DE2714415A1

DE2714415A1 - Verfahren zum nachweis des vorhandenseins oder zur hemmung des wachstums eines mikroorganismus

Info

Publication number: DE2714415A1
Application number: DE19772714415
Authority: DE
Inventors: Barbara Iglewski; Stephen A Morse
Original assignee: Oregon State
Current assignee: Oregon State
Priority date: 1976-03-31
Filing date: 1977-03-31
Publication date: 1977-10-13
Also published as: FR2361464A1; CA1089748A; JPS52151783A; AU2368677A; FR2361465A1; JPS57115182A; JPS572319B2; JPS5843077B2; IT1077802B; AU516959B2; US4142939A; SU731904A3; JPS57115198A; GB1575843A

Description

DR. IKG. F. WUKSTHOFF DR. K. τ. PBOHM ANN DR. ING. D. BKHRKNS DIPL. ING. R. GOKTZ PATINTAHW A LTB

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1A-49 194

Patentanmeldung

Anmelder: OREGON STATE BOARD OF HIGHER EDUCATION

P.O. Box 3175, Eugene, Oregon 97403, USA

Titel: Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins

oder zur Hemmung des Wachstums eines Mikroorgani smus

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DR. ING. F. W(JESTHOFF

DR.E.V.PECIIMANN DH. ING. D. BEHRENS DIPL.. ING. R. GOETZ PATENTANWÄLTE

8OOO MÜNCHEN OO SCHWEIOEHSTRASSE S TFiffon (089) ββ 20(51 TELKl 9 24 070

TKLKO HAM MB t

1A-49 194

Beschreibung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis eines spezifischen Mikroorganismus, das darin besteht, daß man diesen Mikroorganismus mit Bakteriocinen von einem Mikroorganismus einer Art zusammenbringt, die taxonomisch nicht mit dem spezifischen Organismus verwandt ist. Das Ergebnis dieser Berührung kann angewandt werden zum Nachweis des Vorhandenseins eines Mikroorganismus, der zu einer taxonomisch nicht verwandten Art gehört. Radioaktiv markierte oder mit Fluorescein markierte Bakteriocine können umgesetzt werden mit spezifischen Bakterien in einer biologischen Probe, und das Vorhandensein derartiger spezifischer Bakterien kann nachgewiesen werden durch Entfernung von überschüssigen Bakteriocinen und Bestimmung des Vorhandenseins von fluorescierenden oder radioaktiven Bakterien in der Probe. Neisseria gonorrhoeae kann identifiziert werden, indem man Bakteriocine auf eine Platte von klinischem Material aufbringt (spotting) oder indem man eine Scheibe anwendet, die mit Bakteriocinen imprägniert ist und sich auf einer Platte befindet, die mit dem klinischen Material beimpft ist, oder die Bakteriocine können in die Hälfte einer aufgespaltenen Agarplatte eingebaut sein, wobei die Identifizierung aufgrund einer Hemmzone durchgeführt wird, die den Fleck umgibt, auf den die Bakteriocine aufgebracht worden sind, oder aufgrund der Wachstumshemmung auf dem Teil der Platte zu dem die Bakteriocine zugegeben worden sind.

Die Erfindung bezieht sich auf die diagnostische Mikrobiologie und besonders auf diagnostische Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins und zur Bestimmung von Mikroorganismen, die

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S i/ *)

zu einer bestimmten Art gehören in einer biologischen Pro-

ff

be und auf Verfahren zur Identifizierung von Antigenen, die taxonomisch nicht verwandten Arten gemeinsam sind.

Das Vorhandensein von bakteriocinartiger Aktivität in Isolaten von Neisseria gonorrhoeae wird berichtet von Flynn and McEnteggart, J. Clin. Path. 25:60-61; (1971). Es wird auch berichtet, daß Substanzen von anderen Organismen bakteriocinartige Aktivität gegenüber Neisseria gonorrhoeae besitzen. Volk und Kraus, Brit. J. Vener. Dis. 49:511-512 (1973) berichten von der in-vitro-Hemmung N. gonorrhoeae durch eine Substanz von N. meningitidis. Geizer, J. Hyg. Epid. 12:241-243 (1968) berichten über die Hemmung des Gonokkokenwachstums durch nicht identifizierte Substanzen, die gebildet worden sind von Stämmen einer Anzahl von Organismen einschließlich Pseudomonas aeruginosa. Die bakteriocinartige Aktivität, die gegenüber vielen Stämmen von N. gonorrhoeae auftritt, wurde der Bildung von hemmenden Gehalten an freien Fettsäuren und Lysophosphatidyäthanolamin zugeschrieben,
(Walstad, et al., Infect. Immunity, 10:481-488 (1974).)

