JPS5843077B2 - バクテリオシンの調製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は診断のための微生物学の分野に関し、更に詳し
くは生物学的試料中の特定の属に属する微生物の存在ま
たは型別を検定するための診断法ふ・よび分類学的関連
のない属に共通した抗原を同定する方法に関する。

ナイセリア・ゴノロエア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎ
ｏｒｒｈｏｅａｅ）の分離物中にバクテリオシン様活性
が認められることをフリン（Ｆｌｙｎｎ） ＞よびマク
エンテガルト（ＭｅＥｎｔｅ−ｇｇａ ｒ ｔ ）がジ
ャーナル・クリニカル・パソロジイ（Ｊ−ＣＩ ｉｎ、
Ｐａｔｈ） 、第２５巻第６０〜６１頁（１９７１年
）に報告している。

その他の微生物からの物質も同じ＜Ｎ、ゴノロエアに対
してバクテリオシン様活性を奏することが報告されてい
る。

フオルク（■ｏｌｋ）およびクラウス（Ｋｒａｕｓ）は
ブリティシュ・ジャーナル・オプ・ヴエネリアル・ディ
シーズ（Ｂｒ ｉ ｔ、 Ｊ、 Ｖｅｎｅｒ、 Ｄｉｓ
、 ）、第４９巻第５１１−５１２頁（１９７３年）に
ナイセリア・メニンギテイデイス（Ｎ、 ｍｅｎｉｎｇ
ｉ ｔｉｄｉｓ）からの物質がＮ、ゴノロエアを試験管
内で抑制することを報告している。

ガイザー（Ｇｅｉｚｅｒ）はジャーナル・オプ・ハイジ
ニツク・エビデミノロジイ（Ｊ、 Ｈｙｇ、 Ｅｐｉｄ
、 ）、第１２巻、第２４１−２４３頁（１９６８年）
にシュードモナス・エルギノザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を含む多数の微生物の菌株
が生産する末同定物質が淋菌の発育を阻止することを報
告している。

Ｎ、ゴノロエアの多くの菌株に対するバクテリオシン様
活性はワルスタツド’、Ｗａ １ ｓ ｔ ａｄ ）イ
ンフエクシオン・イムニテイ（Ｉｎｆｅｃｔ、 Ｉｍｍ
ｕｎｔｙ）、第１０巻、第４８１−４８８頁（１９７４
年）に報告しているように遊離脂肪酸釦よびリゾホスフ
ァチジェタノールアミンが阻止濃度で生産されることに
よるものであった。

（ａ） バクテリオシンの由来と構造 バクテリオシンは種々のバクテリアが生育中に生産する
１群の特定の殺菌性物質である。

これらの物質は種々の分子量を有する蛋白質である。

バクテリオシンは抗生物質特性を有しているものの、治
療用の抗生物質とは異って同一もしくは密に関連する種
のメンバーにのみ作用して特異性が一層強いものである
。

バクテリオシンは感受性微生物のレセプタ一部位に結合
する細胞外物質である。

バクテリオシンは普通には細胞溶解で放出される寸では
生産菌株内に包含された１捷である。

これらの細胞外物質は感受性微生物のレセプタ一部位に
結合し得る。

バクテリオシンのうちのいくつかは検鏡するとバクテリ
オファージ部分と酷似している。

これらの生産は代謝阻害剤例えば紫外線、マイトマイシ
ンＣ，ナイトロジエン・マスタード、その他の種々の剤
で誘起することができる。

バクテリオシンには２種の基本タイプがある。

一つのタイプは、熱安定性を有し、超遠心では沈降し得
ずまた電子顕微鏡では容易に解像し得ない小さい分子で
ある。

もう一つのタイプはより大型であり、ファージテールに
似ている。

この基本タイプの相違はコリシン（Ｃｏｌ １ｃｉｎ）
Ｖとコリシン１５とを比較してみると十分に説明でき
る（コリシンとは大腸菌群微生物に対して特異的なバク
テリオシンをいう）。

