DE19605753C2 - Verfahren und Vorrichtung zur Detektion von stoffwechselaktiven, unlädierten, ungestressten Mikroorganismen - quantitativ und qualitativ im "Sub-ppb-Bereich" innerhalb von Minuten - Google Patents
Verfahren und Vorrichtung zur Detektion von stoffwechselaktiven, unlädierten, ungestressten Mikroorganismen - quantitativ und qualitativ im "Sub-ppb-Bereich" innerhalb von MinutenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Messung des Keimgehaltes über die freige
setzten Stoffwechsel-Zwischen- und Endprodukte in einer speziellen Medium-Kultur
unter Anwendung eines störungsfreien, optimierten Wachstumsprozesses in einer
besonders konstruierten "Gaszelle" als "Reaktor". Sie isoliert während dieses Pro
zesses Medium von Bakterien und führt die sehr unterschiedlichen Stoffwechsel
produkte einer chemisch, physikalischen Trennung und Hochanreicherung zu. Die
neuen, apparativen Konstruktionsmerkmale bilden eine Einheit. Sie sind nicht von
einander trennbar, da sonst das System nicht funktioniert
Das erfindungsgemäße Verfahren findet seinen Einsatz in der Mikrobiologie. Es
findet dort Einsatz, wo sehr schnelle Ergebnisse in unteren Keimbereichen von etwa
0 bis 100 bzw. 1000 KBE/ml bzw. g, gefordert werden. Die Hauptanwendung ist als
analytisches Verfahren zur schnellen Detektion von Mikroorganismen in kritischen
Bereichen konzipiert. Sie weicht vollständig ab von den bekannten Konzepten des
Standes der Technik - egal welche Beispiele genannt werden - da keine (wie
üblich) Voranreicherung (selektiv/nichtselektiv) stattfindet.
Sie ist vergleichbar mit der Idee der "pcr-Technik" die eine "Multiplier-Funktion" als
Reaktionsschritt eines Teils der Zelle (DNA) zur Hilfe nimmt. Sie überwindet aber
jegliche Art und Nachteile von "Transfer-Schritten". Alle bekannten Techniken zeigen
nicht die vorgeschlagene Vorgehensweise - sondern praktizieren eher das Gegen
teil. Die konstruktive erste Stufe der vorgeschlagenen "Gas-Zelle" als Reaktor
steht im konstruktiven Gegensatz des klassischen Perkulationsapparates (Zuleitung
von Nährstoffen) oder bekannten aeroben Fermentern, da in der vorgeschlagenen
Methodik eine Abführung von Medium zeitlich erfolgt, die eine Konzentrationserhö
hung von Bakterien in der Kultur zur Folge hat, wobei aber zeitgleich Bakterien vom
Medium getrennt werden. Es ist kein Verfahren bekannt, das in einer statischen
Kultur unter den optimierten Bedingungen so verfährt, da es im Gegensatz zur
Lehrmeinung steht.
In einem Kulturmedium laufen zeitgleich verschiedene Reaktionen, je nach Zusam
mensetzung des Mediums ab, wobei folgende Begriffe entscheidend sind:
Sauerstoff, Temperatur, pH-Wert, Ionenkonzentration von anorganischen Verbin
dungen, organische Polymere bzw. monomere Verbindungen, Kohlenstoff-, Stick
stoff-Quelle, Ladungszustände von Verbidungen und Molekülen als Elektron-Dona
tor oder Elektron-Akzeptor (Redox-Gleichgewichte), anorganische Ionenkonzentra
tion, metabolische Zwischen- oder Endprodukte sowie H+-Ionenkonzentration des
Systems als auch der Pka-Wert der Puffersysteme (Journal of General Microbiology
(1985), 131, 3055-3076, J. D. Owens).
Besondere Aufmerksamkeit verdient auch die Konzentration an CO2 in einem
Medium, da bei geeignetem Puffersystem (pH-Wert) dieses als HCO3- vorliegt, da
sehr oft große Mengen an Kohlendioxyd als Primär-Reaktion durch Mikroorganis
men gebildet werden.
Ein kontinuierliches Monitoring der Kohlendioxyd-Konzentration in einem speziellen
Medium mit einer Indikator-Substanz ermöglicht die Konzentrationsmessung von
Kohlendioxyd, da der pH-Wert sich analog verändert und erlaubt bei Einsatz einer
kolorimetrischen Messung eine (indirekte) Bestimmung eines Gehaltes an Mikro
organismen (United States Patent, Nummer: 5,217,876 - Jun.8,1993/James E.
Turner, T. C. Thorpe, J. L. DiGuiseppi et al).
