CH669607A5

CH669607A5 -

Info

Publication number: CH669607A5
Application number: CH815/86A
Authority: CH
Inventors: Lee B Eppstein; Robert D Mohler; Shaul Reuveny
Original assignee: New Brunswick Scientific Co
Priority date: 1985-03-01
Filing date: 1986-02-28
Publication date: 1989-03-31
Also published as: US4680267A; GB2171818B; DE3606449A1; FR2578266A1; GB2171818A; GB8603087D0; DE3606449C2; JPH0779678B2; JPS61202684A; FR2578266B1

Description

BESCHREIBUNG Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf ein Steuerverfahren und eine Steuervorrichtung für einen Gewebekultur-Reaktor und insbesondere für einen Gewebekultur-Fermenter, welches gleichzeitig eine Steuerung des Gehaltes an aufgelöstem Sauerstoff (DO) und des pH eines Mediums in einem Fermentier-gefass ausübt, welches eine Gewebekultur-Fermentation enthält. Gefasse für die Gewebekultur-Fermentierung werden verwendet, um Zellen, die an Mikroträger gebunden sind, oder freie Suspensionszellkulturen in einem flüssigen Medium zu züchten, welches verschiedene zum Zellwachstum benötigte Komponenten enthält. Um die richtige Umgebung zu schaffen, damit die Gewebekulturzellen rasch und wirksam wachsen, sind verhältnismässig enge Bereiche an Konzentrationswerten für gewisse Materialien erforderlich. Diese Variablen umfassen die Acidität des umgebenden

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Mediums (pH), die Menge an gelöstem Sauerstoff (DO), sowie die Konzentration an anderen Materialien.

Das flüssige Kulturmedium wird mit einem Rührer, z.B. einem Magnetrührer, bewegt, um eine gleichmässige Verteilung der Materialien in der umgebenden Flüssigkeit aufrecht zu erhalten und zu versuchen, lokale Anreicherungen an Zellen und die Gegenwart von Konzentrationsgradienten, welche unerwünschte Wirkungen auf die Gewebekulturzellen erzeugen können, zu verhindern. Zellen höherer Organismen, welche in Mikroträgerkultu-ren wachsen, und freie Suspensionskulturen sind verhältnismässig stark physikalisch zerbrechlich, und daher ist nur ein Rühren mit niederer Geschwindigkeit möglich. Als Resultat davon kann ein beträchtliches Potential an schädlichen Konzentrationsgradienten auftreten, wo flüssige Säuren oder Basen in das Fermentationsge-fass eingeführt werden. Dies macht eine Regulierung des pH auf andere Weise als durch Zusatz von Flüssigkeiten äusserst wünschenswert, wo dies möglich ist.

Wenn ein Gewebekultur-Fermentationsverfahren im Gange ist, verändert sich im allgemeinen der Bedarf an Sauerstoff und das benötigte pH der Gewebekultur. Als Resultat davon besteht ein Bedürfnis, den Zufluss von Materialien in das Fermentations-gefass in verschiedenen Stufen des Fermentationsverfahrens anzupassen, um die Gewebekulturzellen in einer optimalen Wachstumsumgebung zu halten. Ausser der Aufrechterhaltung der Umgebungsbedingungen innerhalb annehmbarer Werte, ist eine Konsistenz der Werte erwünscht.

Es wurde festgestellt, dass die Gewebekulturzellen nicht nur auf die in der umgebenden Flüssigkeit vorhandenen Umgebungsbedingungen ansprechen, sondern auch auf Veränderungen der Umgebungsbedingungen des flüssigen Mediums. Die Gewebe-kultuizellen wachsen daher oft besser in einer weniger gespannten Umgebung, in welcher rasche Änderungen in der Umgebung verhindert werden. Aus diesem Grunde sind rasche und wiederholte Änderungen in den Umgebungsbedingungen zu vermeiden.

Zwei wichtige Umgebungsbedingungen in einem Gewebekul-tur-Fermenter sind die Menge an gelöstem Sauerstoff, welche in dem flüssigen Medium vorhanden ist, und das pH des flüssigen Mediums. Bisher haben Steuersysteme fur Gewebekultur-Fermenter den Spiegel an gelöstem Sauerstoff (DO) und das pH im Fermentiergefass unabhängig voneinander überwacht und gesteuert. Die unabhängige Steuerung dieser Variablen neigt jedoch dazu, sprunghafte und gespannte Änderungen in der Umgebung der Gewebekultur zu ergeben.

Insbesondere wenn eine ungenügende Menge an gelöstem Sauerstoff im flüssigen Medium vorhanden ist, wird dem Medium zusätzlicher Sauerstoff zugefugt. Dies hat die Wirkung, C02 aus dem Medium auszutreiben, was wiederum das pH des Mediums erhöht (das flüssige Medium wird stärker basisch). Als Resultat davon hat sich nun das pH von dem gewünschten Wert entfernt, und zusätzliches C02 wird eingeführt, um das pH herabzusetzen (Zunahme der Acidität). Wenn jedoch C02 zum flüssigen Medium zugesetzt wird, bewirkt es, dass gelöster Sauerstoff aus dem Medium ausgetrieben wird, was wiederum den Zusatz von Sauerstoff zum flüssigen Medium nötig macht. Dieser Zyklus arbeitet unkontrolliert, und die Menge an gelöstem Sauerstoff in der Flüssigkeit und das pH der Flüssigkeit neigen dazu, einander zu folgen unter Erzeugung einer gespannten Umgebung für die Gewebekultur.