コリシン■は低分子量を有する透析可能な生成物を形成
する。

コリシン１５は沈降可能であり、２００，０００の分子
量を有し、そして電子顕微鏡ではファージのテール構造
に似ている。

バクテリオシンの小量は微生物の正常の培養物中にも放
出され、培養物中の微生物の変性の過程でみられる通常
の細胞溶解の過程で釦そら〈放出される。

これらの遺伝的決定子は、細菌染色体により相中で複製
する特別染色体因子として存在し、それ故菌株が生存す
る限り生存するものである。

これらは量としては細菌細胞の溶解により−この溶解が
ファージ感染、溶菌剤例えば代謝抑制剤の作用あるいは
その他の要因で起るにせよ一放出される。

化学的には、バクテリオシンはすべて巨大分子であり、
ポリペプチド、蛋白質、その他の基例えば分子の最終サ
イズに寄与するような炭水化物、ホスフェート、釦よび
リポ多糖類を含有している。

（ｂ） 命名法 バクテリオシンの由来、化学釦よび活性についての証明
が更につみ重なるにつれて分類ふ・よび命名法は必然的
に変りつつあるが、バクテリオシンは一般則として由来
する微生物の属名よりも種名に基いて命名される。

例えばＥ、コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ） バクテリオシンは
コリシンと称する。

セラティア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ −ｍａ
ｒＣｅＳＣｅｎＳ）テハマルセシン、エンテロバクテラ
エロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏ ｂａｃｔｅｒａｅｒｏｇｅ
ｎｅｓ ）ではエロシン、シュードモナス・エルギノザ
（ピオシアネウス） （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅ
ｒｕ−ｇｉｎｏｓａ （Ｐｙｏｃｙａｎｅｕｓ ） ）
ではビオシン、リステリア・モノシトゲネス（Ｌｉ ｓ
ｔ、ｅｒｉａ ｍｏｎｏ −ｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）テ
ハモノシン、スタフィロコッカス・５ｐ（Ｓｔ、ａｐｈ
ｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ、 ）ではスタフイロシン等
々である。

この分類は、ベルギーのグラティア（Ｇｒａｔ、ｉａ）
がＥ、コリの特別な菌株のろ液が同種の生育を抑制する
ことを初めて報告し、この抑制因子をコリシンと称した
ことから始ったものである。

約２０種のコリシンがその後確認され、Ａ−Ｖと分類さ
れるに至った。

それぞれのコリシンはエンテロバクテラシアーｃ （Ｅ
ｎｔｅｒｏｂａｃｔ、ｅｒａ−ｃｉａｅ） の菌株群
の小グループに対して特異性を有していた。

それぞれのバクテリオシンはＥ。コＩＪ ｔたはその他
の種いずれの由来であれ同−微生物寸たは分類学上関連
のある種の微生物に対し作用上特異的であると考えられ
る。

（ｃ） バクテリオシンの検定 ｐ液中のバクテリオシン濃度は新たに生育した細胞の指
示細菌（１０７／ｍ／！ ）を接種した種培地に１滴（
１０−２０μｌ）をのせて滴定した。