Eine andere, abgewandelte Methode wurde in dem United States Patent, Nummer:
5,217,875 - Jun, 1993 - Hellfried Krapf, Herbert Smole, beschrieben.
Hier wird die metabolische Aktivität von Mikroorganismen in der Auswirkung von
Änderungen von Nährmittelmedien-Zusammensetzungen hervorgerufen durch
Bildung von Kohlendioxyd, Schwefelwasserstoff also Abnahme der Sauerstoffkon
zentration und Änderung der H+-Ionen-Konzentration im Monitoring gemessen und
durch Reflexion-, Lumineszenz- und Absorbtion-Messung bestimmt.
Verändert man die Atmosphäre eines Mediums um streng anaerobe Bedingungen
einzuhalten, kann man beispielsweise flüchtige Fettsäuren mittels Gaschromatogra
phie - als Fingerprinting - detektieren (Virginia Polytechnic Institute and State
University Anaerobe Laboratory Blacksburg, Virginia 1972).
Diese Technik der Aftrennung von Fettsäuren und anschließende Charakterisierung
mittels GC-MS-Kopplung (mit Pyrolyse) wurde "in modern techniques for rapid
microbiological analysis"/Wilfried H. Nelson, VCH-Verlag ausführlich behandelt.
Eine andere Variante spiegelt den Stand der Technik ebenso wider: "Sensors in
Bioprocess Control" - John V. Twork und Alexander M. Vacynych, Verlag Marcel
Dekker, Inc., New York, 1990. Hier werden Bioreaktoren und elektrochemische
Sensoren zusammen mit Trenntechniken, wie die HPLC als online Methode
behandelt. Ziel dieser Arbeit ist es, Substratinhaltstoffe die durch die Fermentation
gebildet werden, aufzutrennen und quantitativ, zu erfassen. Ein Monitoring kann für
die Steuerung des Prozesses eingesetzt werden, um ein Optimum an Ausbeute zu
erhalten.
Um es vereinfacht darzustellen, kann man folgende grobe Aussage verallgemeinern:
polymere Verbindungen - d. h. Makromoleküle werden abgebaut zu monomeren Ver
bindungen, beispielsweise Proteine von Bakterien umgesetzt zu Aminosäuren, die
wenn frühzeitg detektiert, zur qualitativen und oder quantitativen Bestimmung heran
gezogen werden können. Zucker werden von Hefen abgebaut zu kurzkettigen Pepti
den oder beispielsweise Lipide von Schimmelpilzen zu kurzkettigen organischen
Säuren usw. Die Zahl der Publikationen ist endlos.
Viele heute (Stand der Technik) bekannte Methoden messen mit entsprechender
Technik (Beispiel: Leitfähigkeitstechnik) direkt im Nährmedium und erreichen dabei
eben nur eine Konzentrationsschwelle von etwa 106 Keimen/ml, d. h. sie benötigen
zur Detektion von einem aktiven Mikroorganismus ca. 24 Stunden bei nicht selekti
vem Medium (Gesamtflora bzw. Gesamtkeimzahl aerober, mesophiler Keime).
Das gleiche, zeitliche Problem wird nicht gelöst bei allen anderen, heute praktizierten
Methoden (soweit sie überhaupt quantitative Ergebnisse liefern können) wie:
Biolumineszenz- ATP, ELISA, Flow Cytometry, DNA-Probes (hybridisation), ELFA,
PCR u.v.a.m.
Der Level des Schwellenwertes ist unterschiedlich - aber keine beschriebene Metho
de erreicht Werte deutlich unter 1000 Keimen/ml in real time. Jede Methode greift
zurück auf Voranreicherungschritte etc. Keine der oben genannten Methoden ist
"ON-LINE"-fähig oder laüft als Gesamtsystem für alle Keime automatisch - real time.
Davon ausgehend liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein schnell und sicher
arbeitendes Verfahren mit einer entsprechenden Vorrichtung zu schaffen, das kon
tinuierlich bzw. semikontinuierlich arbeitet, in einem geschlossenen System. Das
in der Lage ist in kürzesten Zeiten (Minuten) Ergebnisse (Keime/ml) zu liefern aber
Transfer-Schritte vermeidet. Das im geschlossenen System als Anfangs- bzw.
Ausgangsbedingung, Sterilität gewährleistet und "ON-LINE" automatisch abläuft
sowie als "quasi"'Real-Time-Methode besteht.
