DE3927856A1 - Verfahren zur prozessfuehrung mindestens eines bioreaktors fuer pflanzliche zellkulturen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Prozeßführung mindestens eines Bioreaktors für pflanzliche Zellkulturen der im Oberbegriff des Anspruchs 1 angegebenen Gattung.

Pflanzliche Zellkulturen werden in der Pflanzenzüchtung bereits in großem Umfang angewendet; so ist beispielsweise die ungeschlechtliche Pflanzenvermehrung über Kallus-Kulturen ein Weg zur raschen Erzeugung reinerbiger Nachkommen. Andererseits können Kallus-Kulturen auch in flüssige Suspensionskulturen überführt werden, die sich ähnlich wie Mikroorganismen in Bioreaktoren vermehren lassen. An dieser Stelle können prinzipiell auch genetische Veränderungen vorgenommen werden.

Jede Zelle einer Kultur besitzt das vollständige Erbgut einer ganzen Pflanze und kann theoretisch bei geeigneter Wahl der Nährstoff- und Kulturbedingungen zur Produktion von speziellen Pflanzeninhaltsstof­ fen angeregt werden, die wiederum große wirtschaftliche Bedeutung sowohl in der Pharmazie wie auch in der Kosmetik und der Nahrungsmit­ telindustrie haben.

Die Entwicklung von Produktionsverfahren für pflanzliche Zellkulturen im großtechnischen Maßstab muß die besonderen Eigenschaften von pflanzlichen Zellen berücksichtigen, insbesondere ihre Größe, ihre Morphologie, insbesondere die Scherempfindlichkeit der Zellaggregate, die maximale Wachstumsrate, die Zelldichte, die relativ komplexen Medienansprüche, die Belüftungsrate sowie andere Parameter.

Zur Untersuchung dieser Aspekte wurde eine fünfstufige Fermentations­ anlage im Produktionsmaßstab bis 75 000 Liter errichtet, die in Arti­ keln mit dem Titel "Großtechnische Fermentation von pflanzlichen Zellkulturen" in der Zeitschrift "Bio Engineering", 1/89, Seite 7 ff bzw. 2/89 Seite 28 ff beschrieben wurde.

Eine solche Fermentationsanlage, mit der bisher verschiedene Pflan­ zenzellen kultiviert wurden, wie z.B. Echinacea purpurea, Rauwolfia serpentina und andere, gliedert sich in den sogenannten "Upstream- Prozeß", also die Nährlösungsvorbereitung mit kontinuierlicher Kurzzeitsterilisation, die eigentliche Fermenter-Kaskade, den Down­ stream-Prozeß, nämlich die Erntetechnik und die Suspensions-Aufar­ beitungstechnologie, und schließlich die Medien-Ver- und Entsorgung.

Die Fermenter-Kaskade besteht aus fünf Rührkesseln mit 0,075 m³, 0,75 m³, 7,50 m³, 15 m³ und 75 m³ Bruttovolumen. Mit Ausnahme des 15 m³-Behälters, der zur Überbrückung eines Störfalles dient, werden in jeder Vorstufe ca. 10% Impfmaterial ("Inokulum") für die nächste Stufe erzeugt. Dadurch läßt sich die Flexibilität der Anlage verbes­ sern, die für eine semikontinuierliche Betriebsführung konzipiert ist.

In dem Artikel 1/89 wird darauf hingewiesen, daß neben der üblichen meßtechnischen Ausstattung (Temperatur, pH-Wert, Druck, Sauerstoff­ partialdruck) Optionen zur Einbringung von weiteren Sensoren vorgese­ hen sind.

In dem Artikel 2/89 werden On-Line-Messungen sowie die regelmäßige Probenentnahme für die Off-Line-Analytik erwähnt. Es werden Frischge­ wicht, Trockengewicht, Brechungsindex, Osmclalität, Redox-Potential sowie in Einzelfällen die Ausbeute an Metaboliten bestimmt.

Wie bei jedem verfahrenstechnischen Prozeß stellt auch bei einer sol­ chen Fermentationsanlage die Analyse des Prozeßzustandes die Grundla­ ge von gezielten Stelleingriffen dar. Erst hierdurch werden Bedingun­ gen für eine optimale Produktausbeute im Bioreaktor, nämlich in jedem einzelnen Rührkessel, aber auch in der Gesamtanlage, geschaffen.

Dabei müssen auch die Besonderheiten einer sterilen Prozeßführung, wie sie hier erforderlich ist, berücksichtigt werden.

Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Prozeßführung mindestens eines Bioreaktors für pflanzliche Zellkultu­ ren der angegebenen Gattung zu schaffen, bei dem die oben erwähnten Bedingungen berücksichtigt werden. Insbesondere soll ein Prozeßfüh­ rungsverfahren vorgeschlagen werden, bei dem nur relativ wenige Pro­ zeßparameter erfaßt und geregelt werden müssen, um unter besonderer Berücksichtigung der erforderlichen Sterilität eine optimale Produkt­ ausbeute des Bioreaktors zu gewährleisten.

