DE4317595A1

DE4317595A1 - Verfahren zur Toxizitätsermittlung von Proben durch Biotest

Info

Publication number: DE4317595A1
Application number: DE19934317595
Authority: DE
Inventors: Heinz Dr Schmidt; Ursula Klamm
Original assignee: FZB BIOTECHNIK GmbH
Priority date: 1993-05-24
Filing date: 1993-05-24
Publication date: 1994-12-01

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Toxizitätsermittlung von Proben durch Biotest zur Diagnose von Umweltnoxen.

Die Verwendung von Mikroorganismen zur Messung kritischer Bela stungen durch toxische Substanzen (US-PS 39 81 777) sowie zur Bestimmung von Antibiotikakonzentrationen (EP 02 00 226) ist be kannt. Diesen Methoden liegt die Erfassung des Wachstums der Test-Organismen durch Auszählen der Kolonien, Trübungsmessungen usw. zugrunde. Diese Meßverfahren erfordern die Kultivierung gro ßer Mengen von Mikroorganismen, so daß verläßliche Messungen erst nach einem Zeitraum von 16 bis 22 Stunden durchgeführt werden können.

Natürlich vorkommende, zur Biolumineszenz fähige Mikroorganismen sind nach Resistenz-Adaptation im Labor zum Nachweis bestimmter Toxine eingesetzt worden (PCT/US 84/01 217). Diese Methode hat den Nachteil, daß natürlich vorkommende biolumineszierende Mikro organismen eine hohe Ionenstärke im Testmedium benötigen, die möglicherweise verfälschend auf die Messung wirkt, weil die Lös lichkeit einiger Schadstoffe und damit ihre Verfügbarkeit im Bio test reduziert wird.

Es ist insbesondere aus der medizinischen Diagnostik bekannt, durch Einwirkung toxischer Stoffe hervorgerufene Veränderungen von Blutzellen durch Chemilumineszenzmessungen zu bestimmen (Bio luminescence and Chemiluminescence; Proc. of the VIth Intern. Symp. on Bioluminescence and Chemiluminescence, Cambridge, Sept. 1990, John Wilcy & Sons, 1991).

Jeder bekannte Biotest ist gegenüber verschiedenen Noxen unter schiedlich empfindlich. Toxikologische Befunde werden deshalb durch Testbatterien gesichert. Das Ergebnis bekannter Bioteste liefert nur eine Ja/nein-Aussage über die Anwesenheit einer Noxe bzw. eines Noxengemisches oberhalb einer vom Testorganismus ab hängigen Schwellenkonzentration.

Die Aufgabe der Erfindung ist es, einen Biotest zu entwickeln, dessen Meßergebnis zusätzliche Informationen enthält, aus denen Aussagen über die vorwiegend wirksame Noxenart abgeleitet werden können.

Erfindungsgemäß wird die Bestimmung von Umweltnoxen mit minde stens zwei verschiedenen Mikroorganismen oder Zellenarten durch geführt, deren Empfindlichkeit gegenüber verschiedenen Noxenarten unterschiedlich ist, wobei als Meßgröße die Zell-Chemilumineszenz (CL), die durch Erzeugung von reaktiven Sauerstoffmetaboliten an der Zelle in Gegenwart von Luminol erzeugt und durch Enzyme und Ionen katalysiert wird, dient.

Zell-Chemilumineszenzkurven, die nach Wechselwirkung der Zelle während einer Inkubationszeit für verschiedene Noxen gemessen werden, zeigen unterschiedlichen Verlauf (Fig. 1). Der Kurvenver lauf kann am besten durch die biexponentielle Funktion

Y = y1 _* exp. (-t/HWZ1) + y2 _* exp. (-t/HWZ2)

gefittet werden.

Die maximale Amplitude der CL y1 und die Halbwertzeit des ersten Abklingbereichs HWZ1 zeigen Noxenwirkungen am empfindlichsten und proportional ihrer Konzentration an. Sie sind in jeder Testserie durch die entsprechende CL-Amplitude y0 bzw. HWZO einer noxen freien Kontrollprobe zu normieren.

Ein Beispiel für die Konzentrationsabhängigkeit der Zell-CL ist in Fig. 2 für die Noxe Hydrochinon dargestellt.

Aus diesen Kurven für repräsentative Noxen können dann Kalibrier kurven (Fig. 3) erzeugt werden.

Die Zusatzinformation über eine vorwiegend wirksame Noxe kann nun grafisch oder rechnerisch ermittelt werden.

