DE3606449C2

DE3606449C2 - Fermenter-Steuersystem

Info

Publication number: DE3606449C2
Application number: DE3606449A
Authority: DE
Inventors: Lee B Eppstein; Robert D Mohler; Shaul Reuveny
Original assignee: New Brunswick Scientific Co Inc
Current assignee: New Brunswick Scientific Co Inc
Priority date: 1985-03-01
Filing date: 1986-02-27
Publication date: 1996-02-08
Anticipated expiration: 2006-02-28
Also published as: US4680267A; GB2171818B; JPH0779678B2; JPS61202684A; GB8603087D0; GB2171818A; FR2578266A1; FR2578266B1; DE3606449A1; CH669607A5

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren nach den Oberbegriffen der Ansprüche 1 bzw. 14, zur Steuerung insbesondere eines Gewebekultur- Fermenters, welche gleichzeitig eine Steuerung des Gehaltes an aufgelöstem Sauerstoff (DO) und des pH eines Mediums in einem Fermentiergefäß ausübt, welches eine Gewebekultur-Fermentation enthält. Gefäße für die Gewebekultur-Fermentierung werden verwendet, um Zellen, die an Mikroträger gebunden sind, oder freie Suspensionszellkulturen in einem flüssigen Medium zu züchten, welches verschiedene zum Zellwachstum benötigte Komponenten enthält. Um die richtige Umgebung zu schaffen, damit die Gewebekulturzellen rasch und wirksam wachsen, sind verhältnismäßig enge Bereiche an Konzentrationswerten für gewisse Materialien erforderlich. Diese Variablen umfassen die Acidität des umgebenden Mediums (pH), die Menge an gelöstem Sauerstoff (DO), sowie die Konzentration an anderen Materialien.

Das flüssige Kulturmedium wird mit einem Rührer, z. B. einem Magnetrührer, bewegt, um eine gleichmäßige Verteilung der Materialien in der umgebenden Flüssigkeit aufrechtzuerhalten und zu versuchen, lokale Anreicherungen an Zellen und die Gegenwart von Konzentrationsgradienten, welche unerwünschte Wirkungen auf die Gewebekulturzellen erzeugen können, zu verhindern. Zellen höherer Organismen, welche in Mikroträgerkulturen wachsen, und freie Suspensionskulturen sind verhältnismäßig stark physikalisch zerbrechlich, und daher ist nur ein Rühren mit niederer Geschwindigkeit möglich. Als Resultat davon kann ein beträchtliches Potential an schädlichen Konzentrationsgradienten auftreten, wo flüssige Säuren oder Basen in das Fermentationsgefäß eingeführt werden. Dies macht eine Regulierung des pH auf andere Weise als durch Zusatz von Flüssigkeiten äußerst wünschenswert, wo dies möglich ist.

Wenn ein Gewebekultur-Fermentationsverfahren im Gange ist, verändert sich im allgemeinen der Bedarf an Sauerstoff und das benötigte pH der Gewebekultur. Als Resultat davon besteht ein Bedürfnis, den Zufluß von Materialien in das Fermentationsgefäß in verschiedenen Stufen des Fermentationsverfahrens anzupassen, um die Gewebekulturzellen in einer optimalen Wachstumsumgebung zu halten. Außer der Aufrechterhaltung der Umgebungsbedingungen innerhalb annehmbarer Werte, ist eine Konsistenz der Werte erwünscht.

Es wurde festgestellt, daß die Gewebekulturzellen nicht nur auf die in der umgebenden Flüssigkeit vorhandenen Umgebungsbedingungen ansprechen, sondern auch auf Veränderungen der Umgebungsbedingungen des flüssigen Mediums. Die Gewebekulturzellen wachsen daher oft besser in einer weniger gespannten Umgebung, in welcher rasche Änderungen in der Umgebung verhindert werden. Aus diesem Grunde sind rasche und wiederholte Änderungen in den Umgebungsbedingungen zu vermeiden.

Zwei wichtige Umgebungsbedingungen in einem Gewebekultur-Fermenter sind die Menge an gelöstem Sauerstoff, welche in dem flüssigen Medium vorhanden ist, und der pH des flüssigen Mediums. Bisher haben Steuersysteme für Gewebekultur-Fermenter den Spiegel an gelöstem Sauerstoff (DO) und den pH im Fermentiergefäß unabhängig voneinander überwacht und gesteuert. Die unabhängige Steuerung dieser Variablen neigt jedoch dazu, sprunghafte und gespannte Änderungen in der Umgebung der Gewebekultur zu ergeben.

Insbesondere wenn eine ungenügende Menge an gelöstem Sauerstoff im flüssigen Medium vorhanden ist, wird dem Medium zusätzlicher Sauerstoff zugefügt. Dies hat die Wirkung, CO₂ aus dem Medium auszutreiben, was wiederum den pH des Mediums erhöht (das flüssige Medium wird stärker basisch). Als Resultat davon hat sich nun der pH von dem gewünschten Wert entfernt, zusätzliches CO₂ wird eingeführt, um den pH herabzusetzen (Zunahme der Acidität). Wenn jedoch CO₂ zum flüssigen Medium zugesetzt wird, bewirkt es, daß gelöster Sauerstoff aus dem Medium ausgetrieben wird, was wiederum den Zusatz von Sauerstoff zum flüssigen Medium nötig macht. Dieser Zyklus arbeitet unkontrolliert, und die Menge an gelöstem Sauerstoff in der Flüssigkeit und der pH der Flüssigkeit neigen dazu, einander zu folgen unter Erzeugung einer gestreßten Umgebung für die Gewebekultur.