３７℃で１８〜２４時間培養した後、平板を読み、記録
する。

力価は透明なスポットを生じる最高希釈度の逆数とみな
される。

別の方法は感受性微生物の計数した過剰量にバクテリオ
シンを添加する方法であり、殺菌活性はバクテリオシン
の存在量と比例する。

バクテリオシン活性の１単位は指示菌株の生育を完全に
抑制する最低濃度である。

現在のところ精製はむしろ当初の培養液または生理食塩
水懸濁液からの濃縮の問題ひいては特別のフラクション
の単離の問題である。

最も普通に使用されている方法は６〜２４時間培養後遠
心分離により細胞を除去することである。

精製は硫酸アンモニウム沈殿に続くカラムクロマトグラ
フィー次いで平衡化緩衝液に対する透析によって完了す
る。

精製バクテリオシンは凍結乾燥状態では長期間安定であ
る。

溶液中ではこれらは４℃釦よびｐＨ７，０で６週間安定
である。

バクテリオシンは４Ｍグアニジンチオシアネートまたは
６Ｍ尿素で不可逆的に変性されるが、６’Ｏ’Ｃ，％−
よびｐＨ７，０で６０分間で完全に不活性化される。

（ｄ） 作用の様式 バクテリオシンは増殖の対数期にある細胞に作用する。

感受性細胞の処理により標識ロイシン釦よびチ□ジンの
酸不溶性物質への結合が急速に阻害される。

１４ Ｃ釦よび３Ｈ標識同位体の阻害に要する時間はバ
クテリオシンの濃度に左右される。

ＤＮＡ＄−よび蛋白合成がバクテリオシンで阻害される
ことは確かめられている。

培地中の微生物をバクテリオシンに曝すと、これら微生
物は１４Ｃロイシンを蛋白質にまたは３Ｈチ□ジンをＤ
ＮＡに結合させなくなる。

これは釦そらくは特異バクテリオシンによるロイシン卦
よびチミジンの有効な移送が阻害されることに因るもの
であろう。

同時にＡＴＰの濃度が対照値の１０〜１５係に低下する
。

これは巨大分子合成の減退に関するものではなく、バク
テリオシンに曝された細菌細胞にみられるようなよろめ
きエネルギー移送メカニズムを解説する助けとなる。

ＡＴＰ活性が抑制されるが、ホスホトランスフェラーゼ
系は影響を受けず、α−メチル−Ｄ−グルコシドが大腸
菌に蓄積することがわかった。

これらの作用様式とは別に、感受性を有する微生物の若
干の種では細胞膜の統合性の阻害が起ることがある。

本発明の目的は微生物の生育を抑制する新規にして特異
な方法を提供するにある。

別の目的は特別な属に属する微生物が生物試料中に存在
するか否かを検出するための改善された試験法を提供す
るにある。

他の目的はナイセリア・ゴノロエアの同定のための改善
された試験法を提供するにある。

別の目的はナイセリア・ゴノロエアを型別する手段を提
供するにある。

更に他の目的は共通細菌抗原を同定する試験法を提供す
るにある。

更に他の目的はは乳類細胞の共通抗原もしくは表面成分
が存在するか否かを証明するための試験手段を提供する
にある。

更に別の目的はＮ・ゴノロエアの生育を抑制する新規に
して特異なビオシン（ｐｙｏｃｉｎ）の製造にある。

本発明によれば、前述した目的およびその他の目的は以
下に記載の如くにして達成される。

本発明の一態様は特定の属に属する微生物の生育を抑制
する方法で表わされる。

この方法は該微生物を分類学上関連のない属の微生物か
らのバクテリオシン（前者の微生物に結合する）と接触
させることからなり、以下この方法について次の通り説
明する。

バクテリオシン、微生物あ−よび培地 バクテリオシンはＰ・エルギノザの１菌株（ＡＴＣＣ’
２９２６０．微工研菌寄第４９８０号。

以下ｒＡＴＣＣ２９２６０ｊ とのみ記載する。

）から得られたＲ−タイプビオシン（６１１１３１）
であった。

基礎培地は１１当り次のものを含有していた。

プロテオースペプトン４３ （Ｄｉｆｃｏ）、１５ｇ、
Ｋ２ＨＰＯ４，４ｇ、ＫＨ２ＰＯ４，１ｇ、Ｎａｃｌ。

５ｇ、ふ・よび可溶性でんぷん１ｇｏ培地の最終ｐＨは
７．２であった。

Ｐ、エルギノザによるＲ−タイプビオシンの製造に使用
する場合、オートクレーブ処理後にグリセロール（１容
量／容量％）釦よびグルタミン酸モノナトリウム（８，
４６ｇ／ｌ）を加えた。