Dies wird erfindungsgemäß durch die im kennzeichnenden Teil des An­ spruchs 1 angegebenen Merkmale erreicht.

Zweckmäßige Ausführungsformen werden durch die Merkmale der Unteran­ sprüche definiert.

Die mit der Erfindung erzielten Vorteile beruhen auf einer besonders zweckmäßigen Auswahl der zu erfassenden Prozeßparameter einerseits und der zu regelnden Prozeßparameter andererseits; denn im Prinzip kommen sowohl für die Meßtechnik als auch für die Regeltechnik eine Vielzahl von Prozeßparametern in Frage, die nur mit einem unverhält­ nismäßig großen Aufwand berücksichtigt werden können.

Wählt man aus dieser großen Zahl eine geeignete Kombination von nur relativ wenigen Prozeßparametern aus, so läßt sich sowohl der meß­ technische als auch der regelungstechnische Aufwand wesentlich ver­ ringern.

Mißt man nämlich nur den Sauerstoffpartialdruck sowie die Leitfähig­ keit und den Brechungsindex der Nährlösung im Bioreaktor, und benutzt man die festgestellten Abweichungen von modellgestützt vorgegebenen Sollwerten zur optimalen Regelung von Stellgliedern für die Drehzahl des Rührwerkes, die Belüftungsrate, die Zufuhr an Nutrient und den Kopfdruck, so lassen sich mit relativ einfacher meß- und regeltech­ nischer Hardware sehr gute Ergebnisse erzielen.

Will man die Regelgenauigkeit noch weiter verfeinern, so kann das Trockengewicht der Biomasse und/oder ihre Trübung ermittelt und eben­ falls zur Regelung herangezogen werden.

Hierbei hat man die Wahl zwischen einer On-Line-Messung der Trübung oder einer Off-Line-Messung des Trockengewichtes der Biomasse; die beiden Meßwerte hängen voneinander ab, können also ineinander umge­ rechnet werden.

Mißt man außerdem noch den Kohlendioxid-Gehalt des Abgases, so kann man den Kohlendioxid-Gehalt einerseits und das Trockengewicht der Biomasse bzw. die Trübung andererseits zu einem integralen Maß für die vitale Biomasse im Bioreaktor miteinander verknüpfen und dadurch eine weitere Regelgröße gewinnen.

Selbstverständlich können auch bei dieser Prozeßführung noch weitere Parameter geregelt werden; beispielsweise kann die Schaumhöhe erfaßt und die Zuführung eines Antischaummittels entsprechend geregelt wer­ den. Auch eine Temperaturmessung und eine entsprechende Regelung durch Wärme- bzw. Kältezufuhr sind möglich.

Bei dieser Prozeßführung wurde auch berücksichtigt, daß der Messung von biologischen und produktspezifischen Parametern im Bioreaktor Grenzen gesetzt sind, da einerseits ein vertieftes Verständnis der Zellregulation noch weitgehend fehlt und andererseits robuste On-Line in Situ Meßsysteme für einen solchen Bioprozeß und seine Produktbil­ dung zum Teil erst in der Entwicklung sind.

Deshalb wurde auch weitgehend auf die Prozeßparameter abgestellt, die On-Line erfaßt werden können und für die bereits geeignete Sensoren zur Verfügung stehen. Dies gilt auch für die zu regelnden Prozeßparameter und ihre zugehörigen Stellglieder.

Bei Bedarf kann dieses Prozeßführungsverfahren noch während des Be­ triebs zur Erfassung weiterer Prozeßparameter bzw. Verwendung weite­ rer Regelgrößen ausgerüstet werden, um schließlich im Extremfall mit­ tels eines mathematischen Modells zur Beschreibung von Wachstum und Produktbildung eine vollautomatische Regelung zu ermöglichen. Die Verwendung eines solchen Modells während der Kultivierung muß unter Beachtung von verschiedenen Aspekten erfolgen, nämlich Anlagenopti­ mierung, Beobachtung und Filterung des Prozeßzustandes, Zustands-Prä­ diktion des weiteren Fermentationsverlaufs, optimale Bioreaktor-Pro­ zeßführung und schließlich die optimale Prozeßführung der aus mehre­ ren Bioreaktoren bestehenden Fermenter-Kaskade.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen un­ ter Bezugnahme auf die beiliegenden, schematischen Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 eine Prinzipdarstellung eines einzigen Fermenter-Rührkessels, bei dem die verschiedenen Materialströme einerseits und ei­ nige Prozeßparameter bzw. Regelgrößen andererseits angedeu­ tet sind,

Fig. 2 eine Prinzipdarstellung einer aus insgesamt fünf Fermenter- Rührkesseln bestehenden Fermentations-Kaskade mit dem zuge­ hörigen Prozeßleitsystem, und

Fig. 3 typische idealisierte Meßsignal-Verläufe für verschiedene Prozeßparameter.

