DE60121206T2

DE60121206T2 - Verfahren zum einfangen luftgebundener mikroorganismen mittels wasserlöslicher polymere

Info

Publication number: DE60121206T2
Application number: DE60121206T
Authority: DE
Inventors: Jean-Louis Drocourt; Les Nr. Farnham DODD; Andrew I. Cooper; Philippe Cornet
Original assignee: Chemunex SA
Current assignee: Chemunex SA
Priority date: 2000-11-24
Filing date: 2001-11-23
Publication date: 2007-06-14
Anticipated expiration: 2021-11-24
Also published as: US20040043453A1; US7384762B2; JP2004514430A; ES2238979T3; DE60018431D1; DE60018431T2; DE60121206D1; WO2002042410A3; AU2002234577A1; WO2002042410A2; ES2266287T3; EP1209223A1; ATE290066T1; JP4371195B2; EP1335970B1; EP1335970A2; CA2429652A1; EP1209223B1; ATE331781T1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweisen der Anzahl von Mikroorganismen in der Luft in einer aseptischen Umgebung unter Verwendung von wasserlöslichen Polymeren. Genauer gesagt, die wasserlöslichen Polymere können als ein Transportmittel zum Aufbewahren lebensfähiger und nicht lebensfähiger Mikroorganismen zur weiteren Analyse verwendet werden.
Hintergrund der Erfindung
Polymere bestehen aus Ketten sich wiederholender chemischer Einheiten, die natürlich vorkommen, oder sie können aufgrund ihrer Chemie angepasst werden, um synthetische Polymere durch Regulation der chemischen Struktur und des Gewichts zu bilden.
Synthetische Polymere werden durch die chemische Reaktion von Monomeren zur Bildung langer Polymerketten hergestellt. Die zwei hauptsächlichen Variablen, welche die physikalischen Eigenschaften synthetischer Polymere beeinflussen, sind die chemische Natur der Monomer-Wiederholungseinheiten und das Molekulargewicht des Polymers, das genau reguliert werden kann. Demnach ist es bekannt, dass Polymere mit höheren Molekulargewichten größere mechanische Festigkeit besitzen, aber in Lösung viel viskoser sind.
Durch Variieren des Verhältnisses von chemischen Gruppen innerhalb des Polymers kann man die physikalischen Eigenschaften des Polymers an bestimmte Anwendungen anpassen. Zum Beispiel können die mechanische Festigkeit und Löslichkeit der Polymere auf diese Weise angepasst werden.
Durch Mischen verschiedener Polymertypen können die Merkmale des fertig gestellten Copolymers optimierte Kenngrößen aufweisen. Durch Entwurf und Synthese von spezi fischen Polymeren können Materialien mit den exakten, für eine spezifische Funktion benötigten Eigenschaften erzeugt werden. Zum Beispiel kann der Oberflächenbereich einer Polymerplatte (90 mm) durch eine spezifische Behandlung von 1 Quadratmeter auf 1500 Quadratmeter vergrößert werden. Dieses einzelne Verfahren wird die physikalischen und biologischen Charakteristika des Polymers für einen effizienteren Mechanismus für die Rückgewinnung von Organismen aus der Umgebung steigern.
Wasserlösliche Polymere sind im Fachgebiet bekannt und sind von Prokop et al. in "Water Soluble Polymers for Immunoisolation I: Complex Coacervation and Cytotoxicity" in Advances in Polymer Science, 136: Seiten 53 bis 73 (1998), beschrieben. Diese Polymere haben eine Vielfalt von Verwendungen, wie als künstliche Herzen, als Immunisolierungs-Barrieren, zur Schmerzregulierung von Krebspatienten im Endstadium und bei der Einkapselung von Pankreas-Inselzellen.
Außerhalb seiner medizinischen Verwendungen wird das Polymermaterial auch in Laboratorien in vielen der Verbrauchsmaterialien, wie Teströhrchen, Probenaufnahmevertiefungen, Pipettenspitzen, Wegwerfpipetten und dergleichen verwendet.
Zum Beispiel wurden verschiedenartige Polymere als ein fester Träger innerhalb eines Verfahrens zum Nachweis von DNA in einer Zelle unter Erhalt der Morphologie des Kerns verwendet, wie in dem US-Patent Nr. 5 501 954 beschrieben. Bei diesem Verfahren wurde die DNA auf einem polymeren Membranfilter abgelagert, mit einer Fluoreszenz-markierten Probe inkubiert und unter Verwendung einer markierten Sonde nachgewiesen. Die verwendeten polymeren Membranen waren aus Polycarbonat, Polyvinylidenfluorid, Polysulfon, Nylon, Zelluloseestern, Nitrozellulose und Teflon^® (PTFE) hergestellt. Die in diesem Patent beschriebenen polymeren Membranen sind wasserunlösliche Polymere, da eine der Anforderungen für dieses Verfahren darin besteht, dass die polymeren Membranen das zelluläre Material während einer Reihe von Behandlungen und Waschungen zurückhalten und noch intakt bleiben müssen.
Das EP 546 032 beschreibt ein Verfahren zur Immobilisierung von Molekülen, Polymeren oder Mikroorganismen durch Mischen mit einer Dispersion eines Polymers in wässeriger Lösung und Auftragen der Mischung zu einer zusammenhängenden Folie. Die gebildeten Membranen sind wasserunlöslich und können trocken aufbewahrt werden.
Das US-Patent 5 855 652 offenbart eine Apparatur zum raschen Sammeln von Aerosolen, die feste Teilchen und Mikroorganismen enthalten, aus großen Luftvolumina. Dieses US-Patent legt die Verwendung von wasserlöslichen Polymeren, um Mikroorganismen aus Luftproben zu sammeln, nicht offen.
"Monitoring Airborne Microorganisms during Food and Beverage Processing" in der Technischen Kurzdarstellung der Millipore Corporation, "New Brunswick Slit-to Agar Biological Air Sampler", auf der Online-Webseite der New Brunswick Scientific Corporation und das GB 1 441 576 beschreiben sämtlich die Verwendung von Agar in besonderen Vorrichtungen zur Probenahme von Mikroorganismen aus Luft. Diese Referenzen versagen darin, die Verwendung wasserlöslicher Polymere mit einem Gleichgewichtswassergehalt zwischen 1% und 50% zu beschreiben.
Das EP A 0 845 480 offenbart Polyvinylpyrrolidon-Hydrogele, die vernetzt und somit wasserbeständig sind.
Die Analyse von Mikroorganismen ist in vielen verschiedenen Gebieten wichtig, zum Beispiel bei der Nahrungsmittelherstellung, bei Trinkwasser, für pharmazeutische Anwendungen bei der Arzneimittelherstellung, bei der Kosmetika-Analyse, in elektronischen Industrien und bei der Analyse medizinischer Anwendungen.
Proben zum Prüfen von verschiedenen Mikroorganismen werden im Allgemeinen unter Verwendung von Wattestäbchen beispielsweise gesammelt und zu einem Laboratorium zur Analyse gesandt. Das Analyseverfahren erfordert, dass die Proben zuerst kultiviert werden.
Alternativ sind im Fachgebiet auch Schnellmethoden zur Analyse von Mikroorganismen unter Verwendung von Biosensoren bekannt. Beispielsweise offenbart die WO 9931486 Biosensoren, die eine Polymerfolie aufweisen, die mit einem Metall beschichtet ist, und eine gemusterte Aufnahmeschicht ist auf dem beschichteten Metall gedruckt, auf welcher sich ein aufnahmefähiges Material befindet, dass spezifisch den Analyten bindet. Die Menge an Mikroorganismen, die an den Biosensor angelagert wurde, wurde mithilfe eines Beugungsbildes infolge der Bestrahlung mit einem Laser gemessen.
