DE4317595A1 - Verfahren zur Toxizitätsermittlung von Proben durch Biotest - Google Patents
Verfahren zur Toxizitätsermittlung von Proben durch BiotestInfo
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Toxizitätsermittlung von
Proben durch Biotest zur Diagnose von Umweltnoxen.
Die Verwendung von Mikroorganismen zur Messung kritischer Bela
stungen durch toxische Substanzen (US-PS 39 81 777) sowie zur
Bestimmung von Antibiotikakonzentrationen (EP 02 00 226) ist be
kannt. Diesen Methoden liegt die Erfassung des Wachstums der
Test-Organismen durch Auszählen der Kolonien, Trübungsmessungen
usw. zugrunde. Diese Meßverfahren erfordern die Kultivierung gro
ßer Mengen von Mikroorganismen, so daß verläßliche Messungen erst
nach einem Zeitraum von 16 bis 22 Stunden durchgeführt werden
können.
Natürlich vorkommende, zur Biolumineszenz fähige Mikroorganismen
sind nach Resistenz-Adaptation im Labor zum Nachweis bestimmter
Toxine eingesetzt worden (PCT/US 84/01 217). Diese Methode hat
den Nachteil, daß natürlich vorkommende biolumineszierende Mikro
organismen eine hohe Ionenstärke im Testmedium benötigen, die
möglicherweise verfälschend auf die Messung wirkt, weil die Lös
lichkeit einiger Schadstoffe und damit ihre Verfügbarkeit im Bio
test reduziert wird.
Es ist insbesondere aus der medizinischen Diagnostik bekannt,
durch Einwirkung toxischer Stoffe hervorgerufene Veränderungen
von Blutzellen durch Chemilumineszenzmessungen zu bestimmen (Bio
luminescence and Chemiluminescence; Proc. of the VIth Intern.
Symp. on Bioluminescence and Chemiluminescence, Cambridge, Sept.
1990, John Wilcy & Sons, 1991).
Jeder bekannte Biotest ist gegenüber verschiedenen Noxen unter
schiedlich empfindlich. Toxikologische Befunde werden deshalb
durch Testbatterien gesichert. Das Ergebnis bekannter Bioteste
liefert nur eine Ja/nein-Aussage über die Anwesenheit einer Noxe
bzw. eines Noxengemisches oberhalb einer vom Testorganismus ab
hängigen Schwellenkonzentration.
Die Aufgabe der Erfindung ist es, einen Biotest zu entwickeln,
dessen Meßergebnis zusätzliche Informationen enthält, aus denen
Aussagen über die vorwiegend wirksame Noxenart abgeleitet werden
können.
Erfindungsgemäß wird die Bestimmung von Umweltnoxen mit minde
stens zwei verschiedenen Mikroorganismen oder Zellenarten durch
geführt, deren Empfindlichkeit gegenüber verschiedenen Noxenarten
unterschiedlich ist, wobei als Meßgröße die Zell-Chemilumineszenz
(CL), die durch Erzeugung von reaktiven Sauerstoffmetaboliten an
der Zelle in Gegenwart von Luminol erzeugt und durch Enzyme und
Ionen katalysiert wird, dient.
Zell-Chemilumineszenzkurven, die nach Wechselwirkung der Zelle
während einer Inkubationszeit für verschiedene Noxen gemessen
werden, zeigen unterschiedlichen Verlauf (Fig. 1). Der Kurvenver
lauf kann am besten durch die biexponentielle Funktion
Y = y1 * exp. (-t/HWZ1) + y2 * exp. (-t/HWZ2)
gefittet werden.
Die maximale Amplitude der CL y1 und die Halbwertzeit des ersten
Abklingbereichs HWZ1 zeigen Noxenwirkungen am empfindlichsten und
proportional ihrer Konzentration an. Sie sind in jeder Testserie
durch die entsprechende CL-Amplitude y0 bzw. HWZO einer noxen
freien Kontrollprobe zu normieren.
Ein Beispiel für die Konzentrationsabhängigkeit der Zell-CL ist
in Fig. 2 für die Noxe Hydrochinon dargestellt.
Aus diesen Kurven für repräsentative Noxen können dann Kalibrier
kurven (Fig. 3) erzeugt werden.
Die Zusatzinformation über eine vorwiegend wirksame Noxe kann nun
grafisch oder rechnerisch ermittelt werden.
Das Prinzip der grafischen Ermittlung der vorwiegend in einer
Probe wirksamen Noxenart kann beispielsweise mit folgenden Ver
fahrensschritten gezeigt werden:
- 1. Messung von Kalibrierkurven für eine Anzahl repräsentativer Schadstoffe mit 2 verschiedenen Mikroorganismen bzw. Zellen.
- 2. Bestimmung der toxischen Wirkung von Proben unbekannten Schad stoffgehaltes mit den zur Kalibrierung verwendeten Mikroorga nismen.
- 3. Bei einer Anzeige von Schadstoffen Messung einer Probenverdün nungsreihe mit beiden Mikroorganismen bzw. Zellarten und Bestimmung des GL-Wertes der Probe (GL-Wert = Verdünnungsfak tor für die Probe, bei der keine Toxizität mehr signifikant nachgewiesen werden kann).
- 4. Vergleich der relativen CL-Amplituden y1 beider Testorganismen
mit entsprechenden Werten der Kalibrierkurven für die Proben
verdünnungsstufe oberhalb des GL-Wertes.
Beträgt z. B. y1/y0 für die erste Verdünnungsstufe oberhalb des GL-Wertes 1 für den BAKN-Bacillus und 0,4-0,5 für den BAKS-Bacillus, so kann mit Hilfe von Fig. 3.2 geschlußfolgert werden, daß die Probe vorwiegend mit Phenol kontaminiert ist.