Als technische Lösung wird mit der Erfindung verfahrensmäßig vorgeschlagen ein
optimiertes Wachstum unter ganz speziellen Kriterien durchzuführen, wobei Gas
strömung zur Schaffung von aeroben oder anaeroben Bedingungen oder deren
Zwischenzustände herbeigeführt wird. Alle bekannten Gase sind zulässig - oder
deren beliebige Mischung. Das Ziel dieses Schrittes ist es, mit einer definierten, ge
wählten Temperatur für spezielle Mikroorganismen optimale Wachstumsbedingung
zu schaffen, um zeitgleich Medium von Mikroorganismen zu trennen, Soffwechsel
produkte von Mikroorganismen einer Hochanreicherung zuzuführen.
Wichtig für die Detektion von aktiven Mikroorganismen - die über die Stoffwechsel
aktivität frühzeitig detektiert werden sollen - sind folgende Kriterien:
Optimale Bedingungen des Wachstums durch:
- I. Bereitstellung eines optimalen Nährstoffangebotes (N-, C- Quelle) und vielfach überhöhte Substratkonzentration,
- II. optimaler Temperaturbereich - Inkubationstemperatur,
- III. aerobe- bzw. anaerobe Atmosphäre oder deren Übergangszu stände - auch als Löslichkeit im Nährmedium,
- IV. optimaler pH-Wert (Puffersystem) und homogene Verteilung.
Da auch ein einzelner nachzuweisender Mikroorganismus aktiv im Soffwechsel sein
muß, wenden alle bisher bekannten Verfahren einen ersten Schritt an, um eine
Anzahl von z. B. Bakterien mengenmäßig auf einen Level zu bringen, um mit einer
nachgeschalteten Methode, diese auf sehr unterschiedliche Weise, zu erfassen.
Dieser erste Schritt muß aber schon optimiert werden in Bezug auf Wachstumsge
schwindigkeit. Das ist ein bishereriger Nachteil bestehender Verfahren, die nicht
konsequent genug, dieses umsetzen, z. B. im mikrobilogischen Analysengerät.
Dieses führt zu einer neuentwickelten Wachstumszelle als Reaktor der diese Be
dingungen herstellt, und im mikrobiologischen Analysator eingesetzt wird.
Will man Mikroorganismen (heute) qualitativ nachweisen, genügen bekannte
Verfahren der Voranreicherung. Dieses wird in der Regel für pathogene Keime
durchgeführt. Aber auch andere Verfahren führen Voranreicherungen durch um im
Nachhinein mit klassischen Methoden "koloniebildende Einheiten" pro Volumen oder
Gewicht zu erfassen.
Nachteil dieser Verfahren sind in der Regel Transfer-Schritte, wo Mikroorganismen
gestresst, lädiert werden und ein inganggesetzter Stoffwechselschritt unterbrochen
wird. Die Folge ist eine Verzögerung des Wachstums, als nicht optimale Bedingung.
Dieses gilt es zu vermeiden. Auch ist ein Voranreicherungsschritt mit dem Nachteil
behaftet, daß eine Kalibrierung mit Hilfe des klassischen Plattengußverfahrens
verfälscht wird!
Betrachtet man einen einzelnen Mikroorganismus und beispielsweise eine Reaktion,
wo Enzyme, polymere Verbindungen spalten zu monomeren Verbindungen, kann
durch diesen Sachverhalt, wenn er durch genügend vorhandene Biomasse gedeckt
wird, auf sogenannte "Primär-Reaktionen" geschlossen werden.
Hierbei sind die chemischen und physikalischen Eigenschaften der neu entstande
nen Verbindungen entscheidend, z. B. eine Aminosäure.
Es muß also durch entsprechende Kulturbedingungen eine Reaktion gefördert
werden, die entsprechende Reaktionsprodukte liefert in genügend hoher Konzentra
tion, um eine Bestimmung durchzuführen, da die Generationszeit eines Mikroorga
nismusses nicht (beliebig) reduziert werden kann.
Dieses ist der genaue Ansatzpunkt des neuen, vorgeschlagenen Verfahrens und
entsprechender Vorrichtung.
- A. Es wird eine optimale Kulturbedingung hergestellt
- B. Die nach kurzer Zeit entstandenen Reaktionsprodukte werden aufkonzentriert, um so eine Detektion nach kürzester Zeit durch führen zu können, die durchaus kürzer sein kann als eine Generationszeit eines Mikroorganismusses, da die Reaktionsprodukte in Summe schon so hoch sind, daß vor einer ersten kompletten Zellteilung eine Bestimmung durchgeführt werden könnte.
Allein durch diese Vorgehensweise: a. optimale Kulturbedingung gleich höchste
Ausbeute pro Zeiteinheit und b. Aufkonzentration der Reaktionsprodukte zu einem
Level der eine Messung im sub-ppb-Bereich ermöglicht, da eben keine Mikroorga
nismen aufkonzentriert (vorangereichert) werden, sondern die aus ihnen entstande
nen Stoffwechsel-Reaktionsprodukte.