Es besteht daher ein Bedürfnis für ein Steuersystem, um gleichzeitige Regulierung der Menge an gelöstem Sauerstoff und des pH der flüssigen Umgebung der Gewebekultur in einer Weise zu erzielen, welche Fluctuationen in den Konzentrationen des gelösten Sauerstoffes und des pH zu verhindern, welche eine gestreßte Umgebung für die Gewebekulturen erzeugen.

Aus der nachveröffentlichten EP 147 975 sind eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Züchtung von Tierzellen in einem Medium bekannt. Hierbei werden dem Medium Luft, N₂, O₂ und CO₂ gleichzeitig mit jeweils veränderlichen Flußraten, jedoch konstanter Gesamtgasflußrate zugeführt, um den pH- und den O₂-Gehalt in dem Medium zu korrigieren.

Es ist Ziel der vorliegenden Erfindung, eine verbesserte Steuerung eines Mediums während eines biologischen Verfahrens bereitzustellen, welche die genannten Nachteile vermeidet.

Dieses Ziel wird durch eine Vorrichtung und ein Verfahren mit den Merkmalen der Ansprüche 1 bzw. 14 erreicht.

Der Sensor für gelösten Sauerstoff erzeugt ein Signal entsprechend dem Gehalt an gelöstem Sauerstoff im Medium. Der pH-Sensor erzeugt ein Signal entsprechend dem pH des Mediums. Die Ventileinrichtung bringt wahlweise Luft, N₂, O₂ und CO₂ in das Fermentiermedium. Die Steueranordnung erzeugt ein Steuersignal zur Steuerung des Betriebs des Ventilmechanismus, so daß ein im wesentlichen feststehendes Volumen an Gas, bestehend aus einem oder mehreren der Gase Luft, CO₂, N₂ und O₂, während einer Zeitdauer zu dem Medium zugesetzt wird. Die Steueranordnung bestimmt in Abhängigkeit mit dem Signal für gelösten Sauerstoff und pH, die Menge an CO₂, O₂ und/oder N₂, welche benötigt wird, um die Korrektur des gelösten Sauerstoffgehaltes und des pH zu erzielen. Die Steueranordnung reguliert diese bestimmten Werte, um den Verlust an Luft als Folge von CO₂-Zusatz zu kompensieren, so daß die Wirkung der CO₂-Korrektur auf den gelösten Sauerstoffgehalt im wesentlichen auf ein Minimum herabgesetzt wird.

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Schaffung einer verbesserten Steuerung für Gewebekultur- Fermenter, welche den Bedarf für konstante und radikale Infusionen von gelöstem Sauerstoff und Kohlenstoffdioxid zur Aufrechterhaltung der Umgebung innerhalb der vorgeschriebenen Grenzen herabsetzt.

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Schaffung einer Steuerung, welche gleichzeitig die Menge an gelöstem Sauerstoff und den pH in einem Bioreaktor steuert.

Noch ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Schaffung einer Steuerung für pH und gelösten Sauerstoff für einen Gewebekultur-Fermenter, welche eine zeitlich dimensionierte Steuerung des Flusses von Luft, N₂, O₂ und CO₂ verwendet, um den pH und die Menge an gelöstem Sauerstoff innerhalb enger Wertbereiche zu halten.

Noch ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Schaffung einer Steuerung für Kultur-Fermenter, welche die gegenseitige Beeinflussung der unabhängigen Ausgaben des Steuergerätes für gelösten Sauerstoff und pH herabgesetzt, um die streßfördernden Änderungen für das Medium auf ein Minimum herabzusetzen.

Noch weitere Ziele und Vorteile der Erfindung sind aus der Beschreibung ersichtlich.

Die Erfindung umfaßt somit die verschiedenen Stufen und das Verhältnis von einer oder mehrerer solcher Stufen in bezug auf jede der anderen, und die Konstruktionsmerkmale der Vorrichtung, Kombinationen von Elementen und Anordnungen von Teilen, welche zur Durchführung solcher Stufen angepaßt sind, alle wie in der folgenden Beschreibung exemplifiziert, und der Schutzumfang der Erfindung ist in den Ansprüchen angeführt.

Zum besseren Verständnis der Erfindung wird auf die folgende Beschreibung Bezug genommen, welche zusammen mit den beiliegenden Zeichnungen zu betrachten ist, in welchen:

Fig. 1 einen Aufriß eines Gewebekultur-Fermentiersystems, welches ein Steuersystem umfaßt, welches gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ausgeführt ist,

Fig. 2 ein Blockdiagramm der funktionellen Elemente in einem Gewebekultur-Fermentersystem, das gemäß der Erfindung konstruiert wurde,

Fig. 3 ein Blockdiagramm eines Gassteuersystems, wie es in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung verwendet wird, und

Fig. 4 ein Flußdiagramm des Betriebs eines Gewebekultur-Fermenter-Steuersystems, das gemäß der Erfindung konstruiert wurde, darstellt.

In Fig. 1 ist ein Gewebekultur-Zellfermentationssystem 10 dargestellt, welches ein Steuersystem entsprechend der Erfindung enthält. Das Fermentationssystem 10 umfaßt ein Fermentationsgefäß 20, welches eine Gewebekultur und ein flüssiges Medium 22 enthält.

