CN116008242A - 一种DNA-AgNCs荧光生物传感器及其合成方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种DNA‑AgNCs荧光生物传感器，它是以硝酸银为起始原料，DNA寡核苷酸为稳定剂，硼氢化钠为还原剂形成的DNA模板化银纳米簇，该荧光生物传感器的荧光光谱在610nm激发下于674nm处有最大发射峰。本发明还公开了传感器的合成方法及其在检测福美双残留中的应用。检测福美双时，该传感器能在没有金属离子介体的情况下对DNA‑AgNCs产生荧光猝灭效应，可在10分钟内完成响应，显示出卓越的灵敏度和特异性，在福美双快速现场检测中有巨大应用潜力。

Description

一种DNA-AgNCs荧光生物传感器及其合成方法和应用

技术领域

本发明属于有害物残留检测领域，涉及一种以DNA为模板的银纳米簇(DNA-AgNCs)荧光生物传感器及其合成方法，本发明还涉及该传感器在杀虫剂福美双残留检测中的应用。

背景技术

福美双(二硫化四甲基秋兰姆)被广泛用作橡胶工业中的硫化剂和现代农业中的杀虫剂，以控制害虫、杂草和细菌以确保收成。然而，福美双的大量使用使其渗透到大气、水体和土壤中，并在土壤中存留数月，导致福美双在地表水和农产品中的残留问题严重，因此在环境或体内大量积累。关于福美双对人体健康的毒性作用，先前的研究报告称，福美双暴露可能会扰乱生殖周期并引起神经元毒性(Lee and Peters,1976)，在5.0mg/L浓度下对人体皮肤成纤维细胞产生高细胞毒性作用(Cereser等,2001)，福美双中二硫代碳酸盐结构易与金属离子螯合导致细胞内蛋白质功能障碍(Mathieu等,2015)，诱导人红细胞氧化应激并引起细胞成分的氧化修饰(Salam等,2020)。这些报告表明有必要开发一种准确灵敏的传感器来检测福美双残留，以保证环境、食品和人类健康的安全。

目前，福美双残留的分析方法主要是基于大型仪器的技术，如气相色谱串联质谱法(GC-MS)(da Silva等,2022)、液相色谱串联质谱法(LC-MS)(Peruga等,2012)和高效液相色谱法(HPLC)(Charoenkitamorn等,2015)。尽管这些方法具有很高的灵敏度和可靠性，但由于它们需要大型且昂贵的仪器、复杂的样品前处理和熟练的操作人员，因此不适合快速现场检测福美双残留，这表明迫切需要开发一种新颖、简便、低成本、快速和灵敏的福美双检测方法。

研究人员致力于开发福美双残留的快速检测方法，包括表面增强拉曼散射(SERS)策略(Picone等,2022)，酶联免疫吸附测定(ELISA)(Queffelec等,2001)，电化学方法(Wei等,2022)，比色法检测(Li等,2022；Liu等,2022)，以及其他相关方法(Cheng等,2022；Chen等,2022)。近年来，基于荧光纳米材料的荧光检测方法以其瞬时响应、高灵敏度、高特异性、低成本和无需标记等优点在食品安全检测中受到越来越多的关注。作为一种新兴的荧光纳米材料，贵金属纳米团簇(NCs)，如金纳米团簇(AuNCs)和银纳米团簇(AgNCs)，由于其易合成、低毒性、良好的生物相容性和光致发光特性等优点，被广泛用于开发农药检测的荧光传感器，尤其是以DNA寡核苷酸为稳定剂，硼氢化钠为还原剂形成的DNA模板化AgNCs(DNA-AgNCs)具有优异的物理化学特性(Richards等,2008)。大多数基于NCs的荧光传感器是基于金属离子介导的传感策略，通常包括两个步骤，首先，AuNCs或AgNCs的发射荧光被金属离子猝灭或增强；其次，这种荧光变化通过金属离子与农药之间的竞争相互作用而被抑制(Guan等,2022；Yang等,2022；Zhao等,2019)。然而，这些金属离子介导的方法需要额外引入金属离子。同时，一些农药残留物与一种以上的金属离子具有很强的螯合作用，例如在我们之前的研究中，福美双显示出与银离子和铜离子形成强金属络合物的能力(Liu等,2022)，这表明在现场检测福美双的情况下，真实样品基质中的金属离子可能会引起干扰。