Für eine rechnerische Lösung der Aufgabenstellung gehen wir bei
spielsweise davon aus, daß 2 Noxen mit den Konzentrationen
c(No1) und c(No2) in der Probe enthalten sind. Beide Noxen wirken
sowohl auf Mikroorganismus 1 (M01) als auch auf Mikroorganismus 2
(Mo2). Die gesamte CL, die nach der Inkubationszeit mit M01 regi
striert wird, ist dann:
CL(M01) = c(No1) * y1/y0(No1, M01) + c(No2) * y1/y0(No2, M01)
y1/y0 bedeutet die relative y1-Amplitude, die durch Einwirkung
von Noxe 1 auf M01 entsteht. Entsprechend beträgt die mit M02 re
gistrierte CL:
CL(M02) = c(No1) * y1/y0(No1, M02) + c(No2) * y1/y0(No2, M02).
Da die relativen y1-Werte aus den konzentrationsabhängigen CL-
Kurven berechnet werden können und die CL(M01) und CL(M02) dem
Integral der CL-Kurve entsprechen, können die Gleichungen aufge
löst werden:
Mit den relativen y1-Werten der Probe für M01 bzw. M02 lassen
sich die c(No1)- bzw. c(No2)-Werte berechnen.
Voraussetzung für die Anwendung beider Auswertungsverfahren ist
die Aufnahme von Kalibrierkurven für repräsentative Noxen.
Die Durchführung der Bioteste erfolgt unter den dafür üblichen
Bedingungen; jedoch muß jede Probe mit Mikroorganismus 1 und
Mikroorganismus 2 bzw. Zellart 1 und Zellart 2 gemessen werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist auch anwendbar bei Toxizitäts
bestimmungen mit Hilfe von Biosensoren. Als Meßgröße wird in die
sem Fall der Sauerstoffverbrauch oder die H₂O₂-Bildung benutzt.
Als Mikroorganismen wurden zwei verschiedene Stämme des Bacillus
subtilis und Protozoen verwendet. Für das erfindungsgemäße Ver
fahren eignen sich jedoch auch andere Mikroorganismen und Zell
arten. Bedingung ist, daß das jeweils verwendete Meß-Paar unter
schiedliche Empfindlichkeiten gegenüber verschiedenen Noxenarten
aufweist.
Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens:
- - Es wird nicht nur die Anwesenheit von Toxizität in der Probe signalisiert, sondern es kann auch eine Aussage über die vor wiegend wirksame Noxe aus dem Meßergebnis abgeleitet werden.
- - Der Aufwand für herkömmliche Bioteste durch Testbatterien kann reduziert werden. Damit können die Kosten für den Biotest redu ziert werden.
- - In Einzelfällen kann auf zusätzliche chemische Analytik ver zichtet werden.
Claims (4)
1. Verfahren zur Toxizitätsermittlung von Proben durch Biotest,
dadurch gekennzeichnet, daß der Biotest mit mindestens zwei
Mikroorganismen oder Zellarten durchgeführt wird, deren
Empfindlichkeit gegenüber verschiedenen Noxenarten unter
schiedlich ist und aus dieser Unterschiedlichkeit die vorwie
gend wirksame Noxenart rechnerisch oder grafisch ermittelt
wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
vorwiegend wirksamen Noxenkonzentrationen mit Hilfe folgender
Gleichungen ermittelt werden können:
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
vorwiegend wirksamen Noxenkonzentrationen folgendermaßen aus
den Kalibrierkurven grafisch ermittelt werden können:
- - Messung von Kalibrierkurven für eine Anzahl repräsentativer Schadstoffe mit 2 verschiedenen Mikroorganismen bzw. Zellen.
- - Bestimmung der toxischen Wirkung von Proben unbekannten Schadstoffgehaltes mit den zur Kalibrierung verwendeten Mikroorganismen.
- - Bei einer Anzeige von Schadstoffen Messung einer Probenver dünnungsreihe mit beiden Mikroorganismen bzw. Zellarten und Bestimmung des GL-Wertes der Probe (GL-Wert = Verdünnungs faktor für die Probe, bei der keine Toxizität mehr signifi fikant nachgewiesen werden kann).
- - Vergleich der relativen CL-Amplituden y1 beider Testorganis men mit entsprechenden Werten der Kalibrierkurven für die Probenverdünnungsstufe oberhalb des GL-Wertes.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
Toxizitätsbestimmung auch mit Biosensoren unterschiedlicher
Empfindlichkeit gegenüber verschiedenen Noxenarten vorgenommen
werden kann.
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DE4317595A1 true DE4317595A1 (de) | 1994-12-01 |
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Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE4317595A1 (de) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2000047761A2 (en) * | 1999-02-12 | 2000-08-17 | Phase-1 Molecular Toxicology, Inc. | High-throughput toxicological testing using cultured organisms and cells |
WO2001090402A1 (en) * | 2000-05-24 | 2001-11-29 | Phplate Stockholm Ab | New method and device |
-
1993
- 1993-05-24 DE DE19934317595 patent/DE4317595A1/de not_active Withdrawn
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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WO2000047761A2 (en) * | 1999-02-12 | 2000-08-17 | Phase-1 Molecular Toxicology, Inc. | High-throughput toxicological testing using cultured organisms and cells |
WO2000047761A3 (en) * | 1999-02-12 | 2000-11-30 | Phase 1 Molecular Toxicology I | High-throughput toxicological testing using cultured organisms and cells |
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