Das Gefäß 20 ist mit einem magnetisch angetriebenen Rührsystem 24 versehen, welches drehbar auf dem Deckel 25 angebracht ist, um das Medium und die Zellkultur 22 im Gefäß 20 in Bewegung zu halten. Eine pH-Sonde 26 erstreckt sich in das Gefäß 20 durch den Deckel 25 und wird dadurch gehalten. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die pH-Sonde 26 unter Anwendung der Glaselektroden- Technologie ausgeführt. Die pH-Sonde 26 kann jedoch von beliebigem Typus sein, solange sie nicht mit dem Medium oder der Zellkultur innerhalb des Fermentationsgefäßes 20 reagiert. Eine Sonde 28 für gelösten Sauerstoff (DO) erstreckt sich ebenfalls in das Fermentiergefäß 20 durch den Deckel 25 und wird dadurch gehalten. Dieser DO-Sensor 28 kann ein DO-Sensor vom galvanischen oder polarographischen Typus sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die DO-Sonde 28 eine Sonde vom galvanischen Typus, welche ein Millivolt-Signal erzeugt, das direkt proportional zur Sauerstoff-Diffusionsgeschwindigkeit durch dessen Membran ist. Ein Gaseinlaß 30 für das Fermentiergefäß 20 ist durch die Antriebswelle 29 des Rührsystems 24 vorgesehen, welche derart ausgestaltet ist, daß die zugesetzten Gase zum Medium in der Nähe des Bodens des Rührsystems in solcher Weise zugeführt werden, daß eine Auflösung der Gase in der Flüssigkeit im wesentlichen ohne übermäßiges Schäumen erzeugt wird.

Es kann jedoch jedes gewünschte Gaseinführungssystem verwendet werden. Ein Eintrittsrohr 31 für Alkali erstreckt sich ebenfalls durch den Deckel 25 in das Gefäß 20, um eine basische Lösung oder eine andere Flüssigkeit in das Medium 22 einzuführen, wenn dies erforderlich ist.

Das Fermentiergefäß 20 ruht auf einer Unterlage 32, welche ihrerseits auf einem Hauptsockel 34 ruht. Das Gefäß wird unterstützt durch ein Heiz-/Trägerglied 33. Der Hauptsockel 34 ist mit einem Stromschalter 36 versehen und umfaßt einen Mikroprozessor 60 (Fig. 2).

Eine Anzeigekonsole 38 ist auf einem Ständer 40 an der Spitze des Hauptsockels 34 angebracht. Die Anzeigekonsole 38 umfaßt eine Digitalanzeige 42 zur Angabe von Temperatur- und Bewegungswerten. Zusätzlich zu verschiedenen weiteren Anzeigen ist ein Strömungsmesser 44 an der Vordersetie der Anzeigekonsole 38 angebracht. Der Hauptsockel 34 ruht auf einem Instrumentsockel 46, welcher eine Digitalanzeige 48 zur Anzeige der Menge an gelöstem Sauerstoff und des pH-Wertes des Mediums 22 enthält. Der Instrumentsockel 46 weist ferner eine Reihe von Schaltern 50, 52 und 54 zur manuellen Anpassung der Sollwerte der gesteuerten Variablen auf. Die elektrische Verbindung zwischen den Sensoren, wie der pH-Sonde 26 und der DO-Sonde 28, und dem Hauptsockel ist vorhanden (nicht dargestellt).

In Fig. 2 sind die Elemente des Steuersystems dargestellt. Das Steuersystem umfaßt einen Mikroprozessor 60, welcher eine zentrale Datenverarbeitungseinheit sowie Speicherkomponenten einschließlich einem RAM und einem ROM (oder einem EPROM oder EEPROM) aufweist, um die Sollwerte, die Kalibrierungsinformation, die Programme, die Daten und Rechnungsresultate zu speichern. Der Mikroprozessor 60 erhält Eingaben von der pH- Sonde 26 durch einen pH-Signal-Konditionierer 62 und von einer DO-Sonde 28 durch einen DO-Signal-Konditionierer 64.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wandeln der pH-Konditionierer 62 und der DO-Signal- Konditionierer 64 das von der Sonde 26 bzw. der DO-Sonde 28 erhaltene elektrische Analogsignal in ein Frequenzsignal um durch Verwendung eines Opto-Kopplers, um eine elektrische Isolation der pH- und DO-Signale voneinander und vom Mikroprozessor zu erzielen. Anschließend werden die Frequenzsignale, welche den pH des Mediums und den DO anzeigen, in den Mikroprozessor 60 eingegeben. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Frequenzeingaben in Multiplexweise, einem einzigen Port des Mikroprozessors 60 zugeführt. Es können jedoch auch getrennte Eingangsports verwendet werden.

Der Mikroprozessor 60 erhält ferner Benützereingaben von den Steuerungen 66 an der Frontplatte, welche die Schalter 50, 52 und 54 zur Einstellung der Sollwerte des pH und des DO-Gehaltes umfassen.

