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Verfahren und Einrichtung zum Regeln und überwachen des Prozeßverlaufes
bei der biologischen Verarbeitung von Nährlösungen zum Züchten von Mikroorganismen,
Bei der Züchtung sauerstoffverbrauchender Mikroorganismen, z. B. von Hefen, entsteht
aus dem verbrauchten Sauerstoff eine präktisch volumetrisch gleich große Menge Kohlensäure,
da der respiratorische Quotient für die Atmungsvorgänge auch bei Mikroorganistnen
= i ist. Bei anaeroiben Gärprozessen entstehen Kohlensäure oder auch andere
Gase ohne gleichzeitigen Ve#braurh von Luftsauerstoff, lediglich durch Abspaltung
beim Ab-
bau der Kohlehydrate, beispielsweise Kohlensäure bei der alkoholischen
Gärung. Bei der Züchtung von Hefen und anderen Mikroorganisrhen können beide Vorgänge
neben# einander stattfinden, je nachdem in welehern Umfang neben reinem Waehstum
noch eine alkohofische oder sonstige Gärung stattfindet.
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Der Einfachheit halber ist in folgendem an Stelle von Mikroorganismen
im allgemeinen nur Hefe gesetzt uhd statt allgemeiner Gärungsvorgänge alkoholische
Gärung.
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Bei der üblichen Lüftungszüchtung von Hefen wird eine bestimmte Menge
Luftsauerstoff mit C-Atotnen des - Zuckermoleküls zu C 02 zum Zwecke
der Energiebeschaffung verbrannt.
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Bei der alkoholischen Vergärung von Kohlehydraten wird das Zuckermolekül
durch die Fermente der Hefe zu Alkohol und Kohlensäure gespalten, ohne daß gleichzeitig
ein Verbrauch von Sauerstoff erfolgt (solch-- Gä-
rungen verlaufen ohne jede
Sauerstoff- oder Luftzufuhr und ergeben neben dem Alkohol als Produkt praktisch
reine Kohlensäure in einer der Gärungsgleichung entsprechenden Menge).
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Die genaue Größe des Gasumsätzes ist für die Durchführbarkeit des
neuen Verfahrens
ohne Byleutung. Es genügt, daß der Gasumel
Z>
satz in einem konstanten oder annähernd konstanten Verhältnis zum Hefewachstum
steht, was erfahrungsgemäß der Fall ist, da man, wie bekannt, die. Ausbeute an Hefe
bzw. Eiweiß aus einer gegebenen ilenge Zuckerlei
| Vorhandensein ausreichender Mengen aley.' |
| Aufbaustoffe durch Steigerung der Mlen |
| bzw. des Feinheitsgrades der zugeffibrt#ij.:" |
Luft erhöhen oder durch entgegengesetite Maßnahmen jederzeit willkürlich verringern!.
kann.
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Auch wenn eine sonstige Begleiterscheinung der reinen T-Tinwandlung
0.2 + C (des Zuckernioleküls) = CO. vorhanden wäre, die eine zusät7liche
Abspaitung einer gewissen Men-e CO. neben der aus dem Luftsauerstoff stammenden
Menge bedingen würde, muß ein bestimmtes konstantes Verhältnis zwischen verbrauchtem
Sauerstoff und gebildeter Koblensäu-re herrschen, wenn die begleitende CO,-Erzeugung
von Hefewachstum zwangsläufig abhängig ist.
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Außerdem ist es bekannt, daß bei einer Verminderung des Wachstums
bei der Hefezüchtung eine vermehrte Alkoholbildung erfolgt in der Weise, (laß unter
Berücksichtigung des durch die Abluft entfernten Al-
kohols die Beziehung
(Hefezuwachs malKonstante) + Alkoliolerzeugung = Konstant besieht.
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Aus den beiden grundsätzlichen Feststellungen ergibt sich, daß erstens
bei rein alkohol ischei Gärung CO.. ohne Verbrauch von 0,
entsteht,
und zweitens bei reinem Wachstum CO4 in einem ganz bestimmten Verhältnis zum verbrauchten
0, entsteht.
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Es läßt sich also aus dem Verhältnis gebildete CQ, zu verbrauchtem
0. im Abgas das Verhältnis gebildeter Alkohc71 zu gebildeter Hefesubstanz
bestimmen und demnach auch beeinflussen.
