ES2266287T3 - Procedimiento para atrapar y confinar microorganismos en el aire usando polimeros solubles en agua. - Google Patents
Procedimiento para atrapar y confinar microorganismos en el aire usando polimeros solubles en agua. Download PDFInfo
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Abstract
Un procedimiento para la detección del número de microorganismos en el aire en un entorno aséptico, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de: (a) atrapar y confinar dichos microorganismos presentes en el aire con un polímero soluble en agua; (b) disolución de dicho polímero soluble en agua en un diluyente para formar una disolución; (c) separación de dichos microorganismos de dicha disolución; y (d) detección de dichos microorganismos por fluorescencia usando un analizador Scan RDI® o un analizador DCount®.
Description
Procedimiento para atrapar y confinar
microorganismos en el aire usando polímeros solubles en agua.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la detección del número de microorganismos en el
aire en un entorno aséptico usando polímeros solubles en agua. Más
específicamente, los polímeros solubles en agua se pueden usar como
un vehículo en el mantenimiento de microorganismos viables y no
viables para análisis posteriores.
Los polímeros consisten en cadenas de unidades
químicas repetidas que se producen de forma natural o, en virtud de
su química, se pueden adaptar para formar polímeros sintéticos
mediante el control de la estructura química y el peso.
Los polímeros sintéticos se preparan mediante la
reacción química de monómeros para formar cadenas poliméricas
largas. Las dos variables principales que afectan a las propiedades
físicas de los polímeros sintéticos son la naturaleza química de
las unidades repetitivas monoméricas y el peso molecular del
polímero, que se puede controlar de manera precisa. Así, se sabe
que los polímeros con pesos moleculares superiores poseen mayor
resistencia mecánica, pero son más viscosos en disolución.
Variando la relación de grupos químicos dentro
del polímero, uno puede ajustar las propiedades físicas del
polímero para aplicaciones particulares. Por ejemplo, la
resistencia mecánica y solubilidad de los polímeros se puede
ajustar esta manera.
Mezclando diferentes tipos de polímeros, las
características del copolímero final pueden presentar
características optimizadas. Mediante el diseño y la síntesis de
polímeros específicos se pueden generar materiales con las
propiedades precisas necesarias para una función específica. Por
ejemplo, mediante el tratamiento específico, el área superficial de
una placa polimérica (90 mm) se puede incrementar desde 1 metro
cuadrado a 1500 metros cuadrados. Este único proceso incrementará
las características físicas y biológicas del polímero en un
mecanismo más eficiente para la recuperación de organismos del
entorno.
Los polímeros solubles en agua son conocidos en
la técnica y están descritos por Prokop y col. en "Water Soluble
Polymers for Immunoisolation I: Complex Coacervation and
Cytotoxicity" en Advances in Polymer Science, 136: págs.
53 a 73 (1998). Estos polímeros tienen múltiples usos tales como
corazones artificiales, como barreras de inmunoaislamiento, para el
control del dolor en pacientes terminales de cáncer y en la
encapsulación de las isletas pancreáticas.
Aparte de sus usos médicos, el material
polimérico también se usa en muchos de los suministros de
laboratorio tales como tubos de ensayo, pocillos de muestras,
puntas de pipeta, pipetas desechables y similares.
Por ejemplo, como soporte sólido, en un
procedimiento para la detección de ADN en una célula se usaron
diversos polímeros mientras se preservaba la morfología del núcleo,
como se describe en la patente de EE.UU. Nº 5.501.954. En este
procedimiento, el ADN se depositó sobre un filtro de membrana
polimérico, se incubó con una muestra marcada fluorescentemente y
se detectó usando una sonda marcada. Las membranas poliméricas
utilizadas estaban hechas de policarbonato, fluoruro de
polivinilideno, polisulfona, nylon, ésteres celulósicos, nitro
celulosa y Teflon® (PTFE). Las membranas poliméricas descritas en
esta patente son polímeros insolubles en agua, puesto que uno de los
requerimientos de este procedimiento es que las membranas
poliméricas deben retener el material celular a lo largo de una
serie de tratamientos y lavados, y aún así permanecer intacto.
El documento EP 546 032 describe un
procedimiento para la inmovilización de moléculas, polímeros o
microorganismos mezclando con una disolución acuosa una dispersión
de un polímero y aplicando la mezcla a una película coherente. Las
membranas formadas son insolubles en agua y se pueden almacenar en
seco.
La patente de EE.UU. Nº 5.855.652 describe un
aparato para recoger rápidamente aerosoles que contienen partículas
sólidas y microorganismos a partir de grandes volúmenes de aire.
Esta patente de EE.UU. no describe el uso de polímeros solubles en
agua para recoger microorganismos a partir de muestras de aire.
"Monitoring Airborne Microorganisms during
Food and Beverage Processing" en el Technical Brief de la
Millipore Corporation, "New Brunswick Slit-to
Agar Biological Air Sampler" en el sitio web de la New Brunswick
Scientific Corporation y el documento GB 1 441 576 describen el uso
de agar en dispositivos particulares para tomar muestras de
microorganismos a partir del aire. Estas referencias no describen
el uso de polímeros solubles en agua con un contenido de agua en
equilibrio de entre el 1% y el 50%.
El documento
EP-A-0 845 480 describe hidrogeles
de polivinilpirrolidona que están entrecruzados y por tanto son
resistentes al agua.
El análisis de microorganismos es importante en
numerosas áreas diferentes, por ejemplo, en la preparación de
alimentos, en el agua para el consumo, para aplicaciones
farmacéuticas en la producción de fármacos, para análisis
cosméticos, en la industria electrónica y en el análisis de
aplicaciones médicas.
Las muestras para la realización de pruebas de
diversos microorganismos generalmente se recogen usando algodones,
por ejemplo, y se envían a un laboratorio para su análisis. El
procedimiento de análisis requiere que primero se cultiven las
muestras.
Alternativamente, también se conocen en la
materia procedimientos rápidos para el análisis de microorganismos
usando biosensores. Por ejemplo, el documento WO 9931486 describe
biosensores que tienen una película polimérica recubierta con un
metal y una capa receptora estampada impresa sobre el metal
recubierto sobre el cual hay un material receptor que se une
específicamente al analito. La cantidad de microorganismos que se
adhieren al biosensor se mide mediante una imagen de difracción
tras la irradiación con un láser.
En el documento WO 982747 se describe otro tipo
de biosensor que comprende una película polimérica recubierta con
un metal y una monocapa auto-ensamblante que tiene
un material receptor sobre ella específico para un analito, impreso
sobre la película. La monocapa auto-ensamblante se
imprime con un patrón, de manera que, cuando el biosensor se une al
analito, el biosensor difracta la luz transmitida para formar un
patrón.
