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Hintergrund der Erfindung
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1. Gebiet der Erfindung
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Die
Erfindung betrifft eine Verbesserung der Empfindlichkeit der Technik
für die
quantitative Echtzeitbestimmung von Mengen bakterieller Endosporen
auf der Grundlage der Lanthanid-Dipicolinat-Lumineszenz.
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2. Beschreibung des Standes
der Technik
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Eine "Endospore" (d.h. bakterielle
Spore oder bakterielle Endospore) ist ein verallgemeinerter Begriff
für einen
Sporentyp, der im Inneren bestimmter Species von Bakterien erzeugt
wird. Die Hauptaufgabe der meisten Endosporen besteht darin, ein Überleben
durch Zeiten von umgebungsbedingter Belastung zu gewährleisten.
Endosporen sind gegenüber
Trockenheit, Hitze und Aushungerung tolerant. Sie sind geschützt durch
eine gehärtete
Schale aus Protein und Kohlenwasserstoffen und werden erzeugt durch
eine Form einer Zweiteilung. Endosporen sind daher die Hauptlebensform
für die
ungehinderte Verbreitung der Bakterien-Species vom Bazillus und
Clostridium in der Umwelt, d.h. eine Verbreitung ohne irgendeine
andere Lebensform als Wirt. Die Kosten und die technische Schwierigkeit
der Endosporenerzeugung sind im Verlaufe der Zeit geringer geworden
und damit einhergehend mit den ökonomischen
und technischen Möglichkeiten
eines weiteren Segments der Weltbevölkerung und einschließlich radikaler
ideologischer Gruppen, die sich von einer möglichen Vergeltung nicht abbringen
lassen und von inoffiziellen translationalen politischen Netzwerken
aufgefangen werden, die frei von jeglicher nationaler Identifikation
oder Zuständigkeit
sind. Die Notwendigkeit in der Lage zu sein, das Vorhandensein von
Endosporen in dem Bereich nachzuweisen, ist mit dieser signifikanten
Ausbreitung der Biotechnologien dringlicher geworden, die zur Erzeugung
toxischer Endosporen in Menge in der Lage sind.
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Insbesondere
können
bestimmte Bakterien während
der Zeiten einer Belastung oder eines Mangels an Nährstoff
Endosporen bilden. Diese dormante bakterielle Form kann rauhe Bedingungen überleben,
wie beispielsweise Sieden, Gefrieren und Austrocknen, die vegetative
Bakterien mühelos
töten können. So
werden in der Tat Sporen von Bacillus stearothermophilus und Bacillus
subtilis verwendet, um die Funktionsfähigkeit von Autoklaven zu überprüfen. Zwei
Genera von medizinischer Bedeutung, Bazillus und Clostridium, haben
die Fähigkeit
zur Entwicklung von Endosporen. Diese sind die Verursacher von Milzbrand,
Tetanus, Botulismus und Gasbrand. In mehreren Genera von Bodenbakterien
wurden andere Endosporen erzeugende Prokaryoten gefunden, wie beispielsweise
Desulfotomaculum, Sporolactobacillus und Sporosarcina. Am häufigsten werden
Endosporen erzeugende Bakterien im Boden gefunden. Allerdings existieren
die Endosporen selbst fast überall
und einschließlich
in der Atmosphäre,
wo sie auf Staubpartikeln transportiert werden können. Die Tatsache, dass Endosporen
so schwer zu zerstören
sind, ist die Hauptursache für
die Langwierigkeit und Kompliziertheit von Sterilisationsprozeduren,
die in Krankenhäusern
eingesetzt werden, in Konservenfabriken und anderen Orten, wo eine Sterilisation
erforderlich ist.
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Die
Verfahren nach dem gegenwärtigen Stand
der Technik erfordern langwierige und arbeitsaufwändige Methoden.
Zwei traditionelle Methoden werden angewendet, um die Konzentration
von Endosporen in einer Probe zu messen, nämlich das Auszählen von
Kolonien und das direkte mikroskopische Zählen. Die Prozedur des Koloniezählens zur Bestimmung
der Endosporenkonzentration besteht in einer Wärmeschockbehandlung der Probe
zur Abtötung
vegetativer Zellen, während
Endosporen lebensfähig
bleiben; Aufziehen eines bekannten Volumens der Probe mit einem
bekannten Verdünnungsfaktor
auf ein Wachstumsmedium und inkubieren der ausgewachsenen Platten
für zwei
Tage. Abschließend
werden die resultierenden Kolonien ausgezählt und als Kolonie bildende
Einheiten (CFU's)
aufgezeichnet.
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Die
Prozedur des direkten mikroskopischen Zählen besteht in zwei Schritten:
(1) Die Probe wird auf einen Objektträger mit einer Einkerbung eines
bekannten Volumens gegeben und die Glasoberfläche des Objektträgers mit
Quadraten bekannter Fläche beschrieben;
(2) die Bakterien in jedem der mehreren Quadrate werden ausgezählt und
die mittlere Zahl mit einem entsprechenden Faktor multipliziert,
um die Gesamtzahl der Zellen pro Milliliter in der ursprünglichen
Suspension zu erhalten. Bakterielle Endosporen können speziell unter Anwendung
von Methoden des mikroskopischen Anfärbens identifiziert werden.
Aufgrund des eingeschränkten
Gesichtsfeldes eines Mikroskops bei großen Vergrößerungen kann die Suche nach
angefärbten
bakteriellen Zellen in geringen Konzentrationen einen sich verbietenden Zeitaufwand
in Anspruch nehmen.