ナイセリア・ＳＰＰ、の生育に使用する場合、オートク
レーブ処理後にグルコースを欠く以外はイソビタレツク
ス（Ｉｓｏｖｉｔａｌｅｘ）栄養強化物（ＢＢＬ）と同
一組成の生育因子補助剤（ＩＶ／Ｖ％）、ＮａＨＣＯｓ
（４２ｍ９／１．）ｂよびグルコース（５ｇ／Ｖ）
を加えた。

指示のある場合はグルコース（！ｌ／ｌ）、ｉ−よび生
育因子補助剤（ＩＶ／Ｖφ）を含むＧＣ寒天（Ｄｉｆｃ
ｏ）平板を使用した。

Ｒ−タイプビオシン（６１１１３１）の誘導および精製 Ｐ、エルギノザＡＴＣＣ２９２６０の一夜培養液を遠心
分離（２，１１００Ｘ、１０分）にかけ、Ｎａｃｌ ヲ
０．８５φ釦よびシスティン塩酸塩を０．１φ含むｐＨ
６，５の溶液に元の容量の１／１０に再懸濁した。

１ ％ （Ｖ／Ｖ ）接種体を使用し、培地を３７℃で
旋回振とう機で培養した。

培地の濁度が約１５０Ｋｌｅｔｔ単位に達したときにマ
イトマイシンＣを最終濃度１〜／ｒｒＬｌで加えた。

培地の過度の溶解が生じる１で培養を続けた。

これは普通マイトマイシンＣ添加後３時間以内で生じる
。

マイトマイシンＣ−誘発培地を２，４ＯＯＸｇ、３０分
遠心分離して細胞残渣を除去し、得られた上澄ｉをクロ
ロホルム（５Ｖ／Ｖ％）で処理した。

この上澄フラクションを粗製ビオシンと称する。

粗製ビオシン製剤を蔭山釦よび沃土の方法、ライフ・サ
イエンス（Ｌｉｆｅ ５ｃｉ−）第９巻第４７１−４７
６頁（１９６２年）、の変法で更に精製した。

要約するに、この操作法は粗製ビオシン製剤にかくはん
しなからＩＭＭｎｃ１２ （溶解質１１当り６０１ｒＬ
ｌ）をゆっくり添加することからなっていた。

ＩＭＮａＯＨでｐＨを７．５に調節した後得られた沈殿
を遠心分離（２，４００ＸＪ’、１５分間）で除去した
。

上澄液を部分精製ビオシンと称する。それ以上の精製は
（ＮＨ４）２８０４７０％飽和１で加え、４℃で一夜培
養することによって行われる。

４°Ｃで遠心分離（２，４ｏｏ×ｇ、３０分間）した後
、ビオシン活性を含有するペレットを０．０１ＭＭｇｃ
Ａ２ ｋよび０．０１Ｍ Ｍｇ５Ｏ＋ を含有する０
、０１Ｍ）リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−（
トリス）ハイドロクラロイド（ｐＨ７，５）５０ＴＬｌ
に溶解し、同一緩衝液２１に対して４℃で一夜透析した
。

必要に応じて、製剤を遠心分離（２，４００１，１５分
間、４℃）で清澄化した。

ビオシン製剤を次に９０分間ｉｏｏ、ｏｏｏｘ、ｙで遠
心分離した〔タイプ４０ローター、スピンコ（Ｓｐｉｎ
ｃｏ）モデルＩ、２−６５Ｂ超遠心機〕。

ゼラチン状ペレットを緩衝液２０ＴＬｌにゆっくりと溶
解し、ＤＥＡＥセルロースＣＤＥ−５２、英国、ケント
、ワットマン、バイオケミカルズ、リミッテツド（Ｗｈ
ａｔｍａｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｌｔ、ｄ、
） ） （予め洗い、同一緩衝液で平衡化してかいた）
でクロマトグラフ処理した。