Da das Verfahren in vitro abläuft, also ein wässriges Medium vorherrscht, werden
geeignete Mechanismen und Techniken eingesetzt die einen "On-Line-Betrieb" des
Gesamtsystems (Fig. 1) ermöglichen.
Da es sich in der Regel um lösliche, teilweise dissoziierte Verbindungen (Moleküle)
oder anorganische, ionische Verbindungen handelt, werden diese an Ionen-Austau
schern aufkonzentriert (Säulenschaltung), um mit einem geeigneten Eluens als
scharfe Bande (Peak - Gaussche Verteilungskurve) eluiert zu werden, um dann je
nach Stoffklasse und chemischer Konfiguration (funktionelle Gruppen) chemisch
modifiziert (Reaktion, z. B. Aminosäuren mit o-Diphthalaldehyd oder Ninhydrin etc.)
einer Bestimmung zugänglich gemacht zu werden, in Form von z. B.
fluoreszierenden Verbindungen, die im Fluoreszenzdetektor detektiert werden.
Es wurden Applikationen gefahren, die über diesen "Aufkonzentrierungsschritt"
mühelos den "ppt-Level" erreichten. Das bedeutet konkret, daß die von einem
Mikroorgnismus freigesetzte Menge an löslichen Stoffen, die z. B. die Leitfähigkeit
verändern ausreicht, um einen Nachweis, zu führen.
Ein andere Variante wäre die Ionenkonzentration im "Gesamtsystem" der wässrigen
Matrix, da bei Wachstum von Mikroorganismen eine Zunahme oder Abnahme von
Ionenspezies registriert werden kann.
Durch ein geeignetes Säulenmaterial (Ionenaustauscher) wird wiederum aufkon
zentriert, durch eine Säulenschaltung (Fig. 2) wird eluiert und die Konzentrations
bande im geiegneten Detektionssystem (Fig. 3) - Leitfähigkeitsdetektor bestimmt als
Kon- zentrations-Peak. Dieses läßt sich je nach Stoffklasse beliebig modifizieren um
verschiedenste Nachweistechniken, zu adaptieren.
Folgende Kriterien werden zur Optimierung herangezogen und sind durch die kon
struktiven Merkmale der Vorrichtung möglich geworden:
- a. Steuerbare (Gasfluß) Zufuhr von Luft oder Gasmischungen beliebiger Zu
sammensetzung die vortemperiert sein können aber in jedem Falle von
Mikroorganismen 100%-ig befreit sind, durch entsprechende Techniken.
- aa. Eine (Vor-) Gaskühlung ist ebenso vorzusehen um im Bedarfsfall
Temperatur-Gradienten zu fahren.
- aaa. Auch eine Intervallschaltung des Gasflusses (Pulsen) ist vorgese hen.
- aa. Eine (Vor-) Gaskühlung ist ebenso vorzusehen um im Bedarfsfall
Temperatur-Gradienten zu fahren.
- b. Ein konstanter Partialdruck und somit eine bestimmte Löslichkeit von z. B. Sauerstoff wird durch die konstruktive Maßnahme - eines Strömungs widerstandes (Filter) - siehe Fig. 1/Teil 11, umgesetzt. Er dient gleichzeitig zur Wasserabscheidung.
- c. Durch konstruktive Parameter der Bodenfritte gelingt es Turbulenz zu
erzeugen, die einen nötigen Rühreffekt bewirkt. Das bewirkt eine Verhin
derung von Klumpenbildung (keine Mikrostandorte).
Zugleich dient es einem homogenen Nähstoffangebot pro Zeit (Substrat konzentration). - d. Der "Gaszellen-Reaktor" weist zwei Strömungsausgänge auf (Fig. 1/13).
Diese Ausgänge dienen zur zeitlichen Austragung von Medium und ver
hindern durch eine "Membranfritte" (0,4 µ bis 0,2 µ):
- a. den Abtransport von Bakterien
- b. das Einströmen von Gasblasen in die Leitungen.
- e. Das Mehrwegeventil (15) ist in der Schaltung zur Pumpenseite offen ebenso zur Zelle (Membranfilter) und hat im jetzigen Strömungsbereich auch die Kartuschenseite (16) bzw. Säulenseite geöffnet um im PC kontrollierten Mode z. B. 100 µl Medium, zu fördern. Nach definierter Steuerungszeit schließt das Ventil (15) wieder und hat unter Berücksich tigung des Totvolumens von Leitung und Säule unter gegf. zur Hilfenah me eines Eluenten (z. B. wässrige Lösung) das Aufgabevolumen von 100 µl auf einen Ionenaustauscher aufkonzentriert.