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Bei der höchstmöglichen Hefeausbeute muß also theoretisch genau so
viel Sauerstoff (02) verbraucht werden, als Kohlensäure (C 0:, .) entsteht, während
mit sinkender Hefeausbeute eine geringere Menge 0, verbraucht wird, als
CO. entsteht, bis im GrenzfaLl. der rein alkoholischen Gärung nur
CO.
entsteht, ohne daß gleichzeitig 0. verbraucht wird.
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Hier sei unter anderem verwiesen auf j. E f f r o n
t. Comptes rendus hebdomanaires de la soci#t# de Biol. 93, 1248, 1925,
wo als Ergebnis eines anairoben und eines airoben Gärversuches mit Hefe aus
ioogvergärbarem Zucker entweder 5o g Alkohol und 48, 1 g
Kohlensäure
oder 56 g Trockerillefe und 58 g
Kohlensäure erhalten wurden.
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Nach Claasen (Zeitschrift für Spiritusindustrie 1935) werden
zur Erzeugung von ioog Hefesubstanz Sog 0, verbraucht, und es entstellen
144e- CO,. Die Messung von Gasen erfolgt nach Volumen. Die Urnrechnwig der
Claasenschen Zahlen auf Volumen (15' C
.-35 nim Hg) ergibt darnach
einen Verbrauch von 6 110.2 und eine Erzeugung von, So 1 CO,.
Diese
Zahlen entsprechen den von Claastn an anderen Stellen abgegebenen Ausbeutewerten
von etwas unter 5o - Hefesubstanz äus ioo g Zucker. Bei den in. letzter
Zeit häu--fig nachgewiesenen höheren Ausbeuteziffern an Hefesubstanz wird sich die
erzeugte Menge CO2 entsprechend vermindern und im Grenzfalle den Wert des verbrauchten
Q, mit 61 1 erreichen. Man kann also mangels anderen Angaben setzen, daß
i kg Hefesubstanz beiVerbrauchvon61olO2(i5 C735nunHg) entsteht. Da für die
Erzeugung von Alkohol nach der Gärungsglekliung bei Erzeugung von 5 1
g Alkohol rund 49 9 C 02 gebildet werden = 27,3 1 (15' C 735
nun Hg), so kann gesetzt würden, daß für die Erzeugung von i kg Alkohol rund
55o 1 CO, ohne gleichzeitigen Verbrauch von 0, entstehen.
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Man kann aus der Zusammensetzung der Abluft Schlüsse auf den Verlauf
des Hefewachstums ziehen. Auf Grund dieser Schlüsse kann man unter Berücksichtigung
der (las Wachstum beeinflussenden Faktoren und durch gegebenenfalls auf empirischem
Weg erprobte Maßnahmen regelnd eingreifen und den Prozeß so beeinflussen, daß die
gewünschten Wachsturnsverhältnisse erreicht werden. Man hat durch die Abluftanalyse
eine einfache und bequem anwendbare Kontrollmetlhode für den Ablauf des Hefezüchtungsprozesses
in der Hand, die es gestattet, je-
weils die augenblickliche Wachstumsausnutzung
der verbrauchten Nährstoffe festzustellen. Di.e Untersuchung der Abluft: auf
CO,
und 02 kann innerhalb weniger Minuten von einfachen Arbeitern durchgeführt
werden, ist also nicht vom La:boratorium abhängig und kann auch unter Verwendung
bekannter automatischer Geräte selbsttätig und sogar splbstregistrierend erfolgen,
wodurch ein außerordentlich hoher Stand der Betriebsüberwachung möglich ist.