Das Prinzip der grafischen Ermittlung der vorwiegend in einer Probe wirksamen Noxenart kann beispielsweise mit folgenden Ver fahrensschritten gezeigt werden:

1. Messung von Kalibrierkurven für eine Anzahl repräsentativer Schadstoffe mit 2 verschiedenen Mikroorganismen bzw. Zellen.
2. Bestimmung der toxischen Wirkung von Proben unbekannten Schad stoffgehaltes mit den zur Kalibrierung verwendeten Mikroorga nismen.
3. Bei einer Anzeige von Schadstoffen Messung einer Probenverdün nungsreihe mit beiden Mikroorganismen bzw. Zellarten und Bestimmung des GL-Wertes der Probe (GL-Wert = Verdünnungsfak tor für die Probe, bei der keine Toxizität mehr signifikant nachgewiesen werden kann).
4. Vergleich der relativen CL-Amplituden y1 beider Testorganismen mit entsprechenden Werten der Kalibrierkurven für die Proben verdünnungsstufe oberhalb des GL-Wertes.
Beträgt z. B. y1/y0 für die erste Verdünnungsstufe oberhalb des GL-Wertes 1 für den BAKN-Bacillus und 0,4-0,5 für den BAKS-Bacillus, so kann mit Hilfe von Fig. 3.2 geschlußfolgert werden, daß die Probe vorwiegend mit Phenol kontaminiert ist.

Für eine rechnerische Lösung der Aufgabenstellung gehen wir bei spielsweise davon aus, daß 2 Noxen mit den Konzentrationen c(No1) und c(No2) in der Probe enthalten sind. Beide Noxen wirken sowohl auf Mikroorganismus 1 (M01) als auch auf Mikroorganismus 2 (Mo2). Die gesamte CL, die nach der Inkubationszeit mit M01 regi striert wird, ist dann:

CL(M01) = c(No1) _* y1/y0(No1, M01) + c(No2) _* y1/y0(No2, M01)

y1/y0 bedeutet die relative y1-Amplitude, die durch Einwirkung von Noxe 1 auf M01 entsteht. Entsprechend beträgt die mit M02 re gistrierte CL:

CL(M02) = c(No1) _* y1/y0(No1, M02) + c(No2) _* y1/y0(No2, M02).

Da die relativen y1-Werte aus den konzentrationsabhängigen CL- Kurven berechnet werden können und die CL(M01) und CL(M02) dem Integral der CL-Kurve entsprechen, können die Gleichungen aufge löst werden:

Mit den relativen y1-Werten der Probe für M01 bzw. M02 lassen sich die c(No1)- bzw. c(No2)-Werte berechnen.

Voraussetzung für die Anwendung beider Auswertungsverfahren ist die Aufnahme von Kalibrierkurven für repräsentative Noxen.

Die Durchführung der Bioteste erfolgt unter den dafür üblichen Bedingungen; jedoch muß jede Probe mit Mikroorganismus 1 und Mikroorganismus 2 bzw. Zellart 1 und Zellart 2 gemessen werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist auch anwendbar bei Toxizitäts bestimmungen mit Hilfe von Biosensoren. Als Meßgröße wird in die sem Fall der Sauerstoffverbrauch oder die H₂O₂-Bildung benutzt.

Als Mikroorganismen wurden zwei verschiedene Stämme des Bacillus subtilis und Protozoen verwendet. Für das erfindungsgemäße Ver fahren eignen sich jedoch auch andere Mikroorganismen und Zell arten. Bedingung ist, daß das jeweils verwendete Meß-Paar unter schiedliche Empfindlichkeiten gegenüber verschiedenen Noxenarten aufweist.

Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens:

- Es wird nicht nur die Anwesenheit von Toxizität in der Probe signalisiert, sondern es kann auch eine Aussage über die vor wiegend wirksame Noxe aus dem Meßergebnis abgeleitet werden.
- Der Aufwand für herkömmliche Bioteste durch Testbatterien kann reduziert werden. Damit können die Kosten für den Biotest redu ziert werden.
- In Einzelfällen kann auf zusätzliche chemische Analytik ver zichtet werden.

Claims

1. Verfahren zur Toxizitätsermittlung von Proben durch Biotest, dadurch gekennzeichnet, daß der Biotest mit mindestens zwei Mikroorganismen oder Zellarten durchgeführt wird, deren Empfindlichkeit gegenüber verschiedenen Noxenarten unter schiedlich ist und aus dieser Unterschiedlichkeit die vorwie gend wirksame Noxenart rechnerisch oder grafisch ermittelt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die vorwiegend wirksamen Noxenkonzentrationen mit Hilfe folgender Gleichungen ermittelt werden können:

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die vorwiegend wirksamen Noxenkonzentrationen folgendermaßen aus den Kalibrierkurven grafisch ermittelt werden können:

- Messung von Kalibrierkurven für eine Anzahl repräsentativer Schadstoffe mit 2 verschiedenen Mikroorganismen bzw. Zellen.
- Bestimmung der toxischen Wirkung von Proben unbekannten Schadstoffgehaltes mit den zur Kalibrierung verwendeten Mikroorganismen.
- Bei einer Anzeige von Schadstoffen Messung einer Probenver dünnungsreihe mit beiden Mikroorganismen bzw. Zellarten und Bestimmung des GL-Wertes der Probe (GL-Wert = Verdünnungs faktor für die Probe, bei der keine Toxizität mehr signifi fikant nachgewiesen werden kann).
- Vergleich der relativen CL-Amplituden y1 beider Testorganis men mit entsprechenden Werten der Kalibrierkurven für die Probenverdünnungsstufe oberhalb des GL-Wertes.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Toxizitätsbestimmung auch mit Biosensoren unterschiedlicher Empfindlichkeit gegenüber verschiedenen Noxenarten vorgenommen werden kann.