DE19720997C2 - Schadstoff-Biogewebesensor zur Bestimmung biologischer Schadstoffeffekte - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft einen Schadstoff-Biogewebesensor (SBGS) zur Bestim­ mung biologischer Schadstoffeffekte durch gasförmige, volatile und semivolatile Schadstoffe sowie Schadstoffgemische, wie sie bei Emissionen und Immissionen vorliegen. Mögliche Anwendungsgebiete sind die Beurteilung gesundheits- und/oder naturschädigender Einwir­ kungen von Emissionen und Immissionen unterschiedlichster Herkunft und Zusammenset­ zung in Form eines Biomonitorings sowie die allgemeine und/oder auf ein Individuum bezo­ gene und damit im konkreten Fall objektivierbare Beurteilung von Innenraumbelastungen durch volatile organische Kohlenwasserstoffe (VOCs). Damit kann einerseits ein vergleichs­ weise kostengünstiges, zeitlich kontinuierliches und räumlich definiertes, auf bestimmte Or­ ganspezifitäten abgestimmtes Biomonitoring von Schadstoff-Emittenten durchgeführt wer­ den. Toxische Emissionen aus Industrie, Hausbrand, Müllverbrennung, Straßenverkehr, mili­ tärischen Anwendungen u. a. können frühzeitig und im Vergleich zur chemischen Analytik toxikologisch wesentlich umfassender erkannt werden. Zum anderen ist eine individuelle Be­ urteilung von Schadstoffwirkungen in Innenräumen (Büroräume, öffentliche Gebäude, indivi­ duelle Wohnstätten) und damit eine Objektivierung bisher so unklarer, häufig nicht beurteil­ barer Krankheitsbefunde wie beispielsweise das Sick Building Syndrom (SBS) und die Mul­ tiple Chemische Sensitivität (MCS) möglich.

Eine Abschätzung von Gesundheitsrisiken durch volatile Umweltverschmutzungen ist über die Messung chemisch-analytischer Summenparameter oder einzelner Leitkomponen­ ten nur in begrenztem Masse denkbar. So sind in den meisten Emissionen, solchen aus der Müllverbrennung, dem Hausbrand oder zahlreichen industriellen Prozessen, aber auch im Gemisch der (VOCs) aus Innenräumen, unbekannte organische Verbindungen enthalten, die hinsichtlich ihrer zytotoxischen, immuntoxischen oder kanzerogenen Wirkung bisher nicht eingeschätzt werden können und zu Besorgnis Anlass geben. Hierbei spielt die häufig schwankende Zusammensetzung der Emissionen bzw. Immissionen, die nicht immer vorher­ sehbar ist, eine wichtige Rolle. Eine wirksame Überwachung derartiger Emissionen bzw. Im­ missionen allein durch chemisch analytische Verfahren stößt spätestens bei der Beurteilung der analysierten Komponenten, die in ihrer toxikologischen Wirkungen häufig nur unzurei­ chend bekannt sind, auf Probleme, zumal mögliche Kombinationswirkungen komplexer Gemische nur in seltenen Ausnahmefällen abgeschätzt werden können. Biologische Testverfah­ ren können aus diesem Dilemma einen Ausweg aufzeigen.

Sie wurden jedoch bisher nur selten zur Beurteilung volatiler oder semivolatiler Emissionen oder Immissionen einbezogen. Systeme, welche die Wirkung von toxischen Ga­ sen auf lebende Zellen und Zellkulturen messen, sind allgemein bekannt.