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Diese
Methoden haben den unüberwindlichen
Nachteil bei Freilandproben geringer Konzentration. Erstens, neigen
Endosporen zu einer Agglomeration auf partikulären Substanzen, anhaftende Endosporen
lassen sich mit den traditionellen Methoden nicht genau auszählen, obgleich
sie ohne weiteres den überwiegenden
Anteil an Biomasse in einer Freilandprobe repräsentieren könnten. Zweitens, nehmen die
traditionellen Methoden eine lange Zeitdauer in Anspruch und sind
arbeitsintensiv. Schließlich
funktionieren die Methoden des Koloniezählens lediglich bei kultivierbaren
Bakterien, die in Freilandproben in der Minderheit sind.
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Die
Methode für
den Endosporennachweis bekannter Ausführung wurde zuerst erarbeitet
von L. E. Sacks, "Chemical
Germination of Native and Cation-Exchariged
Bacterial-Spores with Trifluoperazine", Applied and Environmental Microbiology,
Bd. 56, S. 1185–1187,
1990. Diese Methode nach der
US-P-5
876 960 von Rosen hat eine Nachweisgrenze von 10
5 Sporen/ml, die für viele Anwendungen zu hoch
ist, um praktisch zu sein. Bei dieser Technik wird ein Lanthanid,
wie beispielsweise Europium oder Terbium, mit einem Medium vereint,
das auf Endosporengehalt getestet werden soll. Das Lanthanid wird
mit Calciumdipicolinat reagieren, das in vielen bakteriellen Sporen
in dem Probenmedium vorhanden ist, und wird ein Lanthanid-Komplex
erzeugen, speziell ein Terbium- oder Europiumdipicolinat. Der Lanthanid-Komplex
verfügt über ein
unterscheidbares Absorptionsvermögen
und Emissionsspektren, die unter Anwendung beispielsweise eines
Testens mit Photolumineszenz nachgewiesen werden können. Das
Auftreten einer Emission von dem Probenmedium bei Anregung, bei
Wellenlängen,
die von denen des Lanthanid-Dipicolinat-Komplexes verschieden sind, ergibt damit
das Vorhandensein von Sporen in dem Probenmedium. Die Konzentration
von Sporen kann ermittelt werden, indem man eine Kalibrierungskurve
herstellt, in der die Intensitäten
der Absorption oder Emission mit den Sporenkonzentrationen für Testproben
mit bekannten Sporenkonzentrationen in Beziehung gesetzt werden.
Die Kalibrierungskurve kann benutzt werden, um die Sporenkonzentration
eines Probenmediums zu bestimmen, indem die Intensität der Absorption
oder Emission für das
kombinierte Lanthanid/Probenmedium genutzt wird.
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Die
WO 00/63422 offenbart Methoden
und Vorrichtungen für
den Nachweis biologischer Kriegsführungsmittel.
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Gomez-Hens
A. und Aguilar-Caballos M.P. (2002), Terbium-sensibilisierte Lumineszenz:
ein selektives und vielseitiges analytisches Vorgehen. Trends in
Analytical Chemistry 21(2): 131 bis 141 worin mehrzähnige Liganden
beschrieben werden, die an Tb-Ionen binden.
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Das
Lumineszenz-Schema der quantitativen Endosporenbestimmung nach dem
neusten Stand der Technik hat den Nachteil einer geringen Empfindlichkeit,
die durch die Bindungskonstante begrenzt ist, das heißt durch
die Affinität
von Dipicolinsäure zum
Binden an dem Lanthanid-Ion. Benötigt
wird eine Echtzeit-Methodik für
eine quantitative Endosporenbestimmung, die nicht durch hohe Nachweisgrenzen
beschränkt
ist. Eine Erfindung findet damit unmittelbare Anwendungen auf dem
Gebiet der Gesundheitsfürsorge,
auf Märkten
der Lebensmittelherstellung/Kontrolle und zur Überwachung von Angriffen biologischer
Kriegsführung.
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Kurze Zusammenfassung der
Erfindung
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Eine
verbesserte Empfindlichkeit für
den Nachweis bakterieller Endosporen wird auf der Grundlage einer
durch Dipicolinsäure
ausgelösten Lanthanid-Lumineszenz realisiert.
Es wird ein Lanthanid mit einem auf Endosporen zu testenden Medium
vereint. Aus Endosporen wird durch Einleitung der Keimbildung und
destruktive Lyse (zum Beispiel mit Mikrowellen, Autoklavieren, chemische
Oxidation) Dipicolinsäure
freigesetzt. Die freigesetzte Dipicolinsäure bindet die Lanthanide,
die über
unterscheidbare Emissionsspektren (d.h. Lumineszenz) verfügen und
unter Anwendung von Photolumineszenz-Messungen nachgewiesen wird.
Die Konzentration von Sporen wird ermittelt, indem eine Kalibrierungskurve
erzeugt wird, welche die Emissionsintensitäten mit den Sporenkonzentrationen
von Testproben mit bekannten Sporenkonzentrationen in Beziehung
setzt. Als das analytische Reagens wird ein Lanthanid-Komplex genutzt,
wie er in den Ansprüchen
festgelegt ist. Der Lanthanid-Komplex weist das an einem mehrzähnigen Ligand
gebundene Lanthanid-Ion auf, welches die Bindungskonstante der Dipicolinsäure über eine
kooperative Bindungswirkung in Bezug auf Lanthanidchlorid erhöht (d.h.
ein Lanthanid-aquo-Komplex in Lösung).