(a) Ursprung und Struktur von Bakteriocinen

Bakteriocine sind eine Gruppe von spezifischen, von Bakterien stammenden Substanzen, die während des Wachstums vieler Bakterien gebildet werden. Sie sind Proteine unterschiedlichen Molekulargewichts. Bakteriocine besitzen antibiotische Eigenschaften, sind jedoch im Gegensatz zu Antibiotika, die klinisch angewandt werden, sehr viel spezifischer und wirken nur auf/^6aniSmender gleichen oder nahe verwandten Art. Sie sind extracelluläre Substanzen, die an Rezeptorstellen von empfänglichen Organismen gebunden werden. Bakteriocine bleiben üblicherweise in dem Stamm enthalten, in dem sie gebildet worden sind, bis sie durch Lysis der Zellen freigesetzt werden. Diese extracellulären *) (genus) 70984 1/0902

Substanzen können dann an Rezeptorstellen von empfänglichen Organismen gebunden werden. Einige Bakteriocine erinnern stark an Teile von Bakteriophagen, wenn sie mikroskopisch untersucht werden. Ihre Bildung kann eingeleitet /werden durch Mittel, die den Stoffwechsel stören, wie UV-Licht, Mytomicin C, Senfgaskörper (nitrogen mustard) und viele andere Mittel.

Es gibt zwei grundlegende Arten von Bakteriocinen.Eine Art ist ein kleines Molekül, das thermostabil ist und das in der Ultrazentrifuge nicht sedimentiert werden kann und nicht leicht im Elektronenmikroskop sichtbar gemacht werden kann. Die andere Art besteht aus größeren Gliedern und erinnert an die Schwänze von Phagen. Dieser Unterschied in den Grundtypen kann gut illustriert werden durch einen Vergleich von Colicin V mit Colicin 15 (Colicine sind Bakteriocine, die spezifisch sind für coliforme Organismen). Colicin V bildet ein dialysierbares Produkt mit einem niederen Molekulargewicht. Colicin 15 ist sedimentierbar, besitzt ein Molekulargewicht von 200 000 und erinnert im Elektronenmikroskop an die Schwanzstruktur von Phagen.

Kleine Mengen von Bakteriocinen werden freigesetzt in normalen Organismuskulturen und werden vermutlich freigesetzt während der normalen Lysis, die während der Degeneration von Organismen in der Kultur auftritt. Ihre genetischen Determinanten liegen vor als ein Element außerhalb der Chromosomen, d s sich in Phase mit Bakterienchromosomen repliziert und daher solange lebt wie der Stamm lebt. Sie werden quantitativ freigesetzt durch die Lysis der Bakterienzellen, unabhängig davon, ob diese auftritt durch eine Phageninfektion, die Wirkung von bakteriolytischen Mitteln, wie metabolischen Hemmstoffen, oder anderen Faktoren,

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Chemisch sind alle Bakteriocine makromolekular und enthalten Polypeptide, Proteine und andere Reste wie Kohlenhydrate, Phosphat und Lipopolysaccharid, das zu der Endgröße des Moleküls beiträgt.

(b) Nomenklatur

Während die Klassifizierung und Nomenklatur notwendigerweise Änderungen unterliegen, je mehr über ihren Ursprung, ihre Chemie und Aktivitäten bekannt wird, werden Bakteriocine im allgemeinen mehr nach dem speziellen als dem allgemeinen Namen des sie bildenden Organismus benannt. Zum Beispiel werden Bakteriocine von Escherichja coli als Colicine bezeichnet. Serratia marcescens ergeben Marcesine, Enterobacteraerogenes Aerocine, Pseudomonas aeruginosa (pyocyaneus) Pyocine, Listeria monocytogene Monocine, Staphylococcus sp. Staphylocine usw.

Diese Klassifizierung begann nachdem Gratia in Belgien zuerst berichtete, daß Filtrate eines bestimmten Stammes von Escherichia coli das Wachstum der gleichen Art hemmten und der hemmende Faktor als Colicin bezeichnet wurde. Einige 20 Colicine wurden anschließend erkannt und als A bis V klassifiziert. Jedes Colicin war spezifisch für eine kleine Gruppe von Stämmen von Enterobacteraciae. Jedes Bakteriocin, ob es von E. coli oder anderen Art^tammt, scheint in der Wirkung spezifisch zu sein für den gleichen Stamm oder für taxonomisch verwandte Arten von Organismen.

(c) Bestimmung von Bakteriocinen

Die Konzentration von Bakteriocin in einem Filtrat wird titriert (bestimmt), indem man einen Tropfen (10 bis 20 /Ul) auf eine Rasenkultur aufbringt, die mit Indikatorbakterien (lO'/ml) frisch gewachsener Zellen beimpft ist. Nach 18 bis 24 Stunden langer Inkubation bei 37°C werden die Platten abgelesen und gekennzeichnet.Titer werden angesehen als das Reziproke der höchsten Verdünnung, die einen klaren Punkt ergibt. Ein anderes Verfahren besteht darin, Bakteriocin zu einem zahlenmäßigen Überschuß von empfindlichen Organismen zu geben, wobei die bakterizide Aktivität proportional der Menge des vorhandenen Bakteriocins ist.

