DD245904A1 - Selektionsverfahren fuer effektoren des pflanzlichen stickstoffhaushaltes - Google Patents

Abstract

Die Erfindung "Selektionsverfahren fuer Effektoren von Stickstoffreduktions-Metabolismen" dient der Suche nach Pflanzenschutzmittel mit spezifischem Wirkspektrum auf den Stickstoffhaushalt und der Charakterisierung von Effektoren biologischer Prozesse. Sie verfolgt das Ziel, moeglichst in einem Arbeitsgang die Ergebnisse von Tests zur substanzinitiierten Beeinflussung von Stickstoffreduktions-Metabolismen autotropher Algensuspensionen in mindestens zwei Variationen hinsichtlich der Oxydationsstufe des Stickstoffs der genutzten Stickstoffquelle der Naehrloesung der Algen auszuwerten und dabei primaere Effektoren der Reduktion des Nitrat- bzw. Nitritstickstoffs oder unspezifische Effektoren des Stickstoffhaushalts zu differenzieren und zu charakterisieren. Die Erfindung basiert auf einem Auswertungsverfahren, das die wachstums- und entwicklungsbedingten Beeinflussungen der Ionenumsaetze substanzbehandelter Zellsuspensionen in mindestens zwei Suspensionskulturvariationen bezueglich der Stickstoffquelle bei sonst vergleichbaren Bedingungen nutzt. Die Fig. 2, A3 und A4 illustrieren, dass das Auswertungsverfahren darueber hinaus Informationen ueber Einsetzen, Verlauf, Bestaendigkeit und Richtung der Wirkungsauspraegung in Abhaengigkeit von der Dosis der Effektoren liefert.

Description

Hierzu 2 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Pflanzenschutzmittelforschung, Umweltschutz, Suche nach Regulatoren biologischer Prozesse

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bekannt, daß Stickstoff neben anderen Elementen zu den Hauptnährstoffen pflanzlicher Organismen gehört. Er wird zur •Synthese von Aminosäuren, Eiweißen, Purin- und Pyrimidinbasen, Aminen und anderen organischen Bestandteilen von Lebewesen unbedingt benötigt. Stickstoffautotrophe pflanzliche Organismen verwenden anorganische Stickstoffquellen als Ausgangsmaterial. Die hauptsächlichste Stickstoffquelle bilden Nitrate. Es können aber in der Regel auch Nitrite, Ammoniumsalze und andere Stickstoffverbindungen verarbeitet werden.

Die entscheidenden Schritte des pflanzlichen Stickstoffhaushaltes sind die Reduktion des aufgenommenen Nitrates zu Nitrit und weiterhin zu wasserstoffhaltigen Zwischenprodukten bis zur Oxydationsstufe N⁺³ in Ammoniumverbindungen und die Bindung der letzteren an organische Akzeptoren sowie die sich daran anschließende Synthese von stickstoffhaltiger Mono- und Polymeren wie Aminosäuren und Eiweißen.

Untersuchungen der Frage, welche Seite des pflanzlichen Stickstoffhaushaltes durch Wirkstoffe beeinflußt wird, sind an in vivo-Material bisher nicht möglich. Grundsätzlich muß ein Zellaufschluß sowie eine Reihe von zeit- und arbeitsaufwendigen Reinigungsprozeduren erfolgen, ehe die Tangierung der Aktivität von Schlüsselenzymen wie z. B. Nitratreduktase und der Zunahme von stickstoffhaltigen Bestandteilen der Lebewesen erfaßt werden.

Immer müssen auch mindestens 2 Verfahren zum Einsatz kommen, die die Beeinflussung beider Seiten des, Stoffwechselprozesses signalisieren können.

Neben verschiedenen enzymatischen Untersuchungen werden Verfahren zur Eiweißbestimmung wie teilautomatisierte chromatographische Verfahren und Methoden zur Stickstoffbestimmung nach der Kjeldahltechnik praktisch genutzt. Auch hier liegen die hauptsächlichsten Nachteile im hohen Material-, Personal- und Zeitaufwand sowie in den zum Teil erheblichen apparativen Kosten.