- f. Durch Wechseln des Eluenten (Ventilumschaltung) wird nun in Richtung
Magnetventil (Mehrport) (17) eluiert, um mit entsprechenden Eluenten
von der Säule eine schmale Konzentrationbande des angereicherten
Stoffes (Ionen, Carbonsäuren, Aminosäuren usw.), zu eluieren.
Eine nachgeschaltete Säule bzw. Kartusche kann diesen Vorgang
wiederholen:
- f1. und kann entweder durch eine völlig andere stationäre Phase aus diesem angereicherten Eluenten eine andere Stoffklasse abtrennen
- f2. oder durch Öffnen des Mehrportventiles (17) ein Reagens wie z. B. o-Diphthalaldehyd in entsprechender Menge und Konzen tration unter Einsatz eines Temperatur-Coils zur Reaktion brin gen um ein fluoreszenzfähiges Derivat zu erhalten,
Eine Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens schlägt vor, daß für indirek
te Messungen bzw. Methoden beispielsweise Hefen oder Schimmel in einem selek
tiven optimierten Kulturmedium gezüchtet werden um gasförmige Reaktionsprodukte
wie hier CO2 nachzuweisen.
Zur Optimierung innerhalb der Gas-Reaktor-Zelle (1) wird durch das Septum-Port (2)
ein Enzym zur Reaktionsbeschleunigung zugesetzt (z. B.: Kohlensäure-Dehydratase).
Da Enzyme nur in bestimmten pH-Bereichen arbeiten wird dieser Port auch zur
automatischen Abpufferung des Nährstoffmediums eingesetzt.
Man leitet dann einfach das quantitativ erzeugte Kohledioxyd in eine Lauge z. B. 0,1
molare KOH und mißt die Abnahme der OH--Ionenkonzentration zur Referenz-Zelle.
Ein geiegneter Ionenaustauscher wird vorgeschaltet und wiederum die aufkonzen
trierten Ionen-Spezies nachgewiesen.
Andere Reagenzien sind einsetzbar z. B. als NH3-Nachweis 0,1 m Schwefelsäure
oder für Schwefewasserstoffnachweis lösliche Kupfer-, Blei- oder Quechsilber-
Salze usw.
Eine Weiterbildung schlägt vor, daß alle Messungen über eine rechnergestützte
Verfahrensweise gesteuert und ausgewertet werden, da man mit diesen neuen
Techniken in Detektionsbereiche vordringt, die ohnehin vorher nicht erreicht wurden.
Wichtig ist, daß alle Ionenaustauscher, Kationen- oder Anionen-Austauscher einge
setzt werden können, sowie alle z. B. in der Flüssigkeitschromatographie bestens
bekannten Trägermaterialien und Eluenten, die alle Bereiche dieser Technik umfaßt.
Da der Zeitbedarf für den Aufkonzentrierungsschritt nur wenige Minuten benötigt, ist
es wichtig die Generationszeit der Mikroorganismen zu berücksichtigen, da es
natürlich MO's gibt, die einen sehr inaktiven bzw. langsamen Stoffwechsel vorwei
sen.
Hier genügt es die erste automatische Probennahme (z. B. 50 oder 100 µl) erst nach
30 Minuten erfolgen zu lassen und nicht wie beispielsweise für koliforme Keime
nach 12 bzw. 15 Minuten.
Da Konzentrationen im Massenfluß bestimmt werden, können diese "Aufgabemen
gen" variiert und günstig beeinflußt werden. Das gilt genauso für den Aufkonzentrier
ungsschritt und das Elutionsvolumen und die Elutionsgeschwindigkeit auf einer sta
tionären Phase.
Eine Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens schlägt die quantitative
Erfassung mit bekannten Algorithmen ähnlich der Chromatographie vor, wo eine
Fläche unter der Kurve einer bestimmten Konzentration entspricht. Berechnungen
über internen oder externer Standard sind möglich.
Die Zunahme der beispielsweise Ionenkonzentration in einer bestimmten Zeit, z. B.
15 Minuten kann durch drei Messungen - sprich 3 Peakhöhen - dargestellt werden.
Verbindet man diese Höhen (Scheitelpunkt der Kurve des einzelnen Peaks) mitein
ander entsteht eine Kurve (typische exponentielle Funktion) die dem Wachstums
vorgang (Wachstumskurve) entspricht.
Der Vergleich mit der traditionellen Methode (Ausstreichen auf Agarplatten/MPN-
Verfahren) gewonnenen Werte (KBE/g bzw. ml) ermöglicht die quantitative
Bestimmung im Rechner. Eine logarithmische Darstellung der Kalibrierung ist so
möglich und durch lineare Regressionsberechnung der Varationskoeffizient darstell
bar.