Es besteht daher ein Bedürfnis für ein Steuersystem, um gleichzeitige Regulierung der Menge an gelöstem Sauerstoff und des pH der flüssigen Umgebung der Gewebekultur in einer Weise zu erzielen, welche Fluctuationen in den Konzentrationen des gelösten Sauerstoffes und des pH zu verhindern, welche eine gespannte Umgebung fur die Gewebekulturen erzeugen.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf eine Vorrichtung zur Steuerung des gelösten Sauerstoffes und des pH eines Kulturmediums während eines biologischen Verfahrens, wie einer Fermentation, in einem Gefass. Ein Sensor für gelösten Sauerstoff erzeugt ein Signal entsprechend dem Gehalt an gelöstem Sauerstoff im Medium. Ein pH-Sensor erzeugt ein Signal entsprechend dem pH des Mediums. Ein Ventilglied bringt wahlweise Luft, N2, 02 und C02 in das, Fermentiermedium. Ein Steuergerät erzeugt ein Steuersignal zur Steuerung des Betriebs des Ventilmechanismus, so dass ein im wesentlichen feststehendes Volumen an Gas, bestehend aus einem oder mehreren der Gase Luft, C02, N2 und 02, während einer Zeitdauer zu dem Medium zugesetzt wird. Das Steuergerät bestimmt in Abhängigkeit mit dem Signal für gelösten Sauerstoff und pH, die Menge an C02, 02 und/oder N2, welche benötigt wird, um die Korrektur des gelösten Sauerstoffge-haltes und des pH zu erzielen. Das Steuergerät reguliert diese bestimmten Werte, um den Verlust an Luft als Folge von C02-Zusatz zu kompensieren, so dass die Wirkung der C02-Korrektur auf den gelösten Sauerstoffgehalt im wesentlichen auf ein Minimum herabgesetzt wird.

Das erfindungsgemässe Verfahren und die Vorrichtung zu dessen Durchfuhrung sind in den Patentansprüchen 1 und 13 definiert. Besondere Ausfuhrungsformen sind in den abhängigen Ansprüchen festgehalten.

Die Erfindung umfasst somit die verschiedenen Stufen und das Verhältnis von einer oder mehrerer solcher Stufen in bezug auf jede der anderen, und die Konstruktionsmerkmale der Vorrichtung, Kombinationen von Elementen und Anordnungen von Teilen, welche zur Durchführung solcher Stufen angepasst sind, alle wie in der folgenden Beschreibung exemplifiziert, und der Schutzumfang der Erfindung ist in den Ansprüchen angeführt.

Zum besseren Verständnis der Erfindung wird auf die folgende Beschreibung Bezug genommen, welche zusammen mit den beiliegenden Zeichnungen zu betrachten ist, in welchen:

Fig. 1 einen Aufriss eines Gewebekultur-Fermentiersystems, welches ein Steuersystem umfasst, welches gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ausgeführt ist,

Fig. 2 ein Blockdiagramm der funktionellen Elemente in einem Gewebekultur-Fermentersystem, das gemäss der Erfindung konstruiert wurde,

Fig. 3 ein Blockdiagramm eines Gassteuersystems, wie es in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung verwendet wird, und

Fig. 4 ein Flussdiagramm des Betriebs eines Gewebekultur-Fermenter-Steuersystems, das gemäss der Erfindung konstruiert wurde, darstellt.

In Fig. 1 ist ein Gewebekultur-Zellfermentationssystem 10 dargestellt, welches ein Steuersystem entsprechend der Erfindung enthält. Das Fermentationssystem 10 umfasst ein Fermentations-gefass 20, welches eine Gewebekultur und ein flüssiges Medium 22 enthält. Das Gefäss 20 ist mit einem magnetisch angetriebenen Rührsystem 24 versehen, welches drehbar auf dem Deckel 25 angebracht ist, um das Medium und die Zellkultur 22 im Gefass 20 in Bewegung zu halten. Eine pH-Sonde 26 erstreckt sich in das Gefass 20 durch den Deckel 25 und wird dadurch gehalten. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die pH-Sonde 26 unter Anwendung der Glaselektroden-Technologie ausgeführt. Die pH-Sonde 26 kann jedoch von beliebigem Typus sein, solange sie nicht mit dem Medium oder der Zellkultur innerhalb des Fermentationsgefâsses 20 reagiert. Eine Sonde 28 für gelösten Sauerstoff (DO) erstreckt sich ebenfalls in das Fermentiergefass 20 durch den Deckel 25 und wird dadurch gehalten. Dieser DO-Sensor 28 kann ein DO-Sensor vom galvanischen oder polarographischen Typus sein. In einer bevorzugten Ausfuhrungsform ist die DO-Sonde 28 eine Sonde vom galvanischen Typus, welche ein Minivoltsignal erzeugt, das direkt proportional zur Sauerstoff-Diffusionsgeschwindigkeit durch dessen Membran ist. Ein Gaseinlass 30 für das Fermentiergefass 20 ist durch die Antriebswelle 29 des Rührsystems 24 vorgesehen, welche derart ausgestaltet ist, dass die zugesetzten Gase zum Medium in der Nähe des Bodens des Rührsystems in solcher Weise zugeführt werden, dass eine Auflösung der Gase in der Flüssigkeit im