Nutzt man Mikroalgensuspensionen als Indikator von Wirkungen, so können nach dem Verfahren DD 220047 mittels Wachstums- und lonenumsatzanalysen autotropher Algensuspensionen primäre Photosyntheseeffektoren von primären Effektoren des Stickstoffhaushaltes in einem Arbeitsgang getrennt werden. Eine wünschenswerte Differenzierung von Effektoren, die die verschiedenen Stickstoffreduktions-Metabolismen spezifisch oder unspezifisch tangieren, erlaubt dieses Verfahren nicht.

Auch die Selektionsverfahren für Effektoren DD 94234, DD 200472, DD 211126, DD 212985, DD 213949, DD 213950, DD 214146, DD 216253 und DD 216254 sind nicht in der Lage, primäre Beeinflussungen des Stickstoffhaushaltes im gewünschten Sinne anzuzeigen.

Wirkstoffe, die den Stickstoffhaushalt von Pflanzen tangieren, gewinnen in der landwirtschaftlichen Praxis ständig an Bedeutung.

Sie können die erste, die zweite bzw. beide Reduktionsstufen des Nitratstickstoffmetabolismus beeinträchtigen. Diese Tatsachen führen zur Forderung nach geeigneten Selektionsverfahren für Phytoeffektoren, die nicht nur eine Beeinflussung des Stickstoffhaushaltes als Ganzes unmittelbar anzeigen, sondern auch hinsichtlich der Beeinträchtigung der wesentlichsten Reduktionsstufen innerhalb des Stickstoffmetabolismus zu differenzieren vermögen und sowohl bei der Suche nach neuen Wirkstoffen als auch bei der Aufklärung der Wirkungsmechanismen bekannter Effektoren zum Einsatz kommen können.

Ziel der Erfindung .

Die Erfindung verfolgt das Ziel, ein auf in vivo-Tests an autotrophen Suspensionskulturen einzelliger Mikroalgen beruhendes-Selektionsverfahren vorzuschlagen, das sowohl die unmittelbare Beeinflussung des pflanzlichen Stickstoffhaushaltes anzuzeigen vermag, als auch die Differenzierung und Selektion der Effektoren als primäre.Effektoren der Reduktion des Nitratbzw, des Nitritstickstoffs oder als unspezifische Effektoren des Stickstoffhaushaltes in möglichst einem Arbeitsgang gestattet und damit den Eingriffsort der Noxen genauer charakterisiert.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Aufgabe wird.erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß beim „Selektionsverfahren für Effektoren des pflanzlichen Stickstoffhaushaltes" die teils unterschiedlich substanzinitiierten Beeinflussungen der lonenumsätze des durch Nitrat- bzw. durch Nitritionen und durch Ammoniumionen determinierten Wachstums einzelliger Algensuspensionen analysiert und vergleichend betrachtet werden. Das Auswertungsverfahren liefert darüber hinaus Informationen über Einsetzen, Verlauf und Beständigkeit der Wirkungsausprägung in Abhängigkeit von der Dosis und von der Einwirkungsdauer der Effektoren hinsichtlich der Beeinflussung der lonenumsätze.

Beim „Selektionsverfahren für Effektoren des pflanzlichen Stickstoffhaushaltes" werden zunächst frisch geerntete Autosporen von Mikroalgen so in unterschiedlichen Nährlösungen einmal mit Nitrationen bzw. Nitritionen und zum anderen mit Ammoniumionen als Stickstoffquelle suspendiert, daß beide, gegebenenfalls alle drei Suspensionskulturen die gleiche Autosporendichte aufweisen. Anteile dieser autotrophen Zellsuspensionen einzelliger Grünalgen werden dann als Proben mit definierten Mengen chemischer Verbindungen in unmittelbaren Kontakt gebracht und parallel mit unbehandelten Vergleichskulturen bei einheitlicherTemperaturzwischen 20°C und 38 °C im Licht belüftet, so daß sie auf der Grundlage des sich vollziehenden Photosyntheseprozesses wachsen und sich entwickeln.

Kontinuierlich oder zu festgelegten Zeitpunkten werden dann Proben und Vergleichskulturen oder Anteile von beiden parallel oder in definierter Folge durch Analyse der lonenumsätze mittels pH-Elektroden, nitrat-, nitrit- und ammoniumionensensitiven Elektroden bzw. gegebenenfalls anderen stickstoffionensensitiven Elektroden, polarographischen Methoden, konduktometrischen oder anderen elektrochemischen Verfahren bzw. spektralanalytischen Methoden untersucht und die dabei gewonnenen Ergebnisse vergleichenden Betrachtungen unterzogen.