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Nach der vorliegenden Erfindung soll keine schematische Dosierung
der Luft vorgenominen werden, sondern- eine Anpassung unter Berücksichtigung der
tatsächlich stattgefundenen Ausnutzung des Luftsauerstoffes, und zwar nicht auf
Grund des Verhältnisses des ausgenutzten Sauerstoffes zum unausgenutzten, was zunächst
am nächsten liegen würde, sondern auf Grund einer ganz anderen #Größe, nämlich auf
Grund des Verhältnisses der Kohlensäure, die aus Luftsauerstoff entstanden ist,
und der Kohlensäure, die nicht aus Luftsauerstoff entstanden ist. Da beim
Hefewachstum
nur Kohl-ensäure aus Luftsauerstoff, bei alkoholischer Gärung aber nur Kohlensä#ure
aus Kohlehydrat ohne Verbrauch von Luftsauerstoff entsteht, ist dieses Verhältnis
ein Maßstab dafür, in welchem Ausinaß das Kohlehydrat zum Zellwachstum und in welchem
Ausmaß es zur Alkoholbildung verbraucht wurde. Der Zweck der vorliegenden Erfindung
ist es, den biologischen Prozeß im gewünschten Sinne entweder auf reines Hefewachstum
oder auf ein bestimmtes Verhältnis. von Hefewachstum zu alkoholischer Gärung zu
steuern-.
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Vor allen Dingen ist das neue Regelverfahren bei den neueren, vollkontinuierlichen
Züchtungsverfahren, die mit gleichmäßigem Würzezulauf und gleichmäßigem Würzeablauf
arbeiten, vorteilhaft anwendbar,- da bei diesen Züchtungsverfahren die Verhältnisse
im Gärgefäß nicht zeita:bhängig. veränderlich sind. Aber auch bei anderen Züchtungsverfahren,
z. B * beim bekannten Zulaufverfahren, bringt die neue Regelmethode noch
viele Vorteile, so vor allen Dingen, die Möglichkeit einer sparsamen Luftanwendung
in allen Ziichtungsstadien unter Sicherung -on Höchstausheuten.
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Aus der Zusammensetzung der Abluft läßt sich errechnen, in welchen
Anteilen das Kohlehydrat beispielsweise zum Aufbau von Hefesubstanz und zur Erzeugung
von Alkohol verbraucht wird. Wenn die Menge der Ab-
luft bzw. der zur Belüftung
angewendeten Luft genau bekannt ist, lassen sich sogar die -erzeugten Mengen Hefe
und Alkohol aus der Zusammensetzung der Abluft errechnen. Veränderungen im Verlauf
des Züchtungsprozesses lassen sich auf diese Weise erkennen, bevor sie durch andere
Methoden feststellbar sind. Da der Stickstoff der Luft bei der Hefezüchtung keine
Mengenveränderung erleidet, kann mittels der nach Abzug der gasanalytisch feststellbaren
Gehalte des Abgases an 02 und CO2 verbleibenden Menge Stickstoff aus der Abgaszusammensetzung
ohne weiteres das Verhältnis der Menge -der Ahluft zur Menge der. zugeleiteten
Luft errechnet werden.
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Wesentlich ist dabei nur, daß die das Gärgefäß verlassende Abgasmenge
in irgendeiner Form gesammelt und abgeleitet wird, so daß in der Sammelleitung die
Durglimischung der etwa an verschiedenen Stellen mit verschieausgetretenen analytischen
dener Zusammensetzung Bestimmung Gase eintritt, aus dienenden bevor der die Flüssigkeit
zur Proben gas- -
an einer weiter entfernten, Stelle der Abluftleitung entnorumen,
werden-. Der Zweck und der große Vorzug des neuen Verfahrens ist es, aus der augenblicklichen
Zusammensetzung der Abluft, die an Hand einer solchen momentanen Durchschnittsprobe
der das Gärgefäß v.erlassenden Abluft feststellbar ist, die notwendigen Maßnahmen
für die Beeinflussung des Verfahrens in der gewollten Richtung abzuleiten, und zwar
in solcher Vollkommen'heit, daß sogar eine selbsttätige Regelung möglich ist.
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Abb-..i zeigt ein Schema für eine Einriebtung zur Durchführung des
Verfahrens, Dem Gärgefäß i wird bei :2 Luft zugeführt, bei 3
läuft Würze Yti.