受我们前期研究的启发，结合DNA-AgNCs的光学优势，开发了一种用于福美双残留量分析的猝灭型荧光传感器，其传感原理基于福美双对DNA-AgNCs的有效荧光猝灭效应。这主要归因于福美双与DNA-AgNCs中银原子之间的强竞争作用。这种“即混即检”传感器具有设计简单、制备容易、成本低廉、响应迅速、操作方便等优点，对实际样品中福美双残留的检测应用具有重要意义。需要注意的是，此方法不需要额外的金属离子介体、任何修饰、酶或复杂的分离程序。据我们所知，这是首次基于福美双与DNA-AgNCs中的银原子之间竞争作用构建的福美双残留分析探针，为快速筛查实际样品中的农药残留提供了一种新的简便方法。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种用于检测福美双的DNA-AgNCs荧光生物传感器。

一种DNA-AgNCs荧光生物传感器，它是以硝酸银为起始原料，DNA寡核苷酸为稳定剂，硼氢化钠为还原剂形成的DNA模板化银纳米簇，其中，所述DNA寡核苷酸为单链DNA，其C碱基含量为20-60％，该荧光生物传感器的荧光光谱在610nm激发下于674nm处有最大发射峰。

进一步地，所述DNA寡核苷酸的序列为5'-CACCGCTTTTGCCTTTTGGGGACGG ATA-3'。

本发明的第二个目的是提供一种所述DNA-AgNCs荧光生物传感器的合成方法。

该方法包括以下步骤：将DNA寡核苷酸与起始原料硝酸银加入到缓冲液中孵育，然后加入NaBH₄进行还原反应，再次孵育至生成银纳米簇。

优选地，所述缓冲液为pH 6.5-7.5的醋酸铵缓冲液或HEPES缓冲液或Tris-HCl缓冲液。

优选地，所述孵育的温度为1-10℃，在避光条件下进行。

优选地，所述还原反应体系中，硝酸银的终浓度为5-50μM，DNA和NaBH₄的终浓度各为1-20μM。

进一步优选地，所述硝酸银的终浓度为6μM，所述DNA 和NaBH₄的终浓度各为3μM。

本发明的第三个目的是提供所述DNA-AgNCs荧光生物传感器在检测福美双残留中的应用。

本发明的第四个目的是一种检测福美双残留的方法，该检测方法包括以下步骤：以所述DNA-AgNCs荧光生物传感器为探针，将其与检测样品进行孵育，用荧光光谱仪记录混合液的荧光发射广谱，激发波长为610nm，根据674nm处的荧光强度计算福美双浓度。

优选地，所述孵育的温度为35-45℃，时间10-20分钟。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

我们首次发现福美双可以与DNA-AgNCs的银原子发生强烈且竞争性的相互作用，从而在没有额外金属离子介体的情况下对DNA-AgNCs产生荧光猝灭效应。因此，基于DNA-AgNCs传感器成功开发了一种用于荧光检测福美双的猝灭型传感器。该传感器对福美双的响应可在10分钟内完成，检测限低至0.01μM，该传感器对福美双显示出卓越的检测灵敏度和特异性。此外，该传感器在苹果和土壤的实际样品中得到进一步验证，回收率令人满意。总的来说，本发明提出的这种“即混即检”荧光法是无标记的、操作简单、反应迅速、高度灵敏和特异性、不需要复杂的设计或金属离子介导的检测方法，在福美双快速现场检测中有巨大应用潜力。

更详尽的技术方案参见具体实施例。

附图说明

图1是福美双检测原理示意图。

图2是福美双对DNA-AgNCs荧光发射光谱的影响。

图3是DNA-AgNCs、存在福美双的DNA-AgNCs、福美双的FT-IR光谱。

图4是DNA-AgNCs、福美双、以及福美双存在下的DNA-AgNCs的紫外-可见吸收光谱。

图5是福美双对不同DNA序列合成的DNA-AgNCs荧光强度的影响。

图6是福美双对不同硝酸银浓度合成的DNA 0.75-AgNCs的荧光猝灭效率的影响。

图7是不同缓冲液pH值对DNA 0.75-AgNCs荧光的影响。

图8是DNA 0.75-AgNCs的紫外-可见吸收光谱。

图9是DNA 0.75-AgNCs的荧光激发和发射光谱。

图10是DNA 0.75-AgNCs的TEM图像，其中插入图分别为DNA 0.75-AgNCs的粒径尺寸分布和晶格图。

图11是缓冲液种类对DNA 0.75-AgNCs荧光猝灭效率的影响，其中，MES为2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液、PBS为磷酸盐缓冲液、AA为醋酸铵缓冲液、HEPES为羟乙基哌嗪乙硫磺酸、Tris-HCl为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、SA为醋酸钠缓冲液。