Zusätzlich
dazu, dass das Binden von Dipicolinsäure verstärkt wird, werden auch die schädlichen
Wirkungen von koordiniertem Wasser und mehrfachen Gleichgewichten
durch Verkapseln der Lanthanidionen-mehrzähnigen Liganden ebenfalls eliminiert.
Die kombinierte Wirkung einer erhöhten Bindungskonstante und
des Eliminierens von koordiniertem Wasser und mehrfachen Gleichgewichten
erhöht
die Empfindlichkeit des Endosporen-Assays um schätzungsweise drei Größenordnungen
gegenüber
dem Endosporennachweis auf der Grundlage der Lanthanid-Lumineszenz
bekannter Ausführung.
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Dipicolinsäure (DPA,
2,6-Pyridindicarbonsäure)
liegt in dem Kern von Bakteriensporen in hohen Konzentrationen vor
(etwa 1 molar oder etwa 15% Trockenmasse) und im typischen Fall
als ein 1:1-Komplex mit Ca2+(K11 =
104,4M–1). DPA ist nicht in vegetativen
Zellen vorhanden, wobei sie jedoch ein wichtiger Bestandteil von
Bakteriensporen ist, der mit dem Ca2+ aus
der Umgebung extrahiert wird. Sie wird bei der Keimung in bloßer Lösung freigesetzt
(der Prozess der Umwandlung von der Spore zur vegetativen Zelle).
Da die DPA in der Natur lediglich in Bakteriensporen angetroffen
wird, dient sie als ein Indikatormolekül für das Vorhandensein bakterieller
Sporen. Zufälligerweise
ist die DPA auch ein klassischer Ligand der anorganischen Chemie,
der Metallionen mit hoher Affinität bindet. Das Binden der DPA
an Terbium-Ionen triggert eine intensive grüne Lumineszenz unter UV-Anregung.
Das Einschalten der grünen
Lumineszenz signalisiert das Vorhandensein von bakteriellen Sporen,
wobei sich die Intensität
der Lumineszenz mit der Zahl der Endosporen pro Milliliter in Korrelation
bringen lässt.
Potentielle Störstoffe,
wie beispielsweise Zucker, Nuclein- und Aminosäuren sind in den Endosporen
und vegetativen Zellen in sehr viel geringeren Konzentrationen vorhanden
und haben Bindungskonstanten für
Tb, die um mehrere Größenordnungen
kleiner sind als die der DPA (KA = 108,7M–1). Damit ist diese
Methode gegenüber
diesen Störsubstanzen
relativ immun.
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Der
Mechanismus dieser Methode beruht auf den einzigartigen photophysikalischen
Eigenschaften von Lanthanid-Ionen. Die Lumineszenz von Lanthanid-Ionen
ist gekennzeichnet durch eine lange Lebensdauer (0,1 bis 1 ms),
geringe Extinktionskoeffizienten (d.h. ein Absorptionsvermögen von
etwa 1 M–1 cm–1)
und schmale Emissionsbande. Schmale Emissionsbande entstehen, da
die Valenz der f-Orbitale gegenüber
der Umgebung durch die äußeren s- und
p-Elektronen abgeschirmt
sind, und lange Lebensdauerzeiten/geringe Extinktionskoeffizienten
ergeben sich aufgrund dessen, dass der Übergang zwischen dem emittierenden
angeregten Zustand und dem Grundzustand einen großen Bandabstand
hat. So führt
die direkte Erregung von Terbium-Ionen zu einer schwachen Lumineszenz
infolge des geringen Absorptionsquerschnittes. Allerdings triggert
die Koordination organischer Chromophore, wie DPA, eine intensive
Terbium-Lumineszenz. Die Juxtaposition von DPA, die ein Absorptionsvermögen von
5.000 M–1 cm–1 hat,
dient als ein lichtsammelndes Zentrum (d.h. hat einen Antenneneffekt).
Die starke elektronische Kopplung und der Energieabfall erlauben
der DPA-zentrierten Anregungsenergie wirksam zu dem Lanthanid-Ion übertragen
zu werden, das sodann in hellem Grün luminesziert.
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Die
Nachweisgrenze wird in der Erfindung dadurch verbessert, dass die
Bindungskonstante von DPA an Tb erhöht wird. Eine erhöhte Bindungskonstante
führt zu
höheren
DPA-Anteilen, die bei geringen DPA-Konzentrationen am Tb gebunden
sind. Das Binden von DPA an Tb ist für das Einsetzen der grünen Lumineszenz
erforderlich, die das Vorhandensein bakterieller Sporen signalisiert.
Die Bindungskonstante K11, bezieht sich
auf die Bindungsstärke
der DPA an dem Tb-Komplex anhand des folgenden thermodynamischen
Ausdruckes: ΔG
= –RTInK11,worin ΔG die Änderung der "Gibbsschen" freien Enthalpie
beim Binden ist, R ist die Gaskonstante, T ist die Temperatur in
Grad Kelvin und K11 ist die Bindungskonstante
für einen
1:1-Komplex. Das Binden der DPA kann dadurch verstärkt werden,
dass das Tb mit einem Ligand gekapselt wird, der Erkennungsstellen
mit attraktiver Wasserstoffbindung oder elektrostatischen Bindungs wechselwirkungen
für die
ankommende DPA hat, die an Bindungstaschen in Enzymen erinnern,
die eine komplementäre
Form zeigen und Bindungswechselwirkungen für ein ankommendes Substrat.