Die Abluft wird unter dem Deckel des Gärgefäßes i gesammelt und durch den
* Brüdenabzu94 ins Freie geführt. In einiger Entfernung vom Gärgefäß wird
bei 5
die Probe entnommen und durch die Leitung6 dein beispielsweise automatischen
Gasanalysengerät 7 zugeleitet. Auf Grund der Anzeige oder durch automatische
Beeinflussung wird eine der Wachstumsbedingungen, z. B. die Nährstoffzufuhr, mittels
des WürzeitAgenregelorgans 9 beeinflußt, so daß ein anderes Verhältnis zwischen
zugeführter Nährstoffmenge, zugeführter Luftmenge und arbeitender Hefemenge herbeigeführt
wird, bei dem die gewollten Wachstumsbedingungen herrischen. An Stelle der Würzezulaufmenge
können auch andere Faktoren, z. B. Luftmenge, zusätzliche Stellhefezusatzmenge,
,Temperatur, Azidität usw. ibeeinflußt werden. Das Verfahren kann in Verbindung
mit beliebigen Gärgefäßen und Gärverfahren angewendet werden. Eine Reihe der die
Züchtungsbedingungen beeinflussenden Faktoren kann mit oder,ohne Hilfe besonderer
Regeleinrichtungen. leicht 'konstant geh-alten werden, so daß die Regelung auf Grund
der Gasanalyse der Abluft gemäß vorliegender Erfinding auf einen oder höchstens
zwei der das Hefewachstum bestimmenden Faktoren beschränkt werden kann. Bei Konstanthaltung
aller übrigen Faktoren kann man den regelnden Einfluß beispielsweise entweder auf
die zugeführte Luftmenge oder auf die zugeführte .L\Tährstbffmenge oder auf die
Hefekonzentration im Gärgefäß ausüben.
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Nach dem neuen Verfahren kann der Prozeßverlauf bei der Züchtung von
Mikroorganismen dhne oder mit gleichzeitiger Erzeugung von Gärungsprodukten g&egelt
werden. Die Messung der Zusammensetzung der Abluft kann unter Benutzung bekannter
Geräte von Hand, automatisch und gegebenenfalls- auch selbstregistrierend erfolgen.
Auch können durch solche Geräte unmittelbar oder mittelbar Regelorgane betätigt
werden bzw. verstellt werden.
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Die kegelung ermöglicht die praktisch verlustfreie biologische Verarbeitung
von Lösungen mit schwankender Zusammensetzung und Konzentration. Man kann damit
auch unter schwierigen Verhältnissen arbeiten und Verluste bei der biologischen
Verarbeitung von Lösungen weitgehend einschränken.
Wenn andere Gärungsgase
als CO2 entstehen, z.B. bei manchen Gärungen Wasserstoff-, können auch die Abgas-
oder Abluftzusammetisetzungen unter Berücksichtigung ihres Gehaltes an anderen Gasen
als CO., und 0. als Regelgruhdlage benutzt werden.
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Nachgtehend sind zwei Ausführungsbeispiele skizziert. Das erste behandelt
die Erzeugung yon Hefe mit gleienzeitiger Alkoholerzeugung nach dem Zulaufverfahren.
Wenn ein bestimmtes Verhältnis zwischen erzeiigter Hefe und >erzeugtem Alkohol erstrebt
wird, ist es nützlich, dieses Verhältnis schon während der Zulaufzeit möglichst
weitgehend einzuhalten. D.ies-gestattet, mit geringsten Luftmengen höchste Ausbeuten
zu erreichen. EF sollen z. B. aus ioo kg vergärbarem Kohlehydrat ioo
kg Preffhefe = 25 kg Hefetrockensubstanz -und etwa 3o 1 Alkohol
erzAgt werden.
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Durch Rechnung oder durch Versuch läßt sich das genaue Verhältnis
des verbrauchten Sauerstoffs zur gebildeten Kohlensäure leicht ermitteln, bei dem
der gewünschte Gärungsverlauf eintritt. Zum Beispiel: 25 kg I-.Iefesul)-stanz
entsprdchen 25-o,6i=i5,25M3C0, aus Luft - 02; 3o 1 Alkohol
= 23,7 1,9 entsprechen 23,7 - 0,55 = 13 n13
C 02 (zusätzlich erzeugt).
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Wenn die Luftmenge während der Gesamtdatter des biolügischen Prozesses
so reguliert wird, daß das ermittelte Verhältnis der Verminderung des Sauerstoffgehaltes
gegenüber der zugeleiteten Luft zum Kohlensäuregehalt der Abluft eingehalten wird,
so wird die sparsamste Luftanwendung erreicht und in Verbindung damit der geringste
Alkeholverlust durch Verdunstung.
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Das zweite Ausführungsbeispiel beschreibt die Züchtung ven Hefe, z.