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üine Einheit der Bakteriocinaktivität ist die geringste Konzentration, die das Wachstum eines Indikatorstammes vollständig hemmt.

Zur Zeit beruht die Reinigung mehr auf einer Konzentrierung aus einer ursprünglichen Wachstumsbrühe oder Salzsuspension als auf einer Isolierung von spezifischen Fraktionen. Das am häufigsten angewandte Verfahren besteht darin, die Zellen durch Zentrifugieren nach 6 bis 24 Stunden langer Inkubation zu entfernen. Die Reinigung wird vervollständigt durch Säulenchromatographie und anschließende Ausfällung mit Ammoniumsulfat und anschließende Dialyse gegen einen Äqui1i bri e rungspuffe r.

Gereinigte Bakteriocine sind in lyophilisiertem Zustand über/langen Zeitraum stabil. In Lösung sind sie stabil bei 4⁰C und einem pH-Wert von 7,0 über 6 Wochen. Bakteriocine werden durch 4m Guanidinthiocyanat oder 6m Harnstoff nicht irreversibel denaturiert, aber werden vollständig innerhalb von 60 Minuten inaktiviert bei 60°C und einem pH-Wert von 7,0.

(d) Wirkungsweise

Bakteriocine wirken auf Zellen, die sich in der logarithmischen Wachstumsphase befinden. Die Behandlung von empfindlichen Zellen hemmt schnell den Einbau von markiertem Leucin und Thymidin in säureunlöslichen Materialien. Die Zeit, die erforderlich ist zur Hemmung der 14q und 3h markierten Isotopen,hängt ab von der Konzentration der Bakteriocine. Es wurde nachgewiesen, daß die Synthese sowohl von DNS als auch Protein durch Bakteriocin blockiert werden. Wenn Organismen in Kulturen Bakteriocin ausgesetzt werden, bauen sie 14q Leucin nicht in das Protein ein oder 3^ Thymidin in die DNS. Das ist vermutlich der Fall aufgrund einer Wechselwirkung mit dem aktiven Transport von Leucin und Thymidin

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durch das spezifische Bakteriocin. Gleichzeitig fällt die Konzentration an ATP auf 10 bis 15 % des Vergleichswertes. Das hängt nicht zusammen mit einem Abfall in der makromolekularen Synthese, sondern dient dazu, den"stotternden"

Mechanismus des Energietransports zu erklären, der in Bakterienzellen auftritt, die Bakteriocinen ausgesetzt sind. Obwohl die ATP-Aktivität gehemmt wird, wird das Phosphortransferasesystem nicht angegriffen, und es hat gezeigt, daß sich tf-Methyl-D-glucosid in Coliformen ansammelt. Nebenbei kann eine Störung der Unverletztheit der Zellmembran bei einigen Arten von empfindlichen Organismen auftreten.

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues und einzigartiges Verfahren zur Hemmung des Wachstums von Mikroorganismen zu entwickeln sowie ein Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins eines Mikroorganismus, der zu einer bestimmten Art gehört in einer biologischen Probe. Dieser Test soll besonders geeignet sein zum Nachweis und zur Identifizierung von Neisseria gonorrhoeae sowie zu dessen Typisierungi sowie zur Identifizierung üblicher(gemeinsamer) ϋ5*ϊ5ίίΜ854§!^οϋ8ί MlBaStottigher Antigene oder Oberflächenkomponente in Säugetierzellen. Außerdem soll ein neues Pyocin entwickelt werden, das das Wachstum von N. gonorrhoeae hemmt.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Hemmung des Wachstums eines Mikroorganismus, der zu einer bestimmten Art gehört, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man diesen Organismus mit einem Bakteriocin von einem Mikroorganismus einer taxonomisch nicht verwandten Art zusammenbringt, das sich an diesen ersten Mikroorganismus bindet. Bakteriocin, Organismen und Medien

Das Bakteriocin/vom R-Typ (611 131) und erhalten worden vom Stamm P. aeruginosa (ATCC 29 260)

Das Grundmedium enthielt folgende Bestandteile pro Liter: Proteosepepton Nr. 3 (Difco) 15 g; K₂HPO₄ 4 g; KH₂PO₄ 1 g;

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NaCt 5 g und lösliche Stärke 1 g. Der End-pH-Wert des Mediums betrug 7,2. Wenn es zur Bildung von Pyocinen vom R-Typ durch P. aeruginosa angewandt werden sollte, wurden Glycerin (1 Vol.-?6) und Mononatriumglutamat (8,46 g/l) nach der Behandlung im Autoklaven zugegeben. Wenn es zum Wachstum von Neisseria spp. angewandt werden sollte, wurde ein Wachstumsfaktorsupplement (1 Vol.-%) zugegeben, das in der Zusammensetzung identisch war mit "IsoVitaleX enrichment" (BBL), aber keine Glucose enthielt; dann wurden nach der Behandlung im Autoklaven NaHCO, (42 mg/l) und Glucose (5 g/l) zugegeben. Die GC-Agarplatten (Difco), die 5 g/l Glucose und 1 Vol.-% Wachstumsfaktorsupplement enthalten, wurden, wo das angezeigt war, angewandt.