ビオ−シン試料−８・ｍｌヲ１．５ 、×・２、８ ｃ
ｍＯカラムに入れ、１時間吸着せしめた。

カラムを緩衝液２００ｍ１で洗ってＤＥＡＥセルロース
に吸着されていない物質を除いた。

次にビオシンを０．０１Ｍ緩衝液中のＮａｃｌ濃度勾濃
度勾配−１，０Ｍ）８００ｍｌで溶離した。

５Ｖｌ！フラクシヨンを採取し、２８０ ｎｍでの吸光
度釦よびビオシン活性を分析した。

ビオシン活性を示すフラクションをプールし、０．ＯＩ
Ｍ）リス緩衝液（ｐＨ７，５）に対して透析してＮａｃ
ｌを除去し、それから超遠心分離＜ ｉ、ｏｏｏ、ｏｏ
ｏｘｙ、９０分間）で濃縮した。

クロマトグラフ操作は４℃で行った。

（第１図）。ビオシン型別 ビオシン型別はアプライド・マイクロバイオロジイ（Ａ
ｐｐｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 ）第２７巻、第４００
−４０６頁（１９７４年）にジョンズ（Ｊｏｎｅｓ）等
が報告しているプロス法を用いて行った。

ビオシンのタイプ釦よびパターンはジャーナルオブ・イ
ンフエクシアス・ディシーズ（Ｊ−Ｉｎｆｅｃｔ、−Ｄ
ｉｓ、 ）第１３０巻、第５４３−５４６頁（１９７４
年）にファーマー（Ｆ ａ ｒｍｅ ｒ ）ｓＴｈよび
バーマン（Ｈｅｒ−ｍａｎ）が報告している注解に記載
されている。

ビオシン活性の検定 ビオシンに対する感受性を試験するＮ、ゴノロエア菌株
を一夜ＧＣ寒天プレートで生育させた。

０．８５ ％Ｎａｃｌ ｋよび０．１％Ｈｃｌからなる
希釈液（ｐＨ６，４）中のこれら微生物の懸濁液を調製
し、クレット（Ｋｌｅｔｔ）示度５０−６０に調節した
。

ＧＣ寒天プレートに細胞懸濁液に浸したスワブを用いて
接種した。

希釈しないかもしくは連続希釈したビオシン製剤（５μ
ｌ）を寒天プレートの表面に適用した。

全部のプレートを読取り前に３７℃でＣＯ２を増加させ
て（５％ＣＯ□）培養した。

ビオシンカ価は完全ｉ抑制を示す最高希釈度の逆数の２
００倍で表わされる。

電子顕微鏡法 電子顕微鏡での検鏡のためにブレナー（Ｂｒｅ−ｎｎｅ
ｒ）等のネガティブ・ステイニング法〔ビオヒミカ・エ
ト・ビオフイジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ。

Ｂ １ｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ−）第３４巻、第１０３
−１１０頁（１９５９年）〕によりビオシンを調製した
。