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wesentlichen ohne übermässiges Schäumen erzeugt wird. Es kann jedoch jedes gewünschte Gaseinfuhrsystem verwendet werden. Ein Eintrittsrohr 31 für Alkali erstreckt sich ebenfalls durch den Deckel 25 in das Gefass 20, um eine basische Lösung oder eine andere Flüssigkeit in das Medium 22 einzuführen, wenn dies erforderlich ist.

Das Fermentiergefass 20 ruht auf einer Unterlage 32, welche ihrerseits auf einem Hauptsockel 34 ruht. Das Gefass wird unterstützt durch ein Heiz-/Trägerglied 33. Der Hauptsockel 34 ist mit einem Stromschalter 36 versehen und umfasst einen Mikroprozessor 60 (Flg. 2).

Eine Anzeigekonsole 38 ist auf einem Ständer 40 an der Spitze des Hauptsockels 34 angebracht. Die Anzeigekonsole 38 umfasst eine Digitalanzeige 42 zur Angabe von Temperatur- und Bewegungswerten. Zusätzlich zu verschiedenen weiteren Anzeigen ist ein Strömungsmesser 44 an der Vorderseite der Anzeigekonsole 38 angebracht. Der Hauptsockel 34 ruht auf einem Instrumentsockel 46, welcher eine Digitalanzeige 48 zur Anzeige der Menge an gelöstem Sauerstoff und des pH-Wertes des Mediums 22 enthält. Der Instrumentsockel 46 weist ferner eine Reihe von Schaltern 50, 52 und 54 zur manuellen Anpassung der Sollwerte der gesteuerten Variablen auf. Die elektrische Verbindung zwischen den Sensoren, wie der pH-Sonde 26 und der DO-Sonde 28, und dem Hauptsockel ist vorhanden (nicht dargestellt).

In Fig. 2 sind die Elemente des Steuersystems dargestellt. Das Steuersystem umfasst einen Mikroprozessor 60, welcher eine zentrale Datenverarbeitungseinheit sowie Speicherkomponenten einschliesslich einem RAM und einem ROM (oder einem EPROM oder EEPROM) aufweist, um die Sollwerte, die Kalibrierungsinformation, die Programme, die Daten und Rechnungsresultate zu speichern. Der Mikroprozessor 60 erhält Eingaben von der pH-Sonde 26 durch einen pH-Signal-Konditionierer 62 und von einer DO-Sonde 28 durch einen DO-Signal-Konditionierer 64.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wandeln der pH-Konditionierer 62 und der SO-Signal-Konditionierer 64 das von der Sonde 26 bzw. der DO-Sonde 28 erhaltene elektrische Analogsignal in ein Frequenzsignal um durch Verwendung eines Opto-Kopplers, um eine elektrische Isolation der pH-und DO-Signale voneinander und vom Mikroprozessor zu erzielen. Anschliessend werden die Frequenzsignale, welche das pH des Mediums und den DO anzeigen, in den Mikroprozessor 60 eingegeben. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Frequenzeingaben in Multiplexweise einem einzigen Port im Mikroprozessor 60 zugeführt. Es können jedoch auch getrennte Eingangsports verwendet werden.

Der Mikroprozessor 60 erhält ferner Benützereingaben von den Reglern 66 an der Frontplatte, welche die Schalter 50, 52 und 54 zur Einstellung der Sollwerte des pH und des DO-Gehaltes umfasst.

Der Mikroprozessor 60 gibt Signale aus an die Frontplattenanzeige 68, welche unter anderem einen Frontplattenanzeiger-Flussmesser 44 und digitale DO- und pH-Anzeige 48 enthält. Der Mikroprozessor 60 gibt die in dem Mikroprozessor 60 aufgezeichneten Daten, welche den Umgebungszustand des Mediums und der Zellkulturen im Fermentiergefass 20 während der Zeit, in welcher die Fermentation läuft, anzeigen, an den Analog-Recor-der 70 für Ausgabe-Informationen. Dieser Analog-Recorder 70 erlaubt es einem Benützer des Fermentiersystems, die Umgebungsbedingungen des Fermentationsverfahrens oder anderer Bioreaktionen während des ganzen Verfahrens, welches sich oft über eine Dauer von Tagen oder mehreren Wochen erstreckt, zu analysieren. Auf diese Weise kann die Wiederholbarkeit einer gewünschten Reaktion durch Übernahme der Umgebungsmerkmale eines erfolgreichen Verfahrens erzielt werden.

Ausserdem steuert der Mikroprozessor 60 den Betrieb der Gassteuerventile 72. Die Gassteuerventile 72 sind an Quellen von Luft, gasförmigem Stickstoff (N2), gasförmigem Sauerstoff (02) und gasförmigem Kohlendioxid (C02) angeschlossen. Der Ausgang der Gassteuerventile 72 ist mit dem Gaseinlass 30 für die Einfuhrung der Gase in das Fermentiergefass 20 gekoppelt.