So wurden beispielsweise Tumorzellen oder Zellen von verschiedenen Organen als Biosensoren eingesetzt (Lehrbuch der Botanik, Gustav-Fischer Verlag (1978), S. 387, Abb. 371B). Die Druckschrift DE 195 37 033 A1 offenbart ein Verfahren zur Bestimmung von Pharmakokinetik bzw. Toxikokinetik von Testsubstanzen mit Hilfe von in-vitro- Zellkultursystemen und dafür geeignete Vorrichtungen nach dem Prinzip des blasenfrei be­ gasten Wirbelschichtreaktors. Dabei wird eine in-vitro-Zellkultur einer Testsubstanz kontinu­ ierlich oder einmalig ausgesetzt. Die Reaktion des gesamten Systems wird anhand einer Viel­ zahl von Stoffwechselparametern kontinuierlich oder chargenweise gemessen. Allerdings ist der Eintrag gasförmiger Stoffe nicht vorgesehen und die Messung von Parametern mit Mikro­ sensoren im Zellgewebe ist nicht möglich.

In der Patentanmeldung DE 195 26 533 A1 wird eine Expositionsvorrichtung für mit gas- und/oder partikelförmige Beimengungen angereicherte Gasgemisch auf lebende Zellkulturen beschrieben, bei der das definiert angereicherte Gasgemisch über ein Zuleitungs­ system direkt an mindestens einen Träger für die lebenden Zellkulturen von oben her führbar ist und das Nährmedium von unten her an die Zellkulturen über eine semipermeable Membran geleitet wird. Eine organtypische 3D-Zellkulturhaltung ist mit dieser Vorrichtung nicht mög­ lich. Auch erfolgt keine direkte Detektion des Schadeffektes über integrierte Mikrosensoren.

Ein Verfahren, bei welchem mit Hilfe geeigneter Mikroorganismen definierter Sensitivität bzw. Resistenz gegenüber toxischen Substanzen Toxizitätstests in flüssigen oder gasförmigen Phasen kontinuierlich durchgeführt werden können mit dem Ziel, Substanzen mit antimikrobieller Wirkung zu testen, wird in Druckschrift DE 38 33 628 A1 genannt. Da­ bei wird die Toxizität als Veränderung im Metabolismus oder dem Verlust der Lebensfähig­ keit der Indikatororganismen erfasst, die ihrerseits schnell und mit hoher Empfindlichkeit durch Biolumineszenzsignale (Luciferaseproduktion) gemessen werden können. Es handelt sich um einen neuen Typ eines sich selbst regulierenden Plasmidvektors, der sensitiv und ein­ fach Biolumineszenzmessungen mit prinzipiell jedem Mikroorganismus erlaubt. Die Indika­ tororganismen (Prokarionten) erlauben keine direkten humantoxikologischen Wertungen er­ lauben. Die Messung von Parametern mit Mikrosensoren unmittelbar im biologischen Indika­ tor basiert auf dem Prinzip der Lumineszenz-Messung.

Gegenstand der deutschen Patentanmeldung DE 33 27 691 A1 ist ein Verfahren zur Ermittlung von Umweltschadstoffen, bei dem pflanzliche Zellen einem Schadstoffe ent­ haltendem Medium ausgesetzt werden. Die Einwirkung der Schadstoffe wird anhand bioche­ misch-physiologischer Vorgänge der Zellen festgestellt. Als pflanzliche Zellen werden Proto­ plasten eingesetzt, die zur Verzögerung ihrer Seneszenz mit einer gas- und wasserdurchlässi­ gen Matrix, z. B. Ca- oder La-Alginat-Matrix, immobilisiert worden sind. Die Matrix ist gas- und wasserdurchlässig. Zur Toxizitäts-Indikation werden die Hemmung der Ribulose-1,5- biphosphat-carboxylase und die Emissionsrate von Ethan verwendet. Eine organtypische 3D- Zellkulturhaltung ist nicht möglich.

Die Druckschrift FR 2 734 579 A1 berichtet über ein Vorrichtung zur Bestimmung der Toxizität von Gasen. Zwei aerobe Zellkulturen (Zell-Linien vom Typ Makropagen), eine Versuchskultur und eine Kontrollkultur, werden mittels geeigneter Vorrichtungen den Schad­ stoffen (Versuchskultur) bzw. nicht toxischer Kontroll-Luft (Kontrollkultur) exponiert. Die Zahl lebender Zellen dient als Maß für die Giftigkeit der gasförmigen Substanzen. Diese wird durch kolorimetrische Messung eines Parameters bestimmt, der für die Anzahl der lebenden Zellen in jeder Kultur nach der Exposition repräsentativ ist. Es wird die relative Toxizität im Vergleich zur Kontroll-Luft ermittelt. Es ist keine direkte Detektion des Schadeffektes über integrierte Mikrosensoren vorgesehen. Auch eine organtypische 3D-Zellkulturhaltung ist nicht möglich.