Se debe entender que aunque los biosensores
pueden detectar diversos microorganismos en el entorno midiendo un
patrón de difracción, a menudo es inexacto, impreciso y carente de
sensibilidad.
Además, la determinación del número de
microorganismos activos es de gran importancia en muchas áreas de
microbiología, más que las cuentas totales. Desafortunadamente, está
admitido de manera generalizada que las técnicas de cultivo
convencionales subestiman la fracción de microorganismos viables
reales y que las cuentas totales, que representan todas las
partículas de microorganismos, sobrestiman esta fracción.
Aparte de los problemas asociados a la obtención
del número exacto de microorganismos presentes en una muestra,
también es sabido que las técnicas de cultivo en un medio de
crecimiento requieren mucho tiempo y generalmente requieren entre
18 horas y 20 días aproximadamente para obtener un resultado. El
uso de medios de crecimiento tradicionales es no específico y
natural, y por tanto variable y no controlado.
Un procedimiento que supera el requerimiento del
cultivo de los microorganismos después de que se tomen las muestras
se describe en el documento EP 0 816 513A1. Esta referencia
describe el uso de una lámina adhesiva sensible a la presión para
la recolección de microorganismos en superficies que pueden
contener al microorganismo. La lámina adhesiva está constituida de
un laminado de una capa adhesiva compuesta principalmente de un
polímero soluble en agua y una membrana permeable al agua que no
permite el paso de microorganismos. Por tanto, el documento EP 0 816
513A1 requiere que al menos dos capas de la lámina adhesiva se unan
juntas, una de cuyas capas sirve para capturar los microorganismos
en un proceso después de la toma de muestras.
Además, la toma de muestras de los
microorganismos con la lámina adhesiva sensible a la presión
requiere que la lámina adhesiva se ponga en contacto con la
superficie de un objeto de prueba, de manera que se consiga la
acumulación de microorganismos sobre la lámina. Por tanto, usando un
agente cromogénico que esté presente en la capa adhesiva o en el
agua se logra la observación incluso visual de los microorganismos,
por lo que el procedimiento no puede ser muy sensible.
El documento EP 0 816 513A1 no describe o
sugiere que su dispositivo para toma de muestras, que requiere al
menos dos capas laminadas, y/o su procedimiento para detectar
microorganismos se puedan usar para pruebas de esterilidad de
muestras de aire en las cuales es necesaria una sensibilidad de
detección muy elevada.
De hecho, es bien sabido en la materia que son
necesarios la monitorización y el control específicos de entornos
asépticos para el procesamiento de fármacos, formas de dosificación
y, en ciertos casos, dispositivos médicos. Una gran proporción de
productos estériles se fabrican por procesamiento aséptico, puesto
que este procedimiento depende de la exclusión de microorganismos
de la corriente de procesamiento y de la prevención de la entrada
de microorganismos en los contenedores durante el llenado. El
procesamiento aséptico generalmente se realiza en salas blancas y
el entorno siempre se monitoriza cuidadosamente.
Aparte del uso de condiciones asépticas en la
industria farmacéutica, la industria electrónica también usa y
monitoriza salas blancas para la fabricación de componentes
electrónicos, chips para ordenadores, componentes para ordenadores
y similares.
La diferencia entre estas dos industrias en la
monitorización del entorno está en que en la industria electrónica
generalmente se miden los microorganismos o partículas no viables y
hay un menor énfasis en el número de partículas o microorganismos
viables. En contraste, en la industria farmacéutica existe una
mucha mayor preocupación con respecto a la cuestión de
microorganismos viables.
Un procedimiento de monitorización en
condiciones asépticas es establecer la cuenta de particulados
totales. Este procedimiento no proporciona información con respecto
al contenido microbiológico del entorno. La limitación básica de
los contadores de particulados es que sólo miden partículas de 0,5
\mum o superior. Aunque las partículas en suspensión no flotan
libremente o son células únicas, frecuentemente se asocian con
partículas de 10 \mum a 20 \mum y así no es aconsejable probar
exclusivamente las cuentas particuladas sin considerar las cuentas
microbianas.
También es sabido en la materia que las salas
blancas deben cumplir unas normas particulares. De hecho, las
especificaciones para los cambios de aire por hora y las
velocidades, aunque no están incluidos en las normativas federales,
son habituales. Así, por ejemplo, las salas de clase 100.000 en
entornos de procesamiento asépticos están diseñadas para
proporcionar un mínimo de 20 cambios de aire por hora, mientras que
las salas blancas de clase 100 proporcionan más de 100 cambios de
aire por hora. Diluyendo y retirando los contaminantes es probable
que se reduzca la contaminación en suspensión en la producción
aséptica en grandes volúmenes de aire.
Hay ciertas directrices de limpieza del aire que
se deben cumplir para las diferentes categorías de una sala blanca.
Así, por ejemplo, para la clase 100, la media móvil de todos los
puntos de los datos debe ser <1 unidad formadora de colonias
(cfu) por metro cúbico de aire y al menos el 85% de todas las
muestras tomadas debe ser cero. Para las salas blancas de clase
10.000, al menos el 65% de todas las muestras tomadas debe ser cero
y para la clase 100.000 al menos el 50% de las muestras debe ser
cero. Así, estos valores son muy críticos para proporcionar una
monitorización del entorno fiable.
Hay numerosos procedimientos conocidos en la
técnica para la toma de muestras de microorganismos viables en
suspensión, tales como el dispositivo de toma de muestras por
incisión en agar, el impactador de tamiz, el dispositivo de toma de
muestras centrífugo, el dispositivo de toma de muestras de sistema
de aire superficial y el dispositivo de toma de muestras de filtro
de gelatina. Todos estos dispositivos de toma de muestras requieren
una bomba, un motor o vacío que empuje o absorba el aire a través
de la unidad de muestras. El uso de estos dispositivos de toma de
muestras "activos" puede ser un inconveniente cuando haya una
limitación de espacio en la sala blanca, puesto que pueden ocupar
un espacio necesario. Además, estos dispositivos también pueden ser
un peligro para unas condiciones asépticas fiables, puesto que
pueden alterar el flujo de aire direccional como resultado del
tamaño y la localización del instrumento o de la manera en la cual
el equipo fuerza la entrada del aire en el medio o filtro de toma
de muestras.