ビオシン製剤を１時間１００，０ＯＯＸ、！９で遠心分
離し、ペレットをＩ Ｍ ＮＨ４Ｃ２Ｈａ ０２ （ｐ
Ｈ７，０）小量に再懸濁した。

ホルムバール（Ｆｏｒｍ−ｖａｒ）被覆した銅グリッド
を１〜２分間試料１滴ノ上にのせ、濾紙で吸取乾燥させ
た。

これらのグリッドを３０秒間１．５％りんタングステン
酸ナトリウム（ｐＨ７，０）１滴の上にのせた。

過剰の液を濾紙で除いた。

試料をフィリップス（Ｐｈ ｉ １１ ｉｐｓ）ＥＭ−
２００電子顕微鏡で６０ｋｖで検鏡した（第２図（参考
電子写真ｎ））。

ビオシンとＮ、ゴノロエアの細胞との相互作用は同様な
操作で観察した。

ビオシンをＮ、ゴノロエア７２Ｈ８７０の液体培養物に
添加後３０分して試料を除き、上記の通り処理した。

ネガティブ・ステイニングした製剤をＲＣＡ電子顕微鏡
５０ ｋｖで検鏡した。

次の第１表には、上記培地中でＰ、エルギノザＡＴＣＣ
２９２６０の生育中に合成された淋菌抑制因子の生産の
結果を示す。

マイトマイシンＣの添木＊加（ｌｄ／ｍｆｆ１）により
３時間以内に培養物の大幅な溶解をもたらし、Ｐ。

エルギノザＰ Ｓ ７ ｆ；？よびＮ、ゴノロエア菌株
ＪＷ−３１釦よびＤＧ１１９４７での滴定で測定された
抑制因子の濃度の１６倍の増大となった。

第１表にはＮ、ゴノロエアの異った菌株により変化する
抑制因子の力価をも示し、単一菌株の集落変異株では産
異は認められなかった。

シュードモナス０エルギノザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＡＴＣＣ２９２６０による淋
菌抑制因子の生産に対するマイトマイシンＣの効果 抑制因子はＰ、エルギノザ菌株ＡＴＣＣ２９２６０のマ
イトマシンＣ誘発培養物の上澄液から上記操作で部分的
に精製した。

抑制因子はＤＥＡＥセルロースからＯ〜１．０Ｍ濃度勾
配Ｎａｃｌで溶離した（第１図）。

抑制因子を含む２つのピークが認められた。

主ピークＡは０．０６ Ｍ Ｎａｃｌ濃度で溶離し、抑
制活性９０多以上を含有していた。

小ピークＢは０．９１ Ｍ Ｎａｃｌ濃度で溶離し、抑
制活性１０％以下を含有していた。

ピークＡを構成するフラクションをプールし、０．０１
トリス−ハイドロクロライド緩衝液（ｐＨ７，５）に対
して透析してＮａｃｌを除去し、超遠心分離（１００，
０ＯＯＸ、９゜９０分間）で濃縮した。

この製剤を以下に記載する試験で使用した。

精製抑制因子のネガティブ・ステイニングした製剤の電
子顕微鏡による検鏡では、粒子が非収縮釦よび収縮両者
の状態でＲ−タイプビオシンに似ていることがわかった
（第２図）。

非収縮状態ではこれらの粒子は長さ１１１．５ ｎｍ
、幅１５．３ｎｍであった。

収縮状態では粒子は収縮さや（長さ４４．４ｎｍ、幅１
８．６ ｎｍ ）でとりかと１れた内芯（長さ１０５
ｎｍ 、幅６．５ｎｍ）からなっていた。

これらの製剤で観察された粒子の２０〜３０引ま収縮状
態であった。

ネガティブ・ステイニングした製剤のいずれにも無傷フ
ァージもファージ幻影もみられなかった。

部分精製釦よび精製双方の製剤でのビオシンのタイプは
前文に記載の如くにして定められ、結果としてパターン
は精製過程で変化しなかったことがわかった。

ビオシンパターンは６１１ １３１ である。

Ｎ、ゴノロエアの臨床単離物（菌株７２ Ｈ８７０）の
生育に対するビオシン６１１ １３１ の効果この微生
物の生育細胞に対する該ビオシンの効果は精製製剤を種
々の濃度で指数増殖中の培地に添加することによって測
定した。