Induktion der Kultur und Reinigung von Pyocin vom R-Typ (611 131)

Eine Übemacht-KuItür von Pseudomonas aeruginosa ATCC 29 260 wurde zentrifugiert ( 2100 g, 10 Minuten) und erneut in einai£ehntel des ursprünglichen Volumens einer Lösung, enthaltend 0,85 % NaCL und 0,1 % Cysteinhydrochlorid, pH 6,5, suspendiert. Eine Lösung von 1 Vol.-% Inokulum wurde angewandt und die Kultur auf einer sich drehenden Schüttelvorrichtung bei 37°C inkubiert. Wenn die Trübung der Kultur ungefähr 150 Klett-Einheiten erreicht hatte, wurde Mitomycin C mit einer Endkonzentration von 1 /Ug/ml zugegeben. Es wurde weiter inkubiert bis eine ausgedehnte Lyse der Kultur auftrat. Das war üblicherweise innerhalb von 3 Stunden nach der Zugabe von Mitomycin C der Fall. Di <. mit Mitomycin C indizierte Kultur wurde mit 2400 g 30 Minuten ^. trifugiert, um Zelltrüramer zu entfernen, und die überstehende Flüssigkeit wurde mit 5 Vol.-?6 Chloroform behandelt. Diese überstehende Flüssigkeit wurde als rohes Pyocin bezeichnet.

Das rohe Pyocinpräparat wurde weiter gereinigt durch eine Modifikation des Verfahrens nach Kageyama und Egami, Life, Sei. 9:471-476 (1962). Dieses Verfahren^3es"teht kurzgesagt in der

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langsamen Zugabe von 1m MnCl₂ (60 ml/l Lysat) unter Rühren zu dem rohen Pyocinpr<üparat. Nach Einstellung des pH-Werts auf 7,5 mit 1m NaOH wurde der entstehende Niederschlag abzentrifugiert (2400 g, 15 Minuten). Die überstehende Flüssigkeit wurde als teilweise gereinigtes Pyocin bezeichnet.

Eine weitere Reinigung wurde erreicht durch Zugabe von (NH^)₂ ^S04 ^{bis 2U} einer 70-%igen Sättigung und Inkubierung über Nacht bei 4°C. Nach dem Zentrifugieren (2400 g, 30 Minuten) bei 4°C wurde die die Pyocinaktivität enthaltende Perle in 50 ml 0,01m Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris)-hydrochlorid, pH 7,5, enthaltend 0,01m MgCl₂ und 0,01m MgSO^ gelöst und über Nacht bei 4°C gegen 2 1 des gleichen Puffers dialysiert. Soweit nötig, wurde das Präparat geklärt durch Zentrifugieren (2400 g, 15 Minuten bei 4°C). Das Pyocinpräparat wurde dann mit 100 000 g 90 Minuten zentrifugiert (Ultrazentrifuge Typ 40 rotor, Spinco-Modell L2-65B). Die gelatinöse Perle wurde leicht in 20 ml Puffer gelöst und über DEAE-Cellulose (DE-52, Whatman Biochemicals Ltd, Kent, England) chromatographiert, das vorher mit dem gleichen Puffer gewaschen und äquilibriert worden war. Eine 8 ml-Probe von Pyocin wurde auf eine 1,5 x 28 cm Säule gegeben, wo sie 1 Stunde adsorbiert werden konnte. Die Säule wurde mit 200 ml Puffer gewaschen,um nicht an die DEAE-Cellulose adsorbierte Substanzen zu entfernen. Das Pyocin wurde dann mit 800 ml eines NaCE-Gradienten (0 bis 1,0m) in 0,01m Puffer eluiert. 5 ml Fraktionen wurden gesammelt und die Adsorption bei 280 mn sowie die Pyocinaktivität untersucht. Die Fraktionen, die Pyocinaktivität zeigten, wurden zusammengegeben, gegen 0,01m Tris-Puffer (pH 7,5) dialysiert, um NaCl zu entfernen und dann durch Ultrazentrifugation (1 000 000 g, 90 Minuten) eingeengt. Alle chromatographischen Verfahren wurden bei 4⁰C durchgeführt (Figur 1).

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Typisierung von Pyocin

Die Pyocin,typisierung wurde durchgeführt unter Anwendung des von Jones, et al. Appl. Microbiol. 27:400-406 (1974) beschriebenen Verfahrens. Das ALA-Set von 18 Stämmen von P. aeruginosa wurde als Indikatorstämme angewandt. Die Pyocinart und das Schema sind angegeben durch die Bezeichnung, wie sie beschrieben ist von Farmer und Herman, J.Infect. Dis. 130:543-546 (1974).