Der Mikroprozessor 60 gibt Signale ab an die Frontplattenanzeige 68, welche unter anderem einen Frontplattenanzeiger- Flußmesser 44 und eine digitale DO- und pH- Anzeige 48 enthält. Der Mikroprozessor 60 gibt die von dem Mikroprozessor 60 aufgezeichneten Daten, welche den Umgebungszustand des Mediums und der Zellkulturen im Fermentiergefäß 20 während der Zeit, in welcher die Fermentation läuft, anzeigen, an die Analog-Recorder- Ausgabe 70. Diese Analog-Recorder-Ausgabe 70 erlaubt es einem Benützer des Fermentiersystems, die Umgebungsbedingungen des Fermentationsverfahrens oder anderer Bioreaktionen während des ganzen Verfahrens, welches sich oft über eine Dauer von Tagen oder mehreren Wochen erstreckt, zu analysieren. Auf diese Weise kann die Wiederholbarkeit einer gewünschten Reaktion durch Übernahme der Umgebungs-Merkmale eines erfolgreichen Verfahrens erzielt werden.

Außerdem steuert der Mikroprozessor 60 den Betrieb der Gassteuerventile 72. Die Gassteuerventile 72 sind an Quellen von Luft, gasförmigem Stickstoff (N₂), gasförmigem Sauerstoff (O₂) und gasförmigem Kohlendioxid (CO₂) angechlossen. Der Ausgang der Gassteuerventile 72 ist mit dem Gaseinlaß 30 für die Einführung der Gase in das Fermentiergefäß 20 gekoppelt.

In Fig. 3 ist die Art und Weise dargestellt, in welcher die Gassteuerventile 72 den Fluß von Gasen in das Fermentiergefäß 20 steuern. Der Mikroprozessor 60 gibt mit der Zeit variable Signale ab, welche die Zeitdauer angeben, während welcher der Fluß der gewählten Gase stattzufinden hat. In einer bevorzugten Ausführungsform gibt jedoch der Mikroprozessor 60 nicht direkt ein Luftsignal ab. Sondern, wenn der Mikroprozessor 60 angibt, daß kein N₂, O₂ oder CO₂ in den Gaseinlaß 30 fließen soll, wird Luft gewählt. Dies kann mit einer Reihe von Invertern 77 und einer UND-Schaltung 78 implementiert werden. Die Gase werden aus einer Quelle für N₂ 73, einer Quelle für O₂ 74, einer Quelle für CO₂ 75 und einer Quelle für Luft 76 zugeführt. Die Gasaustrittsventile 72 sind an den Gaseinlaß 30 angeschlossen und in das Fermentiergefäß 20 eingeführt.

In Fig. 4 ist sodann der Zyklus dargestellt, welcher vom Mikroprozessor 60 verfolgt wird bei der Ausführung der Steuerung des Fermentiersystems. Der Mikroprozessor 60 liest die Fronttafelschalter im Block 120 und liest dann die pH- und DO-Werte in Block 140. Als nächstes wird im Block 160 der laufende Wert und/oder der Soll-Wert der verschiedenen Variablen auf einer der Anzeigen der Fronttafel angezeigt und an den Analog- Recorder-Ausgang 70 gegeben. Die Steuer-Ausgaben werden dann in Block 180 berechnet, welcher den entsprechenden Gasfluß in das Fermentiergefäß 20 verursacht. Schließlich werden die erhaltenen Daten in einem Reservespeicher in Stufe 200 gespeichert und der Zyklus wiederholt sich wiederum, beginnend bei Block 120.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Herabsetzen der gegenseitigen Beeinflussung der unabhängigen Ausgaben der DO- und pH-Steuerungen auf ein Minimum, welche dazu neigen, einander entgegenzuwirken und zu verhältnismäßig großen Variationen im Zustand des Zellkulturverfahrens führen, zum Nachteil des Verfahrens. Die gegenseitige Beeinflussung wird auf ein Minimum herabgesetzt durch Verwendung der Ausgaben der DO- und pH-Steuerungen als Eingabe für eine Gasfluß- Steueranordnung. Die pH-Sonde 6 zusammen mit dem pH-Signalkonditionierer 62 und die DO-Sonde 26 zusammen mit dem DO-Signalkonditionierer 64 wirken als DO- bzw. pH- Steuergerät. In dieser Ausführungsform wirkt der Mikroprozessor 60 als Gasfluß-Steueranordnung, welche ihre Gasflußentscheidungen durch Aussenden von Signalen zum Gassteuerventil 72 zur Durchführung bringt.

Der Mikroprozessor 60 übt verschiedene Funktionen aus, um als Gasfluß-Steueranordnung zu wirken. Erstens erzeugt er positive Ausgaben Φ N₂ und Φ O₂, welche Funktionen des laufenden Fehlers und aller früherer Fehler in DO (mit Ausnahme gewisser weiter unten beschriebener Fälle) sind. Zusätzlich erzeugt der Mikroprozessor 60 kontinuierliche positive Ausgaben Φ CO₂ und Φ_ALK, welche Funktionen des laufenden Fehlers und aller vorheriger Fehler im pH sind.