第３図は、ビオシンタイプ６１１ １３１ の添加によ
る淋菌生育の濃度依存抑制を示す。

高ビオシン濃度では完全な生育抑制が培養物の広汎な溶
解を伴って１時間以内に生じた。

電子顕微鏡による検鏡（第４図（参考電子写真ＩＶ））
ではビオシンとＮ、ゴノロエアの感受性細胞との間に直
接相互作用が起っていることがわかった。

ビオシン細胞相互作用はビオシンの収縮をきたし、淋菌
細胞表面に受容体が存在していることを示唆＊している
。

＊ビオシンタイプ６１１ １３１の抑制スペクトル精製
ビオシン製剤の一定量をＮ、ゴノロエアの臨床単離物か
ら調製した培地にスポットした。

典型的な抑制パターンを第５図（参考電子写真■）に示
す。

抑制域は検査した全菌株にかいて明らかに認められた。

同一菌株からのコロニータイプＴ−１とＴ−４との間に
差異は認められなかった。

生産菌株Ｐ、エルギノザＡＴＣＣ２９２６０のネガティ
ブ・コントロールも包含されていた。

このビオシンによる種類のナイセリア種の抑制効果を次
の第２表に示す。

伝染性釦よび非伝染性感染症双方からのＮ。

ゴ ノロエアの単離物はいずれも抑制された。

しかし、 Ｎ。

メニンギテイデイスでは２０菌株中３菌株またＮ。

ラクタミカでは１６菌株中５菌株のみが抑制されただけ
である。

血清グループとＮ、メニンギテイデイスの抑制との間に
相関関係は認められなかった。

その他の５種の供試様はいずれもこのビオシンでは抑制
されなかった。

ナイセリア・ゴノロエアの迅速同定 ナイセリア・ゴノロエアを迅速に同定する方法は次の操
作法のいずれかによって行うことができる。

すなわち、ビオシン６１１ １３１ を（励供試生物
試料を含有する寒天プレートにスポットするか、捷たは
（ｂ）ビオシンを含浸させたディスクを試料を接種した
プレートにのせるか、渣たは（ｃ）分割寒天プレートの
半分にビオシンを混入し、これに試料を接種する。

培養後、微生物がＮ、ゴノロエアであることを同定する
のは、ビオシンを適用したスポットをとり普く阻止域を
基とするかあるいはビオシンを混入したプレートの部分
での生育抑制を基として行われる。

この方法は言う捷でもなくその他の細菌の同定にも適用
することができる。

ナイセリア・ゴノロエアの型別 ナイセリア・ゴノロエア釦よびその他のナイセリア種の
型別には数種のビオシンタイプの使用を要し、供試微生
物を抑制するか否かを基準とする。

得られた結果を次の第３表に示す如く一連の既知のタイ
プで得られた結果と関係づけることにより単離物の「タ
イプ」の同定に使用する。

この型別法は、新菌株の有病率もしくは出現が重要とさ
れる疫学の研究に特に有用であり、捷た治療不成功が耐
性微生物によるものかもしくは新型による再感染による
ものかを判定するのにも特に有用である。

本発明の更に他の態様を以下に記載する。

フルオレセイン標識ビオシンを使用するＮ、ゴノロエア
の同定 この方法では、上述の如くして生産、精製したビオシン
をジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）等の方法〔「ハンドブ
ック・オプ・エクスペリメンタル・イムノロシイＪ
（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎ−ｔａ
ｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、ブラックウェル、サイエ
ンティフック・パブリケーションズ（Ｂｌａｃｋｗｅｌ
ｌＳｃｉｅｎｔｉｆｊｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）
、オックスフォード、１９７３年〕に従ってフルオレセ
イン標識する。

このようにして標識されたビオシンを臨床検体捷たは寒
天プレートの単離コロニーから調製したスライド上の被
疑Ｎ、ゴノロエアと反応させる。

スライドを０．０２モルりん酸塩緩衝化生理食塩水（ｐ
Ｈ７，２）緩衝液で洗滌して過剰のビオシンを除去し、
スライドをＵＶ顕微鏡で観察する。

Ｎ。ゴノロエアの典型的な形態を有し、かつ蛍光を示す
細胞をＮ、ゴノロエアに対して陽性とみなす。

同位元素標識ビオシンによる細菌の同定 ビオシンをクロラ□ンＴ法により１２５■でヨード化す
ることによって放射性ビオシンを製造する。

あるいは、マイトマイシンＣによるシュードモナス・エ
ルギノザでのビオシン合成の誘発に先立って、生育培地
に特別標識ア□ノ酸を添加することにより放射性ビオシ
ンを３Ｈ−または１４Ｃで標識して製造することができ
る。