Gegenstand weiterer Publikationen war die Entwicklung von in-vitro-Toxizitäts- Testsystemen, die unter Verwendung von primären Zellen oder Zell-Linien unter Vermeidung der üblicherweise durchgeführten Zwischenschritte adsorptiver oder kondensativer Anreiche­ rung sowie extraktiver Überführung volatiler Schadstoffe in ein Lösungsmittel, durch direkte Begasungsverfahren ersetzt werden. Ein patentiertes Verfahren zur in vitro Exposition von Zellen mit volatilen Schadstoffen basiert beispielsweise auf Mikro-Rollerkulturen (Delraso, N. J. 1996, US-Patent 5508174 A: Method and micro roller bottle for in vitro exposure of cells to volatile chemicals, 4 pp., 04-16-96, United States Dept. of the Air Force). Hierbei werden die Schadstoffe in den Begasungsraum der Rollerkulturen durch ein Septum diskontinuierlich eingebracht. Die Möglichkeit einer unmittelbaren Schadeffekt-Detektion fehlt. Zudem liegt kein dreidimensionaler Gewebeverband vor.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Toxizitäts-Testsysteme zu entwi­ ckeln, die mit wenig experimentellem Aufwand ein einfaches Biomonitoring ermöglichen. Die Aufgabe wird durch einen Schadstoff-Biogewebesensor (SBGS) zur Bestimmung biologischer Schadstoffeffekte gelöst, der aus einer Zellkulturvorrichtung (ZKV) mit einem Gewe­ bekultursystem besteht und der mit einer Verdampfungseinheit oder einer Gasentnahmevor­ richtung, einer Gasdosierungseinrichtung sowie Mikrosensoren ausgerüstet ist. Der erfin­ dungsgemäße SBGS ist ferner dadurch gekennzeichnet, dass die ZKV eine miniaturisierte organtypische Kultur darstellt und das Gewebekultursystem physiologisch oder pathologisch Schadstoffen exponierte pflanzliche, tierische oder menschliche Zell- und/oder Gewebever­ bände enthält und die Mikrosensoren in den SBGS integriert sind. Die integrierten Mikrosen­ soren stellen NAD-, NADH- oder NADPH-Sensoren dar. Erfindungsgemäß lässt sich die Schadstoffzufuhr derart dosieren, dass die Schädigung der Zell- und Gewebeverbände sowie der mikrobiologischen Suspensionen reversibel ist.

Zur Bestimmung biologischer Schadstoffeffekte wird das Kultursystem mit volati­ len oder semivolatilen Schadstoffen dosiert beaufschlagt. Dann werden universelle Stoff­ wechselparameter der Zell- oder Gewebeverbände gemessen. Diese Parameter werden durch NAD-, NADH- oder NADPH-Messungen oder durch Probenahmen aus dem Gewebekultur­ system und externer Detektion erfasst.

Diejenigen Zell- und Gewebeverbände, die unter physiologischen Bedingungen volatilen und semivolatilen Schadstoffen ausgesetzt sind - wie Blatt, Stiel oder Blüte bei der Pflanze und Haut, Lunge, Schleimhäute oder Auge bei Säugern sowie exponierte Insekten­ zellgewebe - werden direkt oder durch Schadstoff-durchlässige Membranen mit den realen Expositionen in Zusammensetzung, Art und Konzentration angepassten volatilen und semivo­ latilen Schadstoffen beaufschlagt.