In Fig. 3 ist die Art und Weise dargestellt, in welcher die Gassteuerventile 72 den Fluss von Gasen in das Fermentiergefass 20 steuern. Der Mikroprozessor 60 gibt mit der Zeit variable Signale ab, welche die Zeitdauer angeben, während welcher der Fluss der gewählten Gase stattzufinden hat. In einer bevorzugten Ausführungsform gibt jedoch der Mikroprozessor 60 nicht direkt ein Luftsignal ab. Sondern, wenn der Mikroprozessor 60 angibt, dass kein N2, 02 oder C02 in den Gaseinlass 30 fliessen soll, wird Luft gewählt. Dies kann mit einer Reihe von Invertern 77 und einer UND-Schaltung 78 implementiert werden. Die Gase werden aus einer Quelle für N2 73, einer Quelle für 02 74, einer Quelle für C02 75 und einer Quelle für Luft 76 zugeführt. Die Gasaustrittsventile 72 sind an den Gaseinlass 30 angeschlossen und in das Fermentiergefass 20 eingeführt.

In Fig. 4 ist sodann der Zyklus dargestellt, welcher vom Mikroprozessor 60 verfolgt wird bei der Ausführung der Steuerung des Fermentiersystems. Der Mikroprozessor 60 liest die Fronttafelschalter im Block 120 und liest dann die pH- und DO-Werte in Block 140. Als nächstes wird im Block 160 der laufende Wert und/oder der Sollwert der verschiedenen Variablen auf einem der Bildschirme der Fronttafel angezeigt und an den Analog-Recorder 70 ausgegeben. Die Steuerausgaben werden dann im Block 180 berechnet, welcher den entsprechenden Gasfluss in das Fermentiergefass 20 verursacht. Schliesslich werden die erhaltenen Daten in einem Reservespeicher in Stufe 200 gespeichert und der Zyklus wiederholt sich wiederum, beginnend bei Block 120.

Die vorliegende Erfindung ermöglicht das Herabsetzen der gegenseitigen Beeinflussung der unabhängigen Ausgaben der DO- und pH-Steuergeräte auf ein Minimum, welche dazu neigen, einander entgegenzuwirken und zu verhältnismässig grossen Variationen im Zustand des Zellkulturverfahrens führen, zum Nachteil des Verfahrens. Die gegenseitige Beeinflussung wird auf ein Minimum herabgesetzt durch Verwendung der Ausgaben der DO- und pH-Steuergeräte als Eingabe für ein Gasflusssteuergerät. Die pH-Sonde 6 zusammen mit dem pH-Signalkonditionie-rer 62 und die DO-Sonde 26 zusammen mit dem DO-Signalkon-ditionierer 64 wirken als DO- bzw. pH-Steuergerät. In dieser Ausführungsform wirkt der Mikroprozessor 60 als Gasflusssteuergerät, welches seine Gasflussentscheidungen durch Aussenden von Signalen zum Gassteuerventil 72 zur Durchführung bringt.

Der Mikroprozessor 60 übt verschiedene Funktionen aus, um als Gasflusssteuergerät zu wirken. Erstens erzeugt er positive Ausgaben ® N2 und O 02, welche Funktionen des laufenden Fehlers und aller früherer Fehler in DO (mit Ausnahme gewisser weiter unten beschriebener Fälle) sind. Zusätzlich erzeugt der Mikroprozessor 60 kontinuierliche positive Ausgaben ® C02 und (DAli& welche Funktionen des laufenden Fehlers und aller vorheriger Fehler im pH sind.

Die verschiedenen «^»-Funktionen werden aus zwei Ausdrücken berechnet (die Berechnung ist weiter unten beschrieben): Ein Ausdruck ist ein dem gegenwärtigen Fehler proportionaler Ausdruck und der andere Ausdruck ist abhängig von einer Integration der gegenwärtig im Verfahren vorhandenen Fehler von Beginn bis zur Gegenwart. Der Fehler wird definiert als die Differenz zwischen den laufenden Wert einer Variablen und dessen Sollwert. Der Sollwert wird von einer Bedienungsperson durch Verwendung der Frontplatten-Steuergeräte 66 eingestellt. Der Sollwert kann im Laufe des Fermentationsverfahrens durch den Verwender angepasst werden. Er bleibt jedoch gleich bis er derart verändert wird. Die «®»-Variable wird wie folgt berechnet:

<5 = KcS + Kc(tm/t)XG

«Kc» ist eine Skalierungskonstante, welche verwendet wird, um den Wert «®» aufgrund der Kapazität des Mediums und der

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Länge des Gaszyklus anzupassen, «e» stellt den Fehler dar, welcher gleich ist der Differenz zwischen dem laufenden Wert und dem Sollwert. «tm» ist eine Systemkonstante, welche repräsentativ ist fur die Zeit zwischen Messungen des Fehlers. In einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung, in welcher die Zyklusdauer 2 Sekunden beträgt, ist tm gleich 1 Sekunde. Dies fuhrt dazu, dass die Umkehrungen asynchron zum Verfahren sind, wodurch die Verzögerung zwischen der Messung und der korrigierenden Wirkung auf etwa 1 Sekunde herabgesetzt wird, «t» ist die Zeitkonstante für den integrierten Ausdruck. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Kc, tm und t vorgewählt und sind für den Verwender nicht zugänglich. In einer anderen Ausführungsform können sie jedoch durch den Verwender verändert werden. «Es» ist die Summe der Irrtümer, welche im Laufe der Zeit, während welcher das Verfahren im Gang war, gemessen wurde.