Der aus Fig. 1 ersichtliche Fermenter wird durch einen Rührkessel ge­ bildet, der den üblichen, beispielsweise in den beiden oben angezoge­ nen Artikeln beschriebenen Aufbau einschließlich eines geeigneten Rührwerks hat. Diesem Fermenter werden verschiedene Materialströme zugeführt, nämlich steriles Nutrient, eine Nährlösung, die während der Zuführung kontinuierlich sterilisiert wird, was durch den Begriff "Kontisterilisation" angedeutet wird, der als Inokulum bezeichnete Impfstoff, die Prozeßluft, ein Antischaum-Mittel, mindestens eine Säure und mindestens eine Lauge.

Die produzierten Pflanzenzellen werden am unteren Ende des Fermenter- Rührkessels abgezogen, was durch den Begriff "Erntetransfer" angedeu­ tet ist. Außerdem ist in diesem Bereich eine Probenentnahme vorgese­ hen.

Die im Fermenter-Rührkessel gebildete Abluft wird am oberen Ende ab­ gezogen, und zwar über ein dort als "Aktor" bezeichnetes Stellglied. Dort ist auch ein zugehöriger Sensor angedeutet, der in diesem Fall den Kopfdruck des Fermenter-Rührkessels erfaßt.

Dieser Sensor und dieser Aktor stehen stellvertretend für eine noch zu erläuternde Reihe von Sensoren und Aktoren, die für dieses Prozeß­ führungsverfahren eingesetzt werden.

Fig. 2 zeigt schematisch den gesamten Aufbau der Fermentations-Kaska­ de, wie sie in den beiden oben angezogenen Artikeln aus "Bio Enginee­ ring" beschrieben wird, nämlich einmal die Fermentations-Kaskade selbst mit den fünf Rührkesseln, die Volumina von 0,075 m³, 0,75 m³ 7,5 m³, 15 m³ und 75 m³ haben. Der Rührkessel mit dem Volumen von 15 m³ dient als Sicherheitsstufe.

Durch die Pfeile sind die Materialströme zwischen den verschiedenen Rührkesseln angedeutet, wie sie auch in den Artikeln beschrieben wer­ den, auf die hiermit ausdrücklich verwiesen wird.

Das einen Prozeßrechner benutzende Prozeßleitsystem erfaßt die Signa­ le der verschiedenen Sensoren, die die Ist-Werte der zugehörigen Prozeßparameter in jedem einzelnen Rührkessel, aber auch der Gesamt­ anlage überwachen, und zwar entweder On-Line oder Off-Line, also durch die Analyse einer Stichprobe im Labor. Die Off-Line ermittelten Ergebnisse werden über den Eingabeterminal dem Prozeßleitsystem zuge­ führt.

Außerdem ist eine Prozeßleitstation vorgesehen, die diese Anlage be­ obachtet und bedient und wiederum von dem Prozeßleitsystem über alle wesentlichen Prozeßparameter, aber auch über eventuelle Störfälle, informiert wird.

Das Prozeßleitsystem regelt wiederum die verschiedenen Aktoren, also Stellglieder, die zur Regelung des Verfahrensablaufs in jedem einzel­ nen Fermenter-Rührkessel, aber auch in der Gesamtanlage erforderlich sind.

Im folgenden sollen zunächst die wesentlichen, bei diesem Prozeßfüh­ rungsverfahren benutzten Meßgrößen erörtert werden, bevor auf die einzelnen Stellgrößen eingegangen wird.

Wie bereits oben erwähnt wurde, sind die drei wichtigsten Meßgrößen der Partialdruck des Sauerstoffes in dem bzw. jedem Rührkessel sowie die Leitfähigkeit und der Brechungsindex der Nährlösung in dem bzw. jedem Rührkessel.

Bei einem aeroben Fermentationsprozeß wird Sauerstoff zur Atmung und somit zur Energiegewinnung für alle weiteren biochemischen Prozesse verbraucht. Die Menge des benötigten Sauerstoffs hängt von der vor­ handenen Biomasse einerseits und ihrer biochemischen Aktivität ande­ rerseits ab. Da sich Sauerstoff in wäßrigen Medien relativ schlecht löst, können bei hohen Biomasse-Konzentrationen, ungünstigen Durchmi­ schungsbedingungen sowie ungenügender Belüftung sehr rasch Mangel­ erscheinungen auftreten, die sogenannte "Sauerstofflimitierung", die einer rationellen Kulturführung entgegenstehen.