Jene Zell- und Gewebeverbände, die unter pathologischen Bedingungen volatilen und semivolatilen Schadstoffen ausgesetzt sind - wie immunkompetente Gewebe, Drüsenge­ webe, Nervengewebe, Muskelgewebe, Knorpelgewebe, Bindegewebe oder pathologisch ver­ änderte Hautschichten bei Säugern - werden direkt oder durch Schadstoff-durchlässige Membranen mit den realen Expositionen in Zusammensetzung, Art und Konzentration ange­ passten volatilen und semivolatilen Schadstoffen beaufschlagt.

Der erfindungsgemäße SBGS ist ferner dadurch gekennzeichnet, dass ein unab­ hängiger bzw. parallel und/oder in Reihe abhängiger Betrieb vieler vergleichbarer mit identi­ schem und/oder differentem Material beschickter Kulturräume erfolgt. Er ist zum Biomonito­ ring von volatilen und semivolatilen Schadstoffen, vorzugsweise anthropogen bedingten Emissionen und Immissionen - wie industrielle, städtische sowie durch den Straßenverkehr, die Abfallentsorgung oder die Landwirtschaft bedingte Emissionen und Immissionen- sowie zum Biomonitoring der Innenraumbelastung durch volatile und semivolatile Schadstoffen geeig­ net.

Das Wesen der Erfindung besteht darin, dass in die Gasphase überführte volatile oder semivolatile, auf ihre Toxizität zu testende Stoffe oder Stoffgemische oder reale volatile Schadstoffgemische über ein Gas-Dosierungssystem der physiologischen Begasungsvorrich­ tung des Schadstoff-Biogewebesensors zugemischt werden. Die Schadstoffe diffundieren durch eine gasdurchlässige Trennmembran der Zellkulturvorrichtung in ein dreidimensionales organtypisches Gewebekultursystem, das auf gleichem Wege mit Sauerstoff und Kohlendi­ oxid versorgt wird. Sie verursachen auf diesem Wege biologische Wirkungen in der Gewebe­ kultur, die über geeignete Sensoren (z. B. NAD/NADH-Sensor) oder durch eine miniaturisier­ te Probenahme aus dem Gewebekultursystem und externer Detektion gemessen werden.

Der erfindungsgemäße SBGS besteht dementsprechend aus einer Verdampfungs­ einheit zur Herstellung eines bezüglich Volumen, Druck und Temperatur konstanten Schad­ stoff-Gasraumes oder eines Probenamegefäßes für volatile Schadstoffe (Gasmaus) oder einer isokinetischen Gasentnahmevorrichtung zur Messung von Emissionen oder Immissionen, einer Gas-Dosiervorrichtung zur Schadstoff-Dotierung der physiologischen Gasversorgung der Zellkulturvorrichtung, der physiologischen Gasversorgungseinrichtung selbst sowie dem miniaturisierten Gewebekultursystem nebst Mikrosensoren. Er stellt eine Zellkulturvorrich­ tung in Form einer miniaturisierten organtypischen Kultur dar, die eine Erfassung biologi­ scher Schadstoffeffekte in physiologischen oder pathologischen pflanzlichen, tierischen und menschlichen Zell- und Gewebeverbänden sowie in mikrobiologischen Suspensionen unter direkter regulierbarer Beaufschlagung von volatilen und semivolatilen Schadstoffen ermög­ licht. Dabei erfolgt die erfindungsgemäße Erfassung der biologischen Effekte mit Mikrosen­ soren überraschenderweise so sensitiv, dass die Schädigung der Zell- und Gewebeverbände sowie der mikrobiologischen Suspensionen reversibel gestaltet werden kann. Der erfindungs­ gemäße Schadstoff-Biogewebesensor eignet sich zur Bestimmung der Gesundheitsrisiken durch volatile und semivolatile Schadstoffe.

Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Sensoren werden nach der direkten, regulierba­ ren Beaufschlagung mit volatilen Schadstoffen universelle Stoffwechselparameter der Zell- und Gewebeverbände hochsensitiv, vorzugsweise durch NADH (Nicotinamid-Adenin- Dinucleotid) und/oder NADPH-(Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat)-Messung (La­ serbasierend) erfasst.