Die verschiedenen "Φ"-Funktionen werden aus zwei Ausdrücken berechnet (die Berechnung ist weiter unten beschrieben): Ein Ausdruck ist ein dem gegenwärtigen Fehler proportionaler Ausdruck und der andere Ausdruck ist abhängig von einer Integration der gegenwärtig im Verfahren vorhandenen Fehler von Beginn bis zur Gegenwart. Der Fehler wird definiert als die Differenz zwischen dem laufenden Wert einer Variablen und dessen Soll-Wert. Der Soll-Wert wird von einer Bedienungsperson durch Verwendung der Frontplatten-Steuerungen 66 eingestellt. Der Soll-Wert kann im Laufe des Fermentationsverfahrens durch den Verwender angepaßt werden. Er bleibt jedoch gleich, bis er derart verändert wird. Die "Φ"-Variable wird wie folgt berechnet:

Φ=K_cε+K_c(t_m/τ)ΣG

"K_c" ist eine Skalierungskonstante, welche verwendet wird, um den Wert "Φ" aufgrund der Kapazität des Mediums und der Länge des Gaszyklus anzupassen. "ε" stellt den Fehler dar, welcher gleich ist der Differenz zwischen dem laufenden Wert und dem Soll-Wert. "t_m" ist eine Systemkonstante, welche repräsentativ ist für die Zeit zwischen Messungen des Fehlers. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, in welcher die Zyklusdauer 2 Sekunden beträgt, ist t_m gleich 1 Sekunde. Dies führt dazu, daß die Umkehrungen asynchron zu Verfahren sind, wodurch die Verzögerung zwischen der Messung und der korrigierenden Wirkung auf etwa 1 Sekunde herbgesetzt wird. "τ" ist die Zeitkonstante für den integrierten Ausdruck. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden K_c, t_m und τ vorgewählt und sind für den Verwender nicht zugänglich. In einer anderen Ausführungsform können sie jedoch durch den Verwender verändert werden. "Σε" ist die Summe der Fehler, welche im Laufe der Zeit, während das Verfahren im Gang war, gemesen wurde.

Als Resultat haben die Funktionen "Φ" beide einen proportionalen Ausdruck und einen integrierten Ausdruck, welche versuchen, sich dem laufenden Bedarf des Systems für die besondere variable Eingabe zu nähern. Es bestehen jedoch gewisse Einschränkungen für die Berechnung von Φ wie es durch die obige Gleichung definiert wurde. Wenn die Summe des proportionalen und integrierten Ausdrucks zu groß ist, wie dies auftreten kann, wenn das Verfahren weit vom Soll-Wert entfernt begonnen wird, kommen vorbestimmte Grenzen für Φ zur Einwirkung, und die Integration wird unterbrochen, um die Durchführung großer Korrekturen zu verhindern, wo dies eine Destabilisierung des Verfahrens hervorrufen könnte. Außerdem weist der proportionale Ausdruck einen Maximalwert für jede Variable auf, und wenn der proportionale Ausdruck diesen Wert überschreitet, wird Φ auf diesen oberen Wert beschränkt und der Integrationsausdruck auf Null zurückgesetzt. Der Zweck des oberen Wertes des proportionalen Ausdrucks besteht darin, eine Überkompensation und gefährlich hohe Einlaßgradienten zu verhindern, welche die Gewebekulturellen besonders stressen. Unter solchen Umständen wartet das Steuerschema, bis das Gewebekulturverfahren näher an dem Soll- Wert ist und erst dann setzt das oben beschriebene Steuersystem ein, wie wenn das Verfahren eben erst angefangen hätte.

Außerdem erzeugt der Mikroprozessor 60 proportional zur Zeit Ausgaben t_Luft, t_N₂, t_O₂ und t_CO₂, welche den Gasfluß in den Reaktor steuern. Die Gasflußsteueranordnung arbeitet auf der Basis eines Zyklus, während welchem zwei Phasen auftreten. Während einer Phase wird Luft in das Fermentiergefäß 20 eingeführt und während der anderen Phase des Zyklus wird eines oder mehrere der Gase N₂, CO₂ und O₂ in spezifischen Volumen zum Fermentationsgefäß 20 zugesetzt. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt t_Zyklus zwei Sekunden. Die Zyklusdauer kann variiert werden je nach der Geschwindigkeit, mit welcher das Fermentationsverfahren oder andere Bioreaktionen fortschreiten, der zur Verfügung stehenden Rechenleistung und Speicherkapazität und dem gewünschten Grad an Steuerung.

Wie oben erwähnt sind Φ_N₂, Φ_O₂, Φ_CO₂ und Φ_ALK positive kontinuierliche Ausgaben, welche Funktionen des laufenden Fehlers und eine Schätzung des Bedarfs für jene Variable aufgrund der Erfahrung dieser Variablen sind. Nur einer der Werte Φ_N₂ und Φ_O₂ wird positiv und nur einer der Werte Φ_CO₂ und Φ_ALK positiv sein. Diese positiven Ausgaben werden verwendet, um die relative Menge von jedem der Gase während jedes Zyklus zu steuern. Das Volumen an Gas, welches während eines Zyklus in das Fermentationsgefäß 20 eingeführt wird, ist im wesentlichen konstant innerhalb der physikalischen Grenzen der Gasventile 72. Als Folge davon, wird die folgende Gleichung verwendet, um die Menge an jedem der Gas-Eingaben in das Fermentiergefäß im Laufe eines Zyklus auszudrücken:

t_Zyklus=t_Luft+t_N₂+t_O₂+t_CO₂

t_Luft ist die Zeit während des Zyklus, in welcher Luft in das Fermentationsgefäß eingeführt wird. Die relativen Werte von t_Luft, t_O₂, t_CO₂ und t_N₂ werden wie folgt bestimmt: Wenn Φ_O₂ größer als Null ist, so gilt:

t_O₂=Φ_O₂+0,25 Φ_CO₂;
t_CO₂=Φ_CO₂ und
T_N₂=O.

