DE2457044C3

DE2457044C3 - Überwachung und Regelung von Anlagen der kontinuierlichen Kultur von Mikroorganismen

Info

Publication number: DE2457044C3
Application number: DE2457044A
Authority: DE
Inventors: Karl Dr. 6501 Elsheim Klemm
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1974-12-03
Filing date: 1974-12-03
Publication date: 1979-11-22
Also published as: DE2554393A1; DE2457044A1; DE2554393C3; DE2554393B2; DE2457044B2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Überwa chung und Regelung von Anlagen zur kontinuierli chen Kultur von Mikroorganismen, wobei als Bezugs größen für die Regelung der Substratzufuhr solche Meßwerte verwendet werden, die Veränderungen de . Kulturmilieus auf Grund des Stoffwechsels der Orga nismen betreffen.

Bei der Kultur von Mikroorganismen in geschlosse nen Gefäßen ändern sich die Kulturbedingungen mi: zunehmender Organismenzahl und abnehmenden' Nährstoffangebot ständig. Zur Kultur von Mikroor ganismen unter gleichbleibenden Bedingungen übe · lang re Zeit sind zwei kontinuierliche Kulturmetho ■ den bekannt.

Im sogenannten »Chemostaten« wird einer Kultu ■ in einem Kulturgefäß mit konstanter Zuflußrate fri ■ sches Substrat zugeführt und in gleichem Maße Organismensuspension entnommen. In der Kultur stellt sich ein Fließgleichgewicht ein, das abhängig ist von den Außenbedingungen und der vom Experimentato · vorgegebenen Zuflußrate. Im sogenannten »Turbidostaten« wird die im Kulturgefäß vorhandene Anzahl von Organismen pro Volumeneinheit als optisch·: Dichte der Kultur ständig überwacht und bei Erhöhung der optischen Dichte durch Zugabe frischen Substrates eine vorgegebene Organismendichte aufrechterhalten. Bei der Messung der optischen Dicht .· im Turbidostaten kann jedoch nicht zwischen lebenden und toten Organismen unterschieden werden. Das Verfahren ist also bei einer Veränderung von Kultur bedingungen in Bereiche, die durch erhöhte Absterberaten gekennzeichnet sind, nicht anwendbar.

Eine Selektion und Anreicherung von Mutanten i> t mit diesen beiden kontinuierlichen Verfahren offensichtlich nicht erreichbar, so daß für derartige Zweck; immer noch das diskontinuierliche Schalenverfahrer, also das Umsetzen der Kulturen in verschiedene Schalen unterschiedlicher Bedingungen, üblich ist.

Aufgabe der Erfindung ist es deshalb, das bekannt; Verfahren zur Überwachung und Regelung von Anlagen zur kontinuierlichen Kultur von Mikroorganismen, wobei als Bezugsgrößen für die Regelung der Substratzufuhr solche Meßwerte verwendet werder, die Veränderungen des Kulturmilieus auf Grund des Stoffwechsels der Organismen betreffen, derart weite r auszugestalten, daß damit eine schnelle und wirkungsvolle Selektion Und Anreicherung von Mutanten heibeigeführt werden kann. Nach der Erfindung wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß die Regelungsmerkmale in Verbindung mit graduellen Veränderungen von Kulturbedingungen, mit oder ohne zusätzlicher Regelung der Gradientenanstiege durch die Meßwerte, verwendet werden.

Nun war es zwar aus der Zeitschrift »Brauwissenschaft«, Jahrgang 20, Heft 10/1967, Seite 417, bereits bekannt, bei Anlagen zur kontinuierlichen Vergärung die Durchflußrate durch den Turm an Hand der Dichte des Bieres zu steuern. Abgesehen davon, daß es dabei nicht um das Überwachen und Regeln der Kultur von Mikroorganismen geht, vermochte diese Literaturstelle schon deshalb keine Anregung zur Lösung der der Erfindung zugrundeliegenden Aufgabe zu liefern, weil - wie schon in Verbindung mit dem sogenannten »Turbidostaten« erwähnt - gerade die Dichtemessung nicht zwischen lebenden und toten Organismen unterscheiden kann und deshalb nicht für

.•ti Selektiomszwecke geeignet ist.

Verändert man Bedingungen für die Kultur (z. B. die Temperatur) graduell in der Zeit, so wird dies bei Annäherung der sich verändernden Bedingungen an Extrem- oder Grenzwerte an einer Änderung der

_·■, Stoffwechselaktivitär erkennbar. Erfolgt die Annäherung an den Grenzwert langsam genug, so werden solche Organismen sich in der Kultur anreichern, die sich für die geänderten Bedingungen im Selektionsvorteil befinden. Es tritt eine Mutanten-Auslese und

in -Anreicherung in der Kultur ein. Überwacht oder regelt man den Anstieg des Gradienten mit Bezug auf die Meßwerte für die Stoffwechselaktivität, so wird im äußersten Fall der Gradient = 0. die Kultur kann aber nicht durch Überschreitung des Grenzwertes ab-

ii getötet werden. Gradienten von Substanzen sind interessant für Selektionen wir Resistenz gegen erhöhte Abbaufähigkeit, Anhäufung von bestimmten Stoffwechsel-|zwischen)-Produkten, Veränderung bisher inert erscheinender Substanzen (Umweltschutz) und

«■ι dergleichen. Besonders gute Resultate sind zu erwarten, wenn die betreffende Bezugssubstanz selbst direkt mil einem Meßwertaufnehmer oder durch schnelle Analysenmethoden bestimmt und als Bezugsgröße für die Regelung verwendet werden kann.

