SU731904A3

SU731904A3 - Способ идентификации микроорганизмов

Info

Publication number: SU731904A3
Application number: SU772466678A
Authority: SU
Inventors: Аллен Морс Стефен; Хотан Иглевски Барбара
Original assignee: За витель
Priority date: 1976-03-31
Filing date: 1977-03-31
Publication date: 1980-04-30
Also published as: JPS57115182A; AU2368677A; JPS52151783A; IT1077802B; CA1089748A; JPS5843077B2; FR2361464A1; DE2714415A1; JPS572319B2; AU516959B2; JPS57115198A; GB1575843A; US4142939A; FR2361465A1

Description

.Культуру, аидуцироваиную митомицином С, центрифугируют с 2400 кратным ускорением в течение 30 мин дл удалени клеточных остатков и нодучающийс в результате отстаивани верхний слой обрабатывают хлороформом (5 об. %). Эта всплыв (па наверх фракци и есть сырой ниоцин.

Сырой пиоцин далее очищают путем лрибавлеНИЯ i.M MnCb (60 мл на 1 л лизата ), примешива при этом смесь к сырому ниоцину. После достижени рН 7,5 с по:мощью 1М NaOH полученный осадок удал ют цен1)рифугированием. Всплывша наверх фаза вл етс очищенным пиоцином .

Дальнейшую очистку провод т добавлением (NH4)2SO4 до 70%-ного насыщени и культивированием в течение ночи нри

,1° с

-I .

После центрифугировани в течение 30 мин при 4° С осадок от центрифугировани , содерл ащий компонент с пиоциновой активностью, раствор ют в 50 мл O.OIM трис-(оксиметил)-аминометан-(трис)хлоргидрата рН 7,5, содержащем 0,0IM MgCls и 0,01М MgSO, и подвергают диализу в течение ночи при 4° С нротив 2 л того же буфера. При необходимости препарат осветл ют центрифугированием в течение 90 мин. Л елатиноподобный осадок от центрифугировани осторожно раствор ют в 20 мл буфера и хроматографируют на целлюлозе ДЕАЕ, предвар.ительно шромытой 1И доведенной до равновесного состо ни с помощью того же буфера. В колонку (размером 1,5X28 см- внос т 8 мл образца ниоцина и адсорбируют в течение ч. Колонку промывают 200 мл буфера дл удалени веществ, неадсорбированных на целлюлозе типа ДЕАЕ. Затем пиоцин элюируют с помощью 800 мм в 0,01М буфере . Собирают фракции по 5 мл и анализ груют на цоглощение при 280 нм и на теоциновую активность.

Фракции, про вл ющие пиодиновую активность , днализируют против 0,01М трисбуфера , рН 7,5 дл удале.ни NaCl, а затем концентрируют с помощью ультрацентрифугировани в течение 90 мин.

Типизацию пиоцина осуществл ют, использу метод жидкой среды, описанный Джоном.

Штаммы Neisseria gonorrhoeae, которые испытывают на восприимчивость к пиоцину , выращивают в течение ночи в чашках с агаровой средой. Суспензию этих микроорганизмов приготавливают в разбавителе, состо щем ,из 0,85% NaCl и 0,1% НС1 (рН 6,4), и довод т до по1каза.н1ий Клетта, paiBiKbix 50-60. Чаш.ки с агаровой средой заражают с помощью тампона, погруженного в клеточную суспензию. Неразбавленные или серийно разбавленные препараты пиоцина (5 мкл внос т на поверхность чашек с агаровой средой. Все чащ-ки культи ., ... ;,

, -, ,.-. , :, «,

.....

731904

вируют в течение ночи при 37° С с повышенным содержанием COs.

Пиоцины были приготовлены дл изучени под электронным микроскопом с помощью метода негативного п тнистого окрашивани . Препараты диоцина центрифугируют с ускорением в 100000 q в течение 1 ч, .и осадок от центриф.угировани повторно суспендируют в малом объеме

1М NH4C2H302 (рН 7,0). Медные сеточки, покрытые формваром, внос т в каплю образца в течение I-2 мин, а затем промокают досуха с помощью фильтровальной бумаги. Эти сеточ-ки внос т затем в каплю 1,5%-ного раст13Ора фосфовольфрамата натри (рН 7,0) в течение 30 с. Избыток жидкости удал ют фильтровальной бумагой.

