DE3788151T2

DE3788151T2 - Schadstoffdetektor.

Info

Publication number: DE3788151T2
Application number: DE19873788151
Authority: DE
Inventors: David Michael Rawson
Original assignee: Water Research Centre
Current assignee: Water Research Centre
Priority date: 1986-04-16
Filing date: 1987-04-16
Publication date: 1994-05-19
Anticipated expiration: 2007-04-17
Also published as: EP0242225B1; EP0242225A2; EP0242225A3; DE3788151D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Verunreinigungsdetektor und ein Verfahren zum Nachweisen von Verschmutzung. Insbesondere, aber nicht ausschließlich, betrifft die Erfindung ein Verfahren und Gerät zum Nachweisen von Verschmutzung in wässerigen Flüssigkeiten, z. B. der Wasserversorgung, durch Verwendung eines bakteriellen Sensormittels.
Dreißig Prozent der Wasserversorgung im Vereinigten Königreich werden direkt aus Flüssen bezogen, welche gelegentlich verschmutzt sein können. Eine solche Verschmutzung kann zur Abschaltung der Wasserreinigungsanlagen führen, wenn sie rechtzeitig entdeckt wird. Wenn die Verschmutzung nicht rechtzeitig entdeckt wird, kann die Wasserversorgung kontaminiert werden. Viele der Verunreinigungen, die in Flüsse gelangen können, sind giftige Chemikalien, z. B. Herbizide, welche während des normalen Wasserreinigungsverfahrens nicht abgebaut werden.
Typische Verunreinigungen, die in Wasserversorgungen gefunden werden können und die durch die vorliegende Erfindung nachgewiesen werden können, schließen ein:
Dieselöl Öl
Petroleum Anilin
Metallsalze z. B. von Cd, Cu, Cr landwirtschaftliche Chemikalien
und insbesondere solche kommerziellen herbiziden Formulierungen wie:
DIQUAT PARAQUAT
MORPHAMQUAT BROMOXYNIL
DICHLOBENIL DIPHENATRILE
IOXYNIL AMETRYNE
ATRATONE ATRAZINE
AZIPOTRYN BLADEX
CHLORAZINE CYPRAZINE
DESMETRYNE IPAZINE
METHOPROTYN PROMETRONE
PROMETRYNE PROPAZINE
SIMAZINE SIMETONE
SIMETRYNE TERBUTRYN
TRIETAZINE BENZOMARC
BENZTHIAZURON BUTURON
CHLOROBROMURON CHLOROXURON
CHLORTOLURON CYCLURON
DCU DIFENOXURON
DIURON (DCMU) FENURON
FLUOMETURON ISONORURON
KARBUTILATE LINURON
METHABENZTHIAZURON METOBROMURON
METOXURON MONOLINURON
MONURON MONURON-TCA
NEBURON NOREA
SIDURON TRIMETURON
ACROLEIN PYRAZON
6706 9785
9774 BROMOCIL
LENACIL DP-733
ISOCIL TERBACIL
Es besteht ein Bedarf für schnelle, einfache und billige Toxizitätsprüfungsverfahren, die verwendet werden können, um die Auswirkung der zunehmenden Anzahl von Chemikalien auf die Qualität von Wasser- und Bodenumgebungen zu bestimmen. Dieser Bedarf tritt nirgendwo stärker zutage als beim Einlaßschutz für Trinkwasser, insbesondere, wenn Rohwasser aus Tieflandflüssen entnommen wird, die durch industrielle oder landwirtschaftliche Verschmutzung bedroht sind. Solches Wasser kann u. U. in weniger als vier Stunden gesammelt, behandelt und zu einem Haushalt geleitet werden. In solchen Situationen müssen Überwachungsanlagen in der Lage sein, rasch zu reagieren, möglicherweise innerhalb von 30 Minuten.
Der Erfolg des Ames-Tests zur schnellen Überprüfung von chemischen Mutagenen hat die Forschung bezüglich der Verwendung von Bakterien zur raschen und kostengünstigen Überprüfung von Chemikalien angespornt. In den letzten Jahren hat die Verwendung von Mikroorganismen in aquatischen Tests zunehmende Aufmerksamkeit gefunden. Die Methoden werden vielfältiger und sind weiterentwickelt worden, um verschiedene Prüffunktionen zu erfüllen. Unter diesen sind der Spirillum volutans-Hemmtest, die Triphenyltetrazoliumchlorid- (TTC) und Resazurindehydrogenaseaktivitätshemmtests, die Microtox- Testvorschrift und der Belebtschlamm-Atmungshemmtest. Obwohl sie in gewissem Maß erfolgreich sind, leiden diese Tests an zwei Hauptnachteilen. Erstens erfordern sie ein bestimmtes Maß an geschickter Handhabung und sind deshalb zeitraubend. Zweitens können sie nicht leicht on-line angewendet werden, was eine Echtzeitanalyse undurchführbar macht. Biosensoren, welche Vorrichtungen sind, die eine selektive biochemische Antwort in ein elektrisches Signal umwandeln, können praktische Alternativen bei der Umweltüberwachung, insbesondere im Hinblick auf Kosten, Leichtigkeit der Herstellung, die Fähigkeit, die Komplexität des Testsystems auf ein Minimum zu reduzieren, und die Eignung für on-line-Anwendungen bieten. Ein weiterer Vorteil, den Biosensoren bieten, ist der, daß eine spezifische Bestimmung in Multikomponentenlösungen durchgeführt werden kann, wodurch die Notwendigkeit von komplizierten und zeitraubenden Trennverfahren aufgehoben wird.
Allgemein besteht ein Biosensor aus einer biologischen Komponente wie einem Enzym, Gewebeschnitt oder einer ganzen Zelle, die in enger Nachbarschaft zu der Oberfläche eines Umwandlungselements gehalten wird. In dieser Konfiguration verleiht der Biokatalysator der Vorrichtung nicht nur Selektivität, sondern erzeugt oder verbraucht auch eine Spezies, die durch den Umwandler nachgewiesen werden kann.