Auf der Grundlage der vorgenannten Gleichung haben wir berechnet,
dass zwei durchschnittliche Wasserstoffbindungen das Binden um drei
Größenordnungen
erhöhen
würden
(wenn als das Lösemittel
Wasser verwendet wird), womit dementsprechend die Nachweisgrenze
erhöht
wird. Wir gehen davon aus, dass ein Ligand, der zur Ausbildung von
zwei Wasserstoffbindungen an der DPA in der Lage ist, zu Nachweisgrenzen
von etwa 1 Spore/ml führen
wird.
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Zusätzlich zu
der Erhöhung
der Bindungskonstante der DPA an Tb eliminieren diese mehrzähnigen Liganden
(d.h. Liganden, die sich mit den mehrfach gebunden Teilen koordinieren)
die nachteiligen Wirkungen von koordiniertem Wasser und mehrfacher
Gleichgewichte. Ein Tb-Ligandenkomplex mit einer Koordinationszahl
von 6 (d.h. der Ligand koordiniert das Lanthanid an sechs Stellen)
macht es lediglich einem DPA-Molekül möglich, sich zu binden, und
der Tb-Ligand-DPA-Komplex enthält
kein koordiniertes Wasser, womit sich die Quantenausbeute erhöht. Die
Nachweisgrenze ist um näherungsweise eine
Größenordnung
infolge der Eliminierung von koordiniertem Wasser und der Verringerung
der Tb-Komplex-Hintergrundlumineszenz erhöht.
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Es
werden Lanthanid-Ionen mit einem Medium vereint, das auf Endosporen
getestet werden soll. Durch Reaktion mit Dipicolinsäure wird
ein Lanthanid-Chelat erzeugt, das aus den Endosporen entweder durch
Keimung oder destruktive Lyse freigesetzt wird; dabei hat der Lanthanid-Dipicolinsäure-Komplex unterscheidbare
Absorptions- und Emissionsspektren, die unter Anwendung von Photolumineszenz-Messungen
detektiert werden können.
Die Konzentration von Sporen kann durch Erzeugung einer Kalibrierungskurve
ermittelt werden, die die Absorptions- und Emissionsintensitäten mit
den Sporenkonzentrationen für
Testproben von bekannten Sporenkonzentrationen in Relation bringt.
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Zusammengefasst
zeigt die Erfindung eine Verbesserung der Empfindlichkeit für eine Methode eines
Echtzeitnachweises von Endosporen, welche die Schritte des Vereinens
von Lanthanid-Ionen mit einem Medium umfasst, das auf Gehalt an
bakteriellen Endosporen analysiert werden soll. Das Lanthanid reagiert
mit der von den bakteriellen Endosporen freigesetzten Dipicolinsäure entweder
durch Keimung oder destruktive Lyse (zum Beispiel Autoklavieren,
Mikrowellenbehandlung, Oxidation), sofern diese in dem Medium vorhanden
sind, um ein Chelat von Lanthanid und Dipicolinsäure zu erzeugen. Jegliches
erzeugtes Lanthanid-Chelat wird mit einer von dem schon vorhandenen
Lanthanid-Chelat unterscheidbaren Anregungsenergie angeregt. Die
Existenz einer Emission, die bei einer Emissionswellenlänge auftritt,
die von der des Lanthanid-Chelats als Folge der Erregung verschieden
ist, wird erfasst. Sodann wird auf der Grundlage der durch Dipicolinsäure ausgelösten Emission
bestimmt, ob bakterielle Endosporen vorhanden sind.
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Spezieller
ist die Erfindung in einer der Ausführungsformen eine Methode zum
Bestimmen von in einem Medium vorhanden bakteriellen Endosporen
nach Anspruch 1.
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In
einer weiteren Ausführungsform
ist die Erfindung eine Methode zum Bestimmen von bakteriellen Endosporen
in einem Medium nach Anspruch 7.
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In
noch einer weiteren Ausführungsform
ist die Erfindung eine Zusammensetzung einer Substanz nach Anspruch
15.
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Die
Erfindung umfasst die Schritte des Vereinens des Lanthanid-Ions
mit dem Medium in Form eines Lanthanid-Komplexes als das Analysereagens, das
mit den Endosporen reagiert. Der Lanthanid-Komplex ist jede beliebige
Kombination des Lanthanid-Ions mit einem oder zusätzlichen
mehrzähnigen
Liganden, einschließlich
ohne Beschränkung
auf Supra- und Supermoleküle.
Der Lanthanid-Komplex umfasst Lanthanid-Kationen, die durch Liganden
eingeschlossen sind, die das Binden der Dipicolinsäure (d.h.
ein kooperatives Binden) verstärken.
In einer der Ausführungsformen
umfassen die Lanthanid-Kationen Terbium-Kationen und in einer anderen Ausführung Europium-Kationen.
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In
dem Schritt des Vereinens der Lanthanid-Ionen mit dem Medium in
Form eines Lanthanid-Komplexes als das Analysenreagens, das mit den
Endosporen reagiert, ist der Ligand, der das kooperative Binden
ermöglicht,
normalerweise mehrzähnig
(d.h. ein Ligand, der mit einer Koordinationszahl von mehr als 1
und bevorzugt 4 bis 6 festgelegt ist) und ermöglicht lediglich das Binden
von nur einem Dipicolinsäure-Molekül an der
der Endospore, wodurch mehrfache Gleichgewichte eliminiert werden
und der resultierende Dipicolinsäure-Komplex
einige wenige bis zu keinen koordinierten Wassermolekülen enthält. Bevorzugt
wird das Terbium in geringen molaren Überschuss gegenüber seinem
stochastischen Verhältnis
bereitgestellt, um die Hintergrund-Lumineszenz von unkoordiniertem
Terbium zu verringern.