Взаимодействие пиоцинов с клетками

Neisseria gonorrhoeae обнаруживают по подобной методике. Спуст 30 мин после добавлени пиоцина к Ж1идкой к ультуре N. gonorrhoeae 72Н870, образец удал ют и обрабатывают так же, как это было описано . Препарат с негативно окрашенными п тнами был изучен с помощью электронного микроскопа RCA (ори 50 кВ)

В табл, 1 даны результаты производства гонококкового фактора .ингибировани , синтезированного во врем выращивани Pseudomona.s aeruginosa АТСС 29260 в указанной среде. Добавление митомицина С (1 мкг1мл) вызывает широкий лизис культуры в пределах 3 ч и приводит к 16-кратному увеличению концентрации фактора инпибировани , определенного путем титровани иа Psendomonas aernginosa Рр7 и 1947. В таблице также показан титр факштаммах N. gonorrhoeae тила JW-31 и DGI тора ингибированл , измен ющийс с изменением различных штаммов Neisseria gonorrhoeae, причем не наблюдаетс различий с колониальными вариантами 1единичного штамма.

Таблица I

Примечание: а) Лнтолпщин С (I мкг на 1 мл среды) прк пос.тедовательном разбавлеиии не был способен ингибировать рост указанных организмов при разбавлении 1 :2 (0,5 мкг/мл);

б) N,D - не определ лось.

Фактор ингибировани был частично очищен от всплывающих наверх жидвих фаз культур Pseudomonas aeruginosa штамма АТСС 29260, индуцированных митомицином С, по методике, описанной выше. Фактор ингибировани элюируют из целлюлозы ДЕАЕ с помошд ю NaCl градиента от О до 1,ОМ. Обнаруживают два пика, содержащие фактор ингибировани . Главный пик (а) злюируетс при концентрации NaCl 0,06М .и обладает более, чем 90%-ной ингибиторной активностью. Слабый пик (6) элюируетс при концентрации NaCl 0,91М и обладает менее, чем 10%-ной активностью. Фракции, составл ющие пик а, объедин ют, диализируют против 0,01 трисхлоргидратного буфера (рН 7,5) дл удалени NaCl и концентрируют ультрацентрифугированием (100000-кратное ускорение в течение 90 мин}. Этот препарат используют в описываемых ниже испытани х .

Изучение с помощью электронного микроскопа препарата с негативно окрашенными п тнами из очищенного фактора ингибировани показывает, что частицы напоминают пиоцины R-типа как в несокращенном, так и в сокращенном состо ни х. В несокращенном состо нии эти частицы имеют длину 11 5 нж и ширину 15,3 нм. В сокращенном состо нии частицы состо т из внутреннего дра (длиной 105 нж и щириной 6,5 «лг), окруженного сокращенной оболочкой (длиной 44,4 нм и шириной 18,6 нм.}. В со,кращенном состо нии находилось 20- 30% частиц, наблюдаемых в этих препаратах .

Тип пиоцина как в частично очищениых , так II в очищенных препаратах определ ют по вышеописанной методике, причем результ ты показывают, что модель ie измен ете;; зс врем очистки. Пиоцин относитс к модели 611131.

Действие пиоцина 611131 на рост клинического изол та Neisseria gonorrhoeae (штамм 72Н870).

Действие шиодина на рост клеток микроорганизма было определено добавлением различных концентраций очищенного препарата к экспоненциально растущим культурам .

При высоких концентраци х пиоцина полное ингибирование .роста, происход щее в пределах 1 ч, сопровождаетс широким ЛИЗИСОМ культуры. Изучение с помощью электронного микроскопа показывает, что между пиоцином и чувствительными клетками Neisseria gonorrhoeae происходит непосредстзепное взаимодействие. Взаимодействие пиоцина с клетками приводит к сокращению пиоцина.

Спектр ингиб)Ировани пиоцина типа 611131.

Аликвотные части очищенного препарата пиоцина нанос т в виде п тен на посевы, полученные из клинических изол тов N. gonorrhoeae. Зона ингибировани отчетливо Внд.на во всех изученных штаммах. Не 1-аблюдаетс различий между колони ми типа Т-1 и Т-4 из одного и того же штамма. Включен также отрицательный контрольный тест продуцирующего штамл а Р. aeruginosa АТСС 29260.

Инлибирование различных видов Neisseria с помощью этого пиоцина показано з табл. 2. Все изол ты N. gonorrhoeae кал

Таблица 2

ИЗ рассе нных, так и нерассе нных заражеПИЙ ингибируютс . Однако ингибируютс 40 только 3 из 20 штаммов N. meningitidis и 5 из 16 щтаммов N. lactamica. Не наблюдаетс какой-либо коррел ции между серологической группой и ингибированием N. meningitidis. Ни один ;-:з других п ти испытанных видов не пнгнбируетс этим пиоцином. Быстра идентификаци Neisseria gonorrhoeae .