Kohlendioxid-spezifische Elektroden sind in Verbindung mit immobilisierten Bakterien verwendet worden, um einen Ganzzell-Biosensor zu erzeugen, der in der Lage ist, Toxine nachzuweisen. Diese spezielle Methode eröffnet die Möglichkeit einer on-line-Überwachung. Wo die Störung von photosynthetischen Elektronentransport(PET)systemen durch Herbizide überwacht wird, muß der Biokatalysator vollständige Photosysteme beinhalten, die in der Lage sind, die Hillreaktion durchzuführen. Isolierte Thylakoide, Chloroplasten und intakte photosynthetische prokaryontische oder eukaryontische Zellen sind in der Lage, als solche Biokatalysatoren zu wirken. Jedoch verringert die Kompliziertheit der Herstellung und die geringe Stabilität der isolierten Membranen und Organellen die Attraktivität als potentielle Biokatalysatoren. Cyanobakterielle und Algenzellen werden jedoch leicht in axenischer Kultur gehalten und geerntet, um einheitliche Materialchargen zu ergeben. Die Abwesenheit von membrangebundenen Organellen in Cyanobakterien macht diese Organismen besonders geeignet für die Verwendung als Biosensor.
In der Vergangenheit sind verschiedene Vorschläge gemacht worden, um Flüssigkeiten unter Verwendung von Bakterien oder Algen zu testen. Z.B. beschreibt US-A-3403081 einen Biosensor mit einer Referenzelektrode und einer Bioelektrode, die einen Mikroorganismus oder Enzym enthält, wobei die Anwesenheit einer Verunreinigung durch eine Änderung des elektrischen Potentials der Bioelektrode bezogen auf die Referenzelektrode nachgewiesen wird. US-A-3506544 beschreibt die Verwendung von enzymkatalysierten Reaktionen in Gegenwart eines Redoxpaars, um eine elektrische Anzeige der Enzymreaktion unter Verwendung von Methylenblau als Elektronentransfervermittler zu ergeben. US-A-3479255 beschreibt ein System, welches lebende Bakterien (oder Algen) einschließt, deren Aktivität durch die Anwesenheit von Giftstoffen verringert wird.
Die Aktivitätsänderung wird unter Verwendung einer ionenempfindlichen Oberfläche erfaßt, deren elektrische Eigenschaften sich in Abhängigkeit von der bakteriellen Aktivität ändern. GB-A-2000805 beschreibt ein Verfahren zum Untersuchen des Verhaltens von Zellen, in welchem essentielle Nährstoffe bereitgestellt werden und einen Elektronentransporter, der sich in einen metabolischen Pfad der Zellaktivität einschaltet.
Die Verwendung von ganzen Zellen in Biosensoren bietet die Vorteile der erhöhten Stabilität und der Leichtigkeit der Immobilisierung. Vermittler wie lösliche Redoxpaare mit niedrigem Molekulargewicht werden bereitgestellt, um an Stellen entlang der Elektronentransportkette zu wechselwirken und reduziert zu werden, wobei sie tatsächlich wie terminale Elektronenakzeptoren wirken. Anschließende Wiederoxidation an der Arbeitselektrode führt zu einem steten Stromfluß, der durch einen äußeren Schaltkreis gemessen wird. Die Größe des Stroms ist der photosynthetischen Aktivität der Organismen proportional, und eventuelle Schwankungen der daraus hervorgehenden Strom/Zeit-Kurve werden verwendet, um die Anwesenheit einer Verunreinigung anzuzeigen.
Wir haben nun gefunden, daß bestimmte Elektronentransfervermittler besonders brauchbar in einem Bakterien/Algen-Biosensor sind.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweisen von Verschmutzung in einem wässerigen Flüssigkeitsstrom bereitgestellt, umfassend die Schritte: Zugeben eines verträglichen Elektronentransfervermittlers zu einem Teil der Flüssigkeit, Einleiten des Gemisches in eine Sensorzelle, in der lebende Bakterien oder Algen enthalten sind, Stimulieren einer Aktivität der Bakterien oder Algen, und Messen der Höhe der Aktivität an einer Elektrode in der Zelle mittels Elektronentransfers an diesen durch den Vermittler; dadurch gekennzeichnet, daß der Vermittler Kaliumferricyanid, Dimethylbenzochinon oder p-Benzochinon, entweder allein oder als Mischung ist, und dadurch, daß die beobachtete Aktivität der Bakterien oder Algen die Atmung und/oder Photosynthese ist.
Die Erfindung schließt auch einen Sensor zum Nachweisen der Anwesenheit einer Verunreinigung in einer wässerigen Flüssigkeit ein, welcher eine Elektrode (4), lebende Bakterien oder Algen, Mittel zum Stimulieren der Aktivität der Bakterien oder Algen (6), einen verträglichen Vermittler zum Übertragen einer Anzeige der Höhe der Aktivität der Bakterien oder Algen auf die Elektrode und Mittel zum Messen eines elektrischen Parameters der Elektrode zur Bestimmung bezüglich des Normalzustandes der Bakterien/Algen-Aktivität umfaßt; dadurch gekennzeichnet, daß der Vermittler Kaliumferricyanid, Dimethylbenzochinon oder p-Benzochinon, entweder allein oder in Mischung, ist.
Gemäß der Erfindung ist die beobachtete Aktivität der Bakterien oder Algen die Atmung und/oder Photosynthese, die beide einen Elektronentransfer einbeziehen.
Der Vermittler wirkt vorzugsweise durch Elektronentransfer von dem Atmungs- oder Photosynthesepfad der Bakterien oder Algen an die Elektrode, wobei der daraus fließende Strom als Maß der Bakterienaktivität wirkt.
Der Vermittler kann Kaliumferricyanid, Dimethylbenzochinon oder p-Benzochinon, entweder allein oder in Mischung, sein.