B. Futterhefe, ohne gleichzeitige Alkoholerzeugung in einem vollkontinuierlichen
Züchtungsverfahren mit kontinuierlichem Würzezufluß und kontinuierlichem Würzeabfluß.
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Da hierbei die Alkoholbildung unterdrückt werden soll, ist ein :2 1 010
wenig überschreitender Wert von Sauerstoff - + Kohlensäure in der Abluft
anzustreben.
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Bei konstanter Luftzuführung kann die zufließende Würzeinenge von
der Zusammensetzung der Abluft abhängig reguliert werden, oder es kann die Hefekonzentration
im Gärraum davon abhängig manuell oder automatisch eingestellt werden. 'Die Hefekonzentration
kann durch die Beeinflussung des in den Apparat zurückgeführten, aus dem Ablauf
abseparierten Hefeschlammes geregelt werden oder auch durch Abziehen von Bodensatzhefe
aus dem Apparat oder Gärgefäß oder aus besonderen Teilen- desselben.
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Auf diese Weise wird die Alkoholbildung von vornherein unterbuncien
und der Umweg der Hefebildung vom Kohlehydrat über den Alkohol mit seinem geringereii
Ausnutzungsgrad ünd seiner längeren Prozeßzeit von vornherein ausgeschaltet.
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Abb. 2 zeigt die Veränderung der Abgaszusammensetzung bei einem Versuch,
bei welchem die Züchtungsbedingungen bewußt geändert wurden. Im Diagramm zeigt die
ausgezogene Linie 9 den 0,-Gehalt und die punktierte Linie io den CO,-Gehalt
der Ab-
gase. Die Richtung für zunehmenden CO,
Gehalt ist aufwärts,
für zunehmenden 0,-Gehalt der Abluft abwärts eingetragen, so daß der fehlende- Sauerstoff
(21 Oi,-0,-Gelialt der Abluft) dieselbe Richtung im Diagramm hat wie die entstandene
Kohlensäure. Im Beispielsfalle wurde bei einem mit kontinuierlichem Zulauf der Nährlösung
und kontinuierlichem Ablauf der verbrauchten Lösung arbeitenden Verfahren die Abgaszusammensetzung
gemessen.
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Dem Gärgefä ß liefen je Stunde 220
1 Würze mit i 0/bZuckergelialt (davon 0,210/0 PCntOSCn), also stündlich 2,2
kg Gesamtzucker zu. Der Hefezuwachs betrug je Stunde i, 12
kg Hefetrockensubstanz mit 5 1 % Eiweiß. Es wurden stündlich
30 in" Luft zugeleitet, die mittelfein verteilt war. Vom Zucker (Hexosen-Pentosen-Gemisch)
wurden 9601, verbraucht. Die lUft Zeigte 911 01102 und --, 1 0/"
CO,., das entspricht einem 0,-Verbrauch von etwa 1,86 0/0,
berechnet
auf zuggeleitete Luft, und eine ge-
bildete C 02-Menge Von 2, 110/0,
berechnet auf zugeleitete Luft. Von den 2, 11 010 C 02 sind 1,86 0/0 aus
Luftsauerstoff entstanden und o,25 01, durch alkoholische Gärung oder sonstige
Begleiterscheinungen der Züchtung. Die' ablaufende Nährlösung zeigt nur Spuren von
Alkohol entsprechend 0,02 % Zucker im Zulauf = o,o44 kg Zucker/Std.
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Im Beharrungszustande (bei ii) des Züchtungsprozesses laufen die beiden
Linien 9 und io in engem Abstand parallel. Bei einer Steigerung der Zuckerkonzentration
der zugeleiteten Würze auf das i,Sfache trat (bei 12) ein starkes Ansteigen der
Linie io (CO2) auf 3,05 01, und ein etwas schwächeres Ansteigen der
Linie 9 (02) auf 18,6 010 ein, d. h. es s ind jetzt etwa
3,05 % Kohlensäure entstanden, davon o,83 01, durch alkoholische Gärung
o. dgl. und 2,22 Ofq aus Luftsauerstoff. Auf zugeleitete Luft gerechnet sind 3,08'io
CO,!
entstanden, davon 2,25% aus Luftsauerstoff und 0,83% durch Nehenvergärungen.