Daraus folgt in diesem Fall t_Zyklus=t_Luft+t_O₂+t_O₂. In diesem Fall jedoch, wenn Φ_CO₂ gleich Null ist, so gilt:

t_CO₂=O; und
t_Zyklus=t_Luft+t_O₂.

Wenn Φ_N₂ größer als Null ist, wird die berechnete Variable Z (Z=Φ_N₂-Φ_CO₂) verwendet.

Wenn Φ_N₂ größer als Null und Z größer als oder gleich Null ist, so gilt:

t_O₂=O;
t_CO₂=Φ_CO₂; und
t_N₂=Z

Daraus folgt in diesem Fall t_Zyklus=t_Luft+t_N₂+t_CO₂.

Wenn Φ_N₂ größer als Null ist und Z weniger als Null, soll gilt:

t_O₂=-0,25 Z;
t_CO₂=Φ_CO₂; und
T_N₂=O.

Daraus folgt in diesem Fall t_Zyklus=t_Luft+t_O₂+t_CO₂.

In den vorstehenden Fällen wird die Wirkung des zur pH-Korrektur erforderlichen CO₂ auf die DO- Korrektur, die Änderung der Menge von dem System in der Luft oder auf andere Weise zugesetzten O₂ infolge des Zusatz von CO₂, kompensiert. Das System kompensiert daher die Menge an Luft, welche durch das CO₂ verdrängt wurde durch Zusatz von Luft (reduziert N₂) oder Zusatz von Sauerstoff, wobei N₂ und CO₂ gleichermaßen als inerte Gase für diese Zweck betrachtet werden.

Die Endlage ist derart, daß, wenn Φ_N₂ und Φ_O₂ gleich Null sind, gilt:

t_O₂=t_N₂=O; und
t_CO₂=ΦCO₂.

In diesem Fall ist daher t_Zyklus=t_Luft+t_CO₂.

In diesem Fall ist keine Kompensation des Zusatzes von CO₂ notwendig, weil DO auf dem Sollwert steht.

Verschiedene Beispiele werden nun beschrieben, um die obigen Beispiele zu illustrieren. Wenn die Menge an CO₂, welche als Resultat des pH-Spiegels erforderlich ist, 200 ms beträgt (Φ_CO₂), so beläuft sich die Menge an Sauerstoff, welche als Resultat des DO- Spiegels erforderlich ist, auf 100 ms (Φ_O₂). Die Steueranordnung berechnet die "t"-Variablen wie folgt:

t_CO₂=200 ms und
t_O₂=150 ms.

Die durch das CO₂ (200 ms) verdrängte Luft wird hierbei durch Zusatz von zusätzlichen 50 ms O₂ kompensiert. Es ist zu beachten, daß Luft im wesentlichen aus 80% N₂ und 20% O₂ besteht, und daß für die Zwecke der DO- Korrektur, CO₂ als inertes Gas betrachtet werden kann.

Ein zweites Beispiel ist dasjenige, in welchem die pH-Steuerung 100 ms CO₂ fordert und die DO-Steuerung 250 ms N₂ fordert. In diesem Fall gilt t_CO₂=100 ms und t_N₂=150 ms (Φ_N₂-Φ_CO₂). Der N₂ wird durch die DO-Steuerung zugesetzt, um die Menge an dem anstelle von Sauerstoff zugesetzten inerten Gas zu erhöhen, und für die Zwecke der DO-Steuerung ist es nicht wichtig, ob die 250 ms an inertem Gas ganz aus N₂ oder aus einer Kombination von N₂ und CO₂ besteht. Durch Anpassung der Mengenverhältnisse an inertem Gas zwischen N₂ und CO₂ im vorliegenden Fall können die Erfodernisse sowohl der DO-Steuerung wie der pH-Steuerung erfüllt werden.

Das dritte Beispiel betrifft den Fall, in welchem die pH-Steuerung 100 ms CO₂ und die DO- Steuerung 50 ms N₂ anfordern. In diesem Fall gilt t_CO₂=100, t_N₂=O und t_O₂=Φ_O₂+0,25 (Φ_CO₂-Φ_N₂). In diesem Fall fordert die DO-Steuerung nur 50 ms an inertem Gas, aber die pH-Steuerung fordert 100 ms CO₂ (und inertes Gas in bezug auf die DO-Steuerung). Weitere 50 ms inertes CO₂ werden daher zugesetzt, welche den Sauerstoff verdrängen, welcher zu den 50 ms verdrängter Luft zugesetzt worden wären. Zusätzliche 12,5 ms O₂ werden daher zugesetzt, um den Sauerstoff in der Luft zu ersetzen, was durch das CO₂ verhindert wird.

Als Resultat dieser Berechnungen werden die jeweiligen Zeitabschnitte, während welcher die verschiedenen Gase in das Fermentiergefäß eingeführt werden, gesteuert.