Die bevorzugten Bakterien sind Cyanobakterien, z. B. Synechococcus, oder alternativ dazu Eubakterien, z. B. E. coli.
Eine Alternative ist eine eukaryontische Alge, z. B. Chlorella.
Das Mittel zum Stimulieren der Aktivität der Bakterien oder Algen kann eine Lichtquelle sein, z. B. eine helle Leuchtdiode, die in der Nähe der Bakterien angebracht ist, oder eine Lichtquelle hoher Intensität und ein Lichtleiter.
Die Bakterien oder Algen können auf einem durchscheinenden Aluminiumoxidfilter zurückgehalten werden. In diesem Fall können die Bakterien mittels eines feinen Nylonnetzes gehalten werden.
Alternativ dazu kann den Bakterien oder Algen eine Energiequelle, z. B. Glucose und/oder Fructose, bereitgestellt werden.
Die Bestimmung des Normalzustandes kann durch Vergleich der Ausgabe eines elektrischen Parameters einer Kontrollelektrode in einem Sensor mit einer wässerigen Flüssigkeit von vorbestimmter Reinheit vorgenommen werden.
Der elektrische Strom kann gemessen werden, so, wie er vorzugsweise mittels einer Kohlenstoff- oder Platinelektrode abgeleitet ist, die sich im Bereich von 400-550 mV bezogen auf Silber/Silberchlorid im Gleichgewicht befindet.
Die Bakterien oder Algen können in einer 0,2 um-Bakterienfiltermembran sein, die gegen die Elektrodenoberfläche von einem Nylonnetz gehalten wird.
Alternativ dazu können die Bakterien in einem Reservoir gehalten werden, durch welches die wässerige Flüssigkeit und der Vermittler geleitet werden, bevor sie zu der Elektrode (4) geleitet werden.
Ausführungsformen der Erfindung werden nun beispielhaft und mit Bezug auf die Zeichnungen im Anhang in größerer Ausführlichkeit beschrieben, worin:
Fig. 1 schematisch eine Form einer Flußzelle zur Verwendung in der Erfindung zeigt;
Fig. 2 schematisch die Elektronentransfervorgänge während der Photosynthese von Cyanobakterien und die Wirkungsorte von Vermittlern zeigt;
Fig. 3 graphisch die Ergebnisse einer ,Reihe von Kontrollsensorläufen mit verschiedenen Kombinationen von Bakterien/Algen und Vermittler mit LED-Stimulierung zeigt;
Fig. 4 und 5 die Fortsetzungen der Läufe von Fig. 3 mit Zugabe einer Verunreinigung zeigen;
Fig. 6 einen graphischen Vergleich eines Kontrollaufs und eines Laufs mit der Zugabe einer DCMU-Verunreinigung für einen Synechococcus-Sensor zeigt;
Fig. 7 graphisch die Ergebnisse eines Kontrollsensorlaufs von E. coli und Vermittler mit Glucosestimulierung zeigt;
Fig. 8 eine elektrochemische Zelle zeigt, die magnetisch gerührt werden kann;
Fig. 9 schematisch eine elektrochemische Zelle mit tangentialem Fluß zur on-line-Verwendung zeigt;
Fig. 10 zeigt graphisch die Ergebnisse der photosynthetischen Aktivität, die in Synechococcus (a) und Chlorella (b) beobachtet wurde, welche auf Celluloseacetatfiltern immobilisiert und in den Flußzellen angebracht wurden, wobei Ferricyanid- und Ferricyanid/p- Benzochinon-Vermittler verwendet wurden. Die Arbeitspotentiale sind in beiden Fällen 400 mV gegen die Ag/AgCl-Referenzelektrode. Die Beleuchtung wurde durch LEDs bereitgestellt; (+) = LEDs ein, (-) = LEDs aus;
Fig. 11 zeigt graphisch die Antwort eines Synechococcus-Biosensors, welcher Zellen enthielt, die aus Kulturen in stationärer Phase gewonnen wurden, auf Aluminiumoxidfilter immobilisiert wurden und in einer Flußzelle mit einer Vermittlerlösung von Ferricyanid in Bg11 eingebaut wurden. Die Beleuchtung wurde wieder durch LEDs bereitgestellt; (+) = LEDs ein, (-) = LEDs aus. Das Arbeitselektrodenpotential betrug 400 mV gegen Ag/AgCl. (Der Signalausschlag ist das Ergebnis des Einführens einer Luftblase in den Vermittlerflußstrom zu dem Sensor.);
Fig. 12 zeigt graphisch die Wirkung des Herbizids DCMU auf die Antwort eines Synechococcus-Biosensors, welcher Zellen, die auf Celluloseacetatfiltern immobilisiert sind, mit Ferricyanid als Vermittler verwendet. DCMU wurde zu dem Reservoir (+ DCMU) gegeben, um eine Herbizidendkonzentration von 233 ppb zu ergeben.
Beide Sensoren waren dem gleichen Hell- und Dunkelschema ausgesetzt, wobei die Beleuchtung durch LEDs erfolgte; (+) = LEDs ein, (-) = LEDs aus. Das Potential an der Arbeitselektrode betrug 400 mV gegen Ag/AgCl;
Fig. 13 zeigt graphisch die Wirkung von Chlortoluron auf die Antwort einer Synechococcus-Elektrode, wobei Zellen, die auf Aluminiumoxidfiltern immobilisiert waren, mit Kaliumferricyanid als Vermittler verwendet wurden. (+) = Beleuchtung ein, (-) = Beleuchtung aus und (+ Chl) = eine Zugabe von Chlortoluron zu der elektrochemischen Zelle, was zu einer Endkonzentration von 2 ppm führte;
Fig. 14 veranschaulicht graphisch die reversible Hemmung eines Synechococcus-Biosensors durch das Herbizid Chlortoluron. Die Zellen sind auf Aluminiumoxidfiltern immobilisiert und der Sensor wurde in der gerührten Glaszelle betrieben, wobei Ferricyanid als Vermittler bei einem Arbeitspotential von 550 mV gegen Ag/AgCl verwendet wurde. Im Anschluß an ein einstündiges Spülen des Sensors in vermittlerfreiem Bg11 wurde die Repression durch Chlortoluron teilweise aufgehoben. Der photosynthetische Elektronentransport wird wiederum beobachtet, wobei Ferricyanid verwendet wurde, und eine zweite Antwort auf Chlortoluron wird erhalten. Chlortoluron wurde bei (+ Chl) zugegeben, um eine Endkonzentration von 2ppm zu ergeben;
