DE4420093C2 - Verfahren zum schnellen Nachweis von herbiziden Wirkstoffen im Wasser - Google Patents
Verfahren zum schnellen Nachweis von herbiziden Wirkstoffen im WasserInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum schnellen Nachweis
von herbiziden Wirkstoffen im Wasser unter Verwendung von
Chloroplastenthylakoiden.
Pflanzenschutzmittel werden in der Landwirtschaft zur
Ertragssicherung und -steigerung eingesetzt. Auch auf
Gleisanlagen, an Wegen, in Baumschulen und Forstanlagen
sowie in Kleingärten kommen Pflanzenschutzmittel, insbeson
dere Herbizide, zur Anwendung. Mit dem Regen- und Draina
gewasser sowie durch Oberflächenabfluß gelangen sie in die
Oberflächengewässer, über das Sickerwasser wird auch das
Grundwasser mit Pflanzenschutzmitteln kontaminiert
Erst in den letzten Jahren wurde erkannt, daß viele Pflan
zenschutzmittel beim Menschen schon in sehr geringer Kon
zentration neuropatologische Störungen hervorrufen können.
Deshalb fordert die Trinkwasserverordnung von 1989, daß der
Gehalt an Pflanzenbehandlungs- und Schädlingsbekämpfungs
mitteln im Trinkwasser 0,1 µg/l für je einen Wirkstoff und
0,5 µg/l für die gesamten Wirkstoffe einschließlich ihrer
toxischen Abbauprodukte nicht überschreitet. Der Nachweis
von Pflanzenschutzmitteln mittels chemisch-analytischer
Methoden erweist sich angesichts der großen Zahl nachzu
weisender Wirkstoffe und ihrer zum größten Teil unbekannten
Metabolite als aufwendig und teuer.
Hier können Biotests wertvolle Dienste leisten, bei denen
die Wirkung von Schadstoffen auflebende Organismen oder
andere biologische Einheiten gemessen wird. Bei Fischen,
Muscheln und Daphnien beruht die Testmethode auf der Beob
achtung, daß sich das Verhalten des ganzen Organismus bei
Zugabe von Schadstoffen zum Wasser ändert. Jedoch sind
diese Tests besonders schwer zu standardisieren und können
zum Nachweis von niedrigen Schadstoffkonzentrationen im
Bereich des Trinkwassergrenzwertes nicht eingesetzt werden.
Beim Bakterientoximeter wird die Hemmung der Atmungsakti
vität von gewässertypischen Pseudomonaden durch Schadstoffe
in einer Meßzelle anhand des Sauerstoffverbrauchs gemessen.
Diese Methode erfaßt vor allem Atmungsgifte, unter denen
nur wenige Herbizidwirkstoffe repräsentiert sind. Bei ande
ren Bakterien (z. B. Leuchtbakterien, Cyanobakterien) und
bei Algen wird die Hemmung der Bioluminiszenz bzw. der pho
tosynthetischen Aktivität zum Nachweis von Schadstoffen
eingesetzt.
Zum Nachweis von Triazin-Herbiziden im Wasser wurden
immunochemische Methoden entwickelt, die eine hohe
Empfindlichkeit aufweisen. Damit können Herbizid-Konzen
trationen unter 0,1 µg/l nachgewiesen werden, jedoch ist
die Zahl der nachweisbaren Herbizide auf jeweils einen oder
wenige verwandte Stoffe beschränkt.
Derzeit gehören mehr als die Hälfte der in der Land
wirtschaft eingesetzten Herbizide zu der Klasse der soge
nannten Elektronentransportinhibitoren, deren primäre
Wirkung auf der Hemmung des photosynthetischen Elektronen
transports im Bereich des Photosystems II beruht. Die in
den Photosystemen eingefangene Lichtenergie kann daher
nicht zur Bildung von ATP und Reduktionsäquivalenten ver
wendet werden und wird zum Teil als Fluoreszenz freige
setzt. Ein anderer Teil jedoch bewirkt die Bildung von
Sauerstoffradikalen, die eine Zerstörung der Membranen und
damit eine Dekompartimentierung der Zelle verursachen.
Es gibt Bestrebungen zur Entwicklung von Testsystemen, die
dieses breite Spektrum von chemisch sehr unterschiedlichen
Substanzen mit größtmöglicher Empfindlichkeit nachweisen
können. Dazu gehört der Protoplastenbiotest, bei dem die
durch herbizide Wirkstoffe bedingte Hemmung der Nettophoto
syntheserate an immobilisierten oder suspendierten Pro
toplasten gemessen wird. Damit können verschiedene herbi
zide Wirkstoffe im Bereich um 5 µg/l nachgewiesen werden.