Die Messung des gelösten Sauerstoffes in der Nährlösung liefert des­ halb einen Anhaltspunkt für die Menge des den Zellen zur Verfügung stehenden "Substrats" Sauerstoff.

Bei konstantem, ausreichendem Sauerstoff-Eintrag zeigt der Partial­ druck des Sauerstoffes während der Fermentation von Pflanzenzellen einen zur Biomasse-Konzentration inversen Verlauf.

Da Mikroorganismen im allgemeinen eine erheblich größere Atmungsak­ tivität haben als pflanzliche Zellen, gibt der Verlauf der Konzentra­ tion des gelösten Sauerstoffs außerdem noch Hinweise auf mögliche Kontaminationen, die beispielsweise auf mangelhafte Sterilisation zu­ rückzuführen sind.

Als Meßsysteme für den Partialdruck des Sauerstoffes in einem Rühr­ kessel, nämlich in der Nährlösung, kommen überwiegend membrangestütz­ te, sterilisierbare amperometrische Elektroden (Clark-Elektroden) zur Verwendung.

Der am häufigsten auftretende Störfaktor dieses Sensors ist das soge­ nannte "Membran-Fouling", das auf Verschmutzung der verwendeten Mem­ branen im Langzeitbetrieb zurückzuführen ist. Dadurch können gering­ fügige Meßfehler entstehen, denen jedoch durch rechtzeitigen Aus­ tausch der Membran begegnet werden kann.

Fig. 3a zeigt einen typischen, idealisierten Verlauf des Meßsignals für den Sauerstoff-Partialdruck PO₂ einerseits und der Konzen­ tration X der Biomasse (auf Trockengewichtsbasis) bei der Fermenta­ tion von Pflanzenzellen andererseits.

Es läßt sich erkennen, daß der Sauerstoff-Partialdruck einen zur Kon­ zentration der Biomasse inversen Verlauf hat.

Die Leitfähigkeit ist eine einfache Meßgröße zur Bestimmung der Kon­ zentration salzartiger Substrate. Bei "normalen" vollsynthetischen Nährmedien, wie sie für Pflanzenzellkulturen eingesetzt werden, hängt die Leitfähigkeit nahezu ausschließlich von der Salzkonzentration im Medium ab. Eine für Pflanzenzellen übliche Nährlösung, z.B. das unter der Bezeichnung "MS-Medium" bekannte Nährmedium, weist eine Salzkon­ zentration von ca. 50 bis 55 mVal/l auf und hat eine Leitfähigkeit von 5,6 mS/cm. Diese Leitfähigkeit entspricht der einer 0,5% KNO₃ (50 mMol/l) Lösung allein.

Die Wasserstoffionen-Konzentration der Nährlösung beeinflußt somit die Leitfähigkeit nur in untergeordnetem Maße, solange der pH-Wert größer als 3 bleibt.

Zur On-Line-Messung der Leitfähigkeit wird eine Mehrelektrodensonde verwendet, da die zunehmende Biomasse im Fermenter bei herkömmlichen Leitfähigkeitsmeßzellen zu einer Änderung der Zellkonstanten führt.

Fig. 3b zeigt einen typischen Verlauf des Meßsignals für die Leitfähig­ keit L während eines Fermentationsablaufs.

Die Messung der optischen Dichte eines Mediums ist ein Verfahren zur Bestimmung des Brechungsindex, bei dem es sich um eine stoff-, tempera­ tur- und konzentrationsabhängige Größe handelt, die außerdem noch von der Meßwellenlänge abhängig ist.

Der Brechungsindex wird mit Refraktometern gemessen, wobei der Grenzwin­ kel der Totalreflektion eines Lichtstrahles beim Übergang von einem op­ tisch dichteren Medium in ein dünneres Medium bestimmt wird.

Da der Brechungsindex wäßriger Lösungen durch organische Bestandteile, beispielsweise Zucker, wesentlich stärker beeinflußt wird als durch äquimolare Salzanteile, kann der Brechungsindex der Nährlösungen von Pflanzenzellkulturen in erster Näherung als Maß für den Zuckergehalt der Kulturbrühe angesehen werden.

Ein meßtechnisches Problem beim On-Line-Einsatz handelsüblicher Refrak­ tometer bei der Fermentation liegt in der Verschmutzung des Meßfensters durch organische Beläge sowie in der Störung des Meßsignals durch Gas­ blasen. Hier müssen entsprechende Gegenmaßnahmen getroffen werden.

Fig. 3c zeigt einen typischen, idealisierten Verlauf des Meßsignals eines Sensors für den Brechungsindex n während einer Fermentation.

Auch in diese Kurvendarstellung ist die Änderung der Konzentration X der Biomasse mit der Zeit eingetragen. Auch hier ist zu erkennen, daß der Brechungsindex n einerseits und die Konzentration X der Biomasse andererseits einen inversen Verlauf haben.