Otro tipo de dispositivos de toma de muestras
"no activos" son las placas de sedimentación. Las placas de
sedimentación son una forma barata y sencilla de valorar
cualitativamente el aire de un entorno durante periodos prolongados
de tiempo. Las placas de sedimentación consisten en agar puesto en
placas de Petri y son útiles en áreas críticas en las que el uso de
un dispositivo de muestras activo supone una obstrucción. De hecho,
las placas de sedimentación, cuando se exponen durante periodos de
cuatro a cinco horas, pueden proporcionar un límite de detección
similar a aquellos observados con dispositivos de toma de muestras
activos.
No obstante, en muchos de estos procedimientos,
el agar se usa como medio para capturar los microorganismos y es
sabido que la escasez de agar, así como la variabilidad del
producto, ha llevado a una búsqueda de sustitutos adecuados para el
agar.
Adicionalmente, es bien sabido en la materia que
la monitorización de microorganismos en condiciones asépticas aún
no está perfeccionada. Las variaciones en la sensibilidad de la
toma de muestras y en los límites de detección se pueden atribuir
no sólo a las características inherentes del procedimiento de toma
de muestras por sí mismo, sino también a la variabilidad del medio,
las temperaturas de incubación, la manipulación de las muestras y
la contaminación accidental de las muestras.
Además, la valoración microbiana de salas
blancas se realiza usando procedimientos que no dan como resultado
una valoración cuantitativa. Más bien, los procedimientos usados se
pueden definir en el mejor de los casos como semicuantitativos. De
hecho, muchos procedimientos sólo son adecuados para medir la
presencia de niveles atípicamente elevados de contaminación
microbiana y su exactitud y precisión es muy mala.
Por tanto, existe una necesidad en la técnica
del análisis de microorganismos en el entorno de proporcionar no
sólo un procedimiento de análisis rápido para muestras de aire,
sino también un medio para llevar a cabo este análisis con una
mayor exactitud, especialmente en el área de pruebas de
esterilidad.
Así, es un objeto de la presente invención
superar los problemas asociados a la técnica anterior.
Es un objeto de la presente invención usar
polímeros solubles en agua para atrapar y confinar microorganismos
en el aire.
Es otro objeto de la presente invención
proporcionar un medio sensible para análisis de esterilidad de
muestras de aire.
Es otro aspecto de la presente invención
proporcionar un polímero que tenga una resistencia mecánica
suficiente, de manera que se pueda transportar, sea soluble en agua
o en otros diluyentes fisiológicos, retenga agua hasta un cierto
grado mientras mantiene vivos a los microorganismos en un estado
viable y pueda capturar microorganismos del aire.
Aún es otro objeto de la presente invención
proporcionar un procedimiento para la detección rápida de
microorganismos en una muestra desconocida de aire.
Es un objeto adicional de la presente invención
proporcionar un procedimiento para detectar microorganismos en una
muestra desconocida de aire que no requiera que el microorganismo
se someta a un crecimiento posterior.
Es otro objeto de la presente invención
proporcionar un procedimiento en el cual se evita el sistema
variable y descontrolado de uso de medio de crecimiento.
Estos y otros objetos se consiguen mediante la
presente invención, como demuestran el resumen de la invención, la
descripción de las formas de realización preferidas y las
reivindicaciones.
La presente invención proporciona un
procedimiento para la detección del número de microorganismos en el
aire en un entorno aséptico, comprendiendo dicho procedimiento las
etapas de:
(a) atrapar y confinar dichos microorganismos
presentes en el aire con un polímero soluble en agua,
(b) la disolución de dicho polímero soluble en
agua en un diluyente para formar una disolución;
(c) la separación de dichos microorganismos de
dicha disolución; y
(d) la detección de dichos microorganismos por
fluorescencia usando un analizador Scan RDI® o un analizador
D-Count®.
La Fig. 1 es una gráfica que ilustra la
variación del tiempo de filtración con la concentración del
polímero poli(vinilalcohol) (PVA) (K30) usando una membrana
de una porosidad de 0,4 \mum (CB04).
Como se usa en el presente documento, el término
"microorganismo" engloba algas, bacterias, hongos (levaduras,
mohos y esporas de mohos) (incluyendo líquenes), rickettsias,
protozoos, pólenes, parásitos, ácaros, virus y agentes
subvíricos.
Como se usa en el presente documento, el término
"bacterias" engloba bacterias formadoras de esporas e incluye,
pero no está limitado a, Escherichia coli, Brucella, Shigella,
Clostridia, Bacillus anthracis, Bacillus subtilis, Staphylococcus
epidermidis, Treponema, Leptospira, Borrelia, Vibrio fetus,
Spirillum minus, Staphlococci, Streptococci, Gonococci, Salmonella,
Meningococci y similares, así como Staphylococus aureus,
Listeria monocytogenes, Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa,
Aspergillus niger, Mycobacterium phlei, Shigella sonnei, Zymomonas
sp, Edwardsiella ictaluri y similares.
Como se usa en el presente documento, el término
"polímeros solubles en agua" significa que los polímeros son
solubles en agua y/o diluyentes fisiológicos, que tienen una
resistencia mecánica suficiente de manera que el polímero se pueda
transportar, retenga agua hasta un cierto grado y se adhiera a
microorganismos.
Por "microorganismos viables" se quiere
decir que los microorganismos son capaces de vivir en las
condiciones apropiadas.
Por "condiciones apropiadas" se quiere
decir que los microorganismos no se desecan o se estresan.
Por "atrapar" se quiere decir que los
microorganismos se secuestran del entorno mediante los polímeros
solubles en agua.
Por "confinar" se quiere decir que los
microorganismos se adhieren a o se atrapan de otra forma mediante
los polímeros solubles en agua.
Por "el entorno" se quiere decir el medio
circundante, ya sea aire, objetos físicos, superficies, y
similares.
Como se usan en el presente documento los
términos "Scan RDI®" y "ChemScanRDl®" se usan
indistintamente y son el mismo instrumento. Es bien sabido en la
materia que en los EE.UU. el instrumento se denomina "Scan
RDI®", mientras que en Europa se denomina
"ChemScanRDl®".
Más específicamente, la presente invención se
refiere a un procedimiento para atrapar y confinar microorganismos
que están presentes en el aire usando un polímero soluble en agua.
Preferentemente, la presente invención implica el análisis de
microorganismos en el entorno presentes en, por ejemplo, una sala
blanca en la cual se deben mantener unas condiciones asépticas.
Después de atrapar y confinar los microorganismos, se pueden
transportar posteriormente a un laboratorio para su análisis
posterior.