Ein anderer Biosensortyp ist in der WO 982747 offen gelegt, der eine Polymerfolie umfasst, die mit einem Metall und einer sich selbst aufbauenden Monoschicht beschichtet ist, die ein aufnahmefähiges Material, spezifisch für einen Analyten, auf sich aufweist, und die auf die Folie gedruckt ist. Die sich selbst aufbauende Monoschicht ist in einem Muster gedruckt, so dass, wenn der Biosensor den Analyten bindet, der Biosensor transmittiertes Licht unter Bildung eines Musters beugt.
Obwohl Biosensoren verschiedene Mikroorganismen in der Umgebung nachweisen können, sollte es anerkannt werden, dass die Messung eines Beugungsmusters oftmals unrichtig, ungenau und von mangelnder Empfindlichkeit ist.
Darüber hinaus ist eher die Bestimmung der Anzahl aktiver Mikroorganismen als die der Gesamtanzahl in vielen Gebieten der Mikrobiologie von großer Bedeutung. Leider ist es weitgehend anerkannt, dass übliche Kultivierungstechniken den Anteil von wirklich lebensfähigen Mikroorganismen unterschätzen, und dass Gesamtanzahlen, die alle Mikroorganismen-Teilchen zeigen, diesen Anteil überschätzen.
Neben den mit dem Erhalt einer richtigen Anzahl von in einer Probe vorliegenden Mikroorganismen verbundenen Problemen ist es auch bekannt, dass Kultivierungstechniken auf einem Wachstumsmedium zeitaufwendig sind und im Allgemeinen zwischen etwa achtzehn Stunden und zwanzig Tagen erfordern, um ein Ergebnis zu erhalten. Die Verwendung von herkömmlichem Wachstumsmedium ist nicht-spezifisch und natürlich, dadurch variabel und unkontrolliert.
Ein Verfahren, dass die Erfordernis des Kultivierens von Mikroorganismen, nachdem sie als Probe genommen wurden, überwindet, ist in der EP 0 816 513A1 beschrieben. Diese Referenz offenbart die Verwendung einer druckempfindlichen Adhäsionsplatte zum Sammeln von Mikroorganismen auf Oberflächen, welche die Mikroorganismen enthalten können. Die Adhäsionsplatte besteht aus einem Laminat aus einer klebrigen Schicht, die hauptsächlich aus einem wasserlöslichen Polymeren besteht, und einer wasserdurchlässigen Membran, die die Passage von Mikroorganismen nicht zulässt. Somit erfordert die EP 0 816 513A1 , dass mindestens zwei Schichten der Adhäsionsplatte aneinander gebunden werden, von denen eine Schicht das Einfangen der Mikroorganismen in einem Vorgang nach der Probenahme bewirkt.
Darüber hinaus erfordert die Probenahme der Mikroorganismen mit der druckempfindlichen Adhäsionsplatte, dass die klebrige Schicht derart mit der Oberfläche eines Prüfgegenstands in Kontakt gebracht wird, dass eine Anreicherung von Mikroorganismen auf der Platte bewerkstelligt wird. Deshalb wird sogar eine visuelle Beobachtung von Mikroorganismen unter Verwendung eines chromogenen Mittels, das in der Adhäsionsschicht oder in Wasser vorliegt, bewerkstelligt, wobei ein solches Verfahren nicht sehr empfindlich sein kann.
Die EP 0 816 513 A1 legt nicht offen oder nahe, dass entweder ihre Vorrichtung zur Probenahme, die mindestens zwei laminierte Schichten benötigt, und/oder ihr Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen zur Sterilitätsprüfung von Luftproben, bei dem eine sehr hohe Nachweisempfindlichkeit erforderlich ist, verwendet werden kann/können.
Tatsächlich ist es im Fachgebiet gut bekannt, dass eine spezifische Überwachung und Kontrolle von aseptischen Umgebungen für die Verarbeitung von Arzneimitteln, Dosierungsformen und, in bestimmten Fällen, von medizinischen Vorrichtungen erforderlich sind. Ein großer Teil steriler Produkte wird durch aseptische Verarbeitung hergestellt, da dieser Vorgang auf dem Ausschluss von Mikroorganismen aus dem Prozessfluss und der Verhinderung des Eindringens von Mikroorganismen in Behälter während des Abfüllens beruht. Die aseptische Verarbeitung wird im Allgemeinen in Reinräumen durchgeführt, und die Umgebung wird immer sorgfältig überwacht.
Neben der Anwendung aseptischer Bedingungen in der pharmazeutischen Industrie verwendet und überwacht auch die elektronische Industrie Reinräume für die Herstellung elektronischer Komponenten, von Computerchips, von Computerkomponenten und dergleichen.
Der Unterschied zwischen diesen beiden Industrien in der Umgebungsüberwachung besteht darin, dass in der elektronischen Industrie nicht-lebensfähige Mikroorganismen oder Teilchen im Allgemeinen gemessen werden, und es wird weniger Gewicht auf die Anzahl lebensfähiger Teilchen oder Mikroorganismen gelegt. Im Gegensatz dazu gibt es in der pharmazeutischen Industrie viel größere Besorgnis über den Punkt der lebensfähigen Mikroorganismen.
Ein Überwachungsverfahren unter aseptischen Verhältnissen besteht darin, die Teilchengesamtzahl festzustellen. Dieses Verfahren liefert keine Information, die den mikrobiologischen Gehalt der Umgebung betrifft. Die grundsätzliche Begrenzung von Teilchenzählern besteht darin, dass sie lediglich Teilchen von 0,5 μm oder größer messen. Während aus der Luft stammende Teilchen nicht frei schwebend oder einzelne Zellen sind, assoziieren sie sich häufig mit Teilchen von 10 μm bis 20 μm, und deswegen ist das ausschließliche Prüfen auf Teilchenanzahlen ohne Mikrobenzählungen entmutigend.
Es ist im Fachgebiet bekannt, dass Reinräume besondere Standards erfüllen müssen. Tatsächlich sind Spezifikationen für Luftwechsel pro Stunde und Geschwindigkeiten gebräuchlich, obwohl nicht in bundesweite Standards aufgenommen. Beispielsweise sind demnach Räume in aseptischen Verarbeitungsumgebungen der Klasse 100 000 entworfen, um ein Minimum von 20 Luftwechseln pro Stunde bereitzustellen, während Räume der Klasse 100 mehr als 100 Luftwechsel pro Stunde vorsehen. Durch Verdünnung und Entfernung von Verunreinigungen ist es wahrscheinlich, dass große Luftvolumina eine aus der Luft stammende Verunreinigung bei der aseptischen Produktion vermindern.
Es gibt bestimmte Luftreinheits-Richtlinien, die für die verschiedenen Reinraumklassen erfüllt werden müssen. Beispielsweise muss danach für die Klasse 100 der laufende Mittelwert aller Datenpunkte < 1 Kolonie-bildende Einheit (cfu) pro Kubikmeter Luft betragen, und mindestens 85% aller genommenen Proben müssen den Wert Null aufweisen. Für Reinräume der Klasse 10 000 müssen mindestens 65% aller genommenen Proben den Wert Null aufweisen, und für Klasse 100 000 müssen mindestens 50% der Proben den Wert Null aufweisen. Diese Werte sind somit sehr kritisch, um eine zuverlässige Umgebungsüberwachung bereitzustellen.