Ausführungsbeispiele

"Frisch geschlüpfte Aplanosporen synchroner Kulturen einzelliger Grünalgen der Species Chlorella vulgaris var. vulgaris, Stamm BÖHM und BORNS 1972/1, werden in eine anorganische Nährlösung mit Fe-EDTÄ-Komplex und Spurenstoffen so überführt, daß jeder Kubikzentimeter der Suspension etwa sechs Millionen Algenzellen enthält. 1 Liter der Kultur-Nährlösung N setzt sich dabei aus den drei Teilnährlösungen N-i, N₂ und N₃ zusammen;

1 000cm³ N = 998cm³ N₁ + 1 cm³ N₂ + 1 cm³ N₃.

Die Nährlösungen N₁, N₂ und N₃ enthalten folgende Substanzen: Nährlösung N₁ für die Testvariante mit Nitrationen als Stickstoffquelle

Für die Nährlösung N-i werden zunächst die Stammlösungen 1 bis 4 durch Auffüllen der genannten Substanzmengen mit Aqua dest. hergestellt:

Stämmlösung 1: 100g KNO₃/1 000cm³

Stammlösung 2: 25g CaCI₂ · 6H₂O/1 000cm³

Stammlösung 3: 250g MgSO₄ · 7H₂O/1 000cm³

Stammlösung 4: 160g KH₂PO₄/1 000cm³

Nährlösung N₁ für die Testvariante mit Ammoniumionen als Stickstoffquelle

Stammlösung 1: 120g NH₄H₂PO₄, 260g Na₂HPO₄/1 000cm³

Stammlösung 2: 25g CaCI₂ · 6H₂OZIOOOCm³

Stammlösung 3: 250g MgSO₄ · 7H₂O/1 000cm³

Stammlösung 4: 160g KH₂PO₄/1 000cm³

Diese Stammlösungen sind zu sterilisieren (Feuchtsterilisation) und kühl zu lagern.

Aus je 5cm³ der Stammlösung 1,0,5cm³ der Stammlösung 2,1 cm³ der Stammlösung 3 und 5cm³ der Stammlösung 4 werden durch Auffüllen mit destilliertem Wasser entweder 1000cm³ bzw. bei Beachtung der Verhältnisse eine beliebige Menge der Nährlösung N₁ hergestellt.

Nährlösung N₂

Die Nährlösung N₂ enthält in 1 000cm³ Lösung 61 mg H₃BO₃,169mg MnSO₄ · H₂O, 287mg ZnSO₄ 7H₂O, 2,5mg CuSO₄ · 5H₂O und 12,4mg (NH₄J₂ MoO₄.

Nährlösung N₃

Zur Herstellung der Nährlösung N₃ werden 6,9g FeSO₄ · 7 H₂O und 9,3 g Na-EDTA in destilliertem Wasser gelöst und auf 1 000cm³ mit Aqua dest. aufgefüllt.

Je 80cm³ der so hergestellten Suspension werden in je eine Kulturröhre eingebracht, mit je 1 cm³ verschieden konzentrierter Lösung der zu prüfenden Substanzen A und B beimpft oder als nur mit dem Lösungsmittel behandelte Kontrollen bei 37°C belichtet und mit gereinigter Luft, der 2 Vol.-% Kohlendioxid beigegeben werden, belüftet, so daß alle erforderlichen Voraussetzungen für die Photosynthese gegeben sind.

Während die in den zwei Nährlösungen mit unterschiedlicher Stickstoffquelle suspendierten Zellen in den unbehandelten Vergleichskulturen normal und vergleichbar wachsen und sich entwickeln, werden Wachstum und lonenumsatzin den mit

Chemikalien versetzten Proben mehr oder weniger be.einflußt, wenn verschiedene Substanzkonzentrationen den Photosyntheseprozeß bzw. den Stickstoffhaushalt mehr oder weniger stören. In definierter Zeitfolge werden von den Vergleichskulturen und den mit der Substanz A behandelten Proben der pH-Wert, dessen Änderung als Maß für den Stickstoffhaushalt anzusehen ist, gemessen.