Bestimmung der Pyocinaktivität

Die Stämme von Neisseria gonorrhoeae, die auf ihre Empfindlichkeit gegenüber Pyocin untersucht werden sollten, wurden über Nacht auf GC-Agarplatten gezüchtet. Eine Suspension dieser Organismen wurde hergestellt in einem Verdünnungsmittel, bestehend aus 0,85 % NaCl und 0,1 % HCl (pH 6,4) und eingestellt auf einen Klett-Wert von 50 bis Die GC-Agarplatten wurden beimpft mit Hilfe eines Übertragungstupfers, der in die Zellsuspension eingetaucht worden war. Unverdünnte oder in Serie verdünnte Pyocinpräparate (5 /Ul) wurden auf die Oberfläche der Agarplatten aufgebracht. Alle Platten wurden über Nacht bei 37°C mit zunehmendem CO₂ (5 % CO₂) inkubiert bevor sie abgelesen wurden. Die Pyocintiter werden ausgedrückt als das 200-Fache des reziproken Wertes der höchsten Verdünnung, die eine vollständige Hemmung ergibt.

Elektronenmikroskopie

Pyocine wurden hergestellt zur Untersuchung in einem Elektronenmikroskop durch das negative Anfärbverfahren nach Brenner, et al., Biochim. Biophys. Acta 34:103-110 (1959). Die Pyocinzubereitungen wurden mit 100 000 g 1 Stunde zentrifugiert und die Perlen wieder in einem kleinen Volumen 1m NH-- C₂H₃O₂ (pH 7,0) suspendiert. Mit Formvar

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bedeckte Kupfergitter wurden auf einen Tropfen der Probe 1 bis 2 Minuten aufgelegt und dann mit Filterpapier trockengetupft. Diese Gitter wurden dann auf einen Tropfen 1,5 % Natriumphosphorwolfranat(pH 7,0) 30 Sekunden gelegt. Überschüssige Flüssigkeit wurde mit Filterpapier entfernt. Die Proben wurden in einem Phillips EM-200-Elektronenmikroskop bei 60 kV untersucht (Figur 2).

Die Wechselwirkung zwischen Pyocinen und Zellen von Neisseria gonorrhoeae wurden nach dem gleichen Verfahren beobachtet. 30 Minuten nach Zugabe von Pyocin zu einer flüssigen Kultur von N. gonorrhoeae 72H870 wurde eine Probe entnommen und wie oben behandelt. Das negativ gefärbte Präparat wurde in einem RCA-Elektronenmikroskop bei 50 kV untersucht.

Tabelle I zeigt die Ergebnisse der Bildung des Gonoccocenhenunfaktors, der während des Wachstums von P. aeruginosa ATCC 29 260 in ^eoben beschriebenen Medium gebildet worden ist. Die Zugabe von Mitomycin C (1 /Ug/ml) führte zu einer außerordentlich starken Lyse der Kultur innerhalb von 3 Stunden und zu einer 16-fachen Zunahme der Konzentration des Hemmfaktors, bestimmt durch Titration von P. aeruginosa PS7 und N. gonorrhoeae Stämmen JW-31 und DGI 1947. In Tabelle I ist auch der Titer des Hemmfaktors angegeben, der mit unterschiedlichen Stämmen von N. gonorrhoeae variiert. Kein Unterschied wurde beobachtet mit Kolonievarianten eines einzelnen Stammes.

Der Hemmfaktor wurde teilweise gereinigt aus den überstehenden Flüssigkeiten der mit Mitomycin C indizierten Kulturen von Pseudomonas aeruginosa Stämmen ATCC 29260 durch das oben beschriebene Verfahren. Der Hemmfaktor wurde von der DEAE-Cellulose mit einem NaCl-Gradienten von 0 bis 1,0m eluiert (Figur 1). Es wurden zwei Peaks, enthaltend

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den Hemmfaktor, beobachtet. Der Hauptpeak (A), der mit einer NaCl-Konzentration von 0,06m eluiert wurde, enthielt mehr als 90 % der Hemmaktivität. Ein kleinerer Peak (B), der bei einer NaCl-Konzentration von 0,91m eluiert wurde, enthielt weniger als 10 % der Aktivität. Die den Peak (A) enthaltenden Fraktionen wurden zusammengegeben, gegen 0,01 Trishydrochloridpuffer (pH 7,5) dialysiert, um NaCl zu entfernen und durch Ultrazentrifugieren (100 000 g, 90 Minuten) eingeengt. Dieses Präparat wurde in den später beschriebenen Versuchen angewandt.