Es gibt viele im Fachgebiet bekannte Verfahren für die Probenahme lebensfähiger Mikroorganismen aus der Luft, wie der Spalt-auf-Agar-Probenehmer, der Sieb-Impaktor, der Zentrifugal-Probenehmer, der Oberflächen-Luftsystem-Probenehmer und der Gelatinefilter-Probenehmer. Alle diese Probenahmegeräte benötigen eine Pumpe, einen Motor oder ein Vakuum, welche/r/s Luft durch die Probenahmeeinheit entweder zieht oder drückt. Die Verwendung dieser "aktiven" Probenahmevorrichtungen kann unzweckmäßig sein, wenn es eine Platzbeschränkung in dem Reinraum gibt, weil sie benötigten Platz besetzen können. Darüber hinaus können diese Vorrichtungen auch eine Gefahr für zuverlässige aseptische Bedingungen sein, da sie einen gerichteten Luftstrom als ein Ergebnis der Größe und Anordnung des Instruments unterbrechen können oder aufgrund der Weise, in der die Gerätschaft Luft in die Probenahme-Medien oder -Filter zwingt.
Ein anderer Typ von "nicht-aktiven" Probenahmevorrichtungen besteht aus Besiedlungsplatten. Besiedlungsplatten stellen einen einfachen und kostengünstigen Weg zur qualitativen Bewertung der Luftumgebung über lange Zeitperioden dar. Besiedlungsplatten bestehen aus Agar, der in Petri-Schalen eingebracht ist, und sind nützlich in kritischen Bereichen, wo die Verwendung einer aktiven Probenahmevorrichtung behindernd ist. In der Tat können Besiedlungsplatten, wenn sie während Perioden von vier bis fünf Stunden exponiert werden, eine Nachweisgrenze ähnlich denjenigen, die mit aktiven Probenahmevorrichtungen beobachtet werden, zur Verfügung stellen.
Bei vielen dieser Verfahren wird jedoch Agar als das Medium zum Einfangen der Mikroorganismen verwendet, und es ist bekannt, dass Agar-Engpässe wie auch Produktschwankungen zur Suche nach geeigneten Ersatzmitteln für Agar geführt haben.
Darüber hinaus ist es im Fachgebiet gut bekannt, dass die Überwachung von Mikroorganismen unter aseptischen Bedingungen bisher nicht ausgereift ist. Schwankungen in Probenahmeempfindlichkeit und Nachweisgrenzen können nicht nur den inhärenten Merkmalen des Probenahmeverfahrens selbst zugeschrieben werden sondern auch Medienschwankungen, Inkubationstemperaturen, Probenbehandlung und unbeabsichtigter Kontamination der Proben.
Darüber hinaus wird die mikrobielle Beurteilung von Reinräumen unter Anwendung von Verfahren, die keine quantitative Bewertung ergeben, durchgeführt. Stattdessen können die angewendeten Verfahren bestenfalls als halbquantitativ definiert werden. Viele Verfahren sind tatsächlich nur geeignet, die Anwesenheit von untypisch hohen Niveaus an mikrobieller Kontamination zu messen, und ihre Richtigkeit und Präzision ist sehr gering.
Es besteht daher in dem Fachgebiet der Umgebungsanalyse hinsichtlich Mikroorganismen ein Bedarf, nicht nur ein schnelles Analyseverfahren für Luftproben sondern auch ein Hilfsmittel zur Bewerkstelligung dieser Analyse mit größerer Genauigkeit, insbesondere im Bereich der Sterilitätsprüfung, zur Verfügung zu stellen.
Es ist somit ein Ziel der vorliegenden Erfindung, die mit dem Stand der Technik verbundenen Probleme zu überwinden.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, wasserlösliche Polymere zu verwenden, um Mikroorganismen in Luft einzufangen und einzuschließen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein empfindliches Hilfsmittel zur Sterilitätsanalyse von Luftproben bereitzustellen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Polymer bereitzustellen, das eine ausreichende mechanische Festigkeit besitzt, so dass es transportiert werden kann, das in Wasser oder anderen physiologischen Verdünnungsmitteln löslich ist, Wasser in einem bestimmten Ausmaß zurückhält, während lebendige Mikroorganismen in einem lebensfähigen Zustand gehalten werden, und Mikroorganismen aus der Luft einfangen kann.
Noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zum raschen Nachweis von Mikroorganismen in einer unbekannten Luftprobe bereitzustellen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen in einer unbekannten Luftprobe bereitzustellen, das nicht erfordert, dass die Mikroorganismen einem weiteren Wachstum unterzogen werden.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren bereitzustellen, bei dem das schwankende und unkontrollierte System der Verwendung von Wachstumsmedium vermieden wird.
Diese und andere Ziele werden durch die vorliegende Erfindung erreicht, wie durch die Zusammenfassung der Erfindung, die Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen und die Ansprüche gezeigt wird.
Zusammenfassung der vorliegenden Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweisen der Anzahl von Mikroorganismen in der Luft in einer aseptischen Umgebung bereit, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(a) Einfangen und Einschließen der erwähnten in der Luft vorhandenen Mikroorganismen mit einem wasserlöslichen Polymer;
(b) Auflösen des wasserlöslichen Polymers in einem Verdünnungsmittel zur Bildung einer Lösung;
(c) Abtrennen der Mikroorganismen von der Lösung; und
(d) Nachweisen der Mikroorganismen mittels Fluoreszenz unter Verwendung eines Scan RDI^®-Analysators oder eines D-Count^®-Analysators.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen
Die 1 ist eine Graphik, welche die Variation der Filtrationszeit mit der Konzentration des Polymers Poly(vinylalkohol) (PVA) (K30) unter Verwendung einer 0,4 μm-Porositätsmembran (CB04) darstellt.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung
Wie hierin verwendet, umfasst der Ausdruck "Mikroorganismus" Algen, Bakterien, Pilze (Hefe, Schimmel und Schimmelsporen) (einschließlich Flechten), Rickettsien, Protozoen, Pollen, Parasiten, Milben, Viren und subvirale Agenzien.
Wie hierin verwendet, umfasst der Ausdruck "Bakterien" Sporen bildende Bakterien und beinhaltet Escherichia coli, Brucella, Shigella, Clostridia, Bacillus anthracis, Bacillus subtilis, Staphylococcus epidermidis, Treponema, Leptospira, Borrelia, Vibrio fetus, Spirillum minus, Staphylococci, Streptococci, Gonococci, Salmonella, Meningococci und dergleichen, wie auch Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa, Aspergillus niger, Mycobacterium phlei, Shigella sonnei, Zymomonas sp, Edwardsiella ictulari und dergleichen, ist jedoch nicht darauf beschränkt.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Ausdruck "wasserlösliche Polymere", dass die Polymere in Wasser und/oder physiologischen Verdünnungsmitteln löslich sind, ausreichende mechanische Festigkeit, so dass das Polymer befördert werden kann, aufweisen, Wasser in einem bestimmten Ausmaß zurückhalten und an Mikroorganismen haften.
Mit "lebensfähigen Mikroorganismen" ist gemeint, dass die Mikroorganismen in der Lage sind, unter geeigneten Bedingungen zu leben.
Mit "geeigneten Bedingungen" ist gemeint, dass die Mikroorganismen nicht ausgetrocknet oder nicht gestresst werden.
Mit "Einfangen" ist gemeint, dass die Mikroorganismen von der Umgebung durch die wasserlöslichen Polymere abgesondert werden.
Mit "Einschließen" ist gemeint, dass die Mikroorganismen an den wasserlöslichen Polymeren anhaften oder anderweitig eingefangen werden.
Mit "der Umgebung" sind Umfelder gemeint, gleich, ob sie Luft, physikalische Objekte, Oberflächen oder dergleichen sind.
