷的提取缓冲液(0.1％TFA，30％ACN，蛋白酶抑制剂混合物)，剪碎成小段后用镊子挤出毒液溶于提取缓冲液中，涡旋震荡，混匀，10000g 4℃离心10min，上清即为毒素提取液，冷冻抽干。
(2)芋螺毒素多肽的检测
提取得到的芋螺毒素多肽用8M尿素(于0.1M Tris-HCl,pH 8.5)复溶。采用考马斯亮蓝(Bradford)法检测芋螺毒素多肽的蛋白含量，具体为：以0.2μg/μl的牛血清蛋白(BSA)溶液为母液，配制一组梯度浓度的BSA溶液，在595nm处测定这组溶液的吸光度，得到蛋白质浓度对吸光度的一条标准曲线，测定未知蛋白质浓度样品的吸光度，根据标准曲线得到蛋白质的浓度。由标准曲线得总蛋白浓度为16.2μg/μl，总体积400μl，即蛋白总量为6.48mg，具体如图1所示。
通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶检测芋螺毒素多肽的分子量分布，具体为：配制7cm宽，1mm厚的分离胶和浓缩胶，分离胶和浓缩胶的凝胶浓度分别为12％、5％，使用Bio Rad电泳装置，电泳程序为：0-20min，80V电压进行浓缩电泳；20-70min，120V电压进行分离电泳。Marker(6-66KDa)上样量为10ug，样品上样20ug。电泳完毕后用考马斯亮蓝染色液在摇床上进行染色2小时，然后用脱色液(8％醋酸+25％乙醇水溶液)进行脱色3至凝胶背景透明。电泳结果如图2所示，从结果可看出，芋螺毒素蛋白的电泳条带清晰，无降解，且大部分为分子量偏小的多肽组分。
(3)芋螺毒素多肽的富集
取总蛋白量为500μg的芋螺毒素多肽，用8M尿素稀释至200μl后加入2μl浓度为1M的DTT(终浓度为10mM)，56℃反应1h，冷却至室温后加入20μl浓度为550mM的IAM(终浓度为55mM)室温暗室反应45min，无沉淀现象。
将上述芋螺毒素多肽用8M尿素稀释至1ml，按Strata-X C18富集标准操作规程操作，先用1ml甲醇活化柱子，再加1ml 0.1％FA使其平衡，芋螺毒素多肽样品上样1ml，缓冲液(5％ACN+0.1％FA)洗涤，重复洗涤3次，100％ACN洗脱芋螺毒素多肽。
通过MALDI-TOF-MS、Nanodrop(Thermo Scientific)检测富集的芋螺毒素多肽的分子量及浓度。MALDI-TOF-MS分子量检测范围为700～3500道尔顿，板上点样1μl，烘干后加基质(饱和CHCA)，标准品点样，烘干后检测，具体检测结果如图3中所示。
重复上述步骤，得到T1和T2两个样品，按Nanodrop 8000多肽浓度测定标准操作规程操作，A280测浓度，检测结果如表1中所示。
表1芋螺毒素多肽Nanodrop(A280)检测结果
样品 浓度(μg/μl) 体积(μl)
T1 3.049 200
T2 2.607 200
(4)芋螺毒素多肽的分离、测序以及序列选取：
240μg芋螺毒素多肽(T1和T2两个样品)经SCX-HPLC(Shimadzu)系统进行组分分离(如表2中所示)，芋螺毒素多肽用强阳离子交换缓冲液A(10mM KH2PO4在25％ACN中，pH 3.5)稀释后上柱，缓冲液B所含成分是在缓冲液A的基础上含500mM氯化钾，分离时先用0-40％的线性二元梯度的缓冲液B以每分钟1ml的流量分离10分钟，浓度40-90％的缓冲液B反应2分钟，浓度90％的缓冲液B持续3分钟，在214nm进行吸光度检测，通过梯度洗脱共收集10个馏分。收集的馏分用SCANVAC浓缩仪进行干燥，0.1％的甲酸复溶，C18固相萃取柱除盐(Strata-X,Phenomenex)，除盐后的芋螺毒素多肽干燥浓缩后用30μl的0.1％的甲酸复溶，进行nanoLC-MS/MS分析。
表2芋螺毒素多肽样品分离的上样量
样品 浓度(μg/μl) 注入量(μg) 注入体积(μl)
T1 3.049 240 80
T2 2.607 240 92
nanoLC-MS/MS分析具体包括：采用岛津的nano HPLC色谱仪系统和AB Sciex的Triple TOF 5600质谱仪系统。每个预分离好的芋螺毒素多肽组分分别经过自制的12cm长，75μm内径，填充了粒径3μm孔径120A的Welch Materials品牌XB-C18柱料的Ultimate毛细管分析柱分离，流速为300nl/min。检测进样体积为25μl，洗脱梯度为B液浓度从5％均匀上升到45％经过40min。质谱采集的电喷雾电压为2.5kV，辅气气压为30PSI，鞘气气压为15PSI，源温度为150℃。一级质谱的采集使用大于或等于30000的高分辨率模式。二级质谱的采集，选择母离子价态在2电荷到5电荷的范围，扫描一次一级质谱后可接着连续做30个二级质谱碎裂，这样在250ms内完成对30个二级谱子离子的扫描，每秒可产生超过120张二级谱，总的一个循环时间为3.3秒。