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Alternativ
ist die Erfindung auch als das Verfahren zur Bestimmung der Konzentration
bakterieller Endosporen festgelegt, die in einem Medium vorhanden
sind, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: Vereinen eines Lanthanid-Komplexes
als ein Analysereagens mit einem Probenmedium und Bestimmen der
Konzentration bakterieller Endosporen, die in den vereinten Lanthanid-Komplexen
und dem Probemedium vorhanden sind auf der Grundlage der Menge an
Lanthanid-Dipicolinat-Chelat, das aus der Vereinigung von Lanthanid-Komplexen
mit dem Probenmedium resultiert. Der Schritt der Bestimmung der
Konzentration bakterieller Endosporen wird unter Anwendung einer
Photolumineszenzprüfung
des Lanthanid-Dipicolinat-Chelats ausgeführt.
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Der
Schritt der Bestimmung der Konzentration bakterieller Endosporen
umfasst die Erzeugung einer Kalibrierungskurve, mit der die Intensität der Lumineszenz
in Relation zu der Endosporenkonzentration unter Anwendung einer
Photolumineszenzprüfung
von mindestens zwei und bevorzugt mehr Testprobenmedien gebracht
wird, die unterschiedliche vorbestimmte Endosporenkonzentrationen
aufweisen; Ausführen
der Photolumineszenzprüfung
an dem Probenmedium mit unbekanntem Endosporengehalt zur Bestimmung
der Intensität
des Absorptionsvermögens
des unbekannten Probenmediums und unter Anwendung der Kalibrierungskurve
die Intensität
des Absorptionsvermögens
des unbekannten Probenmediums mit einer Endosporenkonzentration
in Beziehung setzen.
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Der
Schritt der Bestimmung, ob die vereinten Lanthanid-Komplexe und
das Probenmedium ein Lanthanid-Dipicolinat-Chelat enthält, umfasst
die Anregung des Probenmediums und die Bestimmung, um eine signifikante
Erhöhung
des Lumineszenzintensität
bei Wellenlängenauftritt,
die von denen des Lanthanid-Chelats verschieden sind.
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In
einer noch anderen Weise umfasst der Schritt der Bestimmung, ob
die vereinten Lanthanid-Komplexe und das Probenmedium ein Lanthanid-Dipicolinat-Chelat enthält, die
Anregung des Probenmediums und die Bestimmung, ob eine signifikante
Emission bei Wellenlängenauftritt,
die von dem Lanthanid-Dipicolinat-Chelat verschieden sind.
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Die
Erfindung lässt
sich besser veranschaulichen, indem man sich den folgenden Zeichnungen zuwendet,
worin ähnliche
Elemente mit ähnlichen Zahlen
bezeichnet sind.
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Kurze Bezeichnung der Zeichnungen
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Es
zeigen:
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1 eine
mikroskopische Darstellung einer Spore, worin die DPA-reiche Sporenumhüllung hervorgehoben
ist;
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2a eine
Moleküldarstellung
des Tb3+-Ions, das durch die dunkelgetönte Kugel
dargestellt wird. Das Tb3+ kann die lichtauffangende
DPA binden, die einen Absorptionsquerschnitt > 104 M–1 cm–1 hat,
der vor der Spore kommt. Die DPA-Bindung führt zu einer hellen Tb-Lumineszenz;
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2b eine
Darstellung, die das photophysikalische Schema für DPA-sensibilisierte Lumineszenz
des Tb-Kronenether-Komplexes
zeigt, d.h. die Absorption/Energieübertragung/Emission "AETE";
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3 eine
Photographie von zwei Cuvetten auf einer UV-Lampe;
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4 eine
dreidimensionale Darstellung eine Modells für eine potentielle makrozyclische
Ligandenbindung an Tb;
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5 eine
graphische Darstellung, in der der DPA-Bindungsanteil an Tb3+ graphisch in Abhängigkeit von der Konzentration
von DPA dargestellt ist;
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6 eine
Darstellung, die die Synthese von EZ für das verstärkte Binden von DPA an Tb3+ in Lösung
zeigt;
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7 eine
graphische Darstellung der normierten Lumineszenz-Intensitätserhöhung infolge der
Bindung von DPA an Tb3+ mit EZ (rechts)
und ohne EZ (links), wenn die DPA-Gesamtkonzentration von 10–4 bis
10–8M
variiert.
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Die
Erfindung und ihre verschiedenen Ausführungsformen lassen sich nun
besser anhand der folgenden detaillierten Beschreibung der bevorzugten
Ausführungsformen
verstehen, die als veranschaulichende Beispiele der Erfindung geboten
werden, die in den Ansprüchen
festgelegt ist.
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Detaillierte Beschreibung
der bevorzugten Ausführungsformen
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Der
Bezug der Erfindung auf den Molekülaufbau erhöht die Nachweisgrenze um mehr
als drei Größenordnungen.
Der Aufbau ist durch einen Komplex gekennzeichnet, der ein zentrales
Lanthanid-Ion aufweist, das von einem mehrzähnigen Liganden käfigartig
umgeben ist, der zu einer kooperativen Bindung von Dipicolinsäure durch
zusätzliche Bindungswechselwirkung
zu der Dipicolinsäure
infolge von Wasserstoffbindungen oder elektrostatischen Wechselwirkungen
führt.
Die kooperative Bindung ist festgelegt als eine Nettozunahme der
Bindungskonstante von Dipicolinsäure
zu Lanthanid-Komplexen, die in Bezug auf Dipicolinsäure an Lanthanid-Ionen binden
(d.h. der Lanthanid-aquo-Komplex).