Wie hierin verwendet, werden die Ausdrücke "ScanRDI^®" und "ChemScanRDI^®" austauschbar verwendet und stehen für dasselbe Gerät. Im Fachbereich ist es gut bekannt, dass in den USA das Gerät als "ScanRDI^®" bezeichnet wird, während es in Europa als "ChemScanRDI^®" bezeichnet wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft, genauer gesagt, ein Verfahren, um Mikroorganismen, die in der Luft vorliegen, unter Verwendung eines wasserlöslichen Polymers einzufangen und einzuschließen. Vorzugsweise bezieht die vorliegende Erfindung die Umgebungsanalyse hinsichtlich Mikroorganismen ein, die beispielsweise in einem Reinraum vorliegen, in dem aseptische Bedingungen aufrechterhalten werden müssen. Nachdem die Mikroorganismen eingefangen und eingeschlossen sind, können sie zu einem Laboratorium zur weiteren Analyse weiterbefördert werden.
Die Mikroorganismen, die eingefangen und eingeschlossen sind, können lebensfähige Mikroorganismen, nicht-lebensfähige Mikroorganismen und Mischungen davon sein. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden lebensfähige Mikroorganismen in der Luft unter Verwendung wasserlöslicher Polymere eingefangen und eingeschlossen. Die lebensfähigen Mikroorganismen werden dann befördert und einer Analyse unterzogen.
Nachdem die Mikroorganismen auf dem wasserlöslichen Polymer gesammelt sind, werden sie unter Verwendung eines ScanRDI^®- oder D-Count^®-Analysators analysiert. Die Verwendung dieser besonderen Analysatoren liefert eine Zählung der Mikroorganismen innerhalb von etwa 90 Minuten ab dem Empfang der Probe und kann die Anwesenheit von bis hinunter zu einem einzigen in der Luft vorliegenden Mikroorganismus mithilfe des ScanRDI^®-Analysators messen. Die Empfindlichkeit dieser Art der Analyse ist für die Überwachung von Mikroorganismen, die bei aseptischer Verarbeitung, wie in Reinräumen, vorliegen können, extrem wichtig. Außerdem besteht keine Notwendigkeit, die Mikroorganismen vor der Analyse zu kultivieren, wodurch Zeit und Kosten gespart werden.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten wasserlöslichen Polymere sollten an die Umgebungsanalyse anpassbar sein und sollten mit eindeutigen und reproduzierbaren physikalischen Eigenschaften hergestellt werden. Außerdem sollten die in der vorliegenden Erfindung verwendeten wasserlöslichen Polymere in Wasser und/oder einem physiologischen Verdünnungsmittel leicht löslich sein, eine angemessene mechanische Festigkeit haben, so dass sie ohne Bruch transportiert werden können, Wasser in einem bestimmten Ausmaß zurückhalten, damit die Mikroorganismen, die eingefangen und eingeschlossen werden, zur Analyse lebensfähig sein können, und an Mikroorganismen in der Luft haften.
Es ist bevorzugt, dass die wasserlöslichen Polymere eine Morphologie mit einem großen Oberflächenbereich für ein ausreichendes Einfangen der Mikroorganismen aufweisen, nicht-toxisch sind, gute Folienbildungseigenschaften oder Formungseigenschaften besitzen, Verarbeitbarkeit, filtrierbar nach Auflösung sind, nicht-bakterizid und vorzugsweise sterilisierbar sind, sofern gewünscht.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten wasserlöslichen Polymere können natürlich oder synthetisch sein. Falls natürliche Polymere verwendet werden, können sie modifiziert werden, um die oben stehenden spezifischen Merkmale, zum Beispiel durch Polymeraufpfropfen oder Oxidation, zu erlangen. Bevorzugt ist es, dass strukturell eindeutige wasserlösliche Polymere in dem Vorgang des Einfangens und Einschließens der Mikroorganismen verwendet werden.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Polymere können wasserlösliche Homopolymere, wasserlösliche Copolymere, Mischungen aus mehr als einem Homopolymer/-Copolymer, poröse Polymere und dergleichen sein. Diese Polymere können entworfen und synthetisiert werden, um die oben beschriebenen spezifischen Eigenschaften zu erzeugen.
Die wasserlöslichen Polymere der vorliegenden Erfindung sind, genauer gesagt, durch ihre mechanische Festigkeit charakterisiert; d.h., sie können ohne Bruch transportiert werden und haben somit ein bestimmtes Molekulargewicht, das innerhalb des Bereichs von 500 bis 500 000 g/mol, vorzugsweise 2 000 bis 250 000 g/mol, stärker bevorzugt 1 000 bis 100 000 g/mol liegt.
Die wasserlöslichen Polymere müssen außerdem in Wasser und/oder anderen physiologischen Verdünnungsmitteln löslich sein, wobei dieses Merkmal vom Molekulargewicht abhängt und, sofern zutreffend, dem Hydrolysegrad. Die speziellen Molekulargewichte, die durch diese Löslichkeitskriterien umfasst werden, sind oben dargelegt. Soweit, falls anwendbar, der Hydrolysegrad betroffen ist, besitzen die wasserlöslichen Polymere der vorliegenden Erfindung einen Hydrolysegrad zwischen 70% und 90%, vorzugsweise zwischen 75% und 90%, und am meisten bevorzugt zwischen 80 und 89%.
Die wasserlöslichen Polymere der vorliegenden Erfindung müssen außerdem Wasser in einem bestimmten Ausmaß zurückhalten. Dieses Merkmal kann durch den Gleichgewichtswassergehalt gemessen werden, wenn diese Polymere gegossen und luftgetrocknet werden. Genauer gesagt, der Gleichgewichtswassergehalt sollte zwischen 2% und 40% w/w und stärker bevorzugt 4% und 30% w/w liegen.
Aufgrund der obigen Eigenschaften der mechanischen Festigkeit, Hydrophilie und Wasserrückhaltung haften die wasserlöslichen Polymere der vorliegenden Erfindung an Mikroorganismen, wie in den Beispielen beispielhaft dargestellt. Somit können in der Luft anwesende Mikroorganismen leicht mit den in der vorliegenden Erfindung dargelegten wasserlöslichen Polymeren eingefangen und eingeschlossen werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform können die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Polymere auch die folgenden Eigenschaften aufweisen:

(1) das Polymerpulver sollte in einem geeigneten Verdünnungsmittel bei Umgebungstemperatur leicht löslich sein;
(2) sie sollten Folienbildungs- oder Formungseigenschaften besitzen und können als eine einheitliche Folie oder in einer Form gegossen werden;
(3) sie sollten gute mechanische Eigenschaften besitzen und idealerweise leicht aus dem Behälter, in dem sie gegossen werden, ohne Zerbrechen entfernt werden;
(4) die Polymerfolien, -formen, -kugeln oder Mikrokugeln sollten sich vollständig in Wasser bei Umgebungstemperaturen in einem angemessenen Zeitmaß auflösen;
(5) die Polymerfolien, -formen, -kugeln oder Mikrokugeln sollten sich unter Bildung klarer, homogener Lösungen in Wasser, die durch Membranen filtrierbar sind, auflösen;
(6) kein störender Polymerrest sollte nach der Filtration auf der Membran bleiben;
(7) das Polymer sollte nicht-bakterizid sein;
(8) die Polymerfolie, -form, -kügelchen oder Mikrokugeln sollten gegenüber Mikroorganismen anheftend sein;
(9) das Polymer sollte vorzugsweise bis zu 120°C thermisch stabil sein; d.h., stabil unter Autoklavierungsbedingungen oder inert gegenüber Bestrahlung;
(10) das Polymer muss Wasser zurückhalten; und
(11) das Polymer sollte nicht chemisch vernetzt sein, um bei Sterilisation ein unlösliches Gel zu bilden.