Die elektronenmikroskopische Untersuchung von negativ gefärbten Präparaten des gereinigten Hemmfaktors zeigte, daß die Teilchen an Pyocine vom R-Typ erinnerten sowohl im kontrahierten als auch im nicht kontrahierten Zustand (Figur 2). Im nicht kontrahierten Zustand maßen diese Teilchen 111,5 nm in der Länge und 15,3 nm in der Breite. Im kontrahierten Zustand bestanden die Teilchen aus einem inneren Kern (105 nm Länge χ 6,5 nm Breite), umgeben von el^er kontrahierten Hülle (44,4 nm in der Länge und 18,6 nm in der Breite. Zwischen 20 und 30 % der in diesen Präparaten beobachteten Teilcheri^e?anden sich in kontrahiertem Zustand. In den negativ angefärbten Präparaten waren weder intakte Bakteriophagen noch Bakteriophagenseelen (bacteriophage ghosts) zu sehen.

Der Pyocintyp wurti^ sowohl in den teilweise gereinigten als auch in den gerein^j"^ Präparaten, wie oben beschrieben, bestimmt. Die Ergebnisse zeigen, daß sich die Identifizierung (Muster, pattern) während der Reinigung nicht änderte. Die Pyocinidentifiziffung war 611 131.

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Wirkung von Pyocin 611 131 auf das Wachstum eines klinischen Isolats von N. gonorrhoeae (Stamm 72H870)

Die Wirkung dieses Pyocins auf wachsende Zellen dieses Mikroorganismus wurde bestimmt durch Zugabe von verschiedenen Konzentrationen des gereinigten Präparats zu exponentiell wachsenden Kulturen. Die Figur 3 zeigt eine konzentrationsabhängige Hemmung des Gonoccocenwachstums durch Zugabe von Pyocin Typ 611 131.

Bei hohen Pyocinkonzentrationen trat eine vollständige Hemmung des Wachstums innerhalb einer Stunde auf, die begleitet wurde von einer extensiven Lyse der Kultur. Die elektronenmikroskopische Untersuchung (Figur 4) zeigte, daß eine direkte Wechselwirkung eingetreten war zwischen dem Pyocin und empfindlichen Zellen von N. gonorrhoeae. Die Wechselwirkung zwischen Pyocin und Zellen führte zu einer Konzentration an Pyocin und legt nahe, daß Rezeptoren auf der Zelloberfläche der Gonoccocen vorhanden sind.

Hemmspektrum von Pyocin Typ 611 131

Gleiche Anteile des gereinigten Pyocinpräparats wurden auf einen Rasen aufgebracht (spotted), der erhalten worden war von klinischen Isolaten von N. gonorrhoeae. Typische Hemmuster sind in Figur 5 angegeben. Die Hemmzone war bei allen untersuchten Stämmen deutlich. Es wurde kein Unterschied beobachtet zwischen Kolonietypen T-1 und T-4 von dem gleichen Stamm. Ein negativer Vergleich des Erzeugerstammes P. aeruginosa ATCC 29 260 wurde ebenfalls durchgeführt.

Die Hemmung verschiedener Neisseriaarten durch dieses Pyocin ist in Tabelle II angegeben. Alle Isolate von N. gonorrhoeae sowohl von ausgebreiteten als auch von nicht ausgebreiteten Infektionen wurden gehemmt. Es wurden jedoch

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nur 3 von 20 Stämmen von N. meningitidis und 5 von 16 Stämmen von N. lactamica gehemmt. Es wurde kein Zusammenhang beobachtet zwischen der serologischen Gruppe und der Hemmung von N. meningitidis. Keine der anderen fünf untersuchten Arten wurde durch dieses Pyocin gehemmt.

Schnelle Identifizierung von Neisseria gonorrhoeae

Eine schnelle Identifizierung von Neisseria gonorrhoeae kann nach einem der folgenden Verfahren durchgeführt werden: Pyocin 611 131 wird (a) auf einer Agarplatte verteilt, enthaltend die zu untersuchende biologische Probe, oder (b) eine Scheibe, die mit dem Pyocin imprägniert ist, wird auf eine Platte aufgebracht, die mit einer Probe beimpft ist, oder (c) Pyocin wird in eine Hälfte einer getrennten Agarplatte eingebracht und mit der Probe beimpft. Nach der Inkubation wird die Identifizierung des Organismus als N. gonorrhoeae durchgeführt auf der Basis einer Hemmzone, die den Punkt umgibt, wo das Pyocin aufgebracht wurde, oder die Hemmung des Wachstums auf dem Teil der Platte in^e<?as Pyocin eingebaut worden war.

Dieses Verfahren kann natürlich auch auf die Identifizierung anderer Bakterien angewandt werden.