この方法で生産したビオシンは放射性を有している。

放射性ビオシンと細菌の懸濁液とを反応させることによ
り特定の細菌を容易に同定することができる。

次に、この懸濁液を膜濾過または遠心分離して細菌細胞
の表面に特異的に結合していたビオシンから未結合ビオ
シンを除去する。

次いで、フィルターペレットもしくは洗滌細胞ペレット
を計数して標識ビオシン結合量を求める。

データを非特異的結合の度合と比較し、非特異的結合の
程度をこえる任意の増加は未知の微生物の存在を指示し
ている。

本発明は分類上無関係の属の細菌に共通している抗原の
同定に利用することができる。

バクテリオシンは細菌の外部表面に特異的レセプタ一部
位に結合することが知られている。

これらのレセプタ一部位は宿主の防衛機序にも曝されて
いるので、殺菌性またはオプソニン性タイプのいずれか
テアってよい抗体の生産を促進し得るものである。

細菌類は共通の抗原を分有していることもある。

これらの共通抗原はまたバクテリオシンレセプタ一部位
でもあり得るので、バクテリオシンと異種の細菌との相
互作用を分有抗原の指示剤として使用することもできる
。

（第４表参照）これは捷たワクチン製造の抗原の単離、
精製にも使用し得る。

すなわち、−微生物中の副抗原は他の微生物中の主抗原
であり得るので、副抗原の大量生産、精製が一層容易で
ある。

本発明の方法はは乳動物細胞の共通抗原（もしくは表面
成分）を証明するものにも使用し得る。

レセプターの固有の特異性の故に、バクテリオシンは例
えば植物凝集素のような化合物の代りにまたは組織型別
を包含する操作に使用し得る。

本発明は他の細菌の同定に使用することもできる。

すなわち第４表に示した通りビブリオ・コレラ（Ｖｉｂ
ｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、アエロマス・ヒドロフイ
ラ（Ａｅｒｏｍａｓ Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ） ＞よ
びセラチア°マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒ
ｃｅｓｃｅｎｓ）からのバクテリオシンは分類上関係の
ない微生物と交差反応し得る。

前述の点に鑑み、本発明のいくつもの目的が達成され、
かつ様々な他の有利な結果が得られることが明らかであ
る。

本発明の範囲を逸脱することなく上記方法について種々
の変化をなし得るので、前文に記載した事項はすべて例
示であって限定ではないと解されるべきである。

【図面の簡単な説明】

第１図はＰ、エルギｚｆＡＴｃｃ ２９２６０（７）マ
イトマシンＣ誘発培地からの淋菌抑制因子のＤＥＡＥセ
ルロースからのＮａｃｌによる溶離曲線を示し、第２図
はビオシンの電子顕微鏡写真を表し、第３図はビオシン
タイプ６１１１３１による淋菌菌生育阻止濃度を示す曲
線を示し、第４図はビオシンとＮ、ゴノロエアとの相互
作用を示す電子顕微鏡写真を表す図であり、そして第５
図はビオシンの典型的な抑制パターンを示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ シュードモナス・エルギノザＡＴＣＣ２９２６０（
   微工研菌寄第４９８０号）をプロス培養し、前記培養物
   から上澄液を除き、前記上澄液を精製しそしてバクテリ
   オシンに富んだフラクションを分離することを特徴とす
   るナイセリア・ゴノロエアに対して殺菌活性を有するバ
   クテリオシンの調製法。 ２ 前記培養がマイ・トマイシンＣの存在下で起り、そ
   れによってバクテリオシンの濃度が増大する前記第１項
   に記載の方法。 ３ 前記精製が塩分画、ＤＥＡＥ セルロースでのク
   ロマトグラフィー卦よび遠心分離による沈降からなる前
   記第１項記載の方法。