Als Resultat haben die Funktionen «1>» beide einen proportionalen Ausdruck und einen integrierten Ausdruck, welche versuchen, sich dem laufenden Bedarf des Systems für die besondere variable Eingabe zu nähern. Es bestehen jedoch gewisse Einschränkungen für die Berechnung von <£, wie es durch die obige Gleichung definiert wurde. Wenn die Summe des proportionalen und integrierten Ausdrucks zu gross ist, wie dies auftreten kann, wenn das Verfahren weit vom Soll-Wert entfernt begonnen wird, kommen vorbestimmte Grenzen für 3) zur Einwirkung, und die Integration wird unterbrochen, um die Durchführung grosser Korrekturen zu verhindern, wo dies eine Destabilisierung des Verfahrens hervorrufen könnte. Ausserdem weist der proportionale Ausdruck einen Maximalwert für jede Variable auf, und wenn der proportionale Ausdruck diesen Wert überschreitet, wird ® auf diesen oberen Wert beschränkt und der Integrationsausdruck auf Null zurückgesetzt. Der Zweck des oberen Wertes des proportionalen Ausdrucks besteht darin, eine Überkompensation und gefahrlich hohe Einlassgradienten zu verhindern, welche die Gewebekulturzellen besonders stressen.

Unter solchen Umständen wartet das Steuerschema, bis das Gewebekulturverfahren näher an dem Sollwert ist und erst dann setzt das oben beschriebene Steuersystem ein, wie wenn das Verfahren eben erst angefangen hätte.

Ausserdem erzeugt der Mikroprozessor 60 proportional zur Zeit Ausgaben tLuft5 tN2, to2 und tCo2> welche den Gasfluss in den Reaktor steuern. Das Gasflusssteuergerät arbeitet auf der Basis eines Zyklus, während welchem zwei Phasen auftreten. Während einer Phase wird Luft in das Fermentiergefass 20 eingeführt und während der anderen Phase des Zyklus wird eines oder mehrere der Gase N2, C02 und 02 in spezifischen Volumen zum Fermen-tationsgefass 20 zugesetzt. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt tZykius zwei Sekunden. Die Zyklusdauer kann variiert werden je nach der Geschwindigkeit, mit welcher das Fermentationsverfahren oder andere Bioreaktionen fortschreiten, der zur Verfugung stehenden Rechenleistung und Speicherkapazität und dem gewünschten Grad an Steuerung.

Wie oben erwähnt sind d>N2, ®02, ®co2 und ®alk positive kontinuierliche Ausgaben, welche Funktionen des laufenden Fehlers und eine Schätzung des Bedarfs für jene Variable aufgrund der Erfahrung dieser Variablen sind. Nur einer der Werte <DN2 und ®02 wird positiv und nur einer der Werte ®Co2 und ®Alk positiv sein. Diese positiven Ausgaben werden verwendet, um die relative Menge von jedem der Gase während jedem Zyklus zu steuern. Das Volumen an Gas, welches während eines Zyklus in das Fermentationsgefass 20 eingeführt wird, ist im wesentlichen konstant innerhalb der physikalischen Grenzen der Gasventile 72. Als Folge davon wird die folgende Gleichung verwendet, um die Menge an jedem der Gaseingaben in das Fermentiergefass im Laufe eines Zyklus auszudrücken:

tzvklus = tLuft + tN2 + to2 + tC02

W ist die Zeit während des Zyklus, in welcher Luft in das Fermentationsgefäss eingeführt wird. Die relativen Werte von tLufi, t02, tco2 und tN2 werden wie folgt bestimmt: Wenn ®02 grösser als Null ist, so gilt:

*02 = <J)02 + 0,25 ®co2;

tco2 = ®co2 und

TN2 = 0.

Daraus folgt in diesem Fall tzyidus = W + to2 + W In diesem Fall jedoch, wenn <I>co2 gleich Null ist, so gilt:

t(;o2 = 0 und tzykhis = tLuft + to2-

Wenn <DN2 grösser als Null ist, wird die berechnete Variable Z (Z = <t>N2 — *Sco2) verwendet.

Wenn <I>N2 grösser als Null und Z grösser als oder gleich Null ist, so gilt:

to2 = 0;

tco2 — ®co2 und

*n2-

Daraus folgt in diesem Fall tZyklus = tLuft + tN2 + tco2-Wenn ®N2 grösser als Null ist und Z weniger als Null, so gilt:

to2 = — 0,25 Z;

tco2 = ®co2 und tN2 = 0.