Los microorganismos que se atrapan y confinan
pueden ser microorganismos viables, microorganismos no viables y
sus mezclas. En una forma de realización preferida de la presente
invención, los microorganismos viables se atrapan y confinan en el
aire usando polímeros solubles en agua. A continuación los
microorganismos viables se transportan y se someten a análisis.
Después de que los microorganismos se recojan
sobre el polímero soluble en agua, se analizan usando un analizador
Scan RDI® o D-Count®. El uso de estos analizadores
particulares proporciona una cuenta de los microorganismos en 90
minutos aproximadamente desde la recepción de la muestra y pueden
medir la presencia de hasta un microorganismo presente en el aire
con el analizador Scan RDI®. La sensibilidad de este tipo de
análisis es extremadamente importante para la monitorización de
microorganismos que puedan estar presentes en procesamientos
asépticos tales como en salas blancas. Además, no hay necesidad de
cultivar los microorganismos antes del análisis, ahorrando así
tiempo y dinero.
Los polímeros solubles en agua usados en la
presente invención deberían ser adaptables a análisis del entorno y
se deberían preparar con propiedades físicas bien definidas y
reproducibles. Además, los polímeros solubles en agua usados en la
presente invención deberían ser fácilmente solubles en agua y/o en
un diluyente fisiológico, tener una resistencia mecánica razonable
de manera que se puedan transportar sin romperse, retener agua
hasta un cierto grado tal que los microorganismos atrapados y
confinados puedan ser viables para el análisis y adherirse a
microorganismos en el aire.
Se prefiere que los polímeros solubles en agua
tengan una morfología de área superficial elevada para una captura
de microorganismos suficiente, sean no tóxicos, tengan unas
propiedades de formación de películas o propiedades de moldeo
buenas, procesabilidad, filtrables después de su disolución, sean
no bactericidas y preferentemente esterilizables, si se desea.
Los polímeros solubles en agua usados en la
presente invención pueden ser naturales o sintéticos. Si se usan
polímeros naturales, se pueden modificar para conseguir las
características específicas expuestas anteriormente mediante, por
ejemplo, injerto u oxidación del polímero. Se prefiere el uso de
polímeros solubles en agua estructuralmente bien definidos en el
procedimiento para atrapar y confinar a los microorganismos.
Los polímeros usados en la presente invención
pueden ser homopolímeros solubles en agua, copolímeros solubles en
agua, mezclas de más de un homopolímero/copolímero, polímeros
porosos y similares. Estos polímeros se pueden diseñar y sintetizar
para generar las propiedades específicas descritas
anteriormente.
Más específicamente, los polímeros solubles en
agua de la presente invención se caracterizan por su resistencia
mecánica; es decir, se pueden transportar sin romperse y así tienen
un peso molecular particular que está dentro del intervalo de 500 a
500.000 g/mol, preferentemente de 2000 a 250.000 g/mol, más
preferentemente de 1000 a 100.000 g/mol.
Adicionalmente, los polímeros solubles en agua
deben ser solubles en agua y/o otros diluyentes fisiológicos, cuyas
características dependen del peso molecular y el grado de
hidrólisis, si fuese aplicable. Los pesos moleculares particulares
que están englobados en este criterio de solubilidad se exponen
anteriormente. Por lo que respecta al grado de hidrólisis, si fuese
aplicable, los polímeros solubles en agua de la presente invención
tienen un grado de hidrólisis entre el 70% y el 90%,
preferentemente entre el 75% y el 90% y lo más preferentemente entre
el 80% y el 89%.
Además, los polímeros solubles en agua de la
presente invención deben retener agua hasta un cierto grado. Esta
característica se puede medir por el contenido de agua en
equilibrio cuando estos polímeros se moldean y se secan al aire. Más
particularmente, el contenido de agua en equilibrio debería estar
entre el 2% y el 40% en p/p y más preferentemente entre el 4% y el
30% en p/p.
Debido a las propiedades anteriores de
resistencia mecánica, hidrofilicidad y retención de agua, los
polímeros solubles en agua de la presente invención se adhieren a
microorganismos, como se ejemplifica en los ejemplos. Así, los
microorganismos presentes en el aire se pueden atrapar y confinar
fácilmente con los polímeros solubles en agua expuestos en la
presente invención.
En una forma de realización preferida, los
polímeros usados en la presente invención también pueden tener las
siguientes propiedades:
(1) el polvo polimérico debería ser fácilmente
soluble en un diluyente apropiado a temperatura ambiente;
(2) deberían tener propiedades de formación de
película o de moldeo y se pueden moldear como una película uniforme
o en un molde;
(3) deberían tener buenas propiedades mecánicas,
e idealmente, extraerse fácilmente del contenedor en el que se
moldean sin romperse,
(4) las películas, moldes, cuentas, o
microesferas de polímero se deberían disolver completamente en agua
a temperatura ambiente en un intervalo de tiempo razonable;
(5) las películas, moldes, cuentas, o
microesferas de polímero se deberían disolver para formar
disoluciones claras y homogéneas en agua que sean filtrables a
través de membranas;
(6) no debería quedar residuo polimérico que
interfiera sobre la membrana después de la filtración,
(7) el polímero debería ser no bactericida;
(8) las películas, moldes, cuentas o
microesferas de polímero deberían ser adhesivos para los
microorganismos;
(9) preferentemente, el polímero debería ser
térmicamente estable hasta los 120ºC; es decir, estable en
condiciones de autoclavado o de irradiación de inertes;
(10) el polímero debe retener agua; y
(11) el polímero no debería estar químicamente
entrecruzado para formar un gel insoluble después de la
esterilización.
Los ejemplos de los polímeros que se pueden usar
en la presente invención pueden ser polímeros porosos o sintéticos
solubles en agua. Los polímeros porosos se pueden preparar, por
ejemplo, usando el procedimiento de Yang y Zhang, Journal of
Membrane Science, 114, págs. 149-155 (1996).
Los polímeros sintéticos solubles en agua incluyen, pero no están
limitados a óxido de polietileno (PEO), polietilenglicol (PEG),
poli(vinilpirrolidona) (PVP), poli(vinil-
alcohol) (PVA), ácido poliacrílico (PAA), sal de sodio del ácido poliacrílico (PAMPSA), poli(estirensulfonato sódico) (PSSS), poliacrilamida, agarosa, poli(hidroxietilmetacrilato) (PHEMA), poli(hidroxietilacrilato) (PHEA) y similares.
alcohol) (PVA), ácido poliacrílico (PAA), sal de sodio del ácido poliacrílico (PAMPSA), poli(estirensulfonato sódico) (PSSS), poliacrilamida, agarosa, poli(hidroxietilmetacrilato) (PHEMA), poli(hidroxietilacrilato) (PHEA) y similares.