Aus einer Verknüpfung der Ist-Werte für die drei Meßgrößen Sauer­ stoff-Partialdruck PO₂, Leitfähigkeit L und Brechungsindex n kann man Stellsignale für Aktoren für die Drehzahl des Rührwerkes in dem bzw. ei­ nem Rührkessel, für die Belüftungsrate, für die Zuführung des Nutrients bzw. für die Einstellung des Kopfdruckes in dem bzw. jedem Rührkessel gewinnen.

Zur Einstellung des Kopfdruckes im Rührkessel ist ein Abluftventil vor­ gesehen, das in Fig. 1 durch den Begriff "Aktor" angedeutet ist.

Zusätzlich können On-Line noch weitere Prozeßparameter erfaßt werden, nämlich der pH-Wert, das Redoxpotential, die Trübung, die Fluoreszenz, der Sauerstoffgehalt des Abgases und schließlich der CO₂-Gehalt des Abgases.

Der pH-Wert ist eine der ältesten und gebräuchlichsten Meß- und Regel­ größen in der Biotechnologie. Die meisten biologischen Prozesse laufen in pH-Wert-Bereichen zwischen 9 und 3 ab; eine Kultivierung von Pflan­ zenzellen ist im allgemeinen in pH-Werten zwischen 7,5 und 4 möglich. Nahezu jede Fermentation zeigt einen typischen Verlauf des pH-Wertes, so daß starke Abweichungen von diesem vorgegebenen Verlauf Indikatoren für Störungen im System sind, beispielsweise durch Kontaminationen, aber auch durch Autolyse u.ä.

Ein typischer Verlauf des pH-Wertes für die Fermentation von Pflanzen­ zellen ist in Fig. 3d, auch wieder in Verbindung mit der zeitlichen Än­ derung der Konzentration X der Biomasse, dargestellt.

Bei der Kultivierung von Pflanzenzellen wird die sterile Nährlösung bei Fermentationsbeginn im pH-Wert eingestellt; weitere Stelleingriffe sind meist nicht erforderlich.

Darüber hinaus laufen bestimmte Stoffwechsel-Vorgänge, z.B. Produktbil­ dung, Biokonversion usw. nur innerhalb wesentlich engerer pH-Wert-Gren­ zen, die durch die pH-Maxima der beteiligten Enzyme vorgegeben sind, op­ timal ab. Hier dient der pH-Wert zusätzlich als Sollwert für die pH-Re­ gelung zur Aufrechterhaltung eines angepaßten Milieus durch Säure- oder Laugedosierung.

Als Meßsonden für die kontinuierliche On-Line-Erfassung des pH-Wertes dienen kombinierte Glas- und Bezugselektroden (Einstabmeßketten) mit Flüssig- oder Fest-Elektrolyt-Füllung. Diese Meßfühler sind im allgemei­ nen robust, leicht zu eichen und problemlos zu handhaben.

Betriebsstörungen gehen oft auf Verschmutzung der Diaphragmen ("Fou­ ling") im Langzeitbetrieb zurück. Dadurch können Meßfehler bis zu 0,5 pH-Einheiten entstehen.

Die Messung des Redoxpotentials rH wird bei aeroben Fermentationen vor­ wiegend durch den Verlauf des pH-Wertes und des Sauerstoff-Partialdrucks PO₂ in der Fermenterbrühe bestimmt. Die Auswertung dieses Meßsignals liefert deshalb in der Regel keine zusätzlichen Informationen. Die für die Bestimmung des Redoxpotentials rH eingesetzten Elektroden haben je­ doch keinerlei Fouling-Probleme, so daß ihr Meßsignal eine gute Bewer­ tungshilfe für ungewöhnliche Signalverläufe bei Messungen des pH-Wertes und/oder des Sauerstoff-Partialdrucks PO₂ darstellen.

Die Messung der Trübung einer Fermenterbrühe dient zur Bestimmung der aktuellen Biomasse-Konzentration und erfolgt optisch mit einem Vier­ strahl-Wechsellicht-Photometer (Streulichtmessung) in Form einer Fer­ menter-Tauchsonde; diese Meßmethode ist auch für pflanzliche Zellkul­ turen unproblematisch, sofern das Medium selbst keine Feststoffe ent­ hält und ein Bewuchs der Sonde verhindert werden kann.

Fig. 3e zeigt den typischen Verlauf der Trübung T während der Fermentie­ rung.