Eine weitere Weiterbildung des Verfahrens sieht eine erweiterte Vorrichtung vor,
ausgehend von der Gas-Reaktor-Zelle (1), die eine im Durchmesser kleinere aber
aber etwas höhere Gas-Reaktions-Mischzelle (Fig. 4/32) vorweist, die mit Lauge
(z. B. KOH) oder anderen Reagenzien befüllt ist (PbAc, HgCl2 usw.).
Hier werden durch "Primär-Reaktion" der von den Mikroorganismen erzeugten, gas
förmigen Stoffwechselprodukte wie beispielsweise CO2, H2S, NH3 usw. chemisch
zur Reaktion gebracht und wie beschrieben umgekehrt, als z. B. Abnahme der OH--
Konzentration registriert. Je nach Ionen-Spezies und Auswahl des Ionenaustau
schers können hier Nachweise geschehen im Massenfluß-Leitfähigkeits-Detektor.
Für diese Konfiguration ist eine Temperierung auf etwa 0,1°C genau (oder besser)
innerhalb der Gaszelle von Wichtigkeit. Auch ist für beide Volumenströme (Gas und
Flüssigkeit) eine konstante und reproduzierbare Strömung in einem druckstabilen
System, einzuhalten.
Das Bypass-Filter (Porengröße: 0,4 µm bis 0,2 µm) kann aus unterschiedlichen Mate
rialien bestehen, die eine bestimmte Affinität zu wässrigen Lösungen aufweisen,
durch die der Volumenstrom zur Rückhaltung von Mikroorganismen geleitet wird.
Es ist weiterhin vorgesehen "Säulen", mit zur Nährlösung unterschiedlichen Medien,
zu eluieren, deren Zusammensetzung andersartig ist, als das Volumen aus der
Gaszelle.
Der Volumenstrom selbst kann durch alle Arten von Pumpen, oder Druck bewerk
stelligt werden. Säulenschaltungen mit entsprechend inerten, druckbeständigen
Ventilsitzen werden zur Kombination unterschiedlicher Trenn-, bzw. Aufkonzentrier-
Säulen und/oder zur Kombination unterschiedlicher Detektorsysteme herangezo
gen.
Die Temperaturkompensation des Referenzkanals und Messkanals beliebiger
Detektoren soll über eine PC-Lösung (Computer gestützte Gesamtsteuerung mittels
Software) durchgeführt werden. Hierbei sollte das Ausgangsmess-Signal im
Kompensations-Mode über geeignete Software mittels entsprechendem Algorithmus
aufbereitet werden, um Störsignale, Rauschen zu eliminieren und Empfindlichkeit zu
steigern. Die Volumina (Medienaustrag aus dem Reaktor), Aufkonzentriergeschwin
digkeit auf eine stationäre Phase, Fördergeschwindigkeit des Eluens sowie des
Reagens zur Derivatisierung geschehen automatisch, variabel nach den Erforder
nissen des Volumenstroms (PC-Steuerung).
Eine Weiterbildung des Verfahrens sieht den Gebrauch des Gas-Zellen-Reaktors
zur Analyse von Gasen, insbesondere Luft (Continuous Air Monitoring - kontinuier
liche Luftüberwachung). Die Gaszufuhr ist laminar und tritt durch den optimierten
Strömungskörper, um so Mikroorganismen, stressfrei ohne subletale Schädigung in
die Nährlösung, zu tranportieren (hier: Keim-Analyse von Luft).
Die Befüllung zum Nachweis von stoffwechselfreigesetzten Gasen, wie CO2, NH3
und H2S, mit Laugen (KOH, NaOH) oder Säuren (Schwefelsäure, Essigsäure) oder
Salzlösungen zur Fällungsreaktion (wie Kupferchlorid, Bleiacetat, Quecksilberchlo
rid) in entsprechender Konzentration, geschieht in dem "Neben-Gas-Reaktor"
(Fig. 4/32).
Oft reicht auch schon ein im geschlossenen Gas-Zellen-Reaktor befindlicher
Kopfraum ("Headspace") mit einem befülltem Gas unter Normalbedingung aus, um
wie beschrieben die Reaktion durchzuführen und den Massenfluß (Abtranport des
Mediums zur Konzentriersäule/Abtrennung von Mikroorganismen) ablaufen zu las
sen.
Ein Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur "Erfassung" von
Keimen wird nachfolgend anhand der Zeichnungen beschrieben. In diesen zeigen:
Fig. 1 Ansicht einer Gaszellen-Reaktors zur Erfassung nicht gasförmiger,
aus dem Stoffwechselprodukt von Mikroorganismen stammender
Zwischen- bzw. End-Reaktionsprodukte, mit zwei Bypass-Leitungen
inklusive Filtern, Mehrwegventilen, Säulen und Tandemdetektor.