Fig. 15 zeigt graphisch die Wirkung von Linuron auf die Antwort, die von einem Ganzzell-Biosensor, der Synechococcuszellen, die auf Aluminiumoxidfiltern immobilisiert sind, einschließt, mit Ferricyanid als Vermittler und bei 550 mV gegen eine Silberchloridreferenz im Gleichgewicht erhalten wurde. Die Beleuchtung wurde durch eine äußere Lichtquelle bereitgestellt; (+) = Licht ein, (-) = Licht aus. Linuronzugaben (+ Lin) wurden wie angegeben vorgenommen, was zur Endkonzentrationen von 17 ppb und 34 ppb führte.
Bezugnehmend auf Fig. 1 umfaßt eine Sensorzelle einen Einlaß 1 und Auslaß 2 für den Durchgang von wäßriger Flüssigkeit, die mit dem Vermittler vermischt ist. Eine Wasserummantelung 3 ist bereitgestellt, um eine gleichmäßige Temperatur aufrechtzuerhalten, falls dies gewünscht wird. Die Flüssigkeit fließt über eine Elektrode 4, welche eine Kohlenstoff- oder Platinelektrode ist, die sich bei 400 mV bezogen auf eine Silber/Silberchlorid-Referenzelektrode 5 im Gleichgewicht befindet.
Eine intensive Leuchtdiode 6 ist neben der Elektrode 4 angebracht, welche in einer bevorzugten Ausführungsform einen Abstand von 3 mm zu dieser einhält. Ein feines Nylonnetz hält einen 0,2 m-Bakterienfilter gegen die Elektrode 4. Auf dem Filter auf der beleuchteten Seite, d. h. von der Elektrode entfernt, festgehalten und durch eine Dialysemembran geschützt befindet sich ein Bakterium öder eine Alge, welche wie folgt sein kann (PCC bedeutet Pasteur Culture Collection):
Synechococcus PCC - 6301
Anabaena cylindrica PCC - 7122
Anabaena Variabilis ATCC - 29413
Chlorella sp.
Escherichia coli
Bacillus licheniformis
Bacillus subtilis
Agrobacterium tumefaciens
Die ersten vier der oben erwähnten Bakterien können durch Beleuchtung durch die Leuchtdiode stimuliert werden, oder die letzten sechs der Bakterien können durch Zugabe von Glucose und/oder Fructose zu der Eingangsflüssigkeit stimuliert werden.
Die Sensorzelle ist mit einer Anzahl anderer Zellen angeordnet, um selektiv einen Teil der Eingangsflüssigkeit zu empfangen. Die effektive Lebensdauer der Bakterien schwankt mit der Art, dem Alter und dem metabolischen Status, aber erfordert eine Erneuerung nach einer Anzahl von Stunden oder Tagen des Gebrauchs. Um einen kontinuierlichen Nachweis zu ergeben, kann die Eingangsflüssigkeit auf eine erneuerte Zelle umgeschaltet werden, während die Bakterienmittel in einer "verbrauchten" Zelle ausgetauscht werden. Ferner können Zellen bereitgestellt werden, um als Kontrollzellen zu dienen, denen Flüssigkeit mit bekannter oder Standardreinheit zugeführt wird. Die Zellen können erneuert werden, indem eine frische Zufuhr von Bakterien gegen die verwendeten Bakterien ausgetauscht wird oder alternativ indem der Zelle eine Salz- oder Minerallösung, welche Nährstoffe enthält, während einer "Erholungsphase", deren Länge schwanken kann, zugeführt wird.
Der mit der Eingabe vermischte Vermittler ist Kaliumferricyanid, Dimethylbenzochinon und/oder p-Benzochinon.
Fig. 2 zeigt schematisch die Elektronentransfervorgänge während der Photosynthese durch Cyanobakterien. Die von dem Vermittler eingefangenen Elektronen werden an die Elektrode 4 weitergeleitet, wo der Strom gemessen werden kann.
Mit Bezug auf die Fig. 3 bis 5 werden vier Läufe wie folgt graphisch aufgetragen:
A - Cyanobacterium - Synechococcus mit 5 mM Kaliumferricyanidvermittler;
B - Eukaryontische Alge-Chlorella ebenfalls mit 5 mM Kaliumferricyanidvermittler;
C - Synechococcus mit Gemisch aus 5 mM Ferricyanid und 0,5 mM p-Benzochinon; und
D - Chlorella mit dem gleichen Vermittlergemisch wie in C.
Sobald die Bakterien oder Algen eine stabilisierte Aktivität hatten, wurde die Leuchtdiode in Intervallen angeschaltet, wie durch die Punkte L angegeben ist. Sie wurde wieder bei D ausgeschaltet. Wie ersichtlich ist, führte in allen außer einem Fall die Beleuchtung ziemlich rasch zu einer gesteigerten Aktivität (gemessen an der Elektrode).
Beim Abdunkeln nimmt die Aktivität, wieder mit der einen Ausnahme, ab. Das Muster ist in jedem Fall jedoch regulär. Der Ausnahmefall scheint zu zeigen, daß eukaryontische Algen in Abwesenheit von p-Benzochinon nicht richtig funktionieren.
In den Fig. 4 und 5 wurde ein Herbizid 3-(3,4-Dichlorphenyl)-1,1-dimethylharnstoff (DCMU) zu einem Vermittlerreservoir an den mit + markierten Punkten zugegeben, um eine Endkonzentration von 0,75 · 10&supmin;&sup6; M (ca. 175 ppb) zu ergeben. Die Wirkungen sind klar aus den Figuren ersichtlich.
Die Wirkung wird noch klarer in Fig. 6 gezeigt, welche die Wirkung der Zugabe von 1 · 10&supmin;&sup6; M (ca. 233 ppb) DCMU an dem mit + markierten Punkt zu einem Synechococcus-Sensor im Gegensatz zu einem Synechococcus-Kontrollsensor zeigt. Die Zugabe führt zu einer deutlichen Verringerung der bakteriellen Aktivität innerhalb von 2 oder 3 Minuten.