Beispiele der Polymeren, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, können poröse oder wasserlösliche synthetische Polymere sein. Poröse Polymere können beispielsweise unter Anwendung der Vorgehensweise von Yang und Zhang, Journal of Membrane Science, 114, Seiten 149–155 (1996), hergestellt werden. Wasserlösliche synthetische Polymere schließen Polyethylenoxid (PEO), Polyethylenglykol (PEG), Poly(vinylpyrrolidon) (PVP), Poly(vinylalkohol) (PVA), Poly(acrylsäure) (PAA), Poly(acrylsäure)-Natriumsalz (PAMPSA), Poly(natriumstyrolsulfonat) (PSSS), Polyacrylamid, Agarose, Poly-(hydroxyethylmethacrylat) (PHEMA), Poly(hydroxyethylacrylat) (PHEA) und dergleichen ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Zwei Copolymere oder Mischungen von mehr als einem Homopolymer/Copolymer können ebenfalls verwendet werden. Das Polymer kann auch maßgeschneidert oder modifiziert werden, um die verschiedenen Eigenschaften des Polymers wie gewünscht zu verändern; d.h., zum Beispiel, um ihre mechanische Festigkeit, Wasserlöslichkeitsmerkmale, Mikroorganismus-Rückhaltequalität, Wasserrückhaltequalität und Kombinationen davon zu steigern oder abzuschwächen.
In einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist es bevorzugt, als das wasserlösliche Polymer zwischen 1 000 und 250 000 g/mol, stärker bevorzugt zwischen 5 000 und 100 000 g/mol, am stärksten bevorzugt zwischen 7 500 g/mol und 25 000 g/mol von Poly(vinylalkohol) (PVA); 5 000 und 500 000 g/mol, stärker bevorzugt 10 000 und 100 000 g/mol und am meisten bevorzugt 20 000 und 75 000 g/mol Poly(vinylpyrrolidon) (PVP); zwischen 500 und 100 000 g/mol, stärker bevorzugt zwischen 1 000 und 50 000 g/mol, am meisten bevorzugt zwischen 2 000 und 10 000 g/mol Polyethylenoxid (PEO); zwischen 2 000 und 250 000 g/mol, stärker bevorzugt zwischen 5 000 und 100 000 g/mol, am meisten bevorzugt zwischen 10 000 und 50 000 g/mol Poly(acrylsäure) (PAA); zwischen 1 000 und 250 000 g/mol, stärker bevorzugt zwischen 2 000 und 100 000 g/mol, am meisten bevorzugt 5 000 und 50 000 g/mol Poly(acrylsäure)-Natriumsalz (PAMPSA); und zwischen 500 und 500 000 g/mol, stärker bevorzugt 1 000 und 50 000 g/mol, am meisten bevorzugt 1 500 und 10 000 g/mol Polyacrylamid, zu verwenden.
In einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, Poly(vinylalkohol) (PVA) mit einem mittleren Molekulargewicht in dem Bereich von 10 000 bis 100 000 g/mol und einem Hydrolysegrad in dem Bereich von 80% bis 90% zu verwenden.
Die Polymere können in der Form von Folien, Tupfern, Platten, Fasern, Scheiben, Kontaktplatten, Mikrokugeln, Kugeln und dergleichen gestaltet sein. Die Gestalt des Polymers ist nicht wichtig und kann an die Umgebung, in der eine Luftprobenahme benötigt wird, angepasst werden. Alle diese Formen können unter Verwendung von porösen oder nicht-porösen Polymeren angepasst werden.
Wenn die wasserlöslichen Polymere in der Form eines flachen Gegenstandes gestaltet sind, wie eine Folie, Platte oder Scheibe, kann die Dicke des Polymeren in einem Bereich zwischen 50 μm und 5 mm variieren. Es ist bevorzugt, die Dicke in einem Bereich zwischen 50 μm und 1 mm vorliegen zu haben.
Wenn Mikrokugeln oder Kügelchen gewünscht werden, können Verfahren der Extrusion oder Emulgierung/Suspendierung, die im Fachgebiet bekannt sind, angewendet werden. Zum Beispiel können Mikrokugeln durch das Verfahren von Thanoo et al., J. Pharm. Pharmacol. 45, 16 (1993), hergestellt werden.
Die Größe der Mikrokugeln kann abhängig von der Menge von Mikroorganismen, die eingefangen und eingeschlossen werden soll, variieren. Die Größe kann von 50 nm bis 3 mm reichen, stärker bevorzugt von 1 μm bis 1 mm, am stärksten bevorzugt 250 μm bis 500 μm.
Die wasserlöslichen Polymere können aus der Lösung gemäß im Fachgebiet bekannter Methoden gegossen werden. Zum Beispiel kann das Polymerpulver in einem Verdünnungsmittel gelöst und, falls gewünscht, sterilisiert werden.
Das Verdünnungsmittel, das im Allgemeinen zum Auflösen des wasserlöslichen Polymers verwendet wird, ist im Allgemeinen bakterienfreies Wasser. Phosphatgepufferte Salzlösung, destilliertes Wasser, entionisiertes Wasser, WFI-Wasser, steriles Wasser und Mischungen davon können jedoch ebenfalls verwendet werden. Erforderlichenfalls kann der pH-Wert der Polymerlösung unter Verwendung von verdünnter Essigsäure oder verdünntem Natriumhydroxid auf den gewünschten pH-Wert eingestellt werden, wie ein neutraler pH-Wert.
Wenn eine Sterilisation gewünscht wird, kann jedwedes Sterilisationsverfahren angewendet werden, solange die wasserlöslichen Polymere ihre Wasserlöslichkeit, mechanische Festigkeit beibehalten, nicht ausgetrocknet werden und ihre Einfang- und Einschließungsfähigkeiten aufrechterhalten, so dass die Mikroorganismen in dem wasserlöslichen Biopolymer überleben. Die Polymere können, genauer gesagt, unter Verwendung eines Autoklaven (121°C während 15 Minuten), durch Gammabestrahlung (bei einer Dosis zwischen 10 K Gray und 30 K Gray, vorzugsweise 20 K Gray) oder durch die Anwendung einer Ethylenoxidbehandlung sterilisiert werden.
Die Lösung des wasserlöslichen Polymers kann durch eine Polyestermembran filtriert werden, um die Lösung des wasserlöslichen Polymers aufzureinigen. Im Allgemeinen wird eine Membran von 0,3 μm bis 0,6 μm, vorzugsweise 0,4 μm bis 0,5 μm, stärker bevorzugt eine Membran von 0,45 μm verwendet.
Nach der Sterilisation wird das verdünnte wasserlösliche Polymer dann zu einer geeigneten Gestalt geformt, wie oben beschrieben, und wird gegossen, indem die Lösung bei Umgebungstemperatur oder in einem Laminarabzug verdampfen gelassen wird.
Im Allgemeinen reichen die Konzentrationen des wasserlöslichen Polymers während des Gießens von etwa 1% Gew.-% bis 20 Gew.-%, vorzugsweise 1 Gew.-% bis 12 Gew.-%, stärker bevorzugt von 5% Gew.-% bis 10 Gew.-%. Bei der Verwendung von zwei Copolymeren oder von Mischungen aus mehr als einem Homopolymeren/Copolymeren, wird dieselbe Endkonzentration verwendet. Zum Beispiel kann eine Copolymermischung aus 1 Gew.-% Poly(vinylalkohol) und 4 Gew.-% Poly(vinylpyrrolidon) verwendet werden.