将nanoLC-MS/MS检测得到的原始质谱数据进行格式转换成MGF后再用Mascot搜索软件进行数据搜索鉴定。得到的多肽序列中，通过序列特征分析选取全长氨基酸序列为SLCCPEDRWCC的芋螺毒素多肽κ-CPTx-bt104。
制备得到的芋螺毒素多肽κ-CPTx-bt104，经过化学合成及复性后，测试其对钾离子通道抑制活性的作用。
芋螺毒素多肽的化学合成包括：得到全长氨基酸序列为SLCCPEDRWCC的芋螺毒素多肽κ-CPTx-bt104后，采用标准氨基酸树脂化学合成方法合成其全序列(由上海吉尔生化合成公司定制完成)，合成后的芋螺毒素多肽使用MALDI-TOF MS进行分子量确定，具体如图4所示。
芋螺毒素多肽的复性包括：对化学合成后的芋螺毒素多肽一级结构进行复性，恢复其自然状态起活性作用的结构。具体复性方法为：使用复性溶液(0.1M Tris-HCl，0.1MNaCl，5mM GSH，0.5mM GSSG，PH为7.4)按质量体积比1：10溶解合成的多肽，25℃反应24～48小时。
复性完成后的芋螺毒素多肽用MALDI-TOF-MS进行复性效率检测，检索结果如图5中所示。然后用Strata-X C18萃取柱进一步纯化复性后的芋螺毒素多肽。
多肽膜片钳离子通道抑制活性检测包括：取复性后的合成的芋螺毒素多肽，配制成终浓度为10μM的溶液进行全细胞膜片钳方法检测，检索芋螺毒素多肽κ-CPTx-bt104对DRG神经元离子通道的作用，同时，以4-氨基吡啶(4A P)为阳性对照，同样检测其对DRG神经元离子通道的作用。芋螺毒素多肽κ-CPTx-bt104的检测结果如图6中所示，4AP的检测结果如图7中所示，其中，对照曲线为加样前记录的DRG细胞钾通道电流，作为阴性对照。表3为κ-CPTx-bt104对钾离子通道电流抑制率的膜片钳检测结果，可以看到，10μM的κ-CPTx-bt104对DRG神经元细胞钾离子通道电流的抑制率为0.249。
表3钾离子通道电流抑制率的膜片钳检测结果
Figure GDA0002557057920000121
以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所作出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。
序 列 表
<110> 深圳华大基因科技有限公司
BGI SHENZHEN CO., LIMITED
<120> 芋螺毒素多肽κ-CPTx-btl04、其制备方法及应用
<160> 1
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 桶形芋螺（Conus betulinus）
<400>
SLCCPEDRWCC 11

Claims (9)

1.一种芋螺毒素多肽κ-CPTx-bt104，其特征在于，所述芋螺毒素多肽由11个氨基酸组成，所述芋螺毒素多肽的分子量为1313.47道尔顿，所述芋螺毒素多肽的氨基酸全序列为SLCCPEDRWCC。
2.权利要求1所述的芋螺毒素多肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：(1)芋螺毒素多肽的提取；(2)芋螺毒素多肽的检测；(3)芋螺毒素多肽的富集；(4)芋螺毒素多肽的分离、测序以及序列选取。
3.根据权利要求2所述的芋螺毒素多肽的制备方法，其特征在于，所芋螺毒素多肽的提取包括：从桶形芋螺中取出毒管，置于多肽提取液中，混合离心分离，取上清液冷冻抽干。
4.根据权利要求3所述的芋螺毒素多肽的制备方法，其特征在于，所述多肽提取液包括30％乙腈加0.1％三氟乙酸的去离子水溶液，以及蛋白酶抑制剂。
5.根据权利要求2所述的芋螺毒素多肽的制备方法，其特征在于，所述芋螺毒素多肽的检测包括：将提取得到的芋螺毒素多肽用8M尿素溶液复溶，再检测所芋螺毒素多肽的蛋白含量和分子量分布。
6.根据权利要求2所述的芋螺毒素多肽的制备方法，其特征在于，所述芋螺毒素多肽的富集包括：将检测后的芋螺毒素多肽进行还原烷基化处理，再经过萃取柱富集得到芋螺毒素多肽。
7.根据权利要求6所述的芋螺毒素多肽的制备方法，其特征在于，所述还原烷基化处理包括：加入终浓度为10mM的二硫苏糖醇，在56℃下反应1h，冷却至室温后，加入终浓度为55mM的碘代乙酰胺，在室温暗室反应45min。
8.根据权利要求2所述的芋螺毒素多肽的制备方法，其特征在于，所述芋螺毒素多肽的分离、测序以及序列选取包括：将富集得到的芋螺毒素多肽采用强阳离子交换高效液相色谱进行分离，再采用纳升高效液相色谱-质谱联用仪进行多肽质谱检测，根据质谱检测产生的质谱数据进行数据解析和生物信息分析，得到芋螺毒素多肽完整的氨基酸序列。
9.权利要求1所述的芋螺毒素多肽在制备钾离子通道阻断剂中的应用。
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