Die der Erfindung zugrunde liegende Zellkulturvorrichtung ist einerseits dadurch gekennzeichnet, dass der unabhängige bzw. parallel und/oder in Reihe abhängige Betrieb vie­ ler vergleichbarer mit identischem und/oder differentem Material beschickter Kulturräume bei kontinuierlicher effektiver organtypischer Zell- und Gewebeversorgung erfolgt und anderer­ seits dadurch, dass diejenigen Zell- und Gewebeverbände, die unter physiologischen Bedin­ gungen volatilen und semivolatilen Schadstoffen ausgesetzt sind (vorzugsweise Blatt, Stiel, Blüte bei der Pflanze und Haut, Lunge, Schleimhäute, Augen bei Säugern sowie exponierte Insektenzellgewebe), direkt bzw. durch Schadstoff-durchlässige Membranen mit den realen Expositionen in Zusammensetzung, Art und Konzentration angepassten volatilen und semivo­ latilen Schadstoffen beaufschlagt werden. Ebenso können diejenigen Zell- und Gewebever­ bände, die unter pathologischen Bedingungen volatilen und semivolatilen Schadstoffen aus­ gesetzt sind (vorzugsweise immunkompetente Gewebe, Drüsengewebe, Nervengewebe, Mus­ kelgewebe, Knorpelgewebe, Bindegewebe, pathologisch veränderten Hautschichten bei Säu­ gern bzw. beim Menschen) direkt bzw. durch Schadstoff-durchlässige Membranen mit den realen Expositionen in Zusammensetzung, Art und Konzentration angepassten volatilen und semivolatilen Schadstoffen beaufschlagt werden. Die erfindungsgemäße Zellkulturvorrich­ tung ist geeignet, mikrobiologische Suspensionen als diskrete Nachweisreagenzien für Gento­ xizität und Mutagenität zu nutzen.

Die erfindungsgemäße Verwendung des Schadstoff-Biogewebesensors liegt in einem Biomonitoring von volatilen und semivolatilen Schadstoffen, vorzugsweise anthropo­ gen bedingten Emissionen und Immissionen (wie z. B. industrielle, städtische sowie durch den Straßenverkehr), in der Abfallentsorgung oder der Landwirtschaft bedingten Emissionen und Immissionen sowie dem Biomonitoring der Innenraumbelastung durch volatile und semi­ volatile Schadstoffe.

Das Wesen der Erfindung besteht ferner in einer Vorrichtung zur Erfassung biolo­ gischer Schadstoffeffekte in physiologisch organ- bzw. gewebetypisch exponierten pflanzli­ chen, tierischen und menschlichen Zell- und Gewebeverbänden sowie in mikrobiologischen Suspensionen unter direkter regulierbarer Beaufschlagung von volatilen und semivolatilen Schadstoffen. Die Erfassung des biologischen Effekts erfolgt mit Mikrosensoren so sensitiv, dass die Schädigung der Zell- und Gewebeverbände sowie der mikrobiologischen Suspensio­ nen reversibel gestaltet werden kann. Insbesondere erfolgt die Messung universeller Stoff­ wechselparameter der Zell- und Gewebeverbände primärer Zellen oder Zell-Linien, vorzugs­ weise NADH- und/oder NADPH-Messungen, aber auch die Messung spezieller Parameter, wie die Zytokin- oder die Immunglobulinsezernierung nach einer Probenahme von Zellkultur­ flüssigkeit. Damit eröffnet sich in speziellen Fällen die Möglichkeit, Tierversuche durch ande­ re Methoden an nicht schmerzfähigen Systemen zu ersetzen.