Bei einer anderen Testmethode unter Verwendung von Chlo
roplasten reagieren diese auf herbizide Wirkstoffe mit
einer Hemmung des photosynthetischen Elektronentransportes,
was sich in einer Minderung der Sauerstoffproduktion
niederschlägt und so gemessen werden kann. Die als
Elektronenakzeptorsystem eingesetzten Substanzen
(K₃[Fe(CN)₆] und DCPIP) sind allerdings giftig. Außerdem
wird hier die von der Trinkwasserverordnung gefordete
Empfindlichkeit ohne Anreicherung der Proben nicht
erreicht.
Zur Schnellbestimmung von Schadstoffen in Gewässern ist aus
DE 34 12 023 A1 ein Verfahren bekannt, bei dem als Biomate
rial Thylakoide von unter standardisierten Bedingungen ge
zogenen höheren Pflanzen verwendet werden. Thylakoide sind
aus Proteinen und Lipiden zusammengesetzte Biomembranen, in
denen die an der Photosynthese beteiligten Pigmente, Pro
teinkomplexe und Enzyme eingebettet bzw. angelagert sind.
Sie enthalten die Elemente des photosynthetischen Elektro
nentransports, der sich als einer der wichtigsten Angriffs
orte für Herbizide erwiesen hat.
In dem Verfahren nach dem Stand der Technik werden die
Thylakoidmembranen durch Aufschluß der Chloroplasten aus
höheren Pflanzen isoliert. Dabei werden das in den Chlo
roplasten vorhandene NADP, Ferredoxin und die NADP-Ferre
doxin-Oxidoreduktase, welche beim photosynthetischen Elek
tronentransport als Elektronenakzeptor dienen, ausge
waschen. Das System enthält somit keinen Elektronenakzeptor
mehr. Die Elektronen können dann nur auf elementaren
Sauerstoff übertragen werden: Es läuft die sogenannte
Mehler-Reaktion ab, bei der schwacher Sauerstoffverbrauch
mit Wasserproduktion festgestellt wird.
Diese Reaktion ist zur Erfassung von Photosystem II-Herbi
ziden nicht geeignet, da kein Mediator/Akzeptor zum Elek
tronentransport zur Verfügung steht. Der Sauerstoff
verbrauch durch die Mehler-Reaktion ist dann zu gering, um
bei der Messung der Hemmung durch herbizide Wirkstoffe
reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Eine Rekonstitution
der Elektronentransportkette durch Zugabe von Ferredoxin,
Reduktase und NADP kommt aus Kostengründen nicht in Frage.
Auch sollte die Verwendung von toxischen Substanzen (z. B.
K₃[Fe(CN)]₆ oder DCPIP) vermieden werden.
Bei keiner der genannten Methoden können ohne Anreicherung
der Proben Konzentrationen der herbiziden Wirkstoffe unter
0,5 µg/l nachgewiesen werden. Lediglich die auf dem Einsatz
von Antikörpern beruhenden Biosensoren können diesen
Konzentrationsbereich erfassen, sie sind jedoch keine
Wirkungstests und können jeweils nur für eine bestimmte
Gruppe von chemisch eng verwandten Substanzen angewendet
werden.
Hier kommt die vorliegende Erfindung zum Einsatz. Es ist
Aufgabe dieser Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen,
das unter Verwendung von Chloroplastenthylakoiden einen
schnellen Nachweis von herbiziden Wirkstoffen im Konzen
trationsbereich des Trinkwassergrenzwertes ermöglicht.
Zur Lösung dieser Aufgabe schlägt die Erfindung ausgehend
vom Verfahren der oben genannten Art vor, daß anstelle des
bei der Isolierung der Chloroplastenthylakoiden aus dem
photosynthetischen Elektronentransportsystem ausgewaschenen
Elektronenakzeptors ein Mediator eingesetzt wird, und die
Wirkung des herbiziden Wirkstoffes auf den Elektronen
transport bestimmt wird.
Flavinnukleotide sind zur Aufnahme und Übertragung von
Wasserstoff fähig, was hier auch als Aufnahme und Übertra
gung von Elektronen unter Beteiligung von Wasserstoffionen
verstanden werden kann. Flavin-Mononukleotid (FMN) ist ein
physiologischer Stoff, der z. B. in dem als Ferredoxin-
NADP⁺-Oxidoreduktase fungierenden Flavoprotein in vielen
Fällen als prosthetische Gruppe vorkommt und als solche
zwischen dem reduzierten und oxidierten Zustand wechseln
kann. FMN stellt ein Redoxsystem mit einem Redoxpotential
dar, das dem des in der Elektronentransportkette vorhande
nen und bei der Isolierung ausgewaschenen Ferredoxins sehr
ähnlich ist. Dadurch ist FMN in der Lage, an die Stelle des
Ferredoxins zu treten und bei gleichzeitiger Aufnahme von
Wasserstoffionen Elektronen vom Photosystem I zu überneh
men. Flavin-Mononukleotid funktioniert also als Mediator.