Метод дл быстрой идентификации Neisseria goni rrhoeae может быть осуществлен по любой из следующих методик: пиоцин 611131 нанос т в виде п тна в чашку с агаровой средой, содержащую биологический образец, который испытываетс , или диск, пропитанный пиоцином, вноситс в чашку, зараженн1ую образцом, или же пиоцин, внесенный в одну половину чашки с расщепленной агаровой средой, заражаетс образцом. Вслед за культивированием осуществл ют идентификацию микроорганизма в виде N. gonorrhoeae на основе зоны инпибировани , окружающей п тно, куда нанесен пиоцин, или ингибвровани рометод типизации особенно полезен при эпидемиологических исследовани х, когда важно преобладание или по вление новых штаммов, а также при определении обусловлена ли неудача обработк1И устойчивостью микроорганизма или повторным заражением новым типом микроорганизма. Дополнительные варианты изобретени описапы ниже. Идентификаци N. gonorrhoeae, использу пиоцины, меченые флюоресцеином. По этому методу пиоцины, производимые и очищенные так, как это описано вытпе , размечают флюоресцеином согласно методу Джонсона. Меченые таким образом пиоцины реагируют о подозреваемой N. gonorrhoeae на предметном стекле, приготовленном из клинического материала или из изолированных колоний из чашки с агаровой средой. Избыток циоцинов удал ют промывкой предметного стекла 0,02 мол рным физиологическим (рН 7,2) буфером, буферированным фосфатом, и предметное стекло рассматривают под уф-микроскопом. Клетки, имеющие типичную морфологию N. gonorrhoeae и показывающие флюоресценцию , рассматриваютс как положительные дл N. gonorrhoeae.

ста на той части чащки, в которую был внесен пиоцин.

Этот метод может быть применен дл идентификации других бактерий.

Типизаци Neisseria gonorrhoeae.

Типизаци N. gonorrhoeae и других видов Neisseria включает использование нескольких типов пиоцина и основываетс на ингибировании или наингибировании испытываемых микроорганизмов. Наблюдаемые результаты используютс дл идентификации типа изол та .путем соотнесени их с результатами, полученными с помощью целого р да известных типов (табл. 3). Этот

Таблица 3 Идентификаци бактерий с помощью пиоцинов, меченых радиоактивным изотопом . Радиоактивные пиоцины получают путем йодировани их изотопом j с помощью метода с применением хлорамина Т. Их можно получить мечеными с И или С путем ввода конкретных меченых аминокислот в культивируемую среду до начала синтеза пиоцина в Pseudomonas aeruginosa с по.мощью митомицина С. Пиоцины, производимые по этому методу, вл ютс радиоактивными . Специфические бактерии легко идентифицируютс путем взаимодействи радиоактивных пиоцинов с суспензией бактерий . Затем эту суспензию подвергают мембранной фильтрации или центрифугированию дл отделени несв занных пиоцинов от пиоцинов, которые св заны специфически с поверхностью бактериальных клеток . Фильтр или промытый клеточный осадок в пробирке после центрифугировани принимают затем во внимание, чтобы определить количество св занного пиоцина, который был меченым. Данные сравнивают со степенью неспецифического св зывани , любое увеличение над уровнем неспецифического св зывани показывает наличие неизвестного микроорганизма.

Sal. kadack

Sal. miarembe

Sal. onderspoort

Sal. thompson

Sal. spp. Group C

Serratia mercescen

S. marcescens

Shigella flexneri

Sh. spp. Group D

Brucella abortus

B. bronchisepticus

B. suis

Neisserla gonorrho

N. gonorrhoeae

N. meningitidis

N. flava

N. flavescens

N. laciamia

N. lactamica

N. mucosa

N. ovis

N. peiflava

N. subfiava

Acinetobacler anitra

A. anitratus

A. calcoaceiicus

Aeromonrjs hydioph

Alcaligenes viscosib

Azotomanas iiisoliid

EnteroDactcr aeroge

E. cloaceae

Exhericliia coli

E. cnii

E. coli

E. ooH

E. coli

E coli

E. coli B.

E cnli iiidole CP

E, Cdli Se rs

E. coli 1. С 411

E. coli K. 1

E. coli K. 12

E. cuii

Haffni.i Spp

Herrt le;i Vaginocoi

H VagiII с .la

H. Vaguii4-,lH V;igirioi()bi

Hk-bbiclla oz I II.:l

K. pneu ioi;i;k

K. pneumonia

K. pneuinuniae

Mima polymorpha Proteus rnorganic Providencia s tuartie

Таблица 4

+

+ + + + + + + + + + 4- + +

+ +

+

/- +

+/+

+

+/+7+/+/+ /+/I +

+/+

+

+//+

+ -

+/+/+

+ +/+

+

+ I -

+

j

-- i +/- i +

II

Орга:.изн

Pse i: d от on ; s .i er ug i;: os л

P. dertiijir:c-T

PS. aerugin s;i non p;f.T

F alkuligc, ;ifs

PS. irniolo.MC.