Daraus folgt in diesem Fall tZyWus = tLuft + t02 + tC02-In den vorstehenden Fällen wird die Wirkung des zur pH-Korrektur erforderlichen C02 auf die Do-Korrektur, die Änderung der Menge von dem System in der Luft oder auf andere Weise zugesetzten 02 infolge des Zusatzes von C02, kompensiert. Das System kompensiert daher die Menge an Luft, welche durch das C02 verdrängt wurde durch Zusatz von Luft (reduziert N2) oder Zusatz von Sauerstoff, wobei N2 und C02 gleichermassen als inerte Gase für diese Zwecke betrachtet werden.

Die Endlage ist derart, dass, wenn ®N2 und ®02 gleich Null sind, gilt:

to2 = tN2 = 0 und tc02 = $002-

In diesem Fall ist daher tZyHus = tLurt + tC02.

In diesem Fall ist keine Kompensation des Zusatzes von C02 notwendig, weil DO auf dem Sollwert steht.

Verschiedene Beispiele werden nun beschrieben, um die obigen Beispiele zu illustrieren. Wenn die Menge an C02, welche als Resultat des pH-Spiegels erforedrlich ist, 200 ms beträgt (0Co2), so beläuft sich die Menge an Sauerstoff, welche als Resultat des DO-Spiegels erforderlich ist, auf 100 ms ($02)- Das Steuergerät berechnet die «t»-Variablen wie folgt:

tco2 = 200 ms und to2 =150 ms.

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Die durch das C02 (200 ms) verdrängte Luft wird hierbei durch Zusatz von zusätzlichen 50 ms O2 kompensiert. Es ist zu beachten, dass Luft im wesentlichen aus 80% N2 und 20% 02 besteht, und dass für die Zwecke der DO-Korrektur, C02 als inertes Gas betrachtet werden kann.

Ein zweites Beispiel ist dasjenige, in welchem das pH-Steuer-gerät 100 ms C02 fordert und das DO-Steuergerät 250 ms N2 fordert. In diesem Fall gilt tco2 = 100 ms und tN2 = 150 ms (®N2 -®co2)- Der N2 wird durch das DO-Steuergerät zugesetzt, um die Menge an dem anstelle von Sauerstoff zugesetzten inerten Gas zu erhöhen, und für die Zwecke des DO-Steuergerätes ist es nicht wichtig, ob die 250 ms an inertem Gas ganz aus N2 oder aus einer Kombination von N2 und C02 besteht. Durch Anspassung der Mengenverhältnisse an inertem Gas zwischen N2 und C02 im vorliegenden Fall können die Erfordernisse sowohl der DO-Steuerung wie der pH-Steuerung erfüllt werden.

Das dritte Beispiel betrifft den Fall, in welchem das pH-Steuergerät 100 ms C02 und das DO-Steuergerät 50 ms N2 anfordern. In diesem Fall gilt tco2 = 100, tN2 = 0 und to2 = ®02 + 0,25 (<t>co2 - ®N2)- In diesem Fall fordert das DO-Steuergerät nur 50 ms an inertem Gas, aber das pH-Steuergerät fordert 100 ms C02 (und inertes Gas in bezug auf das DO-Steuergerät). Weitere 50 ms inertes C02 werden daher zugesetzt, welche den Sauerstoff verdrängen, welcher zu den 50 ms verdrängter Luft zugesetzt worden wären. Zusätzliche 12,5 ms 02 werden daher zugesetzt, um den Sauerstoff in der Luft zu ersetzen, was durch das C02 verhindert wird.

Als Resultat dieser Berechnungen werden die jeweiligen Zeitabschnitte, während welcher die verschiedenen Gase in das Fermentiergefass eingeführt werden, gesteuert.

Wenn die Zellen wachsen und 02 verbrauchen, wobei Säure in gleicher Geschwindigkeit erzeugt wird wie diejenige, mit welcher der Gasfluss C02 aus dem Medium austreibt, die Zellen jedoch mehr Sauerstoff benötigen, so wird der Fall gewählt, in welchem nur Luft und Sauerstoff während tzykius zugesetzt werden. Dies ist kein stabiler Zustand und tritt nur gelegentlich wenn überhaupt während des Fermentationsverfahrens auf. Zu Beginn des Zellwachstums andererseits, wenn die Luft genau dem Sauerstoffbedarf entspricht, aber die Zellen noch nicht genügend Säure erzeugen und das Kohlenstoffdioxid zu rasch erschöpft wird, besteht tZykius nur aus dem Zusatz von Luft und Kolenstoffdioxid.

Diese zwei Bedingungen können auch mit Hilfe eines Gasflusssteuergerätes reguliert werden, welche unabhängig voneinander den Fluss der Gase in das Fermentiergefass steuern, um pH und DO zu steuern. Diese Situationen treten jedoch nur für einen beschränkten Teil der Reaktionszeit auf, und während der wesentlichen Teile der Reaktion, wenn diese Bedingungen nicht erfüllt sind, würde ein Gasflusssteuergerät, welches pH und DO unabhängig steuert, die ständige Fluctuation der Umgebungsbedingungen infolge der durch den Zusatz von 02 oder C02 hervorgerufenen gegenseitigen Beeinflussung bewirken.