Das gewonnene Meßsignal hängt von der räumlichen Ausdehnung und der Zahl der die Trübung verursachenden Teilchen in der Nährlösung ab und muß durch Eichung mit der Konzentration der Feucht- bzw. Trockenmasse an Biomasse korreliert werden. Im Normalfall einer Fermenterkultur gelingt dies recht gut; dabei muß nur beachtet werden, daß sich unter Umständen durch Ausbildung von verschieden geformten Zellaggregaten erhebliche Unterschiede zwischen einzelnen Kulturen bemerkbar machen können.

Unter der großen Zahl von Verbindungen mit Fluoreszenz-Eigenschaften sind für die Biotechnologie nur wenige von größerer Bedeutung, wobei wohl der wichtigste biogene Fluorophor die reduzierte Form des Nico­ tinamid-Adenin-Dinucleotids (NAD H) ist. NAD H kommt in allen leben­ den Zellen vor und hat im Stoffwechselgeschehen eine zentrale Rolle. Mit Hilfe einer Fluoreszenz-Sonde, eines sogenannten Mikrofluori­ meters, sind Aussagen über Mischzeiten, die Konzentration der Bio­ masse, die Versorgung mit Sauerstoff und Substrat, sowie Regulations­ phänomene möglich.

Das Meßssignal und seine Interpretierbarkeit sind allerdings um so besser, je homogener die zu messende Nährlösung ist.

Der Sauerstoffgehalt des Abgases O₂ (ab) stellt eine wichtige Kenn­ größe zur Bilanzierung des Gasstoffwechsels einer Kultur dar. Bei konstanter Begasungsrate nimmt im allgemeinen der Sauerstoffgehalt mit fortschreitendem Kulturalter aufgrund der Zunahme der Biomasse ab.

Am Verlauf der ausgetragenen Sauerstoff-Mengen lassen sich im Ver­ gleich mit der Begasungsrate und der jeweiligen Konzentration des gelösten Sauerstoffes Rückschlüsse auf die Effektivität des Gasein­ trages (Dispersionsverhalten) ziehen und mögliche Maßnahmen zur ver­ fahrenstechnischen Prozeßoptimierung (Kopfdruck, Drehzahl des Rüh­ rers, Belüftungsrate und Begasungssystem) einleiten.

Auch für den CO₂-Gehalt des Abgases CO₂ (ab) gilt prinzipiell das für den Sauerstoffgehalt des Abgases Gesagte. im Gegensatz zum Sauer­ stoffgehalt nimmt aber der CO₂-Gehalt des Abgases mit zunehmender Biomasse zu und kann deshalb auch als indirekte Meßmethode für vitale (atmende) Biomasse eingesetzt werden.

Da der CO₂-Gehalt der Zuluft sehr gering ist und je nach Gasdurch­ satz auf bis zu 5% des Abgases ansteigen kann, muß man davon aus­ gehen, daß praktisch die gesamte CO₂-Menge durch Atmung neu gebil­ det wird. Bei den üblichen pH-Werten einer Fermentation, nämlich im Bereich von 6 bis 4, läßt sich außerdem nicht von einer nennenswerten Konzentration des gelösten CO₂ ausgehen. Für physiologische Be­ trachtungen ist die CO₂-Konzentration des Abgases wichtiger als die Sauerstoff-Konzentration O₂, da der Meßwert nur von der Absolut­ menge des Abgases (Begasungsrate) und der aktuellen Zellatmungsakti­ vität abhängt.

Von den verschiedenen, in Frage kommenden Meßsystemen, nämlich Infra­ rotmessung, Gaschromatographie, Massenspektrometer und Wärmeleitfä­ higkeitsdetektor, stellt die Infrarotmessung die genaueste und im Vergleich auch am wenigstens störanfällige Methode dar.

Es muß allerdings für die Entfernung von Feuchtigkeit aus dem Meßgas gesorgt werden.

Alle oben für eine On-Line-Prozeß-Analytik erwähnten Meßgrößen müs­ sen, sofern dies möglich ist, zuvor, aber gebenenfalls auch bei laufendem Betrieb, anhand von gezogenen Stichproben im Labor über­ prüft werden.

Denn auch bei erfolgreichem Einsatz von On-Line-Sensoren empfiehlt es sich, die entsprechenden Meßgrößen auch weiterhin im Rahmen der nor­ malen Laborroutine mit zu untersuchen, da man auf diese Weise Erfah­ rungen bezüglich der Zuverlässigkeit der verwendeten On-Line-Systeme sammeln kann.

Zu den Meßgrößen, die parallel zum On-Line-Betrieb noch im Labor un­ tersucht werden sollten, gehören der pH-Wert, der Brechungsindex und die Leitfähigkeit.

Zu den weiteren Prozeßparametern, die regelmäßig anhand von Stichpro­ ben im Labor untersucht werden müssen, gehören das Frischgewicht der Biomasse, das Trockengewicht der Biomasse, die Osmolalität und der Polarisationswinkel α.