Die erzeugte Hefemenge hat, wie auch die Analysen über den im Verhältnis zum Zucker
verbrauchten Nährstickstoff in der Nährlösung bestätigen, im Verhältnis
1,91 : 2,25, d. li. um etwa 18 0/0, zugenommen bei 5o 010 mehr KohlehYdrat.
Die praktische Zuwach.9bestiminung
ergab 1,30 kg Hefetrockensubstanz/Std.,
also etwa 16 "/, mehr als vorher. Eine Alkoholmenge, die umgerechnet
0,35 lo = 0,77 kg
Zucker entspricht, wurde in der verbrauchten Nährlösung
durch Destillation und pyknometrische Wägung festgestellt.
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Nun wurde die zugeleitete Zuckermenge wieder auf das normale Maß zurückgesetzt,
indem bei einem noch bestehenden Zuckergehalt von 1,5 01,) die Menge der zufließenden
Lösung auf i So I/Std. vermindert wurde, so daß stündlich :2,25 kg Zucker
zugeführt wurden. Die Linien 9 und io des Analysenwertes kehrten (bei 13)
auf ihre dem Beh#arrungszustand - (bei ii) entsprechende Lage zurück, und
der Hefezuwachs wurde mit stündlich i, i i kg innerhalb der Meßbegrenzungen
genau so hoch wie bei ii festgestellt. Alkohol war wieder nur in kaum feststellbaren
Spur.en, vorhanden.
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Als weiterer Beeinflussungsversuch wurde die Luftmenge um 1/4 auf
2.2,5 c-bm/Std. reduziert. Es machte'sich ein Ansteigen des C 02-Gehaltes
der Abluft auf 2,7 Olo und ein Ab-
sinken des 02-Gehaltes auf Iß,7
of, bemerkbar (s. Punkt 14 des Diagramms). Von den 2,7 ofo C 0,- stammen
2,2 "/, aus dem Luftsauerstoff und o,5 Of, aus Nebenvorgängen. des Hefewachstums,
insbesondere aus alkoholischer Gärung. Die Hefeausbeute wurde mit stündlich o,92
kg ermittelt, was praktisch dem aus den Analysen errechneten Wert von
entspricht. Bei 15 wurde die Luftmenge von 30 m# wiederhergestellt und damit
der alte Beharrungszustand wie bei i i wieder erreicht.
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Als dritter Beeinflussungsversuch 'wurde die Hefekonzentration- im
Cärgefäß von io Of, auf 5 0/, durch Hefeentzug reduziert. jetzt trat keine
Veränderung des CO.-Gehaltes ein, depselbe blieb 'bei 2, 15 % angenähert
konstant, während der 02-Gehalt auf 19,4 anstieg. Von den :2, 15 0/0 C 02
waren aus 02 1,45 0/, entstanden, und ohne 0,-Verbra ch 0,70 of, (s. Diagrammstreifen
bei 16). ' ie Hefeausbeute wurde zu o,golcg/Std. rmittelt (aus
2,25 kg Zucker/Std.), während in der verbrauchten Lösung eine 0,62kg Zucker/Std.
entsprechende Alkoholmenge festgestellt wurde. Die Errechnung der Hefeausbeute vor
der Änderung des Gasumsatzes hätte ergeben:
während die Alkoholmenge sich aus der Luftmenge von 30 cbm und der Zahl von
0,70 04
mit aus Luftsauerstoff entstandenem C 02 sich entsprechend
der Gärtingsgleichung wie folgt ermitteln läßt: es entstanden 30 000 - 0,0070
=:2io
1 CO,: das sind-, wenn die Luft bei 15' und 735- crn i19 gemessen
wurde, 378 g C 02, die nach der Gärungsgleichung bei der Erzeuzung von
378 Alkohol abgespalten wurden,
wobei 378 + 395 = 773 9
Zucker verbraucht sein müssen. Der Unterschied des
entstandenen Alkohols entsprechend 7h 9 Zucker - 62o g Zucker
= 153 g Zucker, d. s. etwa So g Alkohol, kann, zum Teil durch
Verdunsten an die Abluft verlorengegangen sein und im übrigen durch BegleiterscheiIÄ
nungen der Hefezüchtung und Alkoholgärung Qrklärt werden.