Typisierung von Neisseria gonorrhoeae

Die Typisierung, d.h. Einordnung von N. gonorrhoeae und anderen Arten von Neisseria, umfaßt die Anwendung verschiedener Pyocinarten und beruht auf der Hemmung oder Nichthemmung des zu untersuchenden Organismus. Die erhaltenen Ergebnisse werden angewandt, um den Typ bzw. die Art des Isolats zu identifizieren, indem man sie in Beziehung bringt zu den mit einer Reihe bekannter Typen erhaltenen Ergebnissen (Tabelle 4). Dieses Verfahren der Typisierung ist besonders geeignet für epidemiologische Untersuchungen, wo das Vorherrschen bzw. die Anzahl der Fälle oder das Auftreten von

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neuen Stämmen von Wichtigkeit ist, sowie zur Bestimmung, ob ein Nichtansprechen der Behandlung auf der Resistenz eines Organismus oder auf einer Neuinfektion mit einem anderen Typ beruht.

Weitere Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden im folgenden beschrieben:

Identifizierung von Neisseria gonorrhoeae mit Hilfe von mit Fluorescein markierten Pyocinen

Bei diesem Verfahren werden Pyocine, die wie oben

gebildet und gereinigt worden waren, mit Fluorescein markiert, entsprechend dem Verfahren von Johnson, et al. "Handbook of Experimental Immunology", Blackwell Scientific Publications, Oxford 1973· Die so markierten Pyocine werden umgesetzt mit einer Probe, in der N. gonorrhoeae erwartet werden auf einem Objektträger der hergestellt worden ist mit klinischem Material oder .

isolierten Kolonien von einer Agarplatte. Überschüssige Pyocine werden entfernt, indem man den Objektträger mit 0,02m phosphatgepufferter Salzpufferlösung (pH 7,2) spült und unter einem UV-Mikroskop beobachtet. Die Zellen, die die typische Morphologie von N. gonorrhoeae besitzen und Fluorescens zeigen, werden als für N. gonorrhoeae positiv betrachtet.

Identifizierung von Bakterien durch radioaktivmarkierte Pyocine

Radioaktive Pyocine werden hergestellt, indem man sie mit 125 J nach dem Chloramin-T-Verfahren jodiert. Wahlweise

können auch mit "Ή oder C markierte Pyocile hergestellt werden, indem man speziell markierte Aminosäuren in das Wachstumsmedium einbaut vor Einleitung der Pyocinsynthese in Pseudomonas aeruginosa durch Mitomycin C. Pyocine, gebildet nach diesem Verfahren, sind radioaktiv. Spezielle Bakterien können leicht identifiziert werden durch Umsetzung der radioaktiven Pyocine mit einer Suspension der Bakterien. Diese

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- tgr-

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Suspension wird dann einer Membranfiltration oder Zentrifugierung unterworfen, um nicht gebundene Pyocine von solchen zu entfernen, die spezifisch an die Oberfläche der Bakterienzellen gebunden sind. Das Filter oder die gewaschene Zellperle wird dann ausgezählt, um die Menge an markiertem Pyocin zu bestimmen, das gebunden ist. Die Daten werden verglichen mit dem Grad der unspezifischen Bindung. Eine etwaige Zunahme über die nichtspezifische Bindung hinaus zeigt das Vorhandensein des unbekannten Organismus an.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann angewandt werden zur Identifizierung von Antigenen, die Bakterien von taxonomisch nicht verwandten Arten gemein sind. Es ist bekannt, daß Bakteriocine spezifische Rezeptorstellen auf der äußeren Oberfläche von Bakterien binden. Diese Rezeptorstellen sind auch dem Abwehrmechanismus des Wirtes ausgesetzt und können so die Bildung von Antigenen stimulieren, die entweder baktericid oder opsonisierend sind. Bakterien können gemeinsame Antigene besitzen. Dic~e gemeinsamen Antigene können auch Bakteriocinrezeptorstellen sein, und daher kann die Wechselwirkung von Bacteriocinen mit unterschiedlichen Bakterienarten ausgenutzt werden als Indikator für anteilige Antigene (Tabelle V). Das kann umgekehrt wieder ausgenützt

der

werden bei Isolierung und Reinigung von Antigenen zur Herstellung von Impfstoffen. So kann ein schwächeres Antigen für einen Organismus ein stärkeres Antigen für einen anderen sein und daher leichte gereinigt und in größeren Mengen erhalten werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch angewandt werden, um übliche Antigene (oder Oberflächenbestandteile) in Säugetierzellen nachzuweisen. Aufgrund der innewohnenden Spezifität ihrer Rezeptoren können Bakteriocine anstelle von Verbindungen wie Lectinen oder in Verfahren einschließlich einer Gewebetypisierung angewandt werden. *) (gemeinsame)

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Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch angewandt werden zur Identifizierung von anderen Bakterien. So reagieren, wie aus Tabelle V hervorgeht, Bakteriocine von Vibrio cholerae, Aeromas Hydrophile und Serratia marcescens kreuzweise mit toxonomisch nicht verwandten Organismen.

folgen Tabellen I bis IV

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Tabelle I

Wirkung von Mitomycin C auf den Gonoccocenhemmfaktor von Pseudoraonas aeruginosa ATCC 29260