Wenn die Zellen wachsen und O₂ verbrauchen, wobei Säure in gleicher Geschwindigkeit erzeugt wird wie diejenige, mit welcher der Gasfluß CO₂ aus dem Medium austreibt, die Zellen jedoch mehr Sauerstoff benötigen, so wird der Fall gewählt, in welchem nur Luft und Sauerstoff während t_Zyklus zugesetzt werden. Dies ist kein stabiler Zustand und tritt nur gelegentlich wenn überhaupt während des Fermentationsverfahrens auf. Zu Beginn des Zellwachstums andererseits, wenn die Luft genau dem Sauerstoffbedarf entspricht, aber die Zellen noch nicht genügend Säure erzeugen und das Kohlenstoffdioxid zu rasch erschöpft wird, besteht t_Zyklus nur aus dem Zusatz von Luft und Kohlenstoffdioxid.

Diese zwei Bedingungen können auch mit Hilfe einer Gasfluß-Steueranordnung reguliert werden, welche unabhängig voneinander den Fluß der Gase in das Fermentiergefäß steuern, um pH und DO zu steuern. Diese Situationen treten jedoch nur für einen beschränkten Teil der Reaktionszeit auf, und während der wesentlichen Teile der Reaktion, wenn diese Bedingungen nicht erfüllt sind, würde eine Gasfluß-Steueranordnung, welche pH und DO unabhängig steuert, die ständige Fluctation der Umgebungsbedingungen infolge der durch den Zusatz von O₂ oder CO₂ hervorgerufenen gegenseitigen Beeinflussung bewirken.

Der Mikroprozessor 60 kann nach Bestimmung derWerte von t_O₂, t_CO₂ und t_N₂ den Wert t_Luft aufgrund des bekannten konstanten Wertes von t_Zyklus für jede vorbestimmte Zykluszeit berechnen. Nachdem alle vier Gaszeiten berechnet sind, können die entsprechenden Signale an das Gassteuerventil 72 gesandt werden, um eine entsprechende Menge der verschiedenen Gase in das Fermentiergefäß 20 einzuführen. In der Ausführungsform gemäß Fig. 3 ist diese Luftberechnung jedoch unnötig, weil das System in Abwesenheit eines Instrumentes zur Zufuhr von O₂, N₂ oder CO₂ keine Luft benötigt.

Die Gasfluß-Steueranordnung wird in einer bevorzugten Ausführungsform als Software im Zusammenhang mit dem Mikroprozessor 60 implementiert. Die Software ist in einem Nur-Lese-Speicher-Chip (ROM, PROM, EPROM oder EEPROM) implementiert. Die Software kann jedoch unter Verwendung eines Magnetblasenspeichers oder jeden anderen Typs von nicht-flüchtigem Speichermedium realisiert werden.

Die Gassteuerventile 72 sind in einer bevorzugten Ausführungsform als Solenoid-Ventile ausgebildet. Eines dieser Solenoid-Ventile ist ein Dreiwegventil, welches einen einzigen Auslaß zwischen einem "Luft"- oder einem "Gemisch"-Fluß umschaltet. Die anderen drei Ventile steuern die N₂-, O₂- und CO₂-Quellen in die Gemischabgabe des Dreiwegventils.

Der Benützer kann auch wählen, das Fermentationssystem aus dem Steuerungsmodus zu entfernen, in welchem die Gasflüsse gesteuert werden, und das Fermentationssystem zu einem zweiten Modus überzuführen, in welchem nur Luft in das Fermentiergefäß eingeführt wird.

Die vorliegende Erfindung wurde unter Bezugnahme auf ein Fermentationsverfahren für ein Gewebekulturmedium beschrieben. Das Steuergerät ist jedoch ebenso anwendbar für ein Hohlfaserverfahren und ein Verfahren, in welchem eine mit Glasperlen beschickte Säule verwendet wird. Alle diese Verfahren können als Bioreaktionen oder biologische Verfahren betrachtet werden.

Demzufolge wird ein pH-DO-Steuersystem, welches besonders angepaßt ist für ein Gewebekultur-Fermentationsverfahren, aufgezeigt, welches dazu dient, unstabile Veränderungen in pH und DO während einer Fermentationsreaktion zu verhindern durch Koppelung der Steuerung dieser beiden Variablen.

Claims

1. Vorrichtung zur Steuerung der Menge an gelöstem Sauerstoff und des pH-Wertes eines Mediums während eines biologischen Verfahrens in einem Gefäß (20), gekennzeichnet durch: einen pH-Sensor (26) zur Erzeugung eines vom pH des Mediums abhängigen pH-Signals; einen O₂-Sensor (28) zur Erzeugung eines vom Gehalt an gelöstem Sauerstoff in dem Medium abhängigen O₂-Signals; eine Ventileinrichtung (72) zur selektiven Zuführung von Luft, N₂, O₂ und CO₂ in das Medium; eine Steueranordnung (60) zum Erzeugen eines den Betrieb der Ventileinrichtung (72) steuernden Steuersignals zur zyklischen Zufuhr von einem oder mehreren der Gase Luft, CO₂, N₂ und O₂ zu dem Medium derart, daß während der Dauer jedes Zyklus der Gaszufuhr Luft, CO₂, N₂ bzw. O₂ jeweils mit einer bestimmten Dauer, jedoch festem Volumen zugegeben wird, wobei die Steueranordnung (60) in Antwort auf die pH- und O₂-Signale die Menge an CO₂, O₂ und/oder N₂ bestimmt, die erforderlich ist, um den Gehalt an gelöstem Sauerstoff und den pH aufgrund ihrer erfaßten Werte zu korrigieren, um den Verlust an Luft infolge der CO₂-Zugabe zu kompensieren, so daß die Wirkung der CO₂- Zugabe auf den Gehalt an gelöstem Sauerstoff minimiert wird.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium ein Fermentationsmedium ist.