Die Ergebnisse der Analysen sind den Fig.! und 2 zu entnehmen. FJg₁I₇A₁ enthält die pH-Werte für die u η behandelten Kontrollen K bzw. K' und die mit abgestuft zunehmenden Konzentrationen der Substanz Aversetzten Proben 1 (V) bis 5 (5'), die von der

nullten Stunde bis zur sechsten Stunde alle 60 Minuten gemessen wurden. Die pH-t-Kurven ( ) V bis 5'wurden für die

dosisabhängige Beeinflussung des lonenumsatzes der Zellen in Suspensionskultur mit Nitrationen als Stickstoffquelle und

entsprechend die pH-t-Kurven ( ) 1 bis 5 für die Beeinflussung.der lonenumsätze in Suspensionskultur mit Ammoniumionen

als Stickstoffquelle durch den Effektor A gefunden. Ein Vergleich der parallel in einem Arbeitsgang unter vergleichbaren Bedingungen gewonnenen Wirkeffekt-Zeit-Kurven in Fig. 1, A₁ zeigt deutliche Unterschiede der Wirkung des Effektors A auf die lonenumsätze der Algensuspensionen in beiden Testvarianten. Die Richtung der pH-Wert-Änderung in den beiden Suspensionskulturvarianten wird durch die Stickstoffquelle determiniert. Da eine Nitrationenaufnahme in die Zelle mit einer äquivalenten Hydroxydionenemission verbunden ist, nimmt hier der pH-Wert der Suspension zu. Demgegenüber ist eine Ammoniumionenaufnahme mit einer äquivalenten Protonenabgabe gekoppelt, so daß in dieser Testvariante der pH-Wert abnehmen muß. Beide Effekte sind in Fig. 1, A-, anschaulich wiedergegeben. Darüber hinaus wird durch Vergleich in Fig. 1,A₁ bereits deutlich, daß der in der Nitrationenkultur zu beobachtende lonenumsatz deutlich stärker gehemmt wird als in Ammoniumionenkultur. Dieses differenzierte Verhalten des Effektors A kann auch in Form von Wirkquantitäts (A/pH/)-Zeit-Kurven veranschaulicht werden, Fig. 1, A₂, wobei die Wirkquantität gemäß

Δ/ρΗ/ = /pH/Kontrolle—/pH/probe

bestimmt werden kann.

Einen Eindruck über Qualität und Quantität der Wirkeffekte vermitteln die Fig. 2, A₃ und Fig. 2, A₄. Die Fig. 2, A₃ zeigt eine gegenseitige Auftragung der indirekten Wachstumsparameter pH aus den beiden Testvarianten. Während bei dieser Auftragung für die Kontrolle die annähernde Gerade K mit einem typischen Anstieg gefunden wird, erhält man bei gleicher Auftragung für die wirkstoffbehandelten Proben die Kurven 1 bis 5, die auf mehrere Metabolismen hinweisen. Typisch für den Effektor A ist, daß der lonenumsatz in Suspensionskultur mit Nitrationen als Stickstoffquelle dosisabhängig stärker gemindert wird als in Suspensionskultur mit Ammoniumionen als Stickstoffquelle. Daraus kann geschlußfolgert werden, daß es sich beim Effektor A um einen typischen Hemmer der Nitratstickstoffreduktions-Metabolismen handelt.