In einer typischen Vorgehensweise kann ein Aliquot des wasserlöslichen Polymers gegossen werden. Beispielsweise können 5 ml einer 10%-igen Polymerlösung zu einer Petrischale gegeben werden, und das Wasser wird bei Raumtemperatur in einem Laminarstromabzug verdampfen gelassen, um das wasserlösliche Polymer zu gießen.
Das wasserlösliche Polymer sollte vorzugsweise unter sauberen und staubfreien Bedingungen hergestellt und gegossen werden.
"Im Allgemeinen" werden die wasserlöslichen Polymere für die Luftüberwachung in Petrischalen mit einer Größe zwischen 90 mm und 150 mm Durchmesser, stärker bevorzugt zwischen 50 mm und 130 mm Durchmesser gegossen. Im Allgemeinen wird eine größere Menge des Polymers bei der Probenahme von Luft als bei anderen Umgebungsanwendungen, wie die Überwachung von Mikroorganismen auf Oberflächen, benötigt.
Nachdem die Polymere gegossen sind, wird das wasserlösliche Polymer der Luft ausgesetzt, worin Mikroorganismen eingefangen und eingeschlossen werden. Die Probe wird vorzugsweise unter sterilen Bedingungen durch im Fachgebiet bekannte Verfahren aufgefangen.
Wenn man zum Beispiel die Menge von Mikroorganismen in einer bestimmten Umgebung oder einem bestimmten Raum messen möchte, kann das gegossene wasserlösliche Polymer in der Umgebung oder dem Raum während zwischen 1 und 10 Stunden, vorzugsweise 1,5 und 8 Stunden, stärker bevorzugt 2 und 4 Stunden gelassen werden. Das wasserlösliche Polymer wirkt als eine Falle und schließt die Mikroorganismen in dem Polymer ein.
Als Alternative kann das wasserlösliche Polymer an einem geeigneten Rahmen angebracht und vor einen Ventilationsschacht gehängt werden.
Nachdem die unbekannte Probe auf dem wasserlöslichen Polymer platziert oder eingefangen und eingeschlossen ist, wird das wasserlösliche Polymer mit der unbekannten Probe dann in einem Verdünnungsmittel, wie Pepton und 0,1% Tween80^®, oder WFI-Wasser, bakterienfreies Wasser, steriles Wasser, phosphatgepufferte Salzlösung und dergleichen, resuspendiert.
Die eingefangenen Mikroorganismen können durch Zentrifugation oder Filtration zurück gewonnen werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Filtrationsschritt angewendet. Die resuspendierte Polymerlösung kann durch Membranen von zwischen 0,1 μm bis 5 μm, vorzugsweise 0,2 μm bis 4,5 μm, am stärksten bevorzugt 0,4 μm, filtriert werden.
Der Gehalt der resuspendierten Polymerlösung hinsichtlich der Anzahl von Mikroorganismen wird unter Verwendung des D-Count^®-Analysators (Chemunex) oder unter Verwendung eines Scan RDI^®-Analysators (Chemunex), beschrieben in dem US-Patent 5 663 057, ermittelt. Unter Verwendung dieser zwei Analysatoren kann die Anzahl von in der Probe vorliegenden Mikroorganismen innerhalb von 90 Minuten analysiert werden, und es ist nicht erforderlich, dass die Mikroorganismen vor der Analyse gezüchtet werden. Beide Analysatoren sind Zytometer, die Laserstrahlen für die Analyse verwenden.
In dieser bevorzugten Ausführungsform kann die resuspendierte Polymerlösung, welche die Mikroorganismen enthält, mit dem Scan RDI^® analysiert werden. Die Probe wird dann durch eine Membran der Porosität 0,4 μm filtriert.
Die Mikroorganismen, die auf der Oberfläche zurückgehalten werden, werden entweder durch direktes Zugeben der Markierungslösung in die Proben für den D-Count^®-Analysator oder für den Scan RDI^®-Analysator markiert. Die Mikroorganismen, die auf der Oberfläche der Filtrationsmembran nach der Probenfiltration zurückgehalten werden, werden unter Verwendung eines fluoreszenten Markierungsmittels oder einer beliebigen Chemikalie, die Fluoreszenz erzeugt, markiert.
Fluoreszenzmarkierungsmittel, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen Fluoreszenzfarbstoffe, die auf Fluoreszeinderivaten beruhen, wie ChemChrome V, aber auch andere Arten von Fluoreszenzmarkierungsmitteln, wie Cascade Blue, Lucifer Yellow^®, Oregon Green^®, Acridin-Orange und dergleichen ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
In dieser bevorzugten Ausführungsform wird das ChemChrome V verwendet, wobei die Membran, welche die Mikroorganismen zurückhält, in Kontakt mit der ChemChrome V-Lösung gebracht wird, die auf dem folgenden Weg hergestellt worden ist:
100 μl ChemChrome V wurden zu 10 ml filtriertem (0,22 μm) ChemSol-Markierungspuffer gegeben. Die Lösungen wurden vollständig vermischt.
Nach Inkubation der Membran mit dem Fluoreszenzfarbstoff, gemäß den in der WO 98/-55861 beschriebenen Vorschriften, werden die Membranen danach mit dem Scan RDI^®-Analysator analysiert. Nach der Analyse korreliert die Menge der von den Analysatoren detektierten Fluoreszenzereignisse mit der Anzahl der Mikroorganismen in der Probe.
Um die vorliegende Erfindung und die Vorteile davon weiter zu veranschaulichen, werden die nachfolgenden spezifischen Beispiele gegeben, wobei zu verstehen ist, dass dieselben ausschließlich erläuternd und keineswegs einschränkend sein sollen.
BEISPIELE
Beispiel 1 – Herstellung von Polymeren
Herstellung von Poly(vinylalkohol)(PVA)-Folien
5 g Poly(vinylalkohol) (CAS-Nr. 9002-89-5) mit einem mittleren Molekulargewicht von 10 000 g/mol und einem Hydrolysegrad von 80% wurden in Wasser (100 cm³) unter Rühren bei Raumtemperatur gelöst. Nach vollständiger Auflösung wurde diese Lösung dann autoklaviert. 20 ml der Lösung wurden in eine sterile Plastik-Petrischale gegeben. Die Folie wurde dann in Luft gegossen, indem das Wasser bei Umgebungstemperatur in einem Laminarstrom-Abzug verdampfen gelassen wurde. Die Zeit für das Stattfinden des Foliengießens betrug etwa 10 Stunden, abhängig von den Laminarluftstrombedingungen. Der Gleichgewichtswassergehalt in den Folien, gemessen gemäß der oben dargelegten Vorgehensweise, lag bei etwa 6 Gew.-%.
Herstellung von Poly(vinylpyrrolidon)(PVP)-Folien
5 g Poly(vinylpyrrolidon) (CAS-Nr. 9003-3908) mit einem mittleren Molekulargewicht von 44 000 g/mol wurden in Wasser (100 cm³) unter Rühren bei Raumtemperatur gelöst. Nach vollständiger Auflösung wurde diese Lösung dann durch einen 0,45-Mikron-Filter filtriert. Eine 1%-ige Lösung wurde in eine sterile Plastik-Petrischale gegeben. Die Folie wurde dann in Luft gegossen, indem das Wasser bei Umgebungstemperatur in einem Laminarstrom-Abzug verdampfen gelassen wurde. Die Zeit für das Stattfinden des Foliengießens betrug etwa 16 Stunden.
Beispiel 2 – Wassergehalt und physikalische Eigenschaften der Polymere
Folien wurden aus wässrigen Lösungen in einem Konzentrationsbereich, der von 5% bis 10% variierte, gegossen; d.h., 5 g bis 10 g Polymer in 100 ml Wasser. 5 ml einer 10%-igen Polymerlösung wurden in eine kleine Petrischale gegeben, und das Wasser wurde bei Raumtemperatur und Umgebungsdrucken verdampfen gelassen. Die Folien wurden intakt aus den Petrischalen entfernt, und die mechanischen Eigenschaften der Folien wurden durch Messen der für das Auflösen des wasserlöslichen Polymers benötigten Zeit wie auch der Filtrationszeit beurteilt.