Fig. 2 Eine Säulenschaltung mit verschieden Säulen-Typen, Ventilen und
Detektor.
Fig. 2/1 Einfache Konzentrier-Säulenschaltung mit einem Aufgabeventil
Fig. 3 Detailzeichnung einer Leitfähigkeits-Massen-Fluß-Zelle (Durchflußzelle)
eines Kanales (Referenz- bzw. Meßkanal) stellvertretend für beliebige
andere Lösungen.
Fig. 4 Ansicht eines Gaszellen-Reaktors für gasförmige, metabolische Reak
tions-Endprodukte.
Fig. 5 Aufbau einer vereinfachten Säulenschaltung als Gesamtanlage.
1
Gas-Zellen-Reaktor
2
Septum für Proben-Eingabe
3
Nährmedium
4
Gaszuführung
5
Steigleitung (Gaszuführung)
6
Deckel
7
Hahn
8
Steg
9
Strömungskörper
10
Gasverteilugsraum
11
Gasströmungswiderstand/Wasserabscheider
12
Gasabführungsleitung
13
Filter/0,2 µm mit Vorfilter integriert
14
Mediumleitung zur Konzentrations-Säule
15
Mehr-Port-Schaltventil
16
Vor-Konzentriersäule
17
Mehr-Port-Magnetventil (Derivatisierung)
18
Trennsäule oder Konzentriersäule 2
19
Tandem-Detektor (Meß- und Referenz-Signal)
20
Mediumleitung für Referenzmessung
21
Mehrportschaltventil
22
Mehrportschaltventil
Zu Fig. 1
23Eluens-Zufuhr
24Eluens-Abfluß (Volumenerfassung)
264-Port-Ventil 1
274-Port-Ventil 2
28Vorsäule
29Konzentriersäule
30Trennsäule
31Pumpe
24Eluens-Abfluß (Volumenerfassung)
264-Port-Ventil 1
274-Port-Ventil 2
28Vorsäule
29Konzentriersäule
30Trennsäule
31Pumpe
Zu Fig. 2 (Aufgabe-Position/Injektionsventil)
32Reaktionskammer für gasförmige Stoffwechselprodukte
33Gaszuführungsleitung von 1
34Gasableitung von 32
35Entnahme-Port für Reaktions-Lösung für Konzentriersäule
36Eluens-Pumpe
33Gaszuführungsleitung von 1
34Gasableitung von 32
35Entnahme-Port für Reaktions-Lösung für Konzentriersäule
36Eluens-Pumpe
Zu Fig. 4
416-Port-Injektionsventil
42Konzentriersäule
43Probenpumpe
44Probenbehälter (Gas-Zellen-Reaktor)
45Abfluß
46Leitung zur Trennsäule
47Eluenten-Pumpe
48Controller (Ventil, Probenpumpe)
Detail A
Umkehrung der Flussrichtung Detail B
42Konzentriersäule
43Probenpumpe
44Probenbehälter (Gas-Zellen-Reaktor)
45Abfluß
46Leitung zur Trennsäule
47Eluenten-Pumpe
48Controller (Ventil, Probenpumpe)
Detail A
Umkehrung der Flussrichtung Detail B
Zu Fig. 2/1
49PC mit AD-Wandler / Software zur Erfassung und Auswertung
Zu Fig. 5
50Durchfluß-Zelle zur Leitfähigkeitsmessung
51Eluens Einflußrichtung
52Eluens Ausgang
53Glaskapillare mit sehr kleinem Volumen (µl-Bereich)
54Eingeschmolzene Elektroden
55Beispiel einer vorteilhaften Messanordnung
51Eluens Einflußrichtung
52Eluens Ausgang
53Glaskapillare mit sehr kleinem Volumen (µl-Bereich)
54Eingeschmolzene Elektroden
55Beispiel einer vorteilhaften Messanordnung
Zu Fig. 3
Claims (9)
1. Verfahren zur quantitativen und qualitativen Detektion von Mikroorganismen im
"sub-ppb-Bereich", wobei man in einem geschlossenen System
- 1. a.) die Mikroorganismen in einem Gaszellen-Reaktor in einem Medium störungsfrei, unter optimierten Wachstumsbedingungen wachsen läßt,
- 2. b.) Medium von den Mikroorganismen abtrennt,
- 3. c.) die im Medium enthaltenen Stoffwechselprodukte einer Hochanrei cherung zuführt und
- 4. d.) die Mikroorganismen qualitativ und quantitativ bestimmt, indem man die aufkonzentrierten Stoffwechselprodukte nachweist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß keine Voranreicher
ung der Mikroorganismen durchgeführt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß Luft oder ein ent
sprechendes Gasgemisch auf Inkubationstemperatur erwärmt und filtriert bzw.