FMNH₂ ist nicht stabil und wird sofort unter Sauerstoffver
brauch wieder oxidiert. Der Mediator wird also nicht ver
braucht, wie es bei K₃[Fe(CN)₆] oder DCPIP der Fall ist,
sondern regeneriert sich und kann neue Elektronen aufneh
men.
Ein weiterer Vorteil des Verfahrens gemäß der vorliegenden
Erfindung liegt darin, daß bei Benutzung von FMN die Elek
tronen die gesamte Elektronentransportkette entlanglaufen.
FMN übernimmt die Elektronen ausschließlich vom Akzeptor
des Photosystems I, während DCPIP und K₃[Fe(CN)₆] bei Chlo
roplastenfragmenten nicht Photosystem-I-spezifisch wirken,
sondern auch Elektronen vom Akzeptor des Photosystems II
übernehmen. Bei Benutzung von DCPIP und K₃[Fe(CN)₆] wird die
Hemmung der Elektronentransportkette durch Herbizide
teilweise umgegangen, da deren Wirkungsort unterhalb des
Photosystems II liegt. Dadurch verliert das System an Emp
findlichkeit für Hemmung durch Herbizide.
Das im Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwen
dete Akzeptorsystem ist sehr effizient. Die Elektronen
werden zwar wie in der Mehler-Reaktion auf den Endakzeptor
Sauerstoff übertragen, der Elektronentransport ist aber
stark beschleunigt. FMN ist nicht toxisch und in den im
Verfahren gemäß der Erfindung eingesetzten Mengen sehr
preisgünstig.
Zur Isolierung der Thylakoidmembranen kann beispielsweise
die Methode nach Cohen und Baxter, Plant Physiol. Band 93,
1005-1010 (1990) angewandt werden. Die Membranpräparation
kann standardisiert und die präparierten Membranen können
durch Einfrieren und Lyophilisieren konserviert werden, was
eine Automatisierung der Messungen ermöglicht. Der Kosten-
und Zeitaufwand für die Isolierung der Thylakoidmembranen
und für die Messungen ist sehr gering.
Im Chemikalientest wurden mit dem Verfahren gemäß der
Erfindung Herbizidkonzentrationen (Atrazin, Diuron,
Terbuthylazin) um den Trinkwassergrenzwert von 0,1 µg/l
nachgewiesen. Eine Quantifizierung der Herbizidmenge für
ein bestimmtes Herbizid im Wasser kann durch Vergleich der
Meßkurven mit Standard-Messungen durchgeführt werden.
In dem Verfahren gemäß der Erfindung wird durch den Einsatz
von FMN als Mediator ein starker lichtabhängiger Elektro
nenfluß an den Thylakoidmembranen hervorgerufen. Dieser
Elektronenfluß wird durch verschiedene herbizide Wirkstoffe
gehemmt. Die Hemmung wirkt sich auf den Sauerstoffverbrauch
negativ aus während die Fluoreszenzemission verstärkt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß
der Erfindung wird die Wirkung des Herbizids auf den Elek
tronentransport durch Messung der Fluoreszenzausbeute bei
lichtadaptiertem Chlorophyll unter sättigenden Lichtblit
zen ermittelt. Die Differenz der maximalen Fluoreszenzaus
beute bei sättigendem Lichtblitz (Fm′) zur Grundausbeute
beim Meßlicht (Ft) bezogen auf Fm′ wird gemessen:
(Fm′-Ft) : Fm′ = ΔF : Fm′
Durch den Bezug der Differenz auf Fm′ wird die Messung
weitgehend unabhängig von der eingesetzten Chlorophyll
menge.
Die Fluoreszenzmessung bietet gegenüber der Sauerstoff
messung den Vorteil, daß die Ergebnisse besser reproduzier
bar sind und daß die Empfindlichkeit gegenüber Herbiziden
höher ist. Durch Anwendung der Fluoreszenzmessung an einem
Thylakoidmembransystem ist es möglich, Herbizidkonzentra
tionen unter dem Trinkwassersummengrenzwert von 0,5 µg/l zu
detektieren. Darüberhinaus ist der Zeitaufwand für eine
Messung sehr gering: nur zwei Minuten werden dafür benö
tigt. Die verbesserte Reproduzierbarkeit macht die Anzahl
an Wiederholungen, die zur Absicherung eines Ergebnisses
erforderlich sind, geringer und trägt dazu bei, daß das
Verfahren gemäß der Erfindung als Schnelltest eingesetzt
werden kann.