Die Folien wurden somit in reinem Wasser (50 ml bei 20°C) wieder aufgelöst, und die für die Auflösung benötigte Zeit wurde aufgezeichnet.
Filtrationstests wurden mit allen wasserlöslichen Polymeren (50 ml-Lösungen) in drei verschiedenen Konzentrationen von 1, 2 und 5% unter Standardbedingungen (400 mbar) unter Verwendung von zwei verschiedenen Filtrationsmembranen mit einer Porengröße von 0,2 μm bzw. 0,4 μm durchgeführt.
Der Gleichgewichtswassergehalt wurde für einige der gegossenen Folien erstellt, da angenommen wurde, dass dies von Bedeutung für die Bestimmung der Wasserrückhaltung ist. Die Folien wurden in Luft mithilfe des üblichen Verfahrens gegossen, wurden mit Wasser verdünnt und einem Laminarabzug zum Trocknen ausgesetzt und dann belassen, bis die Proben ein konstantes Gewicht erreichten. Die Proben wurden dann in einem Vakuum-Ofen bei 100°C getrocknet, wiederum bis die Proben ein konstantes Gewicht erreichten. Aus diesen Messungen kann ein Gleichgewichtswassergehalt aus der Massendifferenz zwischen den zwei konstanten Gewichten berechnet werden, die gleich der Wassermasse ist, d.h., ein Massen-Trockengewicht.
Beispiel 3 – Zytotoxizitätsstudien
Die obigen Polymerlösungen, und zwar PVA oder PVP, wurden in 50 ml vorfiltriertem Pepton (1 g/Liter) und 0,1% Tween 80^® resuspendiert. Ungefähr 10 bis 10³ der folgenden Mikroorganismen wurden zu der resuspendierten Polymerlösung in separate Röhrchen gegeben:
E. coli, S. aureus, P. aeruginosa, B. subtilis, C. albicans und A. niger
10 ml von jeder der Polymer/Mikroorganismen-Mischungen wurden dann unter Verwendung des Scan RDI^® unter Anwendung der Vorschriften für "TCV" und "Pilze" analysiert, die von Chemunex entwickelt wurden und mit dem Scan RDI^® kommerzialisiert werden.
Diese Vorschriften werden, genauer gesagt, im Allgemeinen unten dargelegt, aber der Fachmann würde verstehen, das eine ausführlichere Version, der gefolgt werden kann, in der WO 98/55861 dargelegt ist. Alle der unten erwähnten Reagentien sind öffentlich von der Chemunex SA erhältlich, die ihren Welt-Hauptsitz in Maisons-Alfort, Frankreich, hat.
Nachweis von Bakterien, Bakteriensporen und Hefe.
CSE/2-Gegenfärbung.
Mittels einer mit einer Nadel ausgestatteten Spritze (20 ml), wurde der Deckel der CSE/2-Flasche durchbohrt, und CSE/2 (1 ml pro Probe) wurde angesaugt. Eine 0,2-μm-Autotop-Filtereinheit für die Spritze wurde eingepasst, und 1 ml dieses Gegenfärbemittels wurde in den Filtertrichter dispensiert. Der Vakuumhahn wurde geöffnet, und das CSE/2 wurde durch den Filter laufen gelassen. Nach Vollständigkeit (keine Flüssigkeit verblieb auf der Oberfläche der Membran, aber die Membran sollte feucht bleiben) wurde der Vakuumhahn geschlossen. Das Vakuum wurde dann aufgehoben.
Vormarkierung von Proben
Der Probenträger wurde durch Anbringen der Markierungskissen-Träger in Position vorbereitet. Ein Markierungskissen wurde aus der Packung entfernt und 600 μl ChemSolA4 (Aktivierungsmedium) wurden dann auf dem Markierungskissen deponiert.
Die Probenmembran wurde auf das Markierungskissen übertragen, wobei sichergestellt wurde, dass dieselbe Seite der Membran mit dem Markierungskissen in Kontakt war wie mit dem Filter.
Das Markierungskissen und Membranen wurden bei 37°C ± 3°C während 60 min ± 5 min inkubiert.
Markierung der Proben
Nach der Vormarkierungsstufe wurde die Chemfilter-Membran auf ein neues Markierungskissen, das zuvor mit 600 μl Markierungslösung getränkt und während 30 Minuten bei 30°C gemäß den in der WO 98/55861 beschriebenen Vorschriften inkubiert worden war, übertragen.
Scan RDI^®-Analyse
Nach dem Markierungsschritt wurde die markierte Chemfilter-Membran in das Scan RDI^®-Gerät eingeführt. Die Analyse wurde während der auf die Einführung der Membran in das Gerät folgenden vier Minuten durchgeführt.
Die markierte Chemfilter-Membran von dem Markierungskissen wurde auf das Trägerkissen übertragen. Der in einer Petrischale geschützte Membranhalter wurde in das ChemScan-Gerät überführt. Das Abtasten wurde unter Verwendung der Software initiiert. Die Analyse wurde während der auf die Membranhaltervorbereitung folgenden vier Minuten durchgeführt.
Die Vorschrift für Pilze wird untenstehend dargelegt:
Pilze – Nachweis von Hefe und Schimmel
CSE/5-Gegenfärbung
Mittels einer mit einer Nadel ausgestatteten Spritze (20 ml) wurde der Deckel der CSE/5-Flasche durchbohrt, und CSE/5 (1 ml pro Probe) wurde angesaugt. Eine 0,2-μm-Autotop-Filtereinheit für die Spritze wurde eingepasst, und 1 ml wurde in den Filtertrichter dispensiert.
Der Vakuumhahn wurde geöffnet, und das CSE/5 wurde durch den Filter laufen gelassen. Nach Vollständigkeit (keine Flüssigkeit verblieb auf der Oberfläche der Membran, aber die Membran sollte feucht bleiben) wurde der Vakuumhahn geschlossen. Das Vakuum wurde dann aufgehoben.
Vormarkierung von Proben
Ein Markierungskissen wurde aus der Packung entfernt, und 600 μl ChemSolA6 (Aktivierungsmedium) wurden dann auf dem Markierungskissen deponiert. Die Probenmembran wurde auf das Markierungskissen übertragen, wobei sichergestellt wurde, dass dieselbe Seite der Membran mit dem Markierungskissen in Kontakt war wie mit dem Filter.
Das Markierungskissen und die Membranen wurden bei 30°C ± 3°C während 3 h ± 5 min inkubiert.
Markierung der Proben
Nach der Vormarkierungsstufe wurde die Chemfilter-Membran auf ein neues Markierungskissen, das zuvor mit 600 μl Markierungslösung getränkt und während 1 h bei 37°C ± 3°C gemäß den in der WO 98/55861 beschriebenen Vorschriften inkubiert worden war, übertragen.
Für die Markierungsstufe wurde ein frisches Markierungskissen vorbereitet. Das Markierungskissen wurde auf einem Markierungskissenträger angebracht auf dem ChemPrep S., und 600 μl der Markierungslösung wurden auf dem Markierungskissen platziert.
Die Chemfilter-Membran wurde auf das neue Markierungskissen übertragen.
Das Markierungskissen und die Membran wurden dann in dem Probenträger zu dem ChemPrep S. überführt und während eines Minimums von 1 h bei 37°C ± 3°C zur Vervollständigung der Inkubation inkubiert.