Schließlich zeigt Fig. 7 graphisch die Aktivität eines Eubakteriums - Escherichia coli, die von einem Ferricyanidvermittler übertragen wird, wenn sie in Intervallen an den mit ↑ gekennzeichneten Punkten durch Zugabe von Glukose zu der Eingabe aktiviert werden und bei ↓ durch Zurückstellen der Eingabe auf ein Vermittler/Salzlösungs-Gemisch desaktiviert werden.
Das offenbarte Verfahren und die offenbarte Vorrichtung stellen ein nützliches Mittel bereit, um rasch zu bestimmen, ob eine Verunreinigung in dem aufgenommenen Wasser vorhanden ist oder nicht. Wenn ein Signal empfangen wird, daß eine Verunreinigung vorhanden sein könnte, kann der Fluß unterbrochen werden und die Art der Verunreinigung durch analytische oder andere Methoden bestimmt werden.
Die Erfindung ist mit Bezug insbesondere zu Bakterien und Algen beschrieben worden. Andere können natürlich anwendbar sein, ebenso wie andere verträgliche Vermittler.
Da der Vermittler die Aktivität der Bakterien an die Elektrode überträgt, ist es nicht unbedingt erforderlich, daß die Bakterien unmittelbar der Elektrode benachbart sind. Die Bakterien können in einem von der Elektrode entfernten Reservoir enthalten sein und die- Vermittler/Eingabeflüssigkeit von dem Reservoir zu der Elektrode geleitet werden.
Fig. 9 zeigt eine elektrochemische Zelle mit tangentialem Fluß, in welcher der Analyt, mit einem Vermittler vermischt, über eine Sensorelektrode fließt, wobei er periodisch mittels der Leuchtdiode beleuchtet wird.
Die restlichen Figuren zeigen graphisch die Ergebnisse der Verwendung von verschiedenen Bakterien oder Algen im Verfahren der Erfindung. Es soll beachtet werden, daß, wie in Fig. 11 gezeigt ist, eine Luftblase einen Signalausschlag hervorrufen kann. Deshalb ist es ratsam, daß die Probe zuerst durch eine Blasenfalle hindurchgeleitet werden sollte, um solche Komplikationen zu eliminieren.
Es ist möglich, die Haltbarkeit der verwendeten Bakterien oder Algen während eines Zeitraums bis zu mehreren Monaten aufrechtzuerhalten. Die Zellen können der Sensorelektrode in Calciumalginat eingefangen präsentiert werden. Bakterien- oder Cyanobakterienzellen können während des logarithmischen Wachstums geerntet und mit Natriumalginat in einem Konzentrationsbereich von 1 bis 4% Gew./Vol. vermischt werden, um die gewünschte Zelldichte zu ergeben. Das Natriumalginat wird dann durch sechs Stunden langes Eintauchen in 0,5 molare Calciumchloridlösung bei 4ºC zu Perlen oder Bögen verfestigt. Nach dem Spülen in destilliertem Wasser wird das Alginat zwölf Stunden lang bei 25ºC an der Luft getrocknet und in versiegelten Glascontainern gelagert, bis es gebraucht wird.
Vor der Verwendung auf den Sensorelektroden wird das Alginat in einem geeigneten Bademedium (wie BG11 oder 0,9% Salzlösung rehydratisiert).
Mit Bezug nun insbesondere auf Fig. 10 wird die mit Biosensoren auf der Basis von Synechococcus und Chlorella erhaltene Antwort auf ein Schema von Licht- und Dunkelperioden in Anwesenheit von entweder Ferricyanid oder einem Gemisch aus Ferricyanid und p-Benzochinon gezeigt. Das Unvermögen von Ferricyanid, auf die eukaryontische photosynthetische Aktivität einzuwirken, ist klar ersichtlich, da keine Antwort von den Chlorella-Elektroden im Anschluß an die Beleuchtung aufgezeichnet wird. Ein Cocktail, der einen lipophilen Vermittler enthält, ist erforderlich, um auf die Chloroplasten- Elektronentransferketten einzuwirken. Man nimmt an, daß Benzochinon allein als wirksamer Vermittler in diesem System wirkt.
Mit Sensoren auf sowohl Synechococcus- als auch Chlorella- Basis führt die Verwendung von p-Benzochinon zu einer sequentiellen Abnahme des maximalen Stroms, der während des Beleuchtungszeitraums erhalten wird, was letztendlich zu einem völligen Ausfall der Antwort führt.
Im Fall von Synechococcus-Biosensoren können PET-Kettenvorgänge verfolgt werden, wobei nur Ferricyanid verwendet wird, mit einer weniger deutlichen Abnahme der Lichtantwort. Eine Arbeitsdauer von Synechococcus-Biosensoren von 3-4 Tagen fortgesetzten Gebrauchs, wenn nicht mehr, kann unter Verwendung von Ferricyanid erreicht werden.
Typischerweise wird mit Synechococcus, wenn Zellen unmittelbar nach dem Gewinnen aus einer beleuchteten Batch-Kultur verwendet werden, eine wesentliche Dunkelatmungsantwort beobachtet (früher Bereich der Kurve), die erschöpft werden muß, bevor der Sensor zur Verfolgung der Photosynthese verwendet wird. Diese Antwort wird jedoch nicht bei Chlorella oder auch bei Synechococcus, wenn p-Benzochinon im Elektrolyt vorhanden ist, beobachtet.
Von den drei in dieser Untersuchung getesteten Cyanobakterien wurde gefunden, daß Synechococcus am erfolgreichsten ist, während PET-Aktivität sowohl in Anabaena cvlindrica als auch in Anabaena variabilis beobachtet werden konnte, erwies sich die Verwendung dieser fadenförmigen Formen als schwieriger im Hinblick auf das Erhalten von optimalen Beladungsniveaus auf den Filtern. Zusätzlich waren die Antwortzeiten mit diesen Organismen länger als mit Synechococcus. Auf der Basis dieser und anderer Ergebnisse wurde das Einzellercyanobacterium Synechococcus PCC 6301 als Biokatalysator zur Verwendung in allen folgenden Arbeiten ausgewählt.