También se pueden utilizar dos copolímeros o
mezclas de más de un homopolímero/copolímero. El polímero también
se puede adaptar o modificar para cambiar las diversas propiedades
del polímero según se desee: es decir, por ejemplo para incrementar
o disminuir su resistencia mecánica, las características de
solubilidad en agua, las cualidades de retención de
microorganismos, las cualidades de retención de agua y sus
combinaciones.
En una forma de realización más preferida de la
invención, se prefiere el uso como polímero soluble en agua entre
1000 y 250.000 g/mol, más preferentemente entre 5000 y 100.000
g/mol, lo más preferentemente entre 7500 g/mol y 25.000 g/mol de
poli(vinilalcohol) (PVA); de 5000 a 500.000 g/mol, más
preferentemente de 10.000 a 100.000 g/mol y lo más preferentemente
de 20.000 a 75.000 g/mol de poli(vinilpirrolidona) (PVP);
entre 500 y 100.000 g/mol, más preferentemente entre 1000 y 50.000
g/mol, lo más preferentemente entre 2000 y 10.000 g/mol de óxido de
polietileno (PEO), entre 2000 y 250.000 g/mol, más preferentemente
entre 5000 y 100.000 g/mol, lo más preferentemente entre 10.000 y
50.000 g/mol de ácido poliacrílico (PAA); entre 1000 y 250.000
g/mol, más preferentemente entre 2000 y 100.000 g/mol, lo más
preferentemente entre 5000 y 50.000 g/mol de sal sódica del ácido
poliacrílico (PAMPSA); y entre 500 y 500.000 g/mol, más
preferentemente entre 1000 y 50.000 g/mol, lo más preferentemente
entre 1500 y 10.000 g/mol de poliacrilamida.
En la forma de realización más preferida de la
presente invención, se prefiere el uso de poli(vinilalcohol)
(PVA) con un peso molecular medio en el intervalo de 10.000 a
100.000 g/mol y un grado de hidrólisis en el intervalo del 80% al
90%.
Los polímeros se pueden conformar en forma de
películas, algodones, placas, fibras, discos, placas de contacto,
microesferas, cuentas y similares. La forma de polímero no es
importante y se puede adaptar al entorno del cual se necesita la
muestra de aire. Todas estas formas se pueden adaptar usando
polímeros porosos y no porosos.
Si los polímeros solubles en agua se conforman
en forma de un objeto plano, tal como una película, placa o disco,
el grosor del polímero puede variar en un intervalo entre 50 \mum
y 5 mm. Se prefiere tener un grosor en el intervalo de 50 \mum a
1 mm.
Cuando se desea tener microesferas o cuentas se
pueden usar procedimientos de extrusión o emulsión/suspensión que
son conocidos en la técnica. Por ejemplo, las microesferas se
pueden preparar mediante el procedimiento de Thanoo y col., J.
Pharm. Pharmacol. 45, 16 (1993).
El tamaño de las microesferas puede variar
dependiendo de la cantidad de microorganismos que se necesite
atrapar y confinar. El tamaño puede abarcar desde 50 nm a 3 mm, más
preferentemente de 1 \mum a 1 mm, lo más preferentemente 250
\mum a 500 \mum.
Los polímeros solubles en agua se pueden moldear
en disolución según procedimientos conocidos en la materia. Por
ejemplo, el polvo polimérico se puede disolver en un diluyente y se
puede esterilizar, si se desea.
El diluyente que se usa generalmente para
disolver el polímero soluble en agua generalmente es agua exenta de
bacterias. No obstante, también se pueden utilizar tampón fosfato
salino, agua destilada, agua desionizada, agua WFI, agua estéril y
sus mezclas. Se fuese necesario, el pH de la disolución polimérica
se puede ajustar usando ácido acético o hidróxido sódico diluido
hasta el pH necesario, tal como pH neutro.
Si se desea la esterilización, se puede usar
cualquier procedimiento de esterilización mientras los polímeros
solubles en agua retengan su solubilidad en agua, resistencia
mecánica, no se desequen y mantengan sus capacidades para atrapar y
confinar tales que los microorganismos sobrevivan en el biopolímero
soluble en agua. Más específicamente, los polímeros se pueden
esterilizar usando un autoclave (121ºC durante 15 minutos), por
radiación gamma (a una dosis de entre 10 K Gray y 30 K Gray,
preferentemente 20 K Gray) o usando el tratamiento con óxido de
etileno.
La disolución polimérica soluble en agua se
puede filtrar a través de una membrana de poliéster para limpiar la
disolución polimérica soluble en agua. Generalmente se usa una
membrana de 0,3 \mum a 0,6 \mum, preferentemente de 0,4 \mum
a 0,5 \mum, más preferentemente de 0,45 \mum.
Después de la esterilización, el polímero
soluble en agua diluido se conforma en una forma apropiada según se
ha descrito anteriormente y se moldea dejando evaporar la
disolución a temperatura ambiente o en una campana de extracción de
flujo laminar.
En general, las concentraciones de polímero
soluble en agua durante el moldeo abarcan entre el 1% y el 20% en
peso aproximadamente, preferentemente entre el 1% y 12% en peso,
más preferentemente entre el 5% y el 10% en peso. Cuando se usan
dos copolímeros o mezclas de más de un homopolímero/copolímero, se
usa la misma concentración final. Por ejemplo, se puede usar una
mezcla copolimérica del 1% de poli(vinilalcohol) y el 4% en
peso de poli(vinilpirrolidona).
En un procedimiento típico, se puede moldear una
alícuota del polímero soluble en agua. Por ejemplo, se pueden
añadir 5 ml de una disolución polimérica al 10% a una placa Petri y
el agua se deja evaporar a temperatura ambiente en una campana de
extracción de flujo laminar para moldear el polímero soluble en
agua.
Preferentemente el polímero soluble en agua se
debería preparar y moldear en condiciones limpias y exentas de
polvo.
"Generalmente", para la monitorización del
aire los polímeros solubles en agua se moldean en placas Petri que
tienen un tamaño de entre 90 mm y 150 mm de diámetro, más
preferentemente entre 50 mm y 130 mm de diámetro. Generalmente, en
la toma de muestras de aire es necesaria una mayor cantidad de
polímero que en otras aplicaciones del entorno tales como la
monitorización de microorganismos en superficies.
Después de que los polímeros se moldeen, el
polímero soluble en agua en el cual se atrapan y confinan los
microorganismos se expone al aire. La muestra se recoge
preferentemente en condiciones estériles mediante procedimientos
conocidos en la técnica.