In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens gemäß der
vorliegenden Erfindung wird die Hemmung der herbiziden
Wirkstoffe auf den Elektronenfluß über den Sauerstoff
verbrauch verfolgt. Sauerstoffmessungen können beispiels
weise mit Clark-Elektroden durchgeführt werden. Bei jeder
Messung wird eine vorbestimmte Chlorophyllmenge als Suspen
sion von Thylakoidmembranen eingesetzt. Zur quantitativen
Auswertung werden die Messungen jeweils mit Kontroll
messungen verglichen.
Für das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ergibt
sich ein breites Anwendungsfeld. Hierbei ist u. a. zu denken
an Biomonitoring im Grund- und Oberflächenwasser zur
Detektion herbizider Wirkstoffe, die den photosynthetischen
Elektronentransport hemmen, wie sie in handelsüblichen
Herbizidpräparaten eingesetzt werden. Es ist insbesondere
von Vorteil, daß das Verfahren als Schnelltest eingesetzt
werden kann, um an wechselnden Einsatzorten die Einhaltung
des Trinkwassergrenzwertes für Herbizide zu kontrollieren.
Claims (4)
1. Verfahren zum schnellen Nachweis von herbiziden
Wirkstoffen im Wasser unter Verwendung von Chloro
plastenthylakoiden,
dadurch gekennzeichnet,
daß anstelle des bei der Isolierung der Chloroplastenthyla
koiden aus dem photosynthetischen Elektronentransportsystem
ausgewaschenen Elektronenakzeptors ein Mediator eingesetzt
wird und die Wirkung des herbiziden Wirkstoffes auf den
Elektronentransport bestimmt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich
net, daß der Mediator Flavin-Mononukleotid (FNN) ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, daß der Nachweis des herbiziden Wirkstoffes
im Wasser durch Messung der Verringerung des Sauer
stoffverbrauchs als Maß für die Hemmung des Elektronen
transportsystems erfolgt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, daß der Nachweis des herbiziden Wirkstoffes
im Wasser durch Messung der Steigerung der Fluores
zenzemission als Maß für die Hemmung des Elektronen
transportsystems erfolgt.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4420093A DE4420093C2 (de) | 1994-03-02 | 1994-06-09 | Verfahren zum schnellen Nachweis von herbiziden Wirkstoffen im Wasser |
| PCT/EP1995/000750 WO1995023967A1 (de) | 1994-03-02 | 1995-03-01 | Verfahren zum schnellen nachweis von herbiziden wirkstoffen im wasser |
| AU18921/95A AU1892195A (en) | 1994-03-02 | 1995-03-01 | Method of rapidly detecting herbicidal active substances in water |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4406709 | 1994-03-02 | ||
| DE4420093A DE4420093C2 (de) | 1994-03-02 | 1994-06-09 | Verfahren zum schnellen Nachweis von herbiziden Wirkstoffen im Wasser |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE4420093A1 DE4420093A1 (de) | 1995-09-07 |
| DE4420093C2 true DE4420093C2 (de) | 1997-07-24 |
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ID=6511546
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE4420093A Expired - Fee Related DE4420093C2 (de) | 1994-03-02 | 1994-06-09 | Verfahren zum schnellen Nachweis von herbiziden Wirkstoffen im Wasser |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE4420093C2 (de) |
Families Citing this family (1)
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Family Cites Families (5)
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|---|---|---|---|---|
| DE2626915C2 (de) * | 1976-06-16 | 1977-10-06 | Gesellschaft für Strahlen- und Umweltforschung mbH, 8000 München | Verfahren zur Feststellung von Schadstoffen und Anlage zur Durchführung dieses Verfahrens |
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| DE4110548A1 (de) * | 1991-03-30 | 1992-10-01 | Biotechnolog Forschung Gmbh | Verfahren zum nachweis von herbiziden |
| FR2699682A1 (fr) * | 1992-12-22 | 1994-06-24 | Transia Diffchamb Sa | Procédé de détection périodique d'un composé dilué dans un échantillon liquide, phase solide destinée à être utilisée dans le procédé et dispositif de détection pour mettre en Óoeuvre le procédé. |
-
1994
- 1994-06-09 DE DE4420093A patent/DE4420093C2/de not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE4420093A1 (de) | 1995-09-07 |
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