Fig. 11 zeigt typische Ergebnisse, die von einer Synechococcus-Probe erhalten wurden, die aus Zellen erzeugt wurde, welche aus Kulturen während ihrer stationären Wachstumsphase gewonnen wurden. Im Anschluß an die Beleuchtung wiesen solche Sensoren eine rasche Zunahme des Stroms auf, welcher einen maximalen Spitzenwert erreichte. Der Strom nahm dann auf einen niedrigeren aber stabileren Wert ab. Diese Art von Überschießeffekt, der nur bei Zellen beobachtet wird, die aus älteren Kulturen gewonnen wurden, ist in allen nachfolgenden Lichtstimulierungen vorhanden. Die Größe des Überschießens zusammen mit dem stetigen Teil der Kurve ist während des gesamten Sensorlaufs konsistent. Der Signalausschlag am Ende des Sensorlaufs zeigt die Wirkung einer Luftblase, die in den Flüssigkeitsstrom eingebracht wurde. Um sich bei on-line-Anwendungen dagegen abzusichern, muß eine Blasenfalle in der Zufuhrlinie zu der Durchflußzelle angebracht werden.
Um zu bestätigen, daß die Antwort des Sensors tatsächlich das Ergebnis von PET war, wurden die Wirkungen von DCMU, einem bekannten Hemmer der Photosynthese der Cyanobakterien, untersucht. Unter Verwendung von Synechococcus-Biosensoren in der tangentialen Durchflußzellenkonfiguration wurde die Antwort auf die Zugabe von 1 · 10&supmin;&sup6; M (233 ppb) DCMU mit einem Kontrollsensor verglichen, wie es in Fig. 12 gezeigt ist. Nach einer kurzen Transitzeit, die benötigt wird, um das Herbizid an den Biosensor aus dem Aufnahmereservoir heranzutragen, ergab sich eine rasche Beendigung der PET-Aktivität, wie sie durch den Abfall des Sensorstroms bewiesen wird, welcher den wiederspiegelt, der sich bei der Entfernung der Beleuchtung des Kontrollsensors ergibt. Solange das DCMU in dem fließenden Strom ist, konnte keine Erholung der Lichtantwort von dem "vergifteten Sensor" erhalten werden. Anschließend wurden zwei weitere Mitglieder der DCMU-Herbizidfamilie, Chlortoluron und Linuron, untersucht. Die Wirkung einer Zugabe von Chlortoluron bis zu einer Herbizidendkonzentration von 2 ppm auf einen Synechococcus-Biosensor zeigt in Fig. 13 einen gleichermaßen raschen Abfall der photosynthetischen Elektronentransferaktivität.
Die Reversibilität der Wirkungen dieser Herbizide ist in Fig. 14 gezeigt, wo die Chlortoluronhemmung der Synechococcus-Photosynthese bei einer Konzentration von 2 ppm im Anschluß an eine einstündige Erholungsperiode aufgehoben wird, während der der Sensor mit frischem BG11-Medium gespült wird. Ähnliche Ergebnisse sowohl im Hinblick auf das Hemmen der photosynthetischen Antwort als auch die Erholung nach dem Waschen wurden für die Herbizide DCMU und Linuron erhalten.
Fig. 15 zeigt die Ergebnisse einer zwei-Puls-Zugabe von Linuron, Endkonzentration 17 ppb und 34 ppb. Obwohl die Abnahme des Stroms nicht so rasch ist wie die bei höheren Konzentrationen (200 ppb - 2 ppm) festgestellte, ist sie nichtsdestoweniger wesentlich und kann als Anzeige des Vorhandenseins einer Herbizidverschmutzung verwendet werden, selbst bei diesen extrem niedrigen Gehalten.
Um den erfolgreichen Nachweis eines speziellen Herbizids zu gewährleisten, ist es wichtig, das korrekte Vermittlermolekül zu wählen. Um zum Beispiel die Anwesenheit eines PSII- Inhibitors, nachzuweisen, muß der Vermittler stromabwärts vom Wirkungsort des Herbizids reduziert werden. In ähnlicher Weise sollte, um die Anwesenheit eines PSI-Blockers zu überwachen, der Vermittler am entfernten Ende des PET, d. h. nahe der terminalen Elektronenakzeptorstelle, reduziert werden. In diesem Zusammenhang ist Ferricyanid eine gute Wahl als Vermittler, nicht nur wegen seiner chemischen Stabilität in wässeriger Lösung und unkomplizierten Elektrochemie an der Arbeitselektrode, sondern auch, weil es mit dem PET am Ende von PSI wechselwirkt. Folglich sollte es bei Verwendung von Ferricyanid als Vermittler möglich sein, alle Herbizide zu überwachen, die den Fluß von Elektronen durch PSII verhindern und diejenigen, die den Elektronenfluß durch PSI vor dem Ferredoxin, der mutmaßlichen Ferricyanidreduktionsstelle, unterbrechen. Diese Sensoren können zum Nachweis eines weiten Bereichs von Herbizidfamilien wie Nitrilen, Triazinen, bis-Carbamaten, Pyridazinen, Nitrophenylethern, Uracilen und Aniliden angewendet werden.
Die in Fig. 9 gezeigte Sensorkonfiguration könnte eine wichtige Rolle beim Nachweis von Verschmutzungswolken in Flußwasser spielen und soll bestehende Überwachungssysteme ergänzen. Biosensoren haben die Vorteile, daß sie billig hergestellt werden können, daß die Sensorelektrode eine Wegwerfvorrichtung ist und eine minimale Vorbehandlung, d. h. die Entfernung von suspendierten Feststoffen und Luftblasen aus dem Probenfluß zu dem Sensor erfordert. Das System kann auch vollautomatisiert werden, was die Möglichkeit eröffnet, Sensoren an abgelegenen Orten zu plazieren.
Die Erfindung wird mit Bezug auf das folgende Beispiel weiter beschrieben.