Das Frischgewicht der Biomasse wird durch Wägung nach der Fest/Flüs­ sigtrennung aus einer definierten, repräsentativen Probe ermittelt. Diese Untersuchung liefert direkte Ergebnisse in bezug auf das Wachs­ tumsverhalten und dient zur Kontrolle der indirekten On-Line-Bestim­ mung der Biomasse mittels Trübungssonde.

Da der Feuchtigkeitsgehalt von Pflanzenzellen in weiten Bereichen schwanken kann, nämlich im Extremfall zwischen 85% und 97%, ist für die Mehrzahl aller quantitativen Betrachtungen die Konzentration X der Biomasse auf Trockengewichtsbasis die wertvollere Kenngröße. Dar­ über hinaus läßt der Wassergehalt der Zellen bzw. der Trockengewichts­ anteil am Frischgewicht in einigen Fällen Rückschlüsse auf bestimmte physiologische Veränderungen der Pflanzenzellkultur zu.

Die Osmolalität Osm stellt ein Maß für die Zahl der gelösten Teil­ chen in einem Lösungsmittel dar. Die übliche Maßeinheit ist Mol/kg Lösungsmittel.

Die Osmolalität Osm ist eine integrale Meßgröße, d.h., es findet keine Unterscheidung nach der Art der Teilchen statt, sondern es wird ein Meßwert für alle vorhandenen Teilchen ermittelt.

Ein Spaltungs- oder Dissoziationsprozeß von Teilchen in einer Lösung führt zu einer Erhöhung der Gesamtteilchenzahl und somit zu einer Erhöhung der Osmolalität.

Ein typischer Verlauf des Wertes für die Osmolalität Osm während ei­ ner Fermentierung ist in Fig. 3f gezeigt.

Die Osmolalität der Nährlösung stellt im Zusammenhang mit der Leit­ fähigkeit und dem Brechungsindex eine wichtige Meßgröße für die Be­ stimmung des jeweiligen Substrat-Zustandes dar. Ein Anstieg der Osmo­ lalität am Kulturbeginn ist auf die Spaltung der Saccharose in Glucose und Fructose (Zuckerinversion) in der lag-Phase zurückzufüh­ ren.

Einige Lösungen chemischer Substanzen können bei der Durchstrahlung mit linear polarisiertem Licht die Ebene des polarisierten Lichtes drehen. Die Richtung und das Ausmaß der Drehung hängen von der Art der Lösung, von der Wellenlänge, sowie von der Konzentration der Lö­ sung ab.

Das wichtigste Einsatzgebiet für dieses Meßverfahren ist die Bestim­ mung von Zucker in einer Lösung. Bei der Spaltung des rechtsdrehenden Rohrzuckers in rechtsdrehende Glucose und linksdrehende Fructose än­ dert sich der Gesamtdrehwert der Nährlösung ("Inversion"). Je nach­ dem, in welchem Ausmaß die beiden gebildeten Monosaccharide von der Zellkultur verwertet werden, verändert sich im weiteren Kulturverlauf der optische Drehwert weiter und liefert damit Hinweise auf die Art der spezifischen Zuckeraufnahme durch die Kultur.

Fig. 3g zeigt die typische Änderung des Polarisationswinkels während der Fermentierung.

Neben diesen Meßgrößen können mit Hilfe eines Prozeßrechners weitere "Meßdaten" über den Zustand des Bioreaktors erzeugt werden. Denn für die modellgestützte Meßtechnik zur Prozeß-Überwachung und -Führung stellt die Theorie dynamischer Systeme mit dem Beobachter- und Fil­ ter-Prinzip geeignete Werkzeuge zur Verfügung. Größen, die einer direkten Messung nicht unmittelbar zugänglich sind, können so aus leicht meßbaren Größen gewonnen werden.

Aus diskontinuierlichen Meßdaten der Off-Line-Laboranalyse werden über eine Simulation weitere "On-Line-Meßdaten" gewonnen; gestörte, bzw. verrauschte Meßgrößen lassen sich idealisiert darstellen oder rekonstruieren.

Auf diese Weise erhält man sehr frühzeitig Hinweise auf Prozeßstö­ rungen, insbesondere, wenn mittels Simulation der weitere Fermen­ tationsverlauf als Prädiktion visualisiert werden soll.

Aus allen diesen Meßgrößen werden Regelgrößen für verschiedene Ak­ toren gewonnen, nämlich für das Rührwerk, für die Heizung/Kühlung, für die Begasung, für den Kopfdruck, für die Einstellung des pH- Wertes, für die Nachfütterung, für die Schaumunterdrückung, für die Reaktorlogistik und schließlich für die Kaskadenlogistik.

Das Rührwerk läßt sich mittels eines Aktors für die Regelung seiner Drehzahl beeinflussen.