Für den Wirkstoff B, mit dem wie beim Effektor A verfahren wurde, konnte bei einer entsprechenden Auftragung der Wachstumsparameter gemäß Fig. 2, A₃ nur die Gerade B, die mit der Kurve für die Kontrollen identisch ist, gefunden werden. Das weist darauf hin, daß im Gegensatz zum Wirkstoff A der Effektor B nur ein unspezifischer Hemmer des Stickstoffhaushaltes ist. Zu gleichen Schlußfolgerungen führt eine gegenseitige Auftragung der Hemmquantitäten A/pH/ aus beiden Testvarianten, Fig. 2, A₄. Auch hier wurde erwartungsgemäß für den unspezifischen Hemmer des Stickstoffhaushaltes B die Gerade B gefunden. Demgegenüber weisen die Kurvenläufe insbesondere auch für die geringen Dosen 1 und 2 bei typischer Konzentrationsabhängigkeit in den ersten Abschnitten der Kurven auf eine relativ stärkere Hemmung in Nitrationenkultur. Die zweiten Teile der Kurven illustrieren dann Metabolismen, die durch zunehmende Verringerung der Beeinflussung der lonenumsätzein Nitrationenkultur vergleichsweise zu den entsprechenden Umsätzen in Ammoniumionenkultur'gekennzeichnet sind. Für die Wirkstoffcharakterisierung ist die übergeordnete Kurve A in Fig. 2, A₄ bedeutsam, da sie relativiert für den Bereich von 0 bis 1 in einer bestimmten Standardwirkzeit und unter streng standardisierten Bedingungen als quantitatives Maß der spezifischen Wirkung von Effektoren herangezogen werden kann.

Vergleicht man die Aussagen der Figuren 1 und 2 für die Substanzen A und B miteinander, so wird deutlich, daß die Auswertung solcher parallel durchgeführten Tests mit unterschiedlichen Stickstoffquellen in den Suspensionskulturen zu sehr differenzierten Aussagen hinsichtlich der Wirkung von Effektoren auf die Stickstoffreduktions-Metabolismen führen kann. Besonders deutlich zeigen sich diesbezüglich Unterschiede bei Korrelationen der relativen Wachstums- bzw. lonenumsatzparameter pH und Δ/ρΗ/ für die Beeinflussung der Stickstoffhaushalte der Suspensionskulturen in den Testvarianten mit Stickstoffquellen, deren Stickstoff unterschiedliche Oxydationsstufen wie N"⁵ und N⁺³ aufweist, zueinander.

Durch Vergleich entsprechender Wirkbilder von neu untersuchten Substanzen, über deren spezifische herbizide Wirksamkeit bisher nichts oder wenig bekannt ist, mit einer Wirkbildkartei gemäß den Figuren 1 und 2 oder mit Hilfe der elektronischen Datenverarbeitung, die beide entsprechende Daten zu Wirkqualitäten und Wirkquantitäten von gut untersuchten, auch kommerziell vertriebenen Herbiziden oder Standardherbiziden speichern, erhält man konkrete Hinweise über ähnliche Wirkspezifika, Wirkmechanismen, Selektivität und Anwendungsmöglichkeiten solcher Effektoren.

Claims (4)

1. Erfindungsanspruch:

   1. Verfahren zur Selektion für Effektoren des pflanzlichen Stickstoffhaushaltes, dadurch gekennzeichnet, daß die teils unterschiedlich substanzinitiierten Beeinflussungen der lonenumsätze.von Mikroalgensuspensionen in mindestens zwei Testvarianten, bei denen das autotrophe Wachstum von Mikroalgensuspensionen durch Stickstoffquellen mit unterschiedlicher Oxydationsstufe des Stickstoffs determiniert wird, unter vergleichbaren Bedingungen analysiert werden, um mittels Vergleich dersubstanzinitiierten Variationen der lonenumsätze während des Wachstums der Algensuspensionen die Effektoren in möglichst einem Arbeitsgang nach ihrer Wirkspezifik hinsichtlich der Beeinflussung der Stickstoffreduktions-Metabolismen in primäre Effektoren der Reduktion des Nitrat- bzw. Nitritstickstoffs oder als unspezifische Effektoren des Stickstoffhaushaltes differenzieren und charakterisieren zu können.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß als autotrophe Zellsuspensionen alle suspendierbaren autotrophen einzelligen Algen verwendet werden können.
3. 3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der lonenumsatz der Algensuspensionen mittels pH-Elektroden, nitrat-,' nitrit- und ammoniumionensensitiven Elektroden oder anderen ionensensitiven Elektroden, polarographischen Methoden oder anderen elektrochemischen Verfahren, spektralanalytischen Methoden oder durch Kombination mehrerer dieser Methoden analysiert wird.
4. 4. Verfahren nach Punkt 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die lonenumsätze der verschiedenen Proben in einem Arbeitsgang kontinuierlich oder in definierter Zeitfolge parallel oder simultan analysiert werden.