Por ejemplo, si uno quiere medir la cantidad de
microorganismos en una sala o un entorno particular, el polímero
moldeado soluble en agua se puede dejaren el entorno o sala durante
entre 1 a 10 horas, preferentemente de 1,5 a 8 horas, más
preferentemente de 2 a 4 horas. El polímero soluble en agua actúa
como una trampa y confina a los microorganismos en el polímero.
Alternativamente, el polímero soluble en agua se
puede acoplar a una estructura adecuada y se puede colgar frente a
una chimenea de ventilación.
Después de que la muestra desconocida se coloque
o se atrape y confine en el polímero soluble en agua, el polímero
soluble en agua con la muestra desconocida se resuspende a
continuación en un diluyente tal como peptona y Tween80® al 0,1%, o
agua WFI, agua exenta de bacterias, agua estéril, tampón fosfato
salino y similares.
Los microorganismos atrapados se pueden
recuperar por centrifugación o por filtración. En una forma de
realización preferida se usa la etapa de filtración. La disolución
polimérica resuspendida se puede filtrar a través de membranas de
entre 0,1 \mum a 5 \mum, preferentemente de 0,2 \mum a 4,5
\mum, lo más preferentemente de 0,4 \mum.
El contenido en el número de microorganismos de
la disolución polimérica resuspendida se determina usando el
analizador D-Count® (Chemunex) o usando el
analizador Scan RDI® (Chemunex) descritos en la patente de EE.UU.
5.663.057. Mediante el uso de estos dos analizadores, se puede
analizar el número de microorganismos presentes en la muestra en 90
minutos y no requiere que los microorganismos se crezcan antes del
análisis. Ambos analizadores son citómetros que usan rayos láser en
el análisis.
En esta forma de realización preferida la
disolución polimérica resuspendida que contiene los microorganismos
se puede analizar con el Scan RDI®. A continuación la muestra se
filtra a través de una membrana de una porosidad de 0,4 \mum.
Los microorganismos retenidos sobre la
superficie se marcan añadiendo la disolución de marcaje
directamente a las muestras para el analizador
D-Count® o para el analizador Scan RDI®. Los
microorganismos retenidos sobre la superficie de la membrana de
filtración después de la filtración de las muestras se marcan
usando un marcador fluorescente o cualquier producto químico que
genere fluorescencia.
\newpage
Los marcadores fluorescentes que se pueden usar
en la presente invención incluyen, pero no están limitados a
colorantes fluorescentes basados en derivados de fluoresceína tales
como ChemChrome V, pero también otros tipos de marcadores
fluorescentes tales como Cascade Blue, Lucifer Yellow®, Oregon
Green®, Acridine Orange, y similares.
En esta forma de realización preferida el
ChemChrome V se usa poniendo en contacto a la membrana que retiene
a los microorganismos con la disolución de ChemChrome V, que se
prepara de la siguiente manera:
se añaden 100 \mul de ChemChrome V a 10 ml de
tampón de marcaje ChemSol filtrado (0,22 \mum). Las disoluciones
se mezclan totalmente.
Después de incubar la membrana con el colorante
fluorescente, según los protocolos descritos en el documento WO
98/55861, las membranas se analizan a continuación con el
analizador Scan RDI®. Después del análisis de cantidad de casos
fluorescentes detectados por los analizadores se correlaciona con
el número de microorganismos en la muestra.
Para ilustrar en profundidad la presente
invención y sus ventajas, se dan los siguientes ejemplos
específicos, entendiéndose que los mismos están previstos sólo como
ilustrativos y de ninguna manera limitantes.
Se disolvieron en agua (100 cm^{3}) 5 g de
poli(vinilalcohol) (Nº CAS 9002- 89-5) con un
peso molecular medio de 10.000 g/mol y un grado de hidrólisis del
80% mientras se agitaba a temperatura ambiente. Cuando esta
disolución se hubo disuelto completamente se autoclavó. Se
añadieron 20 ml de la disolución a una placa Petri estéril de
plástico. A continuación la película se moldeó al aire dejando
evaporar el agua a temperatura ambiente en una campana de
extracción de flujo laminar. El tiempo para que se produzca el
moldeo de la película fue de 10 horas aproximadamente dependiendo de
las condiciones de flujo laminar del aire. El contenido de agua en
equilibrio en las películas medido en el procedimiento expuesto
anteriormente fue del 6% en peso aproximadamente.
Se disolvieron en agua (100 cm^{3}) 5 g de
poli(vinilpirrolidona) (Nº CAS 9003-3908)
con un peso molecular medio de 44.000 g/mol mientras se agitaba a
temperatura ambiente. Cuando esta disolución se hubo disuelto
completamente se filtró a través de un filtro de 0,45 micrómetros.
Se añadió una disolución al 1% a una placa Petri estéril de
plástico. A continuación la película se moldeó al aire dejando
evaporar el agua a temperatura ambiente en una campana de
extracción de flujo laminar. El tiempo para que se produzca el
moldeo de la película fue de 16 horas aproximadamente.
Se moldearon películas en disoluciones acuosas
en un intervalo de concentraciones que varían entre el 5% y el 10%;
es decir, de 5 g a 10 g de polímero en 100 ml de agua. Se añadieron
5 ml de una disolución polimérica al 10% a una placa Petri pequeña
y el agua se dejó evaporar a temperatura y presión ambiente. Las
películas se extrajeron intactas de las placas Petri y las
propiedades mecánicas de las películas se evaluaron midiendo el
tiempo empleado para disolver el polímero soluble en agua así como
el tiempo de filtración.
Así, las películas se redisolvieron en agua pura
(50 ml a 20ºC) y se anotó el tiempo empleado para la
disolución.
Las pruebas de filtración se llevaron a cabo
sobre polímeros todos solubles en agua (disoluciones de 50 ml) a
tres concentraciones diferentes del 1, 2 y 5% en condiciones
estándar (40 kPa) usando dos membranas de filtración diferentes con
un tamaño de poro de 0,2 \mum y 0,4 \mum, respectivamente.
El contenido de agua en equilibrio se estableció
para algunas de las películas moldeadas, puesto que se considera
que esto es importante en la determinación de la retención de agua.
Las películas se moldearon al aire mediante el procedimiento
habitual diluyéndose con agua y sometiéndose a una campana de
extracción de flujo laminar para el secado, y a continuación se
dejaron hasta que las muestra alcanzaron un peso constante. A
continuación las muestras se secaron en un horno de vacío a 100ºC,
de nuevo hasta que las muestras alcanzaron un peso constante. De
estas mediciones, se puede calcular el contenido de agua en
equilibrio a partir de la diferencia en masa entre los dos pesos
constantes, que es igual a la masa de agua, es decir, el peso de
masa seca.