Der Mikroprozessor 60 kann nach Bestimmung der Werte von to2, tco2 und tN2 den Wert ti^ aufgrund des bekannten kon-5 stanten Wertes von tZykiUs für jede vorbestimmte Zykluszeit berechnen. Nachdem alle vier Gaszeiten berechnet sind, können die entsprechenden Signale an das Gassteuerventil 72 gesandt werden, um eine entsprechende Menge der verschiedenen Gase in das Fermentiergefass 20 einzuführen. In der Ausführungsform gemäss 10 Fig. 3 ist diese Luftberechnung jedoch unnötig, weil das System in Abwesenheit eines Instrumentes zur Zufuhr von 02, N2 oder C02 keine Luft benötigt.

Das Gasflusssteuergerät wird in einer bevorzugten Ausführungsform als Software im Zusammenhang mit dem Mikroprozes-15 sor 60 implementiert. Die Software ist in einem Nur-Lese-Speicher-Chip (ROM, PROM, EPROM oder EEPROM) implementiert. Die Software kann jedoch unter Verwendung eines Magnetblasenspeichers oder jeden anderen Typs von nichtflüchtigem Speichermedium realisiert werden.

20 Die Gassteuerventile 72 sind in einer bevorzugten Ausfüh-rungsform als Solenoid-Ventile ausgebildet. Eines dieser Sole-noid-Ventile ist ein Dreiwegventil, welches einen einzigen Auslass zwischen einem «Luft»- oder einem «Gemisch»-Fluss umschaltet. Die anderen drei Ventile steuern die N2-, 02- und C02-Quellen in 25 die Gemischabgabe des Dreiwegventils.

Der Benützer kann auch wählen, das Fermentationssystem aus dem Steuerungsmodus zu entfernen, in welchem die Gasflüsse gesteuert werden, und das Fermentationssystem zu einem zweiten Modus überzuführen, in welchem nur Luft in das Fer-30 mentiergefäss eingeführt wird.

Die vorliegende Erfindung wurde unter Bezugnahme auf ein Fermentationsverfahren für ein Gewebekulturmedium beschrieben. Das Steuergerät ist jedoch ebenso anwendbar für ein Hohlfaserverfahren und ein Verfahren, in welchem eine mit Glasperlen 35 beschickte Säule verwendet wird. Alle diese Verfahren können als Bioreaktionen oder biologische Verfahren betrachtet werden.

Demzufolge wird ein pH-DO-Steuersystem, welches besonders angepasst ist für eine Gewebekultur-Fermentationsverfahren, beschafft, welches dazu dient, unstabile Veränderungen in pH 10 und DO während einer Fermentationsreaktion zu verhindern durch Koppelung der Steuerung dieser beiden Variablen.

Es ist somit ersichtlich, dass die oben erwähnten Ziele wie auch die aus der obigen Beschreibung ersichtlichen wirksam erreicht werden und, da verschiedene Änderungen bei der Durch-43 führung des obigen Verfahrens und den beschriebenen Apparaturen durchgeführt werden können, ohne den Geltungsbereich der Erfindung zu verlassen, sind alle Angaben in der obigen Beschreibung und die aus den Zeichnungen ersichtlichen Details nur als Beispiele und nicht in einschränkendem Sinne zu interpretieren.