图12是孵育温度对DNA 0.75-AgNCs荧光猝灭效率的影响。

图13是孵育时间对DNA 0.75-AgNCs荧光猝灭效率的影响。

图14是DNA 0.75-AgNCs在不同浓度的福美双存在下的荧光发射光谱(A)以及I_F/I_F0与福美双浓度的线性关系图(B)。

图15是原料配比优化后的荧光发射光谱(A)以及I_F/I_F0与福美双浓度的线性关系图(B)。

图16是DNA 0.75-AgNCs在存在干扰物情况下的特异性检测结果。(A)阳离子(1-16分别代表：空白，福美双，Na⁺，K⁺，Ba²⁺，Fe²⁺，Fe³⁺，Zn²⁺，Co²⁺，Cd²⁺，Ni²⁺，Cr³⁺，Mg²⁺，Mn²⁺，Pb²⁺和Al³⁺)；(B)化学试剂(1-12：空白，福美双，赤霉素，脯氨酸，甘氨酸，赖氨酸，牛血清白蛋白，葡萄糖，甲硫醇钠，异丙硫醇，沙蚕毒素草酸盐，硫辛酸)；(C)杀虫剂(1-18：空白，福美双，乙胺磺隆，呋虫胺，烯唑醇，啶酰菌胺，甲基托布津，嘧菌酯，氰戊菊酯，藜芦碱，多菌灵，西维因，硝磺草酮，溴氰菊酯，苦参碱，啶虫脒，草甘膦，噻虫嗪)。在图A、B、C中，空白为DNA 0.75-AgNCs。图D、E、F是将DNA 0.75-AgNCs与福美双混合后作为空白1，其它干扰物与A、B、C相同。其中，福美双的浓度均为2.0μM。

图17是DNA 0.75-AgNCs在存在干扰物情况下的特异性检测结果。(A)阴离子(1-12分别代表:空白,福美双,HCO₃ ^-,SO₄ ^2-,NO₂ ^-,SO₃ ^2-,S₂O₃ ^2-,Cl^-,C₅H₇O₅COO^-,C₂O₄ ^2-,Br^-和CO₃ ^2-).(B)从1-6分别代表：空白,EDTA,Cu²⁺,EDTA+Cu²⁺,Hg²⁺,EDTA+Hg²⁺.图C和D是将DNA 0.75-AgNCs与福美双混合后作为空白1，其它实验组与A、B相同。其中，福美双的浓度均为2.0μM。

具体实施方式

为便于本领域技术人员实施本发明，以下结合具体实施例对本发明进行详细说明。应当理解，以下具体实施例仅用以解释本发明的技术方案，并不用于限制本发明的保护范围。实施例中所使用的材料和试剂，如无特别说明，均可从市售渠道获得。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或者仪器生产商提供的操作手册中建议的方法予以实施。

试剂和仪器：

DNA样品(DNA 0.75:5'-CACCGCTTTTGCCTTTTGGGGACGGATA-3'、DNA 0.94:5'-TTCCCACCCACCCCGGCCCGTT-3')购买于生工生物工程(上海)股份有限公司；从中国国药集团(上海)购买硼氢化钠(NaBH₄)、硝酸银(AgNO₃)、醋酸铵(CH₃COONH₄，AA)，还有干扰实验中的所有试剂；福美双购自美国Sigma-Aldrich公司。化学试剂贮存液由优普(中国四川)生产的超纯水配制而成。福美双原液(1mM)在无水乙醇中配制，一系列不同浓度的福美双溶液经超纯水稀释用于光学测量。所有化学试剂均为分析级，未经进一步纯化，即按原样使用。