Unter Zell- und Gewebeverbänden im Sinne dieses Patentes werden primäre Zel­ len sowie in vivo tumorös entartete bzw. in vitro immortalisierte Zellen und Zell-Linien pflanzlichen, tierischen (inklusive Insekten) sowie menschlichen Ursprungs verstanden. Vola­ tile und semivolatile Schadstoffe im Sinne dieses Patentes sind einerseits flüchtige und halb­ flüchtige bekannte, "VOCs" (volatile organische Kohlenwasserstoffe, vorzugsweise aus In­ nenraumbelastungen, gegenwärtig ca. 600 beschriebene Substanzen) und andererseits unbe­ kannte Schadstoffe aus Innenräumen sowie Schadstoffimmissionen und Emissionen in der Atmosphäre. Unter Mikrosensoren werden alle Sensoren verstanden, die in die beschriebenen miniaturisierten Zellkulturvorrichtungen (ZKV) dergestalt integrierbar sind, dass sie den ent­ sprechenden Parameter direkt in der Zellkultur unabhängig von ihrem Messprinzip vermessen können.

Kultivierte Zellen sind zur Beobachtung und Messung von Sonderleistungen der Zelle geeignet. Dreidimensionale Zellkultur-Techniken stellen demgegenüber hervorragende Untersuchungssysteme dar, welche die Nachteile konventioneller Zellkulturtechniken - all­ gemein ein- oder zweidimensionale Kulturen mit häufig im Vergleich zur Primärkultur verän­ derten Eigenschaften, begrenztes Nährstoffangebot, geringe Zelldichte, Schlackestoffakkumu­ lation - teilweise kompensieren können. Sie sind andererseits aber noch keine schmerzfähigen Systeme. Toxikologische Untersuchungen an volatilen Schadstoffen wurden in derartigen 3- D-Kulturen bisher nicht vorgenommen.

Der erfindungsgemäße SBGS erlaubt den unabhängigen bzw. parallel und/oder in Reihe abhängigen Betrieb vieler vergleichbarer mit identischem und/oder differentem Materi­ al beschickten Kulturräumen. Die erfindungsgemäße Zellkulturvorrichtung ermöglicht ers­ tens, dass diejenigen Zell- und Gewebeverbände, die unter physiologischen Bedingungen vo­ latilen und semivolatilen Schadstoffen ausgesetzt sind (vorzugsweise Blatt, Stiel, Blüte bei der Pflanze und Haut, Lunge, Schleimhäute, Augen bei Säugern, sowie exponierte Insektenzellgewebe), und zweitens, dass diejenigen Zell- und Gewebeverbände, die unter pathologi­ schen Bedingungen volatilen und semivolatilen Schadstoffen ausgesetzt sind (vorzugsweise immunkompetente Gewebe, Drüsengewebe, Nervengewebe, Muskelgewebe, Knorpelgewebe, Bindegewebe, pathologisch veränderte Hautschichten bei Säugern), direkt bzw. durch Schad­ stoff-durchlässige Membranen mit den realen Expositionen in Zusammensetzung, Art und Konzentration angepassten volatilen und semivolatilen Schadstoffen beaufschlagt werden können. Spezielle mikrobiologische Suspensionen können des weiteren als diskrete Nach­ weisreagenzien für Gentoxizität und Mutagenität genutzt werden. Die erfindungsgemäße Zellkulturvorrichtung ermöglicht mit Mess- und Regeltechnik das Biomonitoring von volati­ len und semivolatilen Schadstoffen, vorzugsweise Emissionen und Immissionen (wie z. B. industrielle, städtische sowie durch den Straßenverkehr, die Abfallentsorgung oder die Land­ wirtschaft bedingte Emissionen und Immissionen). Des weiteren ist das Biomonitoring der Innenraumbelastung durch volatile und semivolatile Schadstoffe möglich.

Die Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.