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Eine
Erhöhung
der Bindungskonstante führt zu
größeren Anteilen
der Dipicolinsäure-Bindung
an den Lanthanid-Molekülen
bei geringer Dipicolinsäure,
wodurch dementsprechend die Empfindlichkeit des bakteriellen Sporen-Assays zunimmt,
da die Dipicolinsäure-Bindung
eine Lanthanid-Lumineszenz auslöst.
Darüber
hinaus dient der mehrzähnige
Ligand zur Erhöhung
der Quantenausbeute um eine Größenordnung,
indem koordinierte Wasser eliminiert wird, welches die Lanthanid-Lumineszenz
wirksam löscht.
Der mehrzähnige
Liganden-Komplex
eliminiert außerdem
mehrfache Gleichgewichte, durch die frühere Wissenschaftler gezwungen
waren, einen großen Überschuss
an Lanthanid zu verwenden, was infolge des freien Lanthanid-Ions
zu einer starken Hintergrund-Lumineszenz
führt.
Die Lanthanide, Ln, schließen
Terbium, Tb, und Europium, Eu, ein. Für die Aufgaben der veranschaulichenden
Ausführungsform
wurde in speziellen Beispielen Tb gewählt, wobei jedoch jedes andere
der Lanthanide gleichermaßen
eingesetzt werden könnte.
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Die
Erfindung verbessert deutlich die Nachweisgrenze für den Nachweis
bakterieller Endosporen auf der Grundlage einer Lanthanid-Dipicolinat-Lumineszenz. 3 ist
eine Photographie, die eine mit 1 mM TbCl3 gefüllte Cuvette
(Tb-Cuvette) und
eine andere, die mit 1 mM TbCl3 + 1 μM DPA (Tb-DPA-Cuvette)
gefüllt
ist. Zu beachten ist, das Anspringen der Lumineszenz bei DPA-Zugabe.
Die DPA-Menge in der Tb-DPA-Cuvette entspricht 106 Sporen/ml. Der
besondere Vorteil dieser Methode gegenüber traditionellen Methoden,
wie beispielsweise gefärbte
Sporenmikroskopie und Platten-Kulturzählung, besteht darin, dass
sehr viel weniger Zeit erforderlich ist, um eine quantitative Sporenanalyse
zu erhalten, nämlich
gegenüber
Stunden oder Tagen nur wenige Minuten. Die Echtzeit-Sporenanalyse
ist ein wertvolles Mittel für
die NASA-Initiativen für
den planetaren Schutz in der Prüfung
der Raumfahrzeug-Sterilisation; in der Umweltüberwachung; in Life-Support-Systemen
im geschlossenen Kreislauf und in der Astrobiologie, wie beispielsweise
beim Testen der Überlebensfähigkeitsdauer
von Sporen.
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Neuere
Untersuchungen von Rosen et al. haben eine dreistufige Methode der
Lanthanid-Lumineszenz zum Nachweisen und zur quantitativen Bestimmung
bakterieller Endosporen entsprechend der Offenbarung in der
US-P-5 876 960 hervorgebracht. Einer
wässrigen
Suspension wurde TbCl
3 im Überschuss
zugegeben, die bakterielle Endosporen enthält, die 2% bis 15 Gew.% Dipicolinsäure (DPA)
entsprechend der Darstellung in dem Diagramm in
1 enthalten,
bei der es sich um eine mikroskopische Darstellung einer Endospore
10 handelt, in der die DPA-reiche Umhüllung 12 hervorgehoben ist. Das
[Tb(H
2O)
9]
3+ reagiert mit DPA, die von der Sporenumhüllung freigesetzt
ist, unter Erzeugung eines Monochelats [Tb(DPA)(H
2O)
6]
+-Komplex. Dieser Komplex
zeigt eine verstärkte
Lumineszenzintensität in
Bezug auf [Tb(H
2O)
9]
3 +, wenn eine Erregung
mit UV-Licht bei
dem DPA-Absorptionsmaximum erfolgt. Partikuläre Substanzen werden aus der
mit Terbium behandelten Suspension durch Filtration unter Verwendung
eines 0,22μm-Filter
filtriert. Die Lumineszenzintensität des Monochelat-Kom plexes
wird sodann gemessen und mit einer Sporenkonzentration in Korrelation
gebracht. Die Korrelation von Lumineszenzintensität in Bezug
auf Sporenkonzentrationen kann durch einfache Messung einer Kalibrierungskurve
unter Verwendung bekannter Sporenkonzentrationen erhalten werden.
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Die
Nachweisgrenze der Methode nach Rosen beträgt 1,2 × 105 CFU/ml,
worin CFU eine koloniebildende Einheit ist. Obgleich die Methode
der Lanthanid-Lumineszenz
für den
Sporennachweis eine rasche quantitative Analyse ermöglicht,
erfordert die Nachweisgrenze eine Verbesserung und speziell bei
Anwendungen im Gesundheitswesen, zum Beispiel bei der Überwachung
der Luft in Operationssälen,
der Lebensmittelqualität
usw., sowie beim planetaren Schutz, wo es bei dem Standard von 300 Sporen/m2 für
die Kategorie der IVa-Missionen
gibt. Wie nachfolgend vorgeschlagen wird, lassen sich diese Nachweisgrenzen
deutlich verbessern, wenn man (1) die Eigenschaften des Bindens
von Dipicolinsäure
an Lanthanid-Ion versteht, (2) die Photophysik der in den 2a und 2b veranschaulichten Schemen
von Absorption/Energieübertragung/Emission
(AETE), sowie den Aufbau eines Lanthanid-Komplexes, der die Nachweisgrenze
entsprechend optimiert. Damit gilt als selbstverständlich, dass
alle der grundsätzlichen
Prozesse, die in der Methode nach Rosen offenbart wurden, mit Hilfe
der Lehren der Erfindung entsprechend der nachfolgenden Beschreibung
verbessert werden können.