Beispiel

Kohlenstoffolienindikatorelektroden wurden in der folgenden Weise hergestellt. Scheiben mit 5 mm Durchmesser wurden aus einem 1 mm dicken Streifen aus porösem Graphit ausgestanzt, zweimal in Aceton gewaschen (30 min für jede Waschung mit leichter Bewegung), einmal in kochendem destilliertem Wasser gewaschen (1 Std.) und in einem Luftofen bei 100ºC getrocknet. Ein elektrischer Kontakt mit den Scheiben wurde hergestellt, indem 0,2 mm-Drähte auf die Oberfläche des Graphits mit einem Tropfen eines elektrisch leitenden (mit Silber beladenen) Epoxyharzes geklebt wurden. Nach dem Härten wurden die Graphitscheiben in ein Gemisch von 9 Teilen Eponharz (Qualitätsstufe 815) und 1 Teil Triethylentetraminkatalysator bei einer Temperatur von 60ºC eingebettet. Unmittelbar vor der Verwendung wurden die Elektroden elektrochemisch in 0,1 M Kaliumdihydrogenorthophosphat konditioniert, indem das Potential zwischen -0,8 und +1,0 Volt gegen Ag/AgCl 100mal mit einer Durchlaufgeschwindigkeit von 1 V/s gewechselt wurde.
Anabaena variabilis (ATTC 29413) und Synechococcus (PCC 6301), Anabaena cvlindrica (PCC 7122) und Chlorella sp. wurden verwendet. Kulturen von Anabaena wurden auf Agarplatten gehalten, die aus BG11o-Medium, nitratfreiem BG11-Medium, welches mit 1,5% (Gew./Vol.) bakteriologischem Agar ergänzt war, gemacht waren.
Synechococcus- und Chlorella-Kulturen wurden auf Agar-ergänztem BG11-Medium gehalten. Flüssige Batch-Kulturen wurden hergestellt durch Transfer von Impfgut von Plattenkulturen in 50 ml steriles BG11o- oder BG11-Medium in konischen Kolben. Flüssigkulturen wurden bei 25ºC mit einer 5,0 Wm&supmin;²-Beleuchtung bis zur mittleren exponentiellen Phase (OD663 = 1,0) gehalten, und die Zellen wurden durch rasche Zentrifugation (12.000 upm während 60 s) geerntet. Die Zellen wurden in 50 ul frischem Kulturmedium resuspendiert und auf die Oberfläche von bakteriologischen Filterscheiben mit 5 mm Durchmesser aufgetragen.
Zwei verschiedene Methoden wurden im vorliegenden Beispiel eingesetzt. Anfänglich wurden Zellen auf 0,2 um Zelluloseacetatfilterscheiben geladen. Diese Filter wurden dann auf die Sensorelektrode gegeben, wobei die mit Zellen beladene Oberfläche freigelegt war. Eine Dialysemembran wurde verwendet, um die Elektrode zu umgeben und den Filter und die Zellen an ihrem Platz festzuhalten. Aluminiumoxidfilter, die durchscheinend sind, wenn sie naß sind, können nun verwendet werden, um Zelluloseacetat zu ersetzen. In diesem Fall werden die Aluminiumoxidfilter der Elektrode mit der Zellschicht gegen die Elektrodenoberfläche präsentiert. Der Filter wird durch ein feines Nylonnetz festgehalten, wodurch eine Dialysemembran sich erübrigt. Vor der Verwendung werden die zusammengebauten Elektroden durch Tränken in BG11-Medium ungefähr 10 Minuten lang konditioniert.