荧光光谱数据均来自于RF-6000荧光分光光度计(日本岛津)所测；透射电子显微镜型号为：(TEM)FEI Talos F200X(捷克共和国)；使用UV-1800光谱仪(日本岛津)记录UV-vis吸收光谱；本工作中的傅立叶变换红外(FT-IR)光谱由Nicolet iS 50FT-IR光谱仪(Thermo Scientific，美国)表征。

实施例1福美双与DNA-AgNCs的相互作用研究

DNA-AgNCs的合成：15.0μL DNA (100μM)和10.0μL AgNO₃(300μM)依次与70.0μL醋酸铵缓冲液(10mM,pH 7.0)混合，然后剧烈震荡30s，4℃避光孵育20min，加入5.0μL现配的NaBH₄(300μM)，再次剧烈震荡30s，混合物在25℃和400rpm下反应30分钟，然后4℃避光孵育10h，即完成DNA-AgNCs的合成。

图1展示了基于荧光DNA-AgNCs的福美双检测示意图。在该检测系统中，单链DNA序列用作形成荧光DNA-AgNCs的模板，与硝酸银溶液混合后，在NaBH₄的还原作用下即可合成得到DNA-AgNCs。该DNA-AgNCs的最大激发波长为610nm，最大发射波长为674nm。加入福美双后，由于福美双与DNA-AgNCs银原子之间的竞争性相互作用，DNA-AgNCs的荧光发生猝灭，且DNA-AgNCs的荧光强度随福美双浓度的增加而逐渐降低。在本研究中，我们发现福美双可以与DNA-AgNCs的银原子结合，削弱DNA模板与AgNCs的相互作用，导致DNA-AgNCs的荧光猝灭效应。

如图2所示，DNA-AgNCs的荧光强度在福美双存在时明显弱于单独的DNA-AgNCs，表明福美双对DNA-AgNCs传感器的猝灭能力。这一结果表明，这种猝灭效应可用于福美双的“即混即检”监测，无需额外的金属离子介体。

福美双和DNA-AgNCs之间的相互作用通过FT-IR和UV-Vis吸收光谱实验得到证实。在图3的FT-IR结果中，福美双和带有DNA-AgNCs的福美双在561cm^-1左右出现峰值，这与在单独的DNA-AgNCs样品中没有观察到峰值形成对比，表明福美双和DNA-AgNCs之间存在相互作用。此外，如图4所示的UV-Vis吸收光谱分析，DNA-AgNCs的紫外-可见吸收强度在添加福美双后明显降低，这可能是由于福美双-银原子络合物的形成。以上这些结果表明，由于DNA-AgNCs中的银原子和福美双之间的强结合效应，使得DNA模板和DNA-AgNCs中的银原子之间的相互作用被福美双削弱，导致DNA-AgNCs的荧光猝灭。

实施例2DNA-AgNCs的合成优化及表征

1.合成优化

为了获得荧光传感器的最佳性能，优化了几个重要的实验参数。首先，银对胞嘧啶(C)碱基的亲和力高于其他碱基，因此选择C碱基含量高的寡核苷酸序列作为模板合成高荧光量子产率(FLQY)的DNA-AgNCs。其次，本发明中福美双荧光测定的机制是基于福美双和DNA-AgNCs中的银原子之间的竞争反应。因此，本案例中用于合成DNA-AgNCs的DNA模板中C碱基含量对于福美双荧光传感器的性能有着重要影响。采用两条不同C碱基含量的DNA模板合成DNA-AgNCs进行实验，这两条序列中C碱基含量分别为25％和59％，对应的荧光量子产率(FLQY)分别为0.75(标记为：DNA0.75-AgNCs)和0.94(标记为：DNA 0.94-AgNCs)。图5中，两种DNA-AgNCs表现出不同强度的荧光，其中，DNA 0.94-AgNCs在四种样品中表现出最高的荧光强度；然而，这两种DNA-AgNCs对福美双的响应明显不同，DNA 0.75-AgNCs对福美双的荧光响应比DNA 0.94-AgNCs更灵敏。因此，选择DNA 0.75-AgNCs进行进一步实验。

所述两种不同C碱基含量的模板单链DNA序列如下：

C碱基含量为25％的单链DNA：5'-CACCGCTTTTGCCTTTTGGGGACGGATA-3'