entkeimt wird, dann durch einen Strömungskörper geleitet wird, so daß durch
aufsteigende, feine Luftbläschen ein Rühreffekt erzielt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß etwa 100 µl Medium
über einen Bypass (Rohrleitungen) nach einer bestimmten Zeit im Intervall aus
der Gaszelle herausgefördert wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Volumenstrom
des Mediums durch eine oder mehrere Säulen, Kartuschen mit spezieller Fül
lung geleitet wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Füllung Ionenaus
tauscher (Kation- und Anion-Austauscher), Gele, Adsorbtionsmaterialien,
Surpressor-Membrane, Mischharze eingesetzt werden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß Stoff
wechselprodukte, die aus dem Gaszellenreaktor über den Bypass gefördert, über
eine oder mehrere Säulen aufkonzentriert, gegf. chemisch modifiziert werden und
in unterschiedlichen Detektorsystemen nachgewiesen werden.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß UV-,
Fluoreszenz-, Leitfähigkeits-, amperometrischer-, Lumineszenz-Detektor und/
oder Ionen-Sensitive-Elektroden zur Detektion verwendet werden.
9. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1-8,
gekennzeichnet durch
einen Gaszellen-Reaktor (1) in dem ein Gasgemisch durch eine Leitung (5), mit Gas-Sammelraum (10) und Umleitungssteg (8) eingeleitet wird, einen zum Eintrag bzw. Austrag einer möglichen Probe verwendeten Septum- Port (2),
einen Strömungskörper (9) zur Erzeugung von Gasbläschen,
ein Filtersystem (13) zur Trennung von Mikroorganismen vom Medium, automatische Ventile (15, 17, 21, 22) zum Anschluß von Pumpen-Systemen,
wobei das Medium auf Vorkonzentriersäulen (16) oder Trenn-Säulen bzw. Kartuschen (18) transportiert, nach Aufkonzentrierung und Elution als scharfe Konzentrationsbande einem Detektor-System (19) zugeführt wird.
einen Gaszellen-Reaktor (1) in dem ein Gasgemisch durch eine Leitung (5), mit Gas-Sammelraum (10) und Umleitungssteg (8) eingeleitet wird, einen zum Eintrag bzw. Austrag einer möglichen Probe verwendeten Septum- Port (2),
einen Strömungskörper (9) zur Erzeugung von Gasbläschen,
ein Filtersystem (13) zur Trennung von Mikroorganismen vom Medium, automatische Ventile (15, 17, 21, 22) zum Anschluß von Pumpen-Systemen,
wobei das Medium auf Vorkonzentriersäulen (16) oder Trenn-Säulen bzw. Kartuschen (18) transportiert, nach Aufkonzentrierung und Elution als scharfe Konzentrationsbande einem Detektor-System (19) zugeführt wird.
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DE1996105753 DE19605753C2 (de) | 1996-02-16 | 1996-02-16 | Verfahren und Vorrichtung zur Detektion von stoffwechselaktiven, unlädierten, ungestressten Mikroorganismen - quantitativ und qualitativ im "Sub-ppb-Bereich" innerhalb von Minuten |
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DE19921999C2 (de) | 1999-05-12 | 2003-02-13 | Fraunhofer Ges Forschung | Vorrichtung und Verfahren zur Überwachung und Kontrolle von biologisch aktiven Fluiden |
DE10100581B4 (de) * | 2001-01-09 | 2007-11-15 | Ursula Schies | Verfahren und Vorrichtung zum Nachweis von Mikroorganismen auf Oberflächen |
FR2853326B1 (fr) * | 2003-04-07 | 2005-05-06 | Biomerieux Sa | Procede de detection et/ou d'identification de bacteries presentes dans un echantillon |
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US5217876A (en) * | 1988-03-15 | 1993-06-08 | Akzo N.V. | Method for detecting microorganisms |
US5217875A (en) * | 1989-05-12 | 1993-06-08 | Avl Ag | Method for detecting biological activities in a specimen and a device for implementing the method |
-
1996
- 1996-02-16 DE DE1996105753 patent/DE19605753C2/de not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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US5217876A (en) * | 1988-03-15 | 1993-06-08 | Akzo N.V. | Method for detecting microorganisms |
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TWORK, J.V., YACYNYCH, A.M.: Sensors in BioprocessControl, Marcel Dekker, Inc. (1990), S. 39-46 * |
Also Published As
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