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3 Blatt Zeichnungen

Claims

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PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Steuerung des Gehaltes an gelöstem Sauerstoff und des pH-Wertes eines Mediums während eines biologischen Verfahrens in einem Gefass, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert des Mediums und der Gehalt an gelöstem Sauerstoff des Mediums festgestellt wird, ein Gemisch von Luft, N2, 02 und CO2 ausgewählt wird, welches in das Medium in einer Zeitdauer einzuführen ist, indem man die Mengen an C02, 02 und/oder N2 bestimmt, welche erforderlich sind, um die Korrekturen der Menge an gelöstem Sauerstoff und des pH-Wertes aufgrund der im Medium festgestellten Werte von gelöstem Sauerstoff und pH zu erzielen, und das Gemisch von Luft, N2, 02 und C02 berechnet, um den Verlust an Luft infolge des zugesetzten C02 zu kompensieren, indem man N2 zusetzt, wenn der N2-Bedarf grösser ist als der C02-Bedarf, und 02 zusetzt, wenn der Bedarf an N2 geringer ist als die erforderliche Menge C02, wodurch die Wirkung der C02-Korrektur auf den Gehalt an gelöstem Sauerstoff weitgehend auf ein Minimum herabgesetzt wird.
2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren ein Fermentationsverfahren ist und das Medium ein Fermentationsmedium ist.
3. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Kompensation durch Zusatz von N2 erfolgt, wenn der Bedarf an N2 grösser ist als der Bedarf an C02, wobei der Zusatz an N2 in einer Menge erfolgt, welche im wesentlichen gleich ist der Menge an erforderlichem N2 minus der Menge an erforderlichem C02, und zusätzliches 02 zugesetzt wird, wenn die Menge an erforderlichem N2 geringer ist als die Menge an erforderlichem C02, und zwar in einer Menge, welche gleich ist einem Viertel der Differenz zwischen dem Bedarf an N2 und an C02.
4. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zeitdauer in einen ersten Abschnitt und einen zweiten Abschnitt unterteilt wird, derart, dass während des ersten Abschnittes Lufit zu dem Medium zugesetzt wird und während des zweiten Abschnittes Mengen an Gasen ausgewählt aus N2, 02 und CO2 zum Medium zugesetzt werden.
5. Verfahren nach Patentanspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass Luft zu dem Medium zugesetzt wird, sofern nicht ein Bedarf besteht, eines oder mehrere der Gase N2, 02 und C02 zuzusetzen.
6. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Auswahl des Gemisches von Luft, N2, 02 und C02 die Fehlerberechnung für pH und gelösten Sauerstoff aufgrund von mindestens einem der vorhandenen pH- und gelösten Sauerstofffehlern bzw. Erfahrungsfehlern im Laufe des Verfahrens umfasst, wobei die Differenz zwischen den Sollwerten an gelöstem Sauerstoff und pH und bestimmten Werten an gelöstem Sauerstoff und pH die jeweiligen Fehler darstellen; sowie die Berechnung der benötigten Zusätze zum Medium zwecks Korrektur des pH-Wertes und der Menge an gelöstem Sauerstoff aufgrund der Fehler für pH und gelösten Sauerstoff erfolgt.
7. Verfahren nach Patentanspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Fehlerberechnung durch Summierung eines dem laufenden Fehler proportionalen Wertes und eines mit dem vorhandenen Fehler und/oder der Summe von mindestens einem Teil der früher im Verfahren aufgetretenen Fehler verbundenen Wertes erfolgt.
8. Verfahren nach Patentanspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Fehler für pH und gelösten Sauerstoff jeweilige Grenzwerte aufweisen, welche sie nicht überschreiten können.
9. Verfahren nach Patentanspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der von der Summe der Erfahrungsfehler im Laufe des Fermentationsverfahrens abhängige Ausdruck aufhört, den laufenden Fehler einzuschliessen, wenn die Summe von zwei Ausdrücken einen bestimmten Grenzwert überschreitet.
10. Verfahren nach Patentanspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der von der Summe der Fehler im Laufe des Verfahrens abhängige Ausdruck auf Null gesetzt wird, wenn der dem laufenden Fehler proportionale Ausdruck den Grenzwert überschreitet.
11. Verfahren nach Patentanspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der von der Summe der Fehler im Laufe des Verfahrens abhängige Ausdruck auf Null gesetzt wird, wenn der im laufenden Fehler proportionale Ausdruck den Grenzwert überschreitet.
12. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Medium ein Gewebekulturmedium ist.
13. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Patentansprüche 1 bis 12, gekennzeichnet durch: pH-Senso-ren zur Erzeugung eines vom pH des Mediums abhängigen Signals; Sensoren für gelösten Sauerstoff zur Erzeugung eines vom Gehalt an gelöstem Sauerstoff im Medium abhängigen Signals; Ventile zur selektiven Zuführung von Luft, N2, 02 und C02 in das Medium, und Steuergeräte zur Erzeugung eines Signals zur Steuerung des Betriebes der Ventile, um ein im wesentlichen festgesetztes Volumen an Gas bestehend aus einem oder mehreren der Gase Luft, C02, N2 und 02 dem Medium zuzusetzen, wobei diese Steuergeräte entsprechend den Signalen für gelösten Sauerstoff und pH die Menge an C02, 02 und/oder N2 bestimmen, welche erforderlich ist, um die Korrektur des Gehaltes an gelöstem Sauerstoff und des pH-Wertes zu bewirken und die bestimmten Werte anzupassen, um den Verlust an Luft infolge des zugesetzten C02 zu kompensieren, um damit die Wirkung der C02-Korrektur auf den Gehalt an gelöstem Sauerstoff im wesentlichen auf ein Minimum herabzusetzen.
14. Vorrichtung nach Patentanspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Sensor eine Gaselektroden-pH-Sonde ist.
15. Vorrichtung nach Patentanspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Sensor für gelösten Sauerstoff ein galvanischer Sensor für gelösten Sauerstoff ist.
16. Vorrichtung nach Patentanspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Steuervorrichtung als Mikroprozessor ausgebildet ist.
17. Vorrichtung nach Patentanspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass sie ausserdem an der Frontplatte mit Anzeigevorrichtungen zur Anzeige der Werte für gelösten Sauerstoff und pH ausgerüstet ist.
18. Vorrichtung nach Patentanspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass sie ausserdem Analog-Aufnahmegeräte enthält zur Aufzeichnung des Standes des biologischen Verfahrens, wobei der Stand des Verfahrens die Werte des gelösten Sauerstoffes, des pH, ihrer Sollwerte und eines Abfalls des im wesentlichen festgesetzten Gasvolumens, welches in der Zeitdauer an das Medium abgegeben wird, umfasst.
19. Vorrichtung nach Patentanspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass sie Ventile zur selektiven Auswahl aus den Zufuhrventilen für Luft, 02, C02 und N2 umfassen.
20. Vorrichtung nach Patentanspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass sie ausserdem Benützer-Eingabegeräte enthält zur Regulierung von Sollwerten.