Ausführungsbeispiele 1. Vorrichtung (siehe Fig. 1)

Die Vorrichtung besteht aus:

• - einer Vorrichtung, welche die Mischung von gasförmigen, volatilen und semivolatilen Schadstoffen erlaubt und die unter Rückhalt infektiöser Erreger exakt in den physiologischen Gasstrom des Schadstoffsensormoduls dosiert (NR1)
• - einem Schadstoffsensormodul (NR2a, 2b und 3), der die gleichmäßige typische Beaufschla­ gung eines organtypischen Zell- und Gewebeverbandes mit beliebigen Gemischen gasförmi­ ger, volatiler und semivolatiler Schadstoffe über einen Gasraum (2a) erlaubt. Der Gaseintrag in das Gewebe wird direkt oder über Barrieren (NR3), vorzugsweise über polymere Membra­ nen, deren Übertragungsfähigkeit bezüglich der Schadstoffe bekannt sind, durchgeführt. Der mit Zellen besiedelte Kulturraum (NR2b) dieses Moduls wird dergestalt versorgt, dass eine organtypische Kultur des jeweiligen Zell- und Gewebeverbandes gewährleistet ist. Das Schadstoffsensormodul besteht aus einer Stoffwechselmikrosensorik (NR4), vorzugsweise einem NADH-Laser
• - einer Medienvorlage, welche die sterile Versorgung der organtypischen Zellkulturen erlaubt.

2. Anordnung

Die Schadstoffsensormodule können erfindungsgemäß in größerer Zahl in Reihe und/oder parallel geschaltet werden. Des weiteren kann in der Vorrichtung bei Beaufschla­ gung der Module mit mehreren separaten Schadstoffgemischen eine einheitliche Medienvor­ lage genutzt werden (Fig. 2), oder bei Vorlage eines gemeinsamen Schadstoffgemisches kön­ nen die Module mit unterschiedlichen Medienvorlagen betrieben werden (Fig. 3). Diese Vari­ ationen der Anordnung dienen einerseits der simultanen Testung verschiedenster Schadstoffe und deren Gemische an vergleichbaren einheitlichen Gewebeverbänden bzw. der Testung der Wirkungen eines Schadstoffgemisches auf unterschiedliche Zell- und Gewebeverbände. An­ dererseits ist bei einem Schadstoff-Monitoring, beispielsweise von Emissionen, nach Mes­ sung erster toxischer Effekte ein Umschalten auf ein parallel betriebenes Schadstoffsensor­ modul möglich. Die Überwachung mit dem Mikrosensor (NR4) erlaubt außerdem ein automa­ tisches Umleiten des Schadstoffgemischen auf ein neues Modul in Abhängigkeit von der Re­ generationsfähigkeit des jeweils eingesetzten Zell- und Gewebeverbandes.

Beispiel 1

Ein Schadstoffsensormodul wurde im Zellkulturraum mit einem von der Lungen­ karzinomzell-Linie NCl-H322 abgeleiteten Zell- und Gewebeverband in einer Dichte von 1,6 × 10E8 Zellen pro Milliliter Kulturraum beschickt und über 24 Stunden an die Systemkompo­ nenten adaptiert, wobei das Gewebe physiologisch begast wurde. Danach wurde zusätzlich mit der Versorgung des Systems mit Kulturmedium begonnen. Über einen Zeitraum von 12 Tagen wurde eine physiologische organtypische Kulturführung mit angepasstem Sauerstoff- und Nährstoffeintrag durchgeführt. Daraufhin wurde ein NADH-Laser, wie in Fig. 4 darge­ stellt, in das Gewebe integriert und ein stabiles Messsignal für den physiologischen Zustand des Gewebes über etwa 2,5 Stunden registriert. Danach wurde mit der Beaufschlagung eines Schadstoffgemisches, welches Glutaraldehyd und Glyoxal in unterschiedlichen Konzentratio­ nen enthielt, begonnen. Es wurde über weitere 3,5 Stunden ein Abfall der relativen Fluores­ zenz bei 337 nm von etwa 170% auf 60% beobachtet (Fig. 5). Die Überprüfung des auf diese Weise beobachteten Schadstoffeffektes erfolgte durch die Eröffnung des von Zellen besiedelten Raumes mit anschließender Lebendzellbestimmung im Trypanblau-Ausschlussverfahren nach einem weiteren Tag. Alle Zellen im Schadstoffsensor waren zu dieser Zeit abgestorben.