Scan RDI^®-Analyse
Nach dem Markierungsschritt wurde die markierte Chemfilter-Membran in das Scan RDI^®-Gerät eingeführt. Die Analyse wurde während der auf die Einführung der Membran in das Gerät folgenden vier Minuten durchgeführt.
Kontrollen, in denen die Mikroorganismen, die keinen Kontakt mit dem Polymer hatten, allein verwendet wurden, wurden ebenfalls wie oben beschrieben analysiert. Die Ergebnisse sind in der untenstehenden Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
In der obigen Tabelle 1 steht die prozentuale Rückgewinnung für das Verhältnis zwischen den Scan RDI^®-Resultaten und den Plattenzählungen.
Beispiel 4 – Zusätzliche Zytotoxizitätsstudien
Die Herstellung der Polymeren wurde in Beispiel 2 durchgeführt. Das gleiche Verfahren wie in Beispiel wurde 3 durchgeführt, ausgenommen, dass die Mikroorganismen mit den Polymeren während 15 Minuten vor der Analyse in Kontakt gebracht wurden. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Tabelle 2 dargelegt.
Tabelle 2
Wie aus den Ergebnissen ersehen werden kann, waren die Rückgewinnungen größer als 100% und sind der Kontrolle sehr ähnlich.
Beispiel 5 – Messung von Mikroorganismen in Luft
In diesem Versuch wurde die Anzahl von Mikroorganismen in der Luft gemessen. Das Polymer PVA wurde wie in Beispiel 2 hergestellt und in den Laboratorien 30 Minuten bzw. 3 h 30 min vor der Analyse gelassen. Die Analyse wurde wie in Beispiel 3 dargelegt ausgeführt. Die Tabelle 3 gibt die Ergebnisse dieses Experiments wieder.
Tabelle 3
Beispiel 6 – Prüfung zusätzlicher Polymere
Polyethylenoxid (PEO), Polyethylenglykol (PEG), Poly(acrylsäure)(PAA), Poly(acrylsäure-Natriumsalz)(PAMPSA), Poly(Natriumstyrolsulfonat) (PSS) und Polyacrylamid werden gemäß Beispiel 2 hergestellt und gegossen unter Befolgung des Verfahrens in Beispiel 1. Zytotoxizitätsstudien werden wie in den Beispielen 3 und 4 durchgeführt. Die Anzahl der Mikroorganismen wird gemäß Beispiel 5 analysiert. Ähnliche Ergebnisse werden unter Verwendung dieser speziellen Polymere erhalten.
Beispiel 7 – In einem Reinraum gemessene Mikroorganismen
In diesem Experiment wird die Anzahl der Mikroorganismen in der Luft in einem Reinraum der Klasse 100 gemessen. Die Polymere werden wie in Beispiel 2 hergestellt und in einer Petrischale mit 90 mm Durchmesser gegossen. Das gegossene wasserlösliche Polymer wird dann durch den Lüftungskanal während Betriebsbedingungen gebracht und während 4 Stunden vor der Analyse gelassen. Die Analyse wurde wie in Beispiel 3 dargelegt ausgeführt.
Weil in dieser Probe keine Mikroorganismen anwesend sind, wird es bestätigt, dass der Reinraum die Luftreinheitsstandards in dieser speziellen kontrollierten Umgebung erfüllt.
Beispiel 8 – Nachweis der Gesamtpopulation von Mikroorganismen mit Acridin-Orange:
Zählung von lebensfähigen und toten Zellen mit dem Scan RDI^®.
Die obigen Polymerlösungen, und zwar PVA oder PVP, wurden wie in Beispiel 2 hergestellt und in eine Petrischale von 90 mm Durchmesser gegossen.
Etwa 10 bis 10³ Mikroorganismen einer Mischung (50 × 50) aus lebensfähigen und getöteten Mikroorganismen werden auf der Oberfläche des gegossenen wasserlöslichen Polymeren abgelegt.
Danach werden die Polymerfolien von den Platten entfernt und, wie in Beispiel 2 beschrieben, in reinem Wasser wieder aufgelöst.
Die die Mikroorganismen enthaltenden Lösungen der Polymere werden durch die 0,4-μm-Chemfilter-Membranen filtriert, bevor diese letzteren nach den folgenden Markierungsvorschriften weiterverarbeitet werden:

• die Anzahl lebensfähiger Mikroorganismen wird unter Verwendung des Lebensfähigkeits-Markierungsmittels (ChemChrome) und Scan RDI^®-Analysators gemäß der TVC-Vorschrift, wie in den vorangehenden Beispielen beschrieben, definiert
• die Gesamtzellpopulation (lebendig und tot) von Mikroorganismen wird unter Anwendung der folgenden Vorschrift ermittelt: 0,8 ml Acridin-Orange-Lösung werden auf die Oberfläche der Chemfilter-Membranen abgelegt und während zwei Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Anzahl markierter Zellen wird dann als Folge einer manuellen Begutachtung auf den Membranen mit einem herkömmlichen Epifluoreszenzmikroskop erhalten.

Die Ergebnisse zeigen einen perfekten Zusammenhang zwischen der mit dem Scan RDI^®-Analysator bestimmten Anzahl lebensfähiger Zellen, der erwarteten Anzahl getöteter Zellen und dem Wert für die Gesamtpopulation, der experimentell ermittelt wurde.

Claims

Verfahren zum Nachweisen der Anzahl von Mikroorganismen in der Luft in einer aseptischen Umgebung, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Einfangen und Einschließen den erwähnten in der Luft vorhandenen Mikroorganismen mit einem wasserlöslichen Polymer; (b) Auflösen des wasserlöslichen Polymers in einem Verdünnungsmittel zur Bildung einer Lösung; (c) Abtrennen der Mikroorganismen von der Lösung; und (d) Nachweisen der Mikroorganismen mittels Fluoreszenz unter Verwendung eines Scan RDI^®-Analysators oder eines D-Count^®-Analysators.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das wasserlösliche Polymer ein Molekulargewicht im Bereich von 500 bis 500 000 g/mol aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das wasserlösliche Polymer ein Molekulargewicht im Bereich von 2 000 bis 250 000 g/mol aufweist.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das wasserlösliche Polymer ein Molekulargewicht im Bereich von 1 000 bis 100 000 g/mol aufweist.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das wasserlösliche Polymer einen Hydrolysegrad von 70% bis 90% aufweist.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das wasserlösliche Polymer einen Hydrolysegrad von 75% bis 90% aufweist.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das wasserlösliche Polymer einen Hydrolysegrad von 80% bis 89% aufweist.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das wasserlösliche Polymer einen Wasser-Gleichgewichts-Gehalt von 2% bis 40% aufweist.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das wasserlösliche Polymer einen Wasser-Gleichgewichts-Gehalt von 4% bis 30% aufweist.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das wasserlösliche Polymer aus der Gruppe von Polyethylenoxid, Polyethylenglycol, Poly(vinylpyrrolidon), Poly(vinylalkohol), Poly(acrylsäure), Poly(acrylsäure)-Natriumsalz, Poly(styrolsulfonat), Polyacrylamid und Mischungen davon gewählt wird.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das wasserlösliche Polymer Poly(vinylalkohol) oder Poly(vinyl)pyrrolidon) ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Mikroorganismen in Schritt (c) mittels Filtration oder Zentrifugation getrennt werden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Verdünnungsmittel in Schritt (b) aus der Gruppe von Bakterien-freiem Wasser, Phosphat-gepufferter Salzlösung, destilliertem Wasser, entionisiertem Wasser, sterilen Wasser und Mischungen davon gewählt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei bis runter zu 1 Mikroorganismus detektiert werden kann.