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4 ist
eine dreidimensionale Darstellung eines Modells eines potentiellen
mehrzähnigen
Liganden, der an Tb gebunden ist, und zwar mit einer Guanidin-Seitengruppe,
die an einer ankommenden DPA eine H-Bindung sein kann. Die Verbesserung der
Nachweisgrenze, verstärkt
durch Umhüllen
des Tb mit einem mehrzähnigen
Liganden entsprechend der Darstellung in 4, der wasserstoffbindende Erkennungsstellen
für die
ankommenden DPA entsprechend der Darstellung in der theoretischen
Kurve von 5 hat, worin der an Tb3+ gebundene DPA-Anteil in Abhängigkeit
von der Konzentration der DPA graphisch dargestellt ist, wenn die
Bindungskonstante (K11) von 109 bis
1012 M–1 zunimmt. Eine einzelne
Bakterienspore, die ihre DPA in 1 ml Masselösung freisetzt, ergibt eine
DPA-Konzentration von 10 bis 12M. Damit wird eine Zunahme der Bindungskonstante
von 109 M–1 (bei
Verwendung von TbCl3) auf 1012 M–1 durch
Einführung
zwischen den Liganden einer intrakomplexen Wasserstoffbindung zu
einer einzigen Spore pro Milliliter Nachweisgrenzen ergeben.
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Ein
Problem, das die Nachweisgrenze in der vorgenannten Methode bestimmt,
ist die Anforderung einer großen Überschusskonzentration
an Terbium gegenüber
DPA. Ein Überschuss
an Terbium gewährleistet,
dass überwiegend
ein Monochelat [Tb(DPA)aq]+ gebildet wird
aus den drei möglichen Tb-Chelaten
[Tb(DPA)n]3-2n für n = 1,
2, 3 die sich im Gleichgewicht befinden. Dieses ist deshalb von
Bedeutung, weil jedes Chelat über
unterschiedliche photophysikalische Eigenschaften verfügt, zum
Beispiel Quantenausbeute, Lebensdauer, und damit eine Mischung von
Chelaten die die quantitative Analyse kompliziert macht. Leider
führt der
große Überschuss
an Tb, der zur Erzeugung von Monochelaten erforderlich ist, auch
zu einer starken, unerwünschten
Hintergrund-Lumineszenz,
die auf eine Lumineszenz von nicht komplex gebundenem Tb3+ zurückzuführen ist,
womit die Nachweisgrenze nachteilig beeinflusst wird. Darüber hinaus
hat das Monochelat sechs von neun Koordinationsstellen mit Wasser
besetzt. Koordinativ gebundenes Wasser führt aufgrund von OH-Oszillatoren hoher
Frequenz zu effizienten strahlungsfreien Zerfallswegen. Diese strahlungsfreien
Zerfallswege verringern drastisch die Quantenausbeute der Lumineszenz,
womit die Nachweisgrenze ebenfalls nachteilig beeinflusst wird.
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Im
Idealfall wäre
Tb in geringfügigem Überschuss,
um die Hintergrund-Lumineszenz
von nicht koordinativ gebundenem Tb zu verringern, während gleichzeitig
mehrfache Gleichgewichte vermieden und koordinativ gebundenes Wasser
eliminiert werden. Dieses lässt
sich dadurch erzielen, dass ein Lanthanid-Komplex als Analalysenreagens
entsprechend den Lehren der Erfindung angewendet wird. Die nachteiligen
Wirkungen von koordinativ gebundenem Wasser und mehrfachen Gleichgewichten lassen
sich durch Umhüllen
der Lanthanid-Ionen in mehrzähnigen
Liganden eliminieren. Die sechs koordinativ gebundenen Atome in
der Molekülstruktur
besetzen sechs von neun koordinativen Stellen des Lanthanid-Ions.
Das Vorhandensein der übrigen
koordinativen Stellen der Ln3+ Kronenether-Komplexe bietet
die Gelegenheit für
lichtaufnehmende DPA, in die Koordinationssphäre einzutreten und mit Hilfe des
AETE-Prozesses nachgewiesen
zu werden. Damit ermöglicht
ein Tb-Kronenether-Komplex,
dass lediglich eines der DPA-Moleküle 18 bindet, d.h. es werden
mehrfache Gleichgewichte eliminiert und der Tb-Kronenether-DPA-Komplex
enthält
kein koordiniertes Wasser.
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In
Kombination mit der erhöhten
Bindungsaffinität
von Dipicolinsäure
für Lanthanid-Komplexe, die
zum kooperativen Binden in der Lage sind, wird die Eliminierung
von koordiniertem Wasser und mehrfachen Gleichgewichten zu einer
schätzungsweise
103- bis 104fachen
Erhöhung
der Empfindlichkeit der Methode der Lanthanid-Lumineszenz für den Nachweis
bakterieller Sporen führen.
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2b veranschaulicht
den ATETE-Prozess. Es wird UV-Licht zur Anregung des DPA-Moleküls 18 in
der kombinierten Form mit dem käfigeingeschlossenen
Lanthanid aus dem Zustand 1π zu
1π* absorbiert.