PS. inaltopliiha

PS. п;а1Ор)

PS saccliarcphili.i

S;:ln;onell;i ariz .

Sa. bergen

Sal. bornura

. cholerssuis

Sal. dahlem

Sal. deversoir

Sal. djakarta

Sal. diigbe

Sal. enieriditis

Sal. florida

Bacteriocjn I Bacteriocin 2 3-acleriocin 3 Bacteriocin 4 Bacterjocin 5 Baceriocin 6 BfiCteriocin 7

Изобретение может быть использовано при идентификации антигенов, которые вл ютс свойственными дл бактерий таксономически несв занных родов. Как известно , бактериоцины св зываютс с специфическими рецепторными участками на внешней поверхности бактерий. Эти рецепторные участки подвергаютс также действию механизМов защиты хоз ина и могут таким образом стимулировать производство антител , которые могут быть либо бактерицидного , либо опсон1изирующего типов. Бактерии могут делить свойственные антигены. Эти свойственные антигены могут быть также бактериоциновыми рецепторными участками , поэтому взаимодействие бактериоцинов с разными видами бактерий может быть использовано в качестве индикатора раздел ющихс антигенов (табл. 4). Это, в свою очередь, может быть использовано при выделен и и очистке антигенов дл производства вакцин. Таким образом, второстепенный антиген на одном микроорганизме может быть главным антигеном на другом н поэтому может облегчать очистку и может быть ползчен в больплих количествах.

Способ моЖет быть использован также дл демонстрировани свойственных антигенов (или поверхностных компонентов) в клетках млекопитающих. Вследствие свойственной специфичности их рецепторов бактериоцины могут быть использованы вме12

Продолжение табл. 4

Б КТСрИОЦКР

: PS aeruginosa FS-5 : PS aeruginosa FS-6 : PS aeruginosa PA 108 : PS aeruginosa PS-7 : PS Vibriocholera Ее Toz : PS Serratia marcesceus : Aeromonas hydro.philia

сто соединений, таких как лектины, к.л:. в методиках, включающих типизацию ткан.:;). Изобретение может быть использовано также при идентификации других бакгеэ зй. Таким образом, это показало в табл. 4, бактериоцины из Vibro cholerae, Aeroni s Hydrophila и Serratia marcescens обычно перекрестно реагируют с таксономичес.ки несв занным микроорганизмом. Предлагаемый способ позвол ет упростить определение наличи микроорган.чзма с использованием любого бактериазина.

Формула И310бретени

L Способ идентификации микрооргакизмов в биолопическо1М материале путан: госева на питательную среду с последующим контактированием выросщих колоний с бактериоцином , инкубированием и учетом наличи или отсутстви роста, о т л и ч а к.щ и и с тем, что, с целью упрощени способа , выросщие колонии контактируют с бактериоцином R-типа из микроорганиз;у;оЕ таксономическ1и несв занного рода.

2.Способ по п. I, отличающийс тем, что в качестве бактериоцина испс.;1ьзуют пиоцин Pseudomonas aeruginosa АТСС 29260, тппированный как 611131.

3.Способ по п. I, отличающийс тем, что идентифицируют микроорганизм Xeisseria gonorrhoeas. 13 Источник информации, нимание при экспертизе: t. G. Volk and S. Kraus прин тый во meningococcal urethritis. Possible protective «Asymptomatic cal Diseases, 1973, 49, p. 511-512. 731904 И value against gonococcal infection by bacteriocin production, «British J. of venerologi

Claims

15 Формула изобретения

1. Способ идентификации микроорганизмов в биолопическо;м материале путем посева на питательную среду с последующим

2® контактированием выросших колоний с бактериоцином, инкубированием и учетом наличия или отсутствия роста, отл и ч г ющийся тем, что, с целью упрощения способа, выросшие колонии контактируют с 25 бактериоцином R-типа из микроорганизмов таксономически несвязанного рода.

2. Способ по π. 1, отличающийся тем. что в качестве бактериоцина используют пиоцин Pseudomonas aeruginosa АТСС

30 2 9 2 60, типированный как 611131.

3. Способ по π. 1, отличающийся тем, что идентифицируют микроорганизм Neisseria gonorrhoeae.