C碱基含量为59％的单链DNA：5'-TTCCCACCCACCCCGGCCCGTT-3'

该荧光传感器的传感机制是基于DNA 0.75-AgNCs中的银原子和福美双之间更强的配位作用，导致DNA 0.75-AgNCs的荧光被福美双猝灭，因此，DNA 0.75-AgNCs中银原子的量决定了DNA 0.75-AgNCs传感器的灵敏度性能。我们研究了不同浓度的硝酸银合成的DNA0.75-AgNCs和其在2.0μM thiram存在下的荧光光谱，统计数据如图6所示，I_F0和I_F分别表示存在和不存在福美双时，DNA 0.75-AgNCs在674nm处的荧光强度，数据显示DNA 0.75-AgNCs在2.0μM福美双存在下的荧光猝灭效率随着硝酸银浓度的增加而发生明显变化，当硝酸银浓度为30μM时，同一浓度的福美双对DNA 0.75-AgNCs的荧光猝灭效果最好。同时，合成DNA0.75-AgNCs的缓冲液pH值从4.0优化到11.0，在674nm处，DNA 0.75-AgNCs传感器在pH 7.0时显示出最高的荧光强度(图7)。因此，DNA 0.75-AgNCs合成优化后的实验条件为醋酸铵缓冲液(pH7.0)、15μM DNA 0.75、30μM硝酸银和15μM硼氢化钠。

另外，DNA-AgNCs的光学特性具有尺寸依赖性，因此DNA-AgNCs的尺寸对检测性能具有一定影响，需精细控制反应条件如时间、温度等。

2.DNA 0.75-AgNCs的表征

在优化条件下，合成的DNA 0.75-AgNCs的紫外-可见吸收光谱在610nm附近表现出明显的峰值(图8)。DNA 0.75-AgNCs的荧光光谱显示最大激发波长为610nm，最大发射波长为674nm(图9)。通过TEM分析表征DNA 0.75-AgNCs的大小和形态，DNA0.75-AgNCs呈球形，具有良好的单分散性，平均尺寸为3.1nm，晶格间距为0.21nm(图10)。

实施例3福美双传感性能

1.传感性能优化

缓冲液种类对DNA 0.75-AgNCs传感器检测福美双的性能至关重要，如图11所示，DNA 0.75-AgNCs传感器在醋酸铵(AA)、羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液(Tris-HCl)中的性能均较好，可以选择醋酸铵(AA)作为缓冲液。此外，还优化了DNA 0.75-AgNCs传感器检测福美双的孵育温度和时间。在图12中，随着孵育温度的升高，I_F/I_F0的比值逐渐减小并在37℃达到平台期，因此选择37℃作为最佳孵育温度。图13显示，随着孵育时间的增加，I_F/I_F0的比值逐渐降低，并在10min时达到平台，因此选择10min为最佳孵育时间。最终，福美双检测操作的最佳条件是将DNA 0.75-AgNCs与福美双样品在醋酸铵缓冲液(pH 7.0)中于37℃孵育10分钟。

2.线性和灵敏性

将DNA-AgNCs溶液置于37℃水浴10分钟，然后DNA-AgNCs(90.0μL)与10.0μL含不同浓度福美双的溶液混匀。37℃再孵育10分钟后，使用荧光分光光度计记录混合物在674nm处的荧光强度。

在与不同浓度的福美双孵育后，记录了DNA 0.75-AgNCs传感器的荧光光谱，在图14A中，在福美双浓度范围为0.2至2.0μM内，可以看到DNA-AgNCs的荧光强度随着福美双浓度的增加而逐渐降低，且在此浓度范围内，I_F/I_F0与福美双的浓度呈现良好的线性关系(图14B)，线性回归方程为y＝1.00-0.414[thiram]，R²＝0.994，其中[thiram]代表福美双的浓度。根据检测限(LOD)计算公式LOD＝3δ/S等式计算所得的LOD为0.2μM(S/N≥3)，其中3是99％的置信因子，δ是20个空白样的标准偏差值，S是线性回归方程的斜率。