Las disoluciones poliméricas anteriores, a
saber, de PVA o PVP, se resuspendieron en 50 ml de peptona filtrada
previamente (1 g/L) y Tween80® al 0,1%. Se añadieron de 10 a
10^{3} aproximadamente de los siguientes microorganismos a la
disolución polimérica resuspendida en tubos separados: E. coli,
S. aureus, P. aeruginosa, B. subtilis, C. albicans y A. niger a
continuación se analizaron 10 ml de cada uno del
polímero/microorganismo usando el Scan RDI® usando los protocolos
de "TCV" y "Fungi" desarrollados por Chemunex y
comercializados con el Scan RDI®.
Más específicamente, estos protocolos se exponen
de manera general a continuación, pero el facultativo experto
comprenderá que se puede seguir una versión más detallada que está
expuesta en el documento WO 98/55861. Todos los reactivos
mencionados a continuación están disponibles al público en Chemunex
SA, que tiene su sede mundial en Maisons-Alfort,
Francia.
Con una jeringa (20 ml) con aguja, se perforó el
tapón de la botella de CSE/2 y se aspiró CSE/2 (1 ml por muestra).
Se ajustó una unidad de filtro Autotop de 0,2 \mum a la jeringa y
se dispensó 1 ml de este contracolorante en el filtro de embudo. Se
abrió la llave de vacío y el CSE/2 se dejó pasar a través del
filtro. Cuando se hubo completado (no quedaba líquido sobre la
superficie de la membrana, pero la membrana estaba húmeda) la llave
de vacío se cerró. A continuación se liberó el vacío.
El portador de muestras se preparó poniendo los
soportes Labeling Pad en posición. Se retiró un Labeling Pad del
paquete y a continuación se depositaron 600 \mul de ChemSol A4
(medio de activación) sobre el Labeling Pad.
La membrana de muestras se transfirió al
Labeling Pad asegurándose de que la misma cara de la membrana
estaba en contacto tanto con el Labeling Pad como con el
filtro.
El Labeling Pad y las membranas se incubaron a
37ºC \pm 3ºC durante 60 min \pm 5 min.
Después de la fase de premarcaje, la membrana
Chemfilter se transfirió a un nuevo Labeling Pad empapado
previamente con 600 \mul de disolución de marcaje y se incubó
durante 30 minutos a 30ºC según los protocolos descritos en el
documento WO 98/55861.
Después de la etapa de marcaje, la membrana
Chemfilter marcada se introdujo en el instrumento Scan RDI®. El
análisis se realizó en los cuatro minutos siguientes a la
introducción de la membrana en la máquina.
La membrana Chemfilter marcada del Labeling Pad
se transfirió sobre el Support Pad. El portamembranas protegido en
una placa Petri se transfirió al instrumento ChemScan. Se inició el
escaneado usando el software. El análisis se realizó en los cuatro
minutos siguientes a la preparación del portamembranas.
El protocolo de hongos se expone a
continuación:
Con una jeringa (20 ml) con aguja, se perforó el
tapón de la botella de CSE/5 y se aspiró CSE/5 (1 ml por muestra).
Se ajustó una unidad de filtro Autotop de 0,2 \mum a la jeringa y
se dispensó 1 ml en el filtro de embudo.
Se abrió la llave de vacío y el CSE/5 se dejó
pasar a través del filtro. Cuando se hubo completado (no quedaba
líquido sobre la superficie de la membrana, pero la membrana estaba
húmeda) la llave de vacío se cerró. A continuación se liberó el
vacío.
Se retiró un Labeling Pad del paquete y a
continuación se depositaron 600 \mul de ChemSol A6 (medio de
activación) sobre el Labeling Pad. La membrana de muestras se
transfirió al Labeling Pad asegurándose de que la misma cara de la
membrana estaba en contacto tanto con el Labeling Pad como con el
filtro.
El Labeling Pad y las membranas se incubaron a
30ºC \pm 3ºC durante 3 horas \pm 5 min.
Después de la fase de premarcaje, la membrana
Chemfilter se transfirió a un nuevo Labeling Pad empapado
previamente con 600 \mul de disolución de marcaje y se incubó
durante 1 hora a 37ºC \pm 3ºC según los protocolos descritos en
el documento WO 98/55861.
Se preparó un Labeling Pad fresco para la etapa
de marcaje. El Labeling Pad se colocó sobre un soporte de Labeling
Pad en el ChemPrep S.
Se pusieron 600 \mul de disolución de marcaje
sobre el Labeling Pad.
La membrana Chemfilter se transfirió al nuevo
Labeling Pad.
El Labeling Pad y la membrana se transfirieron a
continuación al ChemPrep S. en el soporte de muestras y se
incubaron a 37ºC \pm 3ºC durante un mínimo de 1 h hasta completar
la incubación.
Después de la etapa de marcaje, la membrana
Chemfilter marcada se introdujo en el instrumento Scan RDI®. El
análisis se realizó en los cuatro minutos siguientes a la
introducción de la membrana en la máquina.
También se analizaron los controles que usan
microorganismos solos que no han tenido contacto con el polímero,
como se ha descrito anteriormente. Los resultados se muestran en la
Tabla 1 a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
| Control (sin contacto con el polímero) | PVA | PVP | ||||
| n = 2 | Resultado | % de | Resultado | % de | Resultado | % de |
| Chem Scan | recuperación | Chem Scan | recuperación | Chem Scan | recuperación | |
| E. coli | 114 | 110 | 130 | 126 | 113 | 111 |
| S. aureus | 67 | 129 | 85 | 120 | 68 | 109 |
| P. aeruginosa | 49 | 127 | 49 | 98 | 51 | 120 |
| B. subtilis | 81 | 138 | 87 | 156 | 87 | 192 |
| C. albicans | 148 | 130 | 147 | 132 | 147 | 129 |
| A. niger | 61 | 132 | 55 | 101 | 58 | 116 |
En la Tabla 1 anterior, el porcentaje de
recuperación es la relación entre los resultados del Scan RDI® y
las cuentas en placa.