Einem Energieabfall in den 3π*-Zustand des
DPA-Moleküls
18 folgt eine Energieübertragung zu
dem Tb-Kronenether-Komplex in dem 5D4-Zustand. Einer charakteristischen
Energieabnahme oder Emission folgt dann von dem 5D4-Zustand in dem Tb-Kronenether-Komplex
zu dem 7FJ=6-0-Grundzustand. Für
dieses Nachweisschema der Lanthanid-Lumineszenz wurde der Einfluss chemischer
und biologischer Störfaktoren
(die nicht von den Endosporen kommen) umfangreich untersucht und
gilt für
das vorgeschlagene Schema gleichermaßen. Es wurde festgestellt,
dass keine getestete Substanz zu einem falsch positiven Resultat führte, was
der Fall wäre,
wenn die intrinsische Tb-Lumineszenz in Abwesenheit bakterieller
Endosporen verstärkt
würde.
Allerdings treten falsch negative Ergebnisse dann auf, wenn das
Signal einer Endosporen enthaltenden Probe stark verzögert ist. Die
Hauptursache für
die Hemmung der Lumineszenz sind an Tb bindendes Phosphat und Störfaktoren,
die bei der Wellenlänge
der Anregung stark absorbieren. Wenn derartige unbekannte Störfaktoren vorhanden
sind, ist das analytische Vermögen
infrage gestellt. Wenn allerdings Kalibrierungskurven mit vorhandenen
Störfaktoren
ausgeführt
werden, bleibt das analytische Vermögen intakt, obgleich die Nachweisgrenze
nachteilig beeinflusst wird.
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Die
Methode der Lanthanid-Dipicolinat-Lumineszenz kann innerhalb von
Minuten ausgeführt
werden. Mit einer 1.000- bis 10.000fachen Verbesserung der Nachweisgrenze,
die durch Realisierung des in der vorliegenden Veröffentlichung
beschriebenen neuartigen Supramolekularkomplexes erhalten werden,
lassen sich neue Anwendungen für
den Sporennachweis realisieren. Beispielsweise ist der Sporennachweis
besonders relevant für
die Umgebungsüberwachung
von Orten von Gesundheitseinrichtungen, da zahlreiche Erkrankungen
von Bacillus, Clostridium und einschließlich Anthrax (Bacillus anthracis),
Tetanus (Clostridium tetani), Botulismus (Clostridium botulinium)
und Gasbrand (mehrere andere Clostridium-Species) übertragen
werden.
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Die
synthetische Darstellung einer der Formen eines Lanthanid-Komplexes gemäß der Erfindung
ist in der in 6 schematisch dargestellten Ausführungsform
gezeigt, wo ein Ethylendiamintetraessigsäure-Zwitterion (EZ) als Molekül dargestellt
ist. Durch Refluxieren von Ethanol (2-Aminoethyl)trimethyl-ammoniumchlorid
ist Chlorwasserstoff unlöslich, wobei
jedoch die freie Base (2-Aminothyl)trimethyl-ammoniumchlorid löslich ist
und in Lösung
mit Natriumhydroxid erzeugt wird. Es tritt eine Metathesereaktion
auf, und es werden feine Mikrokristalle von Natriumchlorid aus der
heißen
Ethanolmischung ausgefällt,
wobei eine Ethanollösung
der freien Base (2-Aminoethyl)trimethyl-ammoniumchlorid zurückbleibt.
Zu dieser Lösung
wird Ethylendiamintetraessigsäure(EDTA)-dianhydrid
gegeben, das mit der primären
Amingruppe der zwei Äquivalente
von (2-Aminoethyl)trimethyl-ammoniumchlorid reagiert. Diese Reaktion
liefert EZ in seiner Carbonsäure-Form.
Zur Erzeugung der zwitterionischen Form von EZ werden zwei zusätzliche Äquivalente
der dem Amin als freie Base zugeben, um diese intermediäre Carbonsäure zu deprotonieren,
was EZ und (2-Aminoethyl)trimethyl-ammoniumchlorid-hydrochlorid
ergibt, das unlöslich
ist in Ethanol und aus der Lösung
leicht abfiltriert werden kann. Es gilt als selbstverständlich,
dass zahlreiche andere Formen und Synthesen von Lanthanid-Ionen
in der Form eines Lanthanid-Komplexes möglich sind, die ausdrücklich als
in den Schutzumfang der Erfindung einbezogen gelten. Jede der alternativen
Formen wird mit dem Medium als ein Analysereagens vereint, das zum
kooperativen Binden mit Dipicolinsäure von Endosporen unter Erhöhung sowohl
der Lanthanid-Dipicolinsäure-Bindungskonstante,
als auch der Quantenausbeute der Lumineszenz in der Lage ist.
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Das
verstärkte
Binden eines DPA-Moleküls an
dem Tb3+ ist das Ergebnis mehrerer Faktoren,
die in dem ternären
Komplex eines DPA-Moleküls,
eines Tb3+-Ions und EZ-Moleküls eine
Rolle spielen. Erstens, wird das EZ-Molekül als ein Template oder Fundament
zum Einfangen eines Tb3+ mit den Amin- und Carboxylatgruppen
an dem Kern des Moleküls,
um einen Komplex (EZ-Tb)3+ zu liefern. Zu
beachten ist, dass die Gesamtladung dieses Komplexes 3+ beträgt, dass
jedoch zwei Einheiten der Ladung effektiv aus den Trimethylammonium-Gruppen an den Enden des
Moleküls
heraus migriert sind, die bei der Koordination des EZ-Moleküls zu dem
Tb3+-Ion eine Rolle spielen. 7 ist
eine graphische Darstellung der Versuchsdaten, die die erhöhte Intensität im Nachweis
von DPA (M) unter Anwendung des EZ-Moleküls auf den Komplex mit Tb zeigt.