Beispiel 2

Der Ansatz wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt. Nach drei Tagen konstanter Kulturführung wurde die Sensorintegration vorgenommen und nach Registratur eines stabilen Signals nach zwei Stunden für 5 Minuten das gleiche Schadstoffgemisch wie in Beispiel 1 unter denselben Bedingungen beaufschlagt. Danach wurde die Schadstoffzufuhr abgebrochen und die Kultur unter den üblichen physiologischen Bedingungen einen weiteren Tag geführt. Nach Eröffnung des von Zellen besiedelten Raumes konnte die komplette Vitalität des Gewe­ bes registriert werden. Damit wurde eine Reversibilität der Effekte bei frühzeitigem Abbruch belegt. Ausschlaggebend ist hier aber die hochsensitive Detektion des Effektes in dem Zell- und Gewebeverband mittels Sensortechnik.

Claims (9)

1. Schadstoff-Biogewebesensor (SBGS) zur Bestimmung biologischer Schadstoffeffekte, bestehend aus einer Zellkulturvorrichtung (ZKV) mit einem Gewebekultursystem, einer Verdampfungseinheit oder einer Gasentnahmevorrichtung, einer Gasdosierungseinrich­ tung sowie Mikrosensoren, dadurch gekennzeichnet, dass die ZKV eine miniaturisierte organtypische Kultur darstellt, das Gewebekultursystem physiologisch oder pathologisch Schadstoffen exponierte pflanzliche, tierische oder menschliche Zell- und/oder Gewebe­ verbände enthält, die Mikrosensoren in den SBGS integriert sind und die Schädigung der Zell- und Gewebeverbände sowie der mikrobiologischen Suspensionen reversibel ist.

2. Schadstoff-Biogewebesensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die integ­ rierten Mikrosensoren NAD-, NADH- oder NADPH-Sensoren darstellen.

3. Verfahren zur Bestimmung biologischer Schadstoffeffekte, dadurch gekennzeichnet, dass das Kultursystem des Schadstoff-Biogewebesensors nach Anspruch 1 oder 2 mit volatilen oder semivolatilen Schadstoffen beaufschlagt wird und universelle Stoffwechselparame­ ter der Zell- oder Gewebeverbände gemessen werden.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass bei dem Schadstoff- Biogewebesensor nach Anspruch 1 oder 2 die universellen Stoffwechselparameter durch NAD-, NADH- oder NADPH-Messungen oder durch Probenahmen aus dem Gewebekul­ tursystem und externe Detektion erfasst werden.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass diejenigen Zell- und Gewebeverbände, die unter physiologischen Bedingungen volatilen und semivolatilen Schadstoffen ausgesetzt sind, direkt oder durch Schadstoff-durchlässige Membranen mit den realen Expositionen in Zusam­ mensetzung, Art und Konzentration angepassten volatilen und semivolatilen Schadstoffen beaufschlagt werden.

6. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass diejenigen Zell- und Gewebeverbände, die unter pathologischen Bedingungen volatilen und semivolatilen Schadstoffen ausgesetzt sind, direkt oder durch Schadstoff-durchlässige Membranen mit den realen Expositionen in Zusammensetzung, Art und Konzentration angepassten volati­ len und semivolatilen Schadstoffen beaufschlagt werden.

7. Verfahren nach Anspruch 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass mit dem Schadstoff- Biogewebesensor nach Anspruch 1 oder 2 ein unabhängiger bzw. parallel und/oder in Reihe abhängiger Betrieb vieler vergleichbarer mit identischem und/oder differentem Ma­ terial beschickter Kulturräume erfolgt.

8. Verwendung des Schadstoff-Biogewebesensor nach Anspruch 1 oder 2 zum Biomonito­ ring von volatilen und semivolatilen Schadstoffen.

9. Verwendung des Schadstoff-Biogewebesensor nach Anspruch 1 oder 2 zum Biomonito­ ring der Innenraumbelastung durch volatile und semivolatile Schadstoffe.