La preparación de los polímeros se realizó en el
Ejemplo 2. Se llevó a cabo el mismo procedimiento que en el Ejemplo
3, excepto que los microorganismos se pusieron en contacto con los
polímeros durante 15 minutos antes del análisis. Los resultados de
este experimento se exponen en la Tabla 2.
| Control (sin contacto con el polímero) | PVA | PVP | ||||
| Resultado | % de | Resultado | % de | Resultado | % de | |
| Chem Scan | recuperación | Chem Scan | recuperación | Chem Scan | recuperación | |
| E. coli | 38 | 136 | 44 | 140 | 44 | 124 |
| S. aureus | 52 | 146 | 63 | 134 | 55 | 115 |
| C. albicans | 49 | 62 | 64 |
Como se puede observar de estos resultados, las
recuperaciones fueron superiores al 100% y son muy similares al
control.
En este experimento, se midió el número de
microorganismos en el aire. El polímero de PVA se preparó como en
Ejemplo 2 y se dejó en los laboratorios 30 minutos y 3 horas 30
minutos respectivamente antes del análisis. El análisis se realizó
como se ha expuesto en el Ejemplo 3. La Tabla 3 da los resultados
de este experimento.
| Lugar de la toma de muestras y | Resultados del ChemScan | cfu de la placa Petri/me de la |
| condiciones del biopolímero | bacteria/membrana | membrana (TCS, 7 días) |
| de PVA | ||
| Lab 1: 30 minutos de | 48 | 17 |
| contacto | 42 | 24 |
| 42 | ||
| Lab 2: 3 horas 30 | 8 | 19 |
| minutos de contacto | 12 | 16 |
| 14 | 22 |
El óxido de polietileno (PEO), polietilenglicol
(PEG), ácido poliacrílico (PAA), sal sódica del ácido poliacrílico
(PAMPSA), poli(estirensulfonato sódico) (PSSS) y la
poliacrilamida se prepararon según el Ejemplo 2 y se moldearon
siguiendo el procedimiento del Ejemplo 1. Los estudios de
citotoxicidad se realizaron como en los Ejemplos 3 y 4. El número
de microorganismos se analizó según el Ejemplo 5. Se obtuvieron
resultados similares usando estos polímeros particulares.
En este experimento, se midió el número de
microorganismos en el aire en una sala blanca de clase 100. Los
polímeros se prepararon como en el Ejemplo 2 y se moldearon en una
placa Petri de 90 mm de diámetro. A continuación el polímero
moldeado soluble en agua se colocó en el conducto del aire durante
las condiciones de funcionamiento y se dejó durante 4 horas antes
de su análisis. El análisis se realizó como se ha expuesto en el
Ejemplo 3.
Puesto que no hay microorganismos presentes en
esta muestra, se confirma que la sala blanca cumple los niveles de
limpieza del aire en este entorno controlado particular.
Las disoluciones poliméricas anteriores, a
saber, de PVA o PVP, se prepararon como en el Ejemplo 2 y se
moldearon en una placa Petri de 90 mm de diámetro.
Se extendieron sobre la superficie del polímero
moldeado soluble en agua entre 10 y 10^{3} microorganismos
aproximadamente de una mezcla (50 x 50) de microorganismos viables
y muertos.
A continuación las películas poliméricas se
extrajeron de las placas y se redisolvieron en agua pura como se ha
descrito en el Ejemplo 2.
Las disoluciones de polímero que contenían los
microorganismos se pasaron a través de las membranas Chemfilter de
0,4 \mum antes de que estas últimas se procesaran posteriormente
con los siguientes protocolos de marcaje:
- el número de microorganismos viables se define
usando el marcador de viabilidad (ChemChrome) y el analizador Scan
RDI® según el protocolo TVC como se ha descrito previamente,
- la población celular total (viva y muerta) de
microorganismos se determina usando el siguiente protocolo: se
extienden 0,8 ml de disolución de naranja de acridina sobre la
superficie de las membranas Chemfilter y se incuba durante dos
minutos a temperatura ambiente. A continuación el número de células
marcadas se obtiene después de la observación visual de las
membranas con un microscopio de epifluorescencia convencional.
Los resultados muestran una coherencia perfecta
entre el número de células viables determinadas por el analizador
Scan RDI®, el número esperado de células muertas y el valor de la
población total determinado experimentalmente.
Claims (14)
1. Un procedimiento para la detección del número
de microorganismos en el aire en un entorno aséptico, comprendiendo
dicho procedimiento las etapas de:
(a) atrapar y confinar dichos microorganismos
presentes en el aire con un polímero soluble en agua;
(b) disolución de dicho polímero soluble en agua
en un diluyente para formar una disolución;
(c) separación de dichos microorganismos de
dicha disolución; y
(d) detección de dichos microorganismos por
fluorescencia usando un analizador Scan RDI® o un analizador
D-Count®.
2. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que dicho polímero soluble en agua tiene un peso molecular en
el intervalo de entre 500 y 500.000 g/mol.
3. El procedimiento según la reivindicación 1 o
reivindicación 2, en el que el polímero soluble en agua tiene un
peso molecular en el intervalo de entre 2000 y 250.000 g/mol.
4. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el polímero soluble en agua tiene
un peso molecular en el intervalo de entre 1000 y 100.000
g/mol.
5. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho polímero soluble en agua
tiene un grado de hidrólisis entre el 70% y el 90%.
6. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho polímero soluble en agua
tiene un grado de hidrólisis entre el 75% y el 90%.
7. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho polímero soluble en agua
tiene un grado de hidrólisis entre el 80% y el 89%.
8. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho polímero soluble en agua
tiene un contenido de agua en equilibrio de entre el 2% y el
40%.
9. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho polímero soluble en agua
tiene un contenido de agua en equilibrio de entre el 4% y el
30%.
10. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, tiene que dicho polímero soluble en agua se
selecciona del grupo constituido por óxido de polietileno,
polietilenglicol, poli(vinilpirrolidona),
poli(vinilalcohol), ácido poliacrílico, sal de sodio del
ácido poliacrílico, poli(estirensulfonato), poliacrilamida y
sus mezclas.
11. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho polímero soluble en agua
es poli(vinilalcohol) o poli(vinilpirrolidona).
12. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que dichos microorganismos se separan en la etapa (c) por
filtración o centrifugación.
13. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que dicho diluyente en la etapa (b) se selecciona del grupo
constituido por agua exenta de bacterias, tampón fosfato salino,
agua destilada, agua desionizada, agua estéril y sus mezclas.
14. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que se puede detectar hasta 1 microorganismo.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP00403304A EP1209223B1 (en) | 2000-11-24 | 2000-11-24 | Process for trapping and confining microorganisms in air using water-soluble polymers |
| EP00403304 | 2000-11-24 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2266287T3 true ES2266287T3 (es) | 2007-03-01 |
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Family Applications (2)
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