进一步实验表明，当将合成DNA 0.75-AgNCs的原料试剂进行等比例稀释后(AgNO₃、DNA和NaBH₄浓度比分别为6μM、3μM和3μM)，得到的DNA 0.75-AgNCs传感器可以用于更低浓度的福美双的检测。在图15A中，可以看到新合成的DNA0.75-AgNCs的荧光强度在0.012μM至0.20μM的范围内随着福美双浓度的增加而逐渐降低，并且I_F/I_F0与福美双间的线性关系为y＝1.00-2.61[thiram]，其中R²＝0.999(图15B)。根据上述相同计算方法，福美双LOD的计算结果为0.01μM(S/N≥3)，低于之前报道的大多数传感方法。此外，这种荧光传感器不需要引入额外的金属离子或酶，具有很高的稳定性和准确性。此外，DNA 0.75-AgNCs传感器的制备非常简单(在一个试管中即混即检)且便宜。在当前实验室环境中，每次测试的总成本不到0.368美元。整个检测过程可在10分钟内在单管孵育中完成，表明该荧光传感器在方便快捷的福美双检测方面具有良好的应用前景。

3.特异性

为了验证DNA-AgNCs对福美双检测的特异性，选择干扰离子(Na⁺,K⁺,Ba²⁺,Fe²⁺,Fe^{3 +},Zn²⁺,Co²⁺,Cd²⁺,Ni²⁺,Cr³⁺,Mg²⁺,Mn²⁺,Pb²⁺,Al³⁺,Hg²⁺,Cu²⁺,HCO₃ ^-,SO₄ ^2-,NO₂ ^-,SO₃ ^2-,S₂O₃ ^2-,Cl^-,C₅H₇O₅COO^-,C₂O₄ ^2-,Br^-,CO₃ ^2-)的浓度是福美双浓度(2.0μM)的10倍，其他农药和营养物质的浓度是福美双浓度(2.0μM)的5倍进行干扰实验。这些实验分别在存在和不存在福美双的情况下进行。

评估开发的荧光探针对福美双的特异性，在优化的实验条件下使用多种干扰物质进行了干扰测试。干扰物质包括14种常见的阳离子(Na⁺，K⁺，Ba²⁺，Fe²⁺，Fe³⁺，Zn²⁺，Co²⁺，Cd²⁺，Ni²⁺，Cr³⁺，Mg²⁺，Mn²⁺，Pb²⁺，Al³⁺，Hg²⁺，Cu²⁺)，10种阴离子(HCO₃ ^-，SO₄ ^2-，NO₂ ^-，SO₃ ^2-，S₂O₃ ^2-，Cl^-，C₅H₇O₅COO^-，C₂O₄ ^2-，Br^-，CO₃ ^2-)，一种植物激素(赤霉素)，十六种通用农药(乙胺磺隆，呋虫胺，烯唑醇，啶酰菌胺，甲基托布津，嘧菌酯，氰戊菊酯，藜芦碱，多菌灵，西维因，硝磺草酮，溴氰菊酯，苦参碱，啶虫脒，草甘膦，噻虫嗪)，共存营养物质(脯氨酸，甘氨酸，赖氨酸，牛血清白蛋白(BSA)，葡萄糖)和四种具有巯基/二硫键的化学试剂(甲硫醇钠，异丙硫醇，沙蚕毒素草酸盐，硫辛酸)。值得一提的是，这些选择的通用杀虫剂是在作物生产过程中广泛使用的广谱杀虫剂和杀菌剂，它们可能保留在水果和土壤样品中，并可能干扰福美双的检测。此外，该探针高度依赖福美双对DNA 0.75-AgNCs中银原子的竞争作用，我们分析很可能是因为银元素易与含有N、S、O原子的化合物结合，碰巧福美双的化学结构中有一个二硫键，因此选择具有巯基或二硫键的化合物作为干扰代表。如图16、17所示，记录了各干扰物以及这些干扰物与福美双的混合对DNA 0.75-AgNCs在674nm处荧光强度的影响，这些干扰物中的大多数对该荧光探针的影响可以忽略不计。

需要注意的是，Cu²⁺和Hg²⁺金属离子在674nm处对DNA 0.75-AgNCs的荧光强度表现出明显的猝灭效应，这可能是由于Cu²⁺和Hg²⁺与DNA-AgNCs具有潜在的相互作用。然而，当在检测体系中加入乙二胺四乙酸(EDTA)后，由于EDTA和Cu²⁺/Hg²⁺的强螯合作用可导致对该荧光探针的影响可以忽略不计，因此，EDTA可用于消除Cu²⁺和Hg²⁺对DNA 0.75-AgNCs荧光传感器的影响。总的来说，常见的许多干扰物质对DNA0.75-AgNCs荧光传感器检测福美双表现出可控的影响；因此，我们所提出的检测策略在金属离子共存样品中对福美双的检测具有广阔的应用前景。