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium ein Gewebekulturmedium ist.

4. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Steueranordnung (60) eine Fehlerberechnungseinrichtung aufweist, die nach Maßgabe von Fehlern, die aus der Differenz zwischen Sollwerten für gelösten Sauerstoff und pH und durch die Sensoren (26, 28) erfaßten Werten für gelösten Sauerstoff und pH errechnet sind, Steuer-Ausgangssignale für pH und gelösten Sauerstoff erzeugt; und daß mit der Fehlerberechnungseinrichtung Gasfluß-Steuereinrichtungen gekoppelt sind, welche nach Maßgabe der Steuer-Ausgangssignale für pH und gelösten Sauerstoff die benötigten Zusätze zum Medium berechnen.

5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Benützer-Eingabeeinrichtung (66) zur Einstellung der Sollwerte aufweist.

6. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Sensor (26) eine Glaselektroden- pH-Sonde ist.

7. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der O₂-Sensor (28) ein galvanischer Sensor für gelösten Sauerstoff ist.

8. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Steueranordnung (60) als Mikroprozessor mit Firmware ausgebildet ist.

9. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie an ihrer Frontplatte Anzeigevorrichtungen (48) zur Anzeige der Werte für gelösten Sauerstoff und pH aufweist.

10. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Analog-Aufzeichnungsvorrichtung zur Aufzeichnung von Werten des gelösten Sauerstoffs, des pH, ihrer Sollwerte und eines Abfalls des festgesetzten Gasvolumens umfaßt.

11. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Ventileinrichtung (72) solche zur Auswahl aus Luft, O₂, CO₂ und N₂ umfaßt.

12. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Gaszuführung zu dem Medium durch eine Antriebswelle (29) eines Rührsystems (24) für das Medium erfolgt.

13. Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Gas am Boden des Rührsystems (24) austritt.

14. Verfahren zur Steuerung des Gehalts an gelöstem Sauerstoff und des pH-Wertes eines Mediums während eines biologischen Verfahrens in einem Gefäß, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert des Mediums erfaßt wird, der Gehalt an gelöstem Sauerstoff des Mediums erfaßt wird, Mengen von CO₂, O₂ und/oder N₂, welche erforderlich sind, um den gelösten Sauerstoff und pH aufgrund ihrer erfaßten Werte zu korrigieren, bestimmt werden und dem Medium eines oder mehrere der Gase Luft, CO₂, N₂ und O₂ in Zyklen zugeführt wird, wobei während jedes Zyklus Luft, CO₂, N₂ bzw. O₂ jeweils mit einer bestimmten Dauer, jedoch mit festem Volumen dem Medium zugegeben wird, um den Verlust an Luft infolge der CO₂-Zugabe zu kompensieren, so daß die Wirkung der CO₂-Zugabe auf den Gehalt an gelöstem Sauerstoff minimiert wird.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die erfaßten pH- und O₂-Werte durch Zusatz von N₂ korrigiert werden, wenn der Bedarf an N₂ aufgrund des O₂-Signals größer ist als der Bedarf an CO₂ aufgrund des pH-Signals, wobei der Zusatz an N₂ in einer Menge erfolgt, welche gleich der Menge an erforderlichem N₂ minus der Menge an erforderlichem CO₂ ist, und zusätzliches O₂ in einer Menge zugesetzt wird, welche gleich einem Viertel der Differenz zwischen dem Bedarf an N₂ und CO₂ ist, wenn die Menge an erforderlichem N₂ geringer ist als die Menge an erforderlichem CO₂.

16. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Zeitdauer (t_Zyklus) jedes Zyklus in eine erste Phase und eine zweite Phase unterteilt wird, derart, daß während der ersten Phase Luft zu dem Medium zugesetzt wird und während der zweiten Phase eines oder mehrere der Gase N₂, O₂ und CO₂ zum Medium zugesetzt wird.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß bei Zugabe der Gase CO₂, N₂ bzw. O₂ diese jeweils einzeln während der zweiten Periode zugesetzt werden.

18. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß Luft dem Medium zugesetzt wird, wenn keines der Gase N₂, O₂ und CO₂ zuzusetzen ist.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß eine Fehlerberechnungseinrichtung Steuer-Ausgangssignale für pH und gelösten Sauerstoff erzeugt, indem sie einen dem laufenden Fehler proportionalen Ausdruck und einen mit dem vorhandenen Fehler und/oder mit der Summe von mindestens einem Teil der früher im Verfahren aufgetretenen Fehler verbundenen Ausdruck summiert.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß Steuer-Ausgangssignale für pH und gelösten Sauerstoff erzeugt werden, die jeweils Grenzpunkte aufweisen, welche sie nicht überschreiten können.

21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß ein aus der Summe von im Laufe des biologischen Verfahrens erfaßten Fehlern gebildeter Ausdruck aufhört, einen dem gegenwärtigen Fehler proportionalen Ausdruck einzuschließen, wenn die Summe der zwei Ausdrucke einen Grenzpunkt überschreitet.

22. Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, daß der von der Summe der im Laufe des Verfahrens erfaßten Fehler abhängige Ausdruck auf Null gesetzt wird, wenn der dem gegenwärtigen Fehler proportionale Ausdruck den Grenzpunkt überschreitet.