Organismus

P. aeruglncsa PS-7 N. gonorrhoeae JW-31 N. gonorrhoeae DGI 1947 N. gonorrhoeae 1138 (T-I) N. gonorrhoeae 1138 (T-4)

Hemmtiter (Einheiten/ml) induziert induziert

2560	40,960
2560	40,960
640	10,240
N.D.^b	5,120
N.O.	5,120

a. Mitomycin C (1 yug/ml Medium) bei ReihenVerdünnung, Hemmung des Wachstums dieser Organismen hörte bei einer 1:2-Verdünnung auf

b. N.D. = nicht bestimmt

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- w-

Tabelle II

Empfindlichkeit von verschiedenen Heisseriaarten gegenüber gereinigtem Pyocin (R-Typ) von
Pseudomonas aeruginosa Stanun ATCC 29 26Ο

Anzahl der unter- Anzahl der empfind-

Arten Serogruppe suchten Stämme liehen Stämme

N. qonorrhoeae - 56 56 -

N. meninqitidis A4 0

B 5 1

C 3 0

X 3 0

Y 1 1

Z 2 1

135 2 0

N. lactamica - 16 5

N. mucosa 1 °

N. flava 1 °

N. subflava - 1 °

N. ovis 1 °

N. flavescens 1 "

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, -Μ 44 Ib

UL

Tabelle III Organismps

Neisseria gonorrhoeae JW31

N. gonorrhoeae 72H874

N. gonorrhoeae 72H87

N. gonorrhoeae 1938

N. gonorrhoeae 1567

N. gonorrhoeae 2020

N. gonorrhoeae 1344

N. gonorrhoeae 2024

N. gonorrhoeae 1817

N. gonorrhoeae 1947

N. gonorrhoeae 1402

N. gonorrhoeae 1918

N. gonorrhoeae 14 51

Bacteriocin 12 3 4

Bacteriocin 1: Ps. at. :sa FS-5

Bacteriocin 2: Ps. aeruginosa -6

Bacteriocin 3: Ps. aeruginosa ATCC 29260

Bacteriocin 4: Ps. aeruginosa PS-7

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2 7U415

Tabelle IV Bacteriocin Organismus Aeromonas hydrophilia Enterbacter aerogenes E. cloaceae CP

E. coli B

E. coli Sears Providencia stuartii Ps. Aeruginosa non pigm.

Ps. maltophilia B SaI. chloerasuis Brucella abortus B. bronchisepticus B. suis

Bacteriocin 1: Vibrio cholera El Tor Bacteriocin 2: Serratia marcescens Bacteriocin 3: Aeromonas hydrophilia

« . t I

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Claims

ORiSGON STATE BOARD.

Patentansprüche

1. Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseim oder zur Hemmung des Wachstums eines Mikroorganismus, der zu einer speziellen Art gehört, dadurch gekennzeichnet, daß man diesen Mikroorganismus mit einem Bakteriocin von einem Mikroorganismus mit einem Bakteriocin einer taxonomisch nicht verwandten Art zusammenbringt, das sich mit dem zuerst genannten Mikroorganismus verbindet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Mikroorganismus ein Stamm von Neisseria gonorrhoeae oder Pseudomonas aeruginosa

ATCC 29 260 ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß das Bakteriocin ein Pyocin vom Typ R, das als 611 131 bezeichnet werden kann, ist.

h. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet , daß man eine Probe, in der der Mikroorganismus nachgewiesen werden soll, auf ein Wachstumsmedium bringt, dieses probehaltige Wachstumsmedium mit einem Bakteriocin vom R-Typ von einem Mikroorganismus einer taxonomisch nicht verwandten Art zusammenbringt, das sich mit dem Mikroorganismus verbindet, das damit zusammengebrachte die Probe enthaltende Wachstumsmedium inkubiert und das Vorhandensein oder die Hemmung des Wachstums auf dem Medium mißt.

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ORIGINAL INSPECTED

27U415

5. Verfahren zur Herstellung eines Bakteriocins mit baktericider Aktivität gegenüber Neisseria gonorrhoeae, dadurch gekennzeichnet , daß man in einer Kulturbrühe Pseudomonas aeroginosa ATCC 29260 züchtet, die überstehende Flüssigkeit von der Kultur entfernt, reinigt und die bakteriocinreiche Fraktion davon abtrennt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung in Gegenwart von Mitomycin A durchführt.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet , daß man bei der Reinigung mit Hilfe von Salz fraktioniert, über DEAE-Cellulose chromatographiert und durch zentrifugieren sedimentiert.

8. Verfahren zur Identifizierung von Antigenen, die Bakterien von taxonomisch nicht verwandten Arten gemein sind, dadurch gekennzeichnet , daß man die Wechselwirkung eines Bakteriocins mit diesen taxonomisch nicht verwandten Bakterien nachweist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , daß man Antigene von Säugetierzellen verwendet.

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