Claims

1. Verfahren zum Nachweisen von Verschmutzung in einem wäßrigen Flüssigkeitsstrom, umfassend die Schritte: Zugeben eines verträglichen Elektronentransfervermittlers zu einem Teil der Flüssigkeit, Einleiten des Gemisches in eine Sensorzelle, in der lebende Bakterien oder Algen enthalten sind, Stimulieren einer Aktivität der Bakterien oder Algen, und Messen der Höhe der Aktivität an einer Elektrode in der Zelle mittels Elektronentransfers an diese durch den Vermittler; dadurch gekennzeichnet, daß der Vermittler Kaliumferricyanid, Dimethylbenzochinon oder p-Benzochinon, entweder allein oder als Mischung ist, und dadurch daß die beobachtete Aktivität der Bakterien oder Algen die Atmung und/oder Photosynthese ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Vermittler durch Elektronentransfer von dem Atmungs- oder Photosyntheseweg der Bakterien zu der Elektrode wirkt, wobei der davon fließende Strom als Maß der Bakterienaktivität wirkt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die Bakterien Cyanobakterien, vorzugsweise Synechococcus sind.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die Bakterien Eubakterien, vorzugsweise E. coli sind.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die Algen eukaryontische Algen, vorzugsweise Chlorella sind und der Vermittler nicht Kaliumferricyanid allein ist.

6. Verfahren nach Anspruch 3 oder 5, worin das Mittel zum Stimulieren der Aktivität der Bakterien oder Algen eine Lichtquelle ist, vorzugsweise eine helle Leuchtdiode, die in der Nähe der Bakterien oder Algen angebracht ist.

7. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, worin die Bakterien- oder Algenaktivität durch Bereitstellung einer Energiequelle, vorzugsweise die Zugabe von Glukose und/oder Fructose, stimuliert wird.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Bakterien oder Algen auf einem durchscheinenden Aluminiumoxidfilter zurückgehalten werden.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin eine Bestimmung des Normalzustandes durch Vergleich der Ausgabe eines elektrischen Parameters der Elektrode mit der einer Kontrollelektrode in einem Sensor mit einer wäßrigen Flüssigkeit von vorbestimmter Reinheit vorgenommen wird.

10. Sensor zum Nachweisen der Anwesenheit einer Verunreinigung in einer wäßrigen Flüssigkeit, welcher eine Elektrode (4), lebende Bakterien oder Algen, Mittel zum Stimulieren der Aktivität der Bakterien oder Algen (6), einen verträglichen Vermittler zum Übertragen einer Anzeige der Höhe der Aktivität der Bakterien oder Algen auf die Elektrode und Mittel zum Messen eines elektrischen Parameters der Elektrode, zur Bestimmung bezüglich des Normalzustandes der Bakterien/Algenaktivität umfaßt; dadurch gekennzeichnet, daß der Vermittler Kaliumferricyanid, Dimethylbenzochinon oder p-Benzochinon, entweder allein oder in Mischung, ist.

11. Sensor nach Anspruch 10, worin die Bakterien cyanobakterien, vorzugsweise synechococcus sind.

12. Sensor nach Anspruch 10, worin die Bakterien Eubakterien, vorzugsweise E. coli sind.

13. Sensor nach Anspruch 10, worin die Algen eukaryontische Algen, vorzugsweise Chlorella sind, und daß der Vermittler nicht Kaliumferricyanid allein ist.

14. Sensor nach Anspruch 11 oder 13, worin das Mittel zum Stimulieren der Aktivität der Bakterien oder Algen eine Lichtquelle ist, vorzugsweise eine helle Leuchtdiode (6), die in der Nähe der Bakterien oder Algen angebracht ist.

15. Sensor nach Anspruch 12 oder 13, worin die Aktivität der Bakterien oder Algen durch Bereitstellung einer Energiequelle, vorzugsweise durch die Zugabe von Glukose und/oder Fructose stimuliert wird.

16. Sensor nach einem der Ansprüche 10 bis 15, worin die Bakterien oder Algen auf einem durchscheinenden Aluminiumoxidfilter zurückgehalten werden.

17. Sensor nach einem der Ansprüche 10 bis 16, welcher auch eine Kontrollelektrode in einem Sensor mit einer wäßrigen Flüssigkeit von vorbestimmter Reinheit umfaßt, um die Bestimmung des Normalzustands durch Vergleich mit der Ausgabe eines elektrischen Parameters davon mit dem der Elektrode (4) zu ermöglichen.

18. Sensor nach einem der Ansprüche 10 bis 17, worin ein elektrischer Strom gemessen wird, der mittels einer Kohlenstoff- oder Platinelektrode abgeleitet ist, die sich im Bereich von 400 bis 500 mV, bezogen auf Silber/Silberchlorid, im Gleichgewicht befindet.

19. Sensor nach einem der Ansprüche 10 bis 18, worin die Bakterien oder Algen in einer 0,2 um bakteriologischen Filtermembran sind, die gegen die Elektrodenoberfläche von einem Nylonnetz gehalten wird.

20. Sensor nach einem der Ansprüche 10 bis 18, worin die Bakterien oder Algen in einem Reservoir gehalten werden, durch welches die wäßrige Flüssigkeit und der Vermittler geleitet werden können, bevor sie zu der Elektrode (4) geleitet werden.