,, Bestrahlungen im Kulturgefäß (punktförmige Strahlenquellen) oder Zugabe von mutationsauslösenden Substanzen können gegebenenfalls den Gradienten zur Selektion eine Erhöhung der Mutationsrate parallel gehetii lassen.

,„ Bei Konstanz der Kulturbedingu.igen resultiert eine gleichbleibende Stoffwechselaktivität der Kultur mit Bezug auf den Meßwert für die Regelung (z.B. COj-Bildung pr»> Zeiteinheit). Dadurch können Einflüsse von Außenbedingungen oder Substanzen auf

,-, den »steady state« einer Kultur untersucht werden. Bei der Einwirkung von Gift- oder Hemmstoffen ist die Möglichkeit gegeben, durch einmalige Zugabe und Registrierung über längere Zeit auch Erholungsphasen und -zeiten sowie die Wirkung von vermuteten

_h„ Antagonismen /u untersuchen. Durch Kontrolle des Aktivitatiäverlaufs einer Kultur bei Ablauf eines Kon· zentratiohsgradieiiten bezüglich des Substrates öder einzelner Substratbestandteile können Aussagen über optimale Konzentrationen in bezug auf eine ge-

_b-, wünschte Optimierung der Bildung von z. B. Stoffwechsel-Zwischen- oder -Endprodukten erhalten werden.

Je nach Meßwertaufnehmer und meßtechnischem

Aufwand können geringste Stoffwechselaktivitäten als Ist-Werte zur Regelung der Kulturanlage erfaßt werden. Bei Verwendung spezifischer Meßwertaufnehmer oder schneller Analysenmethoden besteht diie Möglichkeit, die Regelung in bezug auf einen spezifischen Stoffwechselvorgang auszurichten. Die technische Ausgestaltung der Kulturgefäße (Glas, Metall. Kunststoff, offen, druckdicht etc.), der Zugabe und Abgabeteile (Pumpen, Dosierpumpen, Regelventile etc.) sowie der Meß- und Regelverschaltungen kann den jeweiligen speziellen Problemen angepaßt werden.

Zur Erläuterung der Erfindung werden nachfolgend noch einige Beispiele angegeben,
a) Bildung von CO₂ als Stoffwechselendprodukt.

Messung der gebildeten CO₂-Menge, z. B. als Druckanstieg bis zu einem Maximum-Schaltpunkt am Druckaufnehmer. Hier Abgabe von etwas Organismensuspension (Überfluß) und dem gebildeten CO_;,-Da durch Druckabnahme bis zum Minimum-Schaltpunkt, hier Zugage von frischem Substrat in der Menge des »Überflusses« (also Kulturvolumen konstant). Weitere CO,-Bildung mit Druckanstieg bis zum Maximum-Schaltpunkt usw. Das Kulturgefäß ist in diesem Fall druckdicht, der Abgangsstutzen seitlich, so daß seine Höhe über Boden das Kulturvolumen bestimmt. Die Abgabe erfolgt durch Schlauchpumpe, die Zugabe mittels Dosierpumpe. Messung mit Differenzdruck-Druckaufnehmer gegen ein steriles Vergleichsgefäß in Größe des Kulturgefäßes zum Ausgleich von Temperaturschwankungen ist zweckmäßig, b) Säurebildung während des Stoffwechselablaufes.

Erfassung der Säurebildung durch pH-Messung von einem Ausgangs-Schaltpunkt (bestimmt durch pH-Wert des sterilen Substrates) bis zu einem festgesetzten End-Schaltpunkt am pH-Meßgerät. Bei dessen Erreichen Rücktitration auf Ausgangs-Punkt und/ oder gekoppelt mit der Titration Zugabe von frischem Substrat.

Das Kulturgefäß hat nur Sterilabschluß, das KuI-turvolumen ist wie unter a) festgelegt. Rücktitration tropfenweise durch impulsgesteuertes Magnetventil, Substratzügabc mit Dosierpumpe. /-,Überfluß» fließt von selbst auf Grund des fixierten Kulturvolumens ab.

Claims

24 ¹M 044

Patentanspruch:

Verfahren zur Überwachung und Regelung von Anlagen zur kontinuierlichen Kultur von Mikroorganismen, wobei als Bezugsgrößen für die Regelung der Substratzufuhr solche Meßwerte verwendet werden, die Veränderungen des KuI-turmilieus auf Grund des Stoffwechsels der Organismen betreffen, dadurch gekennzeichnet daß zum Zwecke der Selektion und Anreicherung von Mutanten die Regelungsmerkmale in Verbindung mit graduellen Veränderungen von Kulturbedingungen, mit oder ohne zusätzlicher Regelung der Gradientenanstiege durch die Meßwerte, verwendet werden.