实施例4福美双在实际样品检测中的应用

苹果样品购自华中农业大学超市，土壤采自学校草坪(中国武汉)。实际样品的前处理如下：将土壤和苹果样品(2.0g)与10.0mL乙腈混合，然后剧烈震荡2分钟，超声提取60分钟，然后以9000rpm离心10分钟。收集上清液后，通过0.22μM滤膜去除剩余的固体杂质。然后采用加标回收法验证了该DNA 0.75-AgNCs荧光传感器在实际样品中的检测。加标福美双浓度为0.10μM和1.0μM，使用相应的标准曲线计算实际样品中加标福美双的浓度。结果表明，苹果样品中加标福美双(浓度为0.10μM和1.0μM)的回收率分别为101.0％和102.0％，土壤样品中加标福美双的回收率均为101.0％，相对标准偏差(RSD)值低于2.8％。上述结果表明，所提出的方法有望用于实际样品中的福美双的分析。

总之，我们首先发现福美双可以与DNA-AgNCs的银原子发生强烈且竞争性的相互作用，从而在没有额外金属离子介体的情况下对DNA-AgNCs产生荧光猝灭效应。因此，基于DNA 0.75-AgNCs成功开发了一种用于荧光检测福美双的猝灭型传感器。该传感器对福美双的响应可在10分钟内完成，福美双检测限低至0.01μM。且该传感器在优化的实验条件下显示出卓越的灵敏度和特异性。此外，该传感器在苹果和土壤的实际样品中得到进一步验证，回收率较好。总的来说，这里提出的这种“即混即检”荧光传感器是无标记的、操作简单、反应迅速、高度灵敏和特异性、不需要复杂的设计或金属离子介质的检测方法，在福美双快速现场检测中有巨大应用潜力。

以上具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种DNA-AgNCs荧光生物传感器，其特征在于：它是以硝酸银为起始原料，DNA寡核苷酸为稳定剂，硼氢化钠为还原剂形成的DNA模板化银纳米簇，其中，所述DNA寡核苷酸为单链DNA，其C碱基含量为20-60％，该荧光生物传感器的荧光光谱在610nm激发下于674nm处有最大发射峰。

2.如权利要求1所述的DNA-AgNCs荧光生物传感器，其特征在于：所述DNA寡核苷酸的序列为5'-CACCGCTTTTGCCTTTTGGGGACGGATA-3'。

3.一种合成权利要求1或2所述DNA-AgNCs荧光生物传感器的方法，其特征在于包括以下步骤：将DNA寡核苷酸与起始原料硝酸银加入到缓冲液中孵育，然后加入NaBH₄进行还原反应，再次孵育至生成银纳米簇。

4.如权利要求3所述的合成方法，其特征在于：所述缓冲液为pH 6.5-7.5的醋酸铵缓冲液或HEPES缓冲液或Tris-HCl缓冲液。

5.如权利要求3所述的合成方法，其特征在于：所述孵育的温度为1-10℃，在避光条件下进行。

6.如权利要求3所述的合成方法，其特征在于：所述还原反应体系中，硝酸银的终浓度为5-50μM，DNA和NaBH₄的终浓度各为1-20μM。

7.如权利要求6所述的合成方法，其特征在于：Ag⁺的终浓度为6μM，DNA和NaBH₄的终浓度各为3μM。

8.权利要求1或2所述的DNA-AgNCs荧光生物传感器在检测福美双残留中的应用。

9.一种检测福美双残留的方法，其特征在于包括以下步骤：以权利要求1或2所述DNA-AgNCs荧光生物传感器为探针，将其与检测样品进行孵育，用荧光光谱仪记录混合液的荧光发射广谱，激发波长为610nm，根据674nm处的荧光强度计算福美双浓度。

10.如权利要求9所述检测福美双残留的方法，其特征在于：所述孵育的温度为35-45℃，时间10-20分钟。

Images