Heizung/Kühlung erfolgt durch entsprechende Zuführung von Dampf- bzw. Kühlwasser zum Doppelmantel des bzw. jedes Fermenters.

Die Regelung der Begasung erfolgt durch Einstellung eines entspre­ chenden Ventils für die Prozeßluft, wobei entweder der gesamte Gas­ strom oder aber auch die Konzentration der einzelnen wesentlichen Komponenten des Gasstroms, nämlich Sauerstoff, CO₂ und Stickstoff, geregelt werden können.

Zur Regelung des Kopfdruckes dient ein Abluft-Ventil in dem bzw. jeden Fermenter (siehe auch den "Aktor" in Fig. 1).

Die Einstellung des pH-Wertes erfolgt über Vorlage-Ventile zur Do­ sierung der zugeführten Säuren bzw. Laugen.

Auch die Regelung der Nachfütterung erfolgt über eine Nutrient-Do­ sierung mittels Vorlage-Ventilen.

Schließlich wird auch die Schaumunterdrückung mittels eines Vorlage­ Ventils für die Zuführung des Antischaummittels geregelt.

Zur Regelung der Reaktorlogistik gehört das Einfüllen des Nutrients bzw. der Nährlösung, gegebenenfalls in Verbindung mit einer konti­ nuierlichen Sterilisation, die ebenfalls über Ventile geregelt wird, der Inokulum-Transfer und schließlich der Ernte-Transfer, jeweils geregelt über Ventile.

Die Regelung der übergeordneten Kaskaden-Logistik für den Verbund aus den hier vorgesehenen fünf Fermentern führt selbsttätig den Up-Stream-Prozeß, den Down-Stream-Prozeß einschließlich Erntetechnik und Suspensionsaufarbeitung sowie die Ver- und Entsorgung der verwen­ deten Medien.

Claims (10)

1. Verfahren zur Prozeßführung mindestens eines Bioreaktors für pflanzliche Zellkulturen, dem Inokulum, Nutrient bzw. Nährlösung sowie gegebenenfalls Chemikalien zugeführt und nach der Fermentation die pflanzlichen Zellkulturen entnommen werden, bei dem

• a) die Ist-Werte mehrerer Prozeß-Parameter ermittelt,
• b) diese Ist-Werte mit vorgegebenen Soll-Werten für diese Prozeßpa­ rameter verglichen und
• c) in Abhängigkeit vom Ergebnis dieses Vergleichs Aktoren für die Beeinflussung von Prozeßparametern verstellt werden, dadurch gekennzeichnet, daß
• d) der Sauerstoff-Partialdruck (PO₂), die Leitfähigkeit (L) und der Brechungsindex (n) der Mischung im Bioreaktor ermittelt werden, und daß
• e) in Abhängigkeit vom Ergebnis des Vergleichs zwischen diesen Ist- Werten und modellgestützt vorgegebenen Soll-Werten für diese Pro­ zeßparameter die Drehzahl des Rührwerks im Bioreaktor, die Belüf­ tungsrate, die Nutrient-Zufuhr und der Kopfdruck optimal einge­ stellt werden.

2. Prozeßführungsverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als weiterer Prozeßparameter das Trockengewicht der Biomasse ermittelt wird.

3. Prozeßführungsverfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Trockengewicht der Biomasse Off-Line, also anhand einer Stichprobe ermittelt wird.

4. Prozeßführungsverfahren nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Trockengewicht der Biomasse On-Line aus der Trübung der Mischung im Bioreaktor ermittelt wird.

5. Prozeßführungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der CO₂-Gehalt der Abluft des Bioreaktors er­ mittelt wird.

6. Prozeßführungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß aus dem Trockengewicht der Biomasse einerseits und dem CO₂-Gehalt der Abluft des Bioreaktors andererseits ein integrales Maß für die vitale Biomasse gebildet wird.

7. Prozeßführungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß als zusätzlicher Prozeßparameter noch mindestens eine der folgenden Meßgrößen ermittelt wird: pH-Wert, Redoxpotential (rH), Sauerstoffgehalt des Abgases, Frischgewicht der Biomasse, Osmo­ lalität, die Temperatur, die Schaumhöhe und der Polarisationswinkel.

8. Prozeßführungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich Aktoren für die Heizung/Kühlung, für die Einstellung des pH-Wertes durch entsprechende Dosierung von Säu­ ren oder Laugen, und für die Zuführung eines Antischaummittels ver­ wendet werden.

9. Prozeßführungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß Aktoren für die Reaktorlogistik einerseits und für die übergeordnete Kaskadenlogistik einer Fermenter-Kaskade an­ dererseits verwendet werden.

10. Prozeßführungsverfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß Aktoren für die Einfüllung der Nährlösung bzw. des Nutrients, für den Inokulum-Transfer und